專利名稱：：三維細胞培養(yǎng)插入件、其制造方法、成套用具及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于活細胞貼附、增殖和分化的多孔三維細胞培養(yǎng)插入件。本發(fā)明還涉及形成和制造所述插入件的方法，以及使用該插入件在細胞培養(yǎng)平板(例如塑料培養(yǎng)皿和多孔組織/細胞培養(yǎng)平板)、細胞培養(yǎng)瓶和生物反應(yīng)器中培養(yǎng)哺乳動物細胞的方法。本發(fā)明屬于細胞、組織培養(yǎng)領(lǐng)域。.
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中，常規(guī)使用的主要的細胞培養(yǎng)方式包括以下兩種1)以單層二維方式培養(yǎng)細胞細胞培養(yǎng)是一種在藥物開發(fā)、細胞生物學(xué)、毒理學(xué)、生物工程以及組織工程領(lǐng)域中非常有用并且被廣泛使用的技術(shù)。常規(guī)的細胞培養(yǎng)是在細胞培養(yǎng)平板如2、4、6、24、96孔細胞培養(yǎng)板中進行，上述細胞培養(yǎng)板由非降解性的聚合物例如聚苯乙烯、聚丙烯和聚氯乙烯制成。這些平板往往用等離子體(plasma)處理其表面，這是組織培養(yǎng)平板的生產(chǎn)者通常采用的^t術(shù)，用于改進其表面的親水性，^v而偵—得培養(yǎng)的細胞可以更好地粘附于所述培養(yǎng)平板的二維表面。在一種典型的細胞培養(yǎng)實驗中，在該聚苯乙烯細胞培養(yǎng)平板中培養(yǎng)的細胞在細胞培養(yǎng)基中以一種二維方式單層生長。2)以三維方式培養(yǎng)細胞二維(2D)細胞培養(yǎng)是一種用于制備、觀察和研究細胞以及它們與藥物、生物因子和生物材料在體外相互作用的方便的方法。但這與所述細胞在體內(nèi)的生長方式并不相仿。在真實的活體內(nèi)，細胞往往是三維(3D)生長的并且其構(gòu)建形成三維的活組織或器官。越來越多的證據(jù)表明體外的三維細胞培養(yǎng)體系可以促進對在正常和病理的組織條件下的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的了解。為了研究這種功能性和形態(tài)學(xué)上的相互作用，一些研究者已經(jīng)探索使用三維的凝膠基質(zhì)，例如膠原凝膠[DouglasWHJ，MoormanGW，和TeelRW,Theformationofhistotypicstructuresfrommonodispersefetalratlungcellsculturedonathreedimensionalsubstrate.ToF7加1976;12:373—381]、明膠、血纖維蛋白、瓊脂糖和藻酸鹽[GruberHE,FisherECJr，DesaiB，StaskyAA,HoelscherG，HanleyEN,Humanintervertebraldisccellsfromtheannulus:ThreedimensionalcultureinagaroseoralginateandresponsivenesstoTGF-(3L腳.Ce"虹1997，235:13—21;GruberHE,StaskyAA，HanleyENJr,Characterizationandphenotypicstabilityofhumandisccellsinvitro.1997;16:285-288]。在這些凝膠體系中，將細胞培養(yǎng)在凝膠基質(zhì)內(nèi)，它們在其中以三維的方式生長。近來的研究已經(jīng)顯示，與單層生長的細胞相比，培養(yǎng)在三維的藻酸鹽或瓊脂糖凝膠體系中的人推間盤細胞(humanannulusdisccells)顯示出不同的形態(tài)，增加了含蛋白多糖的合成，并且形成帶有沉積在細胞周圍和之間的胞外基質(zhì)的多細胞集落[GruberHE,FisherECJr,DesaiB,StaskyAA,HoelscherG,HanleyEN，Humanintervertebraldisccellsfromtheannulus:ThreedimensionalcultureinagaroseoralginateandresponsivenesstoTGF-pl.脈Ce"紐1997，235:13-21;GruberHE,StaskyAA，HanleyENJr，Characterizationandphenotypicstabilityofhumandisccellsinvitro.1997;16:285—288〗。jt匕夕卜，在所述三維藻酸鹽凝膠體系中培養(yǎng)的人推間盤細胞證實產(chǎn)生了I型和II型膠原，而該I型和II型膠原在單層細胞培養(yǎng)時未有發(fā)現(xiàn)[GruberHE和HanleyEN,Jr,Humandisccellsinmonolayervs3Dculture:cellshape,divisionandmatrixformation,jM7M/scw/c^e/efa/"/sorcfers,2000;1:l]。體外動物細胞的三維生長促進正常上皮細胞的極化和分化[RoskelleyCD，BissellMJ,Dynamicreciprocityrevisited:acontinuous,bidirectionalflowofinformationbetweencellsandtheextracellularmatrixregulatesmammaryepithelialcellfunction,》/oc力咖Ce//A/o/1995;73(7-8):391-7]。與活組織細胞相比較，三維培養(yǎng)的細胞地移動和分裂得更快并且具有一種特征性的不對稱外形[CukiermanE,PankovR，StevensDR，YamadaKM，Takingcellmatrixadhesionstothethirddimension,Sc/e薦，2001;294(5547):1708-12]。三維的細胞培養(yǎng)還被用于研究細胞與生長因子以及細胞和藥物之間的相互作用。例如，癌細胞的三維細胞培養(yǎng)可用于探索許多與癌生物學(xué)有關(guān)的基礎(chǔ)性問題，因為與標(biāo)準(zhǔn)的二維組織培養(yǎng)平板相比，癌細胞的腫瘤發(fā)展生長因子的受體在三維細月包培養(yǎng)時的表達方式是不同的[WangF，WeaverVM，Petersen0W，LarabellCA，DedharS,BriandP,LupuR，BissellMJ.Reciprocalinteractionsbetweenbetal-integrinandepidermalgrowthfactorreceptorinthreedimensionalbasementmembranebreastcultures:adifferentperspectiveinepithelialbiology.jPtoc#a〃USA1998;95(25):14821-6;JacksT,WeinbergRA.Takingthestudyofcancercellsurvivaltoanewdimension.6W/，2002;111(7):923-5]。對于乳腺癌，三維細胞培養(yǎng)物提供一種用于了解癌細胞增殖的調(diào)控以及用于評價不同抗癌藥物的模型體系[BissellMJ，RizkiA,MianIS,Tissuearchitecture:theultimateregulatorofbreast印ithelialfunction.C釘一'"e//倫/"，2003;15(6):753-62;PadronJM,爆derWiltCL，SmidK,Smitskamp-WilmsE,BackusHH，PizaoPE,GiacconeG,PetersGJ.Themultilayeredpostconfluentcellcultureasamodelfordrugscreening.j<fft7co7化邁s"/，2000;36(2-3):141-57]。大量的證據(jù)表明，與在單層或^t培養(yǎng)物中的細胞相比，三維培養(yǎng)中生長的細胞對細胞毒性試劑具有更高的耐受性。許多研究已經(jīng)揭示，與單層細胞相比，球體細胞培養(yǎng)具有更高的耐藥性[HoffmanRM.Three-dimensionalhistoculture:originsandapplicationsincancerresearch.。刀cerCe7/s1991;3(3):86-92]。起初，研究者們將細胞球體對藥物的耐受性歸因于藥物向球體內(nèi)部細胞的不良擴散，但是現(xiàn)在已經(jīng)證實，耐藥性是由三維細胞培養(yǎng)而引起的，而不是僅僅無法接觸至'J營養(yǎng)物質(zhì)[LawlerEM，MillerFR,H印pnerGH，Significanceofthreedimensionalgrowthpatternsofmammarytissuesincollagengels,W加1983;19(8):600-10;MillerBE,Mi1lerFR，He卯nerGH，F(xiàn)actorsaffectinggrowthanddrugsensitivityofmousemammarytumorlinesincollagengelcultures,tocerWes，1985;45(9):4200-5]。進一步的研究證實，三維細胞培養(yǎng)是一種用于評價抗癌藥物的體外細胞毒性的更好的模型[HarpreetK.Dhiman,AlokRRay,AmulyaKPanda,Three-dimensionalchitosanscaffoldbasedMCF-7cellcultureforthedeterminationofthecytotoxicityoftamoxifen,》/o鵬/e/"/a/51，2005;26979-986]。不斷增加的證據(jù)表明，三維的(3D)環(huán)境也能揭示細胞功能的基本機制，而且體外的三維培養(yǎng)體系可以促ii^在正常和病理條件中的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的了解[AbbottA.Cellculture:biology'snewdimension.A^ure,2003;424(6951):870-2;HutmacherDW.Scaffolddesignandfabricationtechnologiesforengineeringtissues—stateoftheartandfutureperspectives./^/謹(jǐn)fer尸o/jtz風(fēng)2001;12:107—24;Schmeichel〖L，BissellMJ.Modelingtissue-specificsignalingandorganfunctioninthreedimensions.2003;116(Ptl2):2377-88;ZahirN，WeaverVM,Deathinthethirddimension:apoptosisregulationandtissuearchitecture.Ci/rr6p/刀6fe刀et"ev2004;14:71—80;Martini,WendtD，HebererM，Theroleofbioreactorsintissueengineering,7^/^5io,e&加/,2004;22:80-6]?，F(xiàn)已被普遍接受的是，骨和軟骨來源的細胞在三維(3D)與二維(2D)的環(huán)境中的行為不同，并且，所述三維(3D)體外培養(yǎng)體系比二維(2D)培養(yǎng)體系能更接近地模擬體內(nèi)的情況[KaleS，BiermannS,EdwardsC,TarnowskiC，MorrisM,Long廳，Three—dimensionalcellulardevelopmentisessentialforexvivoformationofhumanbone.5/ofe由o入2000;18:954-8;FerreraD，PoggiS，BiassoniC，DicksonGR,AstigianoS，Barbieri0,FavreA，F(xiàn)ranziAT,StrangioA,FedericiA,ManducaP，Three—dimensionalculturesofnormalhumanosteoblasts:proliferationanddifferentiationpotentialinvitroanduponectopicimplantationinnudemice,加/e2002;30:718—25;TallhedenT，KarlssonC，BrunnerA,VanDerLeeJ，HaggR，To咖asiniR，IAridahlA.Geneexpressionduringredifferentiationofhumanarticularchondrocytes.0"eoar^r/仏for〃/柳，2004;12:525—35;]。在近期的研究中，在一種羥丙基曱基纖維素水凝膠基質(zhì)的內(nèi)部，三維培養(yǎng)三種人成骨細胞系以及正常的人成骨(HOST)細胞。已經(jīng)證實，骨肉瘤細胞以群落球體的方式而增殖，而且所述的HOST細胞集落存活至少3周。成骨細胞標(biāo)記物和細胞因子的礦化試驗和基因表達分析表明，在所述水凝M質(zhì)中三維培養(yǎng)的所有細胞比在塑料細胞培養(yǎng)平板中單層培養(yǎng)的細胞表現(xiàn)出一種更加成熟的分化狀況[TrojaniC，WeissP，MichielsJF，VinatierC,GuicheuxJ,DaculsiG，GaudrayP,CarleGF，RochetN.，Three—dimensionalcultureanddifferentiationofhumanosteogeniccellsinaninjectablehydroxypropylmethylcellulosehydrogel，"jfo咖"W^51,2005;26(27):5509—17]。迄今為止的證據(jù)已經(jīng)清楚地表明，在三維環(huán)境下培養(yǎng)細胞具有二維細胞培養(yǎng)不可比擬的巨大優(yōu)點。然而，使用目前的三維凝月交體系，所述培養(yǎng)的細胞被包埋在凝月^質(zhì)內(nèi)部，由于物質(zhì)在所述凝膠中的擴散受到一定的限制，因此該培養(yǎng)細胞的營養(yǎng)和代謝產(chǎn)物的交換是個問題。并且，由于所述培養(yǎng)的細胞包埋在所述凝膠內(nèi)部，培養(yǎng)后回收或分離所述細胞非常困難。這與使用二維細胞培養(yǎng)平板不同，二維培養(yǎng)的細胞可以使用胰蛋白酶簡單地將其從培養(yǎng)平板上脫離并通過離心加以分離。另外，在^i交基質(zhì)內(nèi)培養(yǎng)細胞要求在每次培養(yǎng)細胞前制備所述的凝膠體系，這不僅會給研究者們造成不方便，尤其是在必須大量培養(yǎng)的時候；而且由于在不同的研究者和實驗室之間凝膠的制備方式上存在著輕微的差異，從而會在不同批次的凝膠制備之間造成不一致。盡管三維細胞培養(yǎng)有更多的優(yōu)點，但由于上面提到的目前使用的三維凝膠培養(yǎng)體系所存在的種種問題，二維細胞培養(yǎng)仍然是主要的細胞培養(yǎng)方法。因此，一種兼具二維細胞培養(yǎng)體系的全部便捷之處的三維培養(yǎng)體系，對于醫(yī)藥、生命科學(xué)以及生物工程研究領(lǐng)域極具價值。這一理想的三維細胞培養(yǎng)體系將具有以下特征1.具有一種多孔的三維結(jié)構(gòu)，從而所述細胞可以同時貼附于該三維結(jié)構(gòu)的外表面和內(nèi)表面。該多孔的結(jié)構(gòu)能夠允許營養(yǎng)物和代謝產(chǎn)物容易地進行交換。2.該多孔的三維結(jié)構(gòu)應(yīng)該易于與目前的二維細胞培養(yǎng)平板一起4吏用。它可以是一種二維細胞培養(yǎng)平板孔內(nèi)的三維插入件。3.該多孔的三維結(jié)構(gòu)應(yīng)該由非細胞毒性的和非生物降解的材料來制造，比如目前的用于二維細胞培養(yǎng)體系中的材料(特別是聚苯乙烯)。4.該多孔的三維結(jié)構(gòu)應(yīng)當(dāng)足夠結(jié)實從而能承受細胞培養(yǎng)過程中正常的機械才喿作，而在細胞培養(yǎng)期間該多孔的結(jié)構(gòu)不發(fā)生變形和改變。長期以來，聚苯乙烯已經(jīng)成為一種成功地用于二維(2D)細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物基底材料。由聚苯乙烯制造的細胞培養(yǎng)平板被廣泛地使用并且具有可從許多供應(yīng)商處商購獲得的多種尺寸規(guī)格。由于聚苯乙烯培養(yǎng)平板對做細胞或組織培養(yǎng)的研究者們來說相當(dāng)熟悉，因此可以想像，一種由聚苯乙烯制造的三維細胞培養(yǎng)體系將不僅能提供三維培養(yǎng)環(huán)境的優(yōu)點，而且能夠提供聚苯乙烯二維細胞培養(yǎng)體系的許多其它優(yōu)點，例如具有明確的表面性質(zhì)且易于使用。然而，聚苯乙烯作為三維細胞培養(yǎng)體系的應(yīng)用在以前卻幾乎從未被探索過。近來，Baker等人報導(dǎo)其使用電場紡絲技術(shù)加工出一種三維多孔的聚苯乙烯纖維基體[BakerSC，AtkinN，GunningPA，GranvilleN,WilsonK,WilsonDandSouthgateJ，Characterisationofelectrospunpolystyrenescaffoldsforthree—dimensionalinvitrobiologicalstudies,Biomaterials,2006;27，3136-46]。他們獲得的三維聚苯乙烯纖維基體類似于一種無紡墊，其申有內(nèi)部纖維間的空隙就是多孔的空隙。他們將該聚苯乙烯無紡墊切割成適當(dāng)?shù)目梢苑旁?孔聚苯乙烯培養(yǎng)平板的孔中的尺寸。經(jīng)在氬氣中等離子體處理后，將這些纖維性基體接種細胞并且在常用的6孔聚苯乙烯細胞培養(yǎng)平板中進行細胞培養(yǎng)。結(jié)果表明，這些聚苯乙烯三維無紡墊具有適于細胞貼附的良好的表面性質(zhì)。該數(shù)據(jù)揭示，這些聚苯乙烯三維纖維性支架可以是二維聚苯乙烯細胞培養(yǎng)平板體系的一種補充。然而，這些纖維性聚苯乙烯基體的缺點是所述纖維的尺寸難以控制；所述基體的孔徑尺寸和形狀不易確定；其平均孔徑較小(15;微米)，并且該纖維性基質(zhì)在自然狀態(tài)下是軟的，從而令所述基質(zhì)在不發(fā)生變形的情況下進行進一步的操作產(chǎn)生困難。很顯然，本領(lǐng)域中需要有一種在常規(guī)的細胞培養(yǎng)實驗中與二維組織培養(yǎng)平板一起使用的、具有良好的確定孔徑尺寸和孔隙率的、結(jié)實的三維非降解性聚合物制成的三維細胞培養(yǎng)插入件。本發(fā)明提供這樣一種三維細胞培養(yǎng)插入件。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種非細胞毒性的和非降解性的多孔三維細胞培養(yǎng)插入件，該插入件用于細胞培養(yǎng)應(yīng)用，與目前的二維組織培養(yǎng)體系例如組織培養(yǎng)平板一起使用。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種制造所述的細胞培養(yǎng)插入件的方法。本發(fā)明的又一個目的在于提供一種制造所述的細胞培養(yǎng)插入件的設(shè)備。本發(fā)明的再一個目的在于提供一種包括所述細胞培養(yǎng)插入件的成套用具。本發(fā)明的又一個目的在于提供一種使用所述的細胞培養(yǎng)插入件培養(yǎng)細胞的方法。針對上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案一方面，本發(fā)明提供一種細胞培養(yǎng)插入件(細胞培養(yǎng)構(gòu)建體)，該插入件由非降解性的聚合物材料制成，所述細胞培養(yǎng)插入件具有三維多孔結(jié)構(gòu)，并且其僅由單個多孔片層構(gòu)成或由多個多孔片層結(jié)構(gòu)組裝而成。優(yōu)選地，本發(fā)明所述細胞培養(yǎng)插入件做成適合細胞培養(yǎng)平板孔、箱、燒瓶和/或生物反應(yīng)器的尺寸。優(yōu)選地，所述細胞培養(yǎng)插入件由恒定或不同直徑的聚合物支柱和/或纖維組成。優(yōu)選地，所述細胞培養(yǎng)插入件的孔隙率可以通過改變所述插入件(構(gòu)建體)中的支柱和/或纖維的數(shù)量和尺寸而改變。所述多孔結(jié)構(gòu)優(yōu)選可通過改變支柱和/或纖維的三維定位圖案而改變。優(yōu)選地，所述支柱和/或纖維具有圓形、三角形、正方形和/或矩形的橫'所述非降解性的聚合物材料優(yōu)選為聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯和/或聚酰胺，更優(yōu)選為聚苯乙烯。所述細胞培養(yǎng)插入件通過表面改性技術(shù)處理，從而改善所述細胞插入件的細胞貼附作用。優(yōu)選地，所述表面改性技術(shù)是物理化學(xué)方式，例如等離子體處理、輝光》文電處理，和/或化學(xué)方式，例如^f吏用H2S04、HNOs等強酸處理。優(yōu)選地，所述的表面改性技術(shù)是一種表面涂覆技術(shù)，通過施加一種不同于用于制備本發(fā)明所述構(gòu)建體的聚合物的涂層物質(zhì)。優(yōu)選地，所述涂層物質(zhì)是天然存在的聚合物，例如蛋白、肽、糖胺聚糖、膠原、粘連蛋白；和/或合成聚合物，例如聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚賴氨酸；和/或無機物質(zhì)，例如，磷酸鉤、Ti02、Si02、A1203;和/或兩種或多種有機材料組成的復(fù)合涂層，例如，凝膠和脫乙酰殼多糖，聚丙烯酸和聚乙二醇，聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮；和/或一種無機/有機的復(fù)合物，例如，磷酸鈣/膠原復(fù)合物、鈣磷酸/聚乙二醇復(fù)合物、磷酸鈣/胞外基質(zhì)。優(yōu)選地，所述的表面涂層物質(zhì)是以化學(xué)方式例如共價鍵、氬鍵、離子鍵或范德華力結(jié)合到所述細胞培養(yǎng)插入件的支柱和/或纖維上。另一方面，本發(fā)明提供一種制造所述的細胞培養(yǎng)插入件的方法，所述方法包括(A)使用常規(guī)的聚合物加工方法，例如注塑、纖維織造和粘合技術(shù)制造所述插入件的單個片層，和(B)根據(jù)結(jié)構(gòu)設(shè)計，將步驟(A)所述的多個多孔片層結(jié)構(gòu)切割或不經(jīng)切割后，組裝成所述的細胞培養(yǎng)插入件。在本發(fā)明制造所述的細胞培養(yǎng)插入件的方法中，所述組裝優(yōu)選使用非細胞毒性的聚合物纖維或夾子等連接件。優(yōu)選地，本發(fā)明所述方法還包括(C)表面處理所述組裝后的細胞培養(yǎng)插入件，所述表面處理是例如等離子體處理和表面涂覆等；和(D)包裝并利用輻射滅菌進行滅菌。本發(fā)明所述表面涂覆處理優(yōu)選是將所述涂層物質(zhì)化學(xué)交聯(lián)、加熱交聯(lián)、真空加熱交聯(lián)和/或輻射交聯(lián)到所述細胞插入件上。優(yōu)選地，所述交聯(lián)是化學(xué)進行的。優(yōu)選地，所述交聯(lián)是使用加熱進行的。優(yōu)選地，所述交聯(lián)是使用真空加熱進行的。優(yōu)選地，所述交聯(lián)是使用輻射進行的。進一步優(yōu)選地，所述輻射是電子束(e-beam)輻射、y輻射和/或紫外線輻射。本發(fā)明所述涂層優(yōu)選是交聯(lián)的。進一步優(yōu)選地，所述交聯(lián)是使用輻射進行的，所述輻射優(yōu)選是電子束輻射、Y輻射和/或紫外線輻射。進一步優(yōu)選地，所述交聯(lián)是化學(xué)進行的。進一步優(yōu)選地，所述交聯(lián)是使用加熱和真空進行的。另一方面，本發(fā)明提供一種制造所述的細胞培養(yǎng)插入件的設(shè)備，所述設(shè)備包括(A)注塑、纖維織造和/或粘合制造聚合物單個片層的機構(gòu)；(B)引導(dǎo)和定向機構(gòu)，為具有適宜橫截面形狀的管狀物，優(yōu)選為矩形、圓形，帶有可調(diào)整旋轉(zhuǎn)角度的旋轉(zhuǎn)動力器件，使得各個片層結(jié)構(gòu)能夠按照預(yù)先確定的相對位置疊放和/或按照確定的方式排列。優(yōu)選地，本發(fā)明所述設(shè)備還包括(C)切割機構(gòu)，優(yōu)選為沖模切割機或激光束切割機；(D)組裝機構(gòu)，將所述疊放好的各個片層裝配在一起。另一方面，本發(fā)明提供一種成套用具，包括所述的細胞培養(yǎng)插入件以及其它細胞培養(yǎng)支持物，例如組織培養(yǎng)平板、培養(yǎng)箱(chamber)、燒瓶和/或生物反應(yīng)器。另一方面，本發(fā)明提供一種使用本發(fā)明所述的細胞培養(yǎng)插入件培養(yǎng)細胞的方法，所述方法包括(A)使用動態(tài)接種或靜態(tài)接種方法，將細胞接種于所述細胞培養(yǎng)插入件中；(B)接種細胞以后，將所述細胞培養(yǎng)插入件保持在浸沒于生長培養(yǎng)基之中的細胞培養(yǎng)支持物，例如組織培養(yǎng)平板、培養(yǎng)箱、燒瓶和/或生物反應(yīng)器中進行培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，本發(fā)明提供一種三維多孔的細胞培養(yǎng)構(gòu)建體(細胞培養(yǎng)插入件)，該構(gòu)建體由非降解性的聚合物支柱和/或纖維制成，用于使哺乳動物細胞貼附在細胞培養(yǎng)基上，由于所述聚合物支柱或纖維按照一種確定的三維圖案結(jié)合，所述多孔構(gòu)建體具有一種確定的多孔結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的三維多孔的構(gòu)建體由恒定直徑的聚合物支柱和/或纖維組成。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的三維多孔的構(gòu)建體由不同直徑的聚合物支柱和/或纖維組成。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的三維多孔的構(gòu)建體由支柱和/或纖維組成，所述支柱和/或纖維具有非圓形的橫截面，例如，但不限于，三角形、正方形、矩形等。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的三維多孔的構(gòu)建體的孔隙率可以通過改變所述構(gòu)建體中的支柱和/或纖維的數(shù)量和尺寸而改變。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的三維多孔的構(gòu)建體的多孔結(jié)構(gòu)可通過改變支柱和/或纖維的三維定位圖案而改變。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的三維多孔的構(gòu)建體通過表面改性:技術(shù)處理，從而改善所述構(gòu)建體中的支柱和/或纖維的細胞貼附作用。進一步優(yōu)選地，本發(fā)明所述表面改性技術(shù)是物理化學(xué)方式，例如等離子體處理、輝光放電等。進一步優(yōu)選地，本發(fā)明所述表面改性技術(shù)是化學(xué)方式，例如使用像1^04、冊03等強酸處理。進一步優(yōu)選地，本發(fā)明所述表面改性技術(shù)是一種表面涂覆技術(shù)，通過施加一種不同于用于制備本發(fā)明所述構(gòu)建體的聚合物的涂層物質(zhì)。進一步優(yōu)選地，本發(fā)明所述表面涂層物質(zhì)是蛋白、肽、或糖胺聚糖，或者其它天然存在的聚合物，例如月交原、粘連蛋白等。進一步優(yōu)選地，本發(fā)明所*面涂層物質(zhì)是合成聚合物，例如聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚賴氨酸等。進一步優(yōu)選地，本發(fā)明所述表面涂層物質(zhì)是以共價鍵結(jié)合到本發(fā)明所述構(gòu)建體的支柱和/或纖維的表面。進一步優(yōu)選地，本發(fā)明所述表面涂層物質(zhì)是通過氬鍵、離子鍵或范德華力結(jié)合到本發(fā)明所述構(gòu)建體的支柱和/或纖維。進一步優(yōu)選地，本發(fā)明所g面涂層物質(zhì)是無機物質(zhì)，例如，但不限于，磷酸釣、Ti02、Si02、A1A等。更進一步優(yōu)選地，本發(fā)明所述無機涂層物質(zhì)是化學(xué)地結(jié)合到本發(fā)明所述多孔構(gòu)建體的支柱和/或纖維。更進一步優(yōu)選地，本發(fā)明所述無機涂層物質(zhì)是通過氳鍵、離子鍵或范德華力結(jié)合到本發(fā)明所述多孔構(gòu)建體的支柱和/或纖維。進一步優(yōu)選地，本發(fā)明所述表面涂層物質(zhì)是兩種或多種有機材料組成的復(fù)合涂層，該復(fù)合涂層是例如，但不限于，凝膠和脫乙酰殼多糖，聚丙烯酸和聚乙二醇，聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮等。'進一步優(yōu)選地，本發(fā)明所述表面涂層物質(zhì)是一種無機/有機的復(fù)合物，例如，但不限于，磷酸鉀/膠原復(fù)合物、釣磷酸/聚乙二醇復(fù)合物、磷酸釣/胞外基質(zhì)。更進一步優(yōu)選地，本發(fā)明所述有機復(fù)合涂層是通過化學(xué)共價鍵結(jié)合到本發(fā)明所述多孔構(gòu)建體的支柱和/或纖維。更進一步優(yōu)選地，本發(fā)明所述有機復(fù)合涂層是通過非共價鍵，例如離子鍵、氬鍵或范德華力，或上述所有方式，結(jié)合到本發(fā)明所述多孔構(gòu)建體的支柱和/或纖維。更進一步優(yōu)選地，本發(fā)明所述無機/有機復(fù)合涂層是通過化學(xué)共價鍵結(jié)合到本發(fā)明所述多孔構(gòu)建體的支柱和/或纖維。更進一步優(yōu)選地，本發(fā)明所述無機/有機復(fù)合涂層是通過非共價鍵，例如離子鍵、氳鍵或范德華力，或上述所有方式，結(jié)合到本發(fā)明所述多孔構(gòu)建體的支柱和/或纖維。根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，本發(fā)明提供一種制造本發(fā)明所述的細胞培養(yǎng)插入件的方法，所述方法包括(A)使用常規(guī)的聚合物加工方法，例如注塑、纖維織造和粘合技術(shù)制造所述插入件的單獨層，(B)根據(jù)結(jié)構(gòu)設(shè)計，使用一種預(yù)制部件來組裝所述細胞培養(yǎng)插入件，(c)表面處理所述組裝后的細胞培養(yǎng)插入件，所述表面處理是例如等離子體處理和表面涂覆等，(D)包裝并利用輻射滅菌進^"滅菌。根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，本發(fā)明提供一種成套用具，包括本發(fā)明所述的三維細胞培養(yǎng)構(gòu)建體及其它細胞培養(yǎng)供應(yīng)物，例如組織培養(yǎng)平板。本發(fā)明所述細胞培養(yǎng)插入件優(yōu)選由一種非降解性的聚合物材料制成。該聚合物材料優(yōu)選聚苯乙烯，該材料目前用于制造二維多孔細胞/組織培養(yǎng)平板和燒瓶。通過所述插入件的設(shè)計來確定表面積、孔隙率和孔徑尺寸，包括支柱的尺寸和幾何結(jié)構(gòu)，每單位體積支柱/纖維的數(shù)目，以及該三維插入件結(jié)構(gòu)中支柱/纖維的構(gòu)建圖案。在一種實施方式中，本發(fā)明提供一種由支柱和/或結(jié)實的纖維在連接處相互垂直結(jié)合而組成的三維細胞培養(yǎng)插入件(圖l-3、5)。.在一種實施方式中，本發(fā)明提供一種由支柱和/或結(jié)實的纖維在連接處按角度結(jié)合在一起而組成的三維細胞培養(yǎng)插入件(圖2和4)。在一種實施方式中，本發(fā)明提供一種由支柱和/或纖維組成的三維細胞培養(yǎng)插入件。所述支柱和纖維按照一種預(yù)先設(shè)計的方式或圖案結(jié)合在一起。在一種具體的實施方式中，所述細胞培養(yǎng)插入件包括由非細胞毒性的和非降解性的聚合物制造的支柱和纖維。在一種更加具體的實施方式中，所述非降解性的聚合物是聚苯乙烯。在一種更加具體的實施方式中，所述細胞培養(yǎng)插入件通過等離子體或輝光放電技術(shù)進一步表面處理來修飾其表面性質(zhì)，從而獲得更好的細胞貼附效果。在一種具體的實施方式中，所述細胞培養(yǎng)插入件是一種三維圓盤狀的多孔結(jié)構(gòu)。在另一種具體的實施方式中，所述細胞培養(yǎng)插入件是一種三維立方形多孔結(jié)構(gòu)。.在一種具體的實施方式中，所述細胞培養(yǎng)插入件進一步用生物分子涂覆其表面，從而增強其細胞貼附性。所述生物分子是力交原(I、II、III、IV、VII型，等等)、纖連蛋白、層粘連蛋白，以及其它的胞外基質(zhì)。所述生物分子或者以共價鍵結(jié)合于所述細胞培養(yǎng)插入件表面，或者物理吸附于插入件表面。為了提高所述生物分子涂層的穩(wěn)定性，該涂層可以使用各種交聯(lián)技術(shù)如化學(xué)交聯(lián)、輻射或熱處理進行交聯(lián)。在一種具體的實施方式中，所述細胞培養(yǎng)插入件^使用一種天然聚合物如藻酸鹽、脫乙酰殼多糖來涂覆。所述天然聚合物或者以共價鍵結(jié)合于所述細胞培養(yǎng)插入件表面，或者物理吸附于插入件表面。為了提高所述天然聚合物涂層的穩(wěn)定性，該涂層可以使用各種交聯(lián)技術(shù)如化學(xué)交聯(lián)、輻射或熱處理等進行交聯(lián)。在一種具體的實施方式中，所述細胞培養(yǎng)插入件使用一種合成聚合物涂覆，該合成聚合物是例如，但不限于，聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮(polypyropirilidone)、聚(L-乳酸)等。所述合成聚合物或者以共價鍵結(jié)合于所述細胞培養(yǎng)插入件表面，或者物理吸附于插入件表面。為了提高所述合成聚合物涂層的穩(wěn)定性，該涂層可以使用各種交聯(lián)技術(shù)如化學(xué)交聯(lián)、輻射或熱處理等進行交聯(lián)。在一種具體的實施方式中，所述細胞培養(yǎng)插入件使用一種由兩種或多種有機材料組成的復(fù)合涂料涂覆，該涂料是例如但不限于，明膠和脫乙酰殼多糖，聚丙烯酸和聚乙二醇，聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮，等等。在一種具體的實施方式中，所述細胞培養(yǎng)插入件用一種無機材料涂覆，該無機材料是例如磷酸4丐、Ti02、A1A等。該無機涂層或者化學(xué)地鍵合到該細胞培養(yǎng)物插入件表面，或者物理吸附于插入件表面。在一種具體的實施方式中，所述細胞培養(yǎng)插入件用一種復(fù)合的無機材料涂覆，該復(fù)合無機材料是例如磷酸4弓和Ti02,磷酸釣和Al203等，該無機復(fù)合物涂層或者化學(xué)地鍵合到該細胞培養(yǎng)物插入件表面，或者物理吸附于插入件表面。在一種具體的實施方式中，所述細胞培養(yǎng)插入件用一種無機和有機材料組成的復(fù)合涂料涂覆，該復(fù)合涂料是例如，但不限于，磷酸鉤/膠原，磷酸鈣/明膠，磷酸鉀/聚乙二醇等。在一種具體的實施方式中，所述細胞培養(yǎng)插入件的涂層用一種或多種生物分子浸漬，該生物分子是例如治療劑，包括但不限于，抗生素、激素、生長因子、抗腫瘤劑、抗真菌劑、抗病毒劑、止痛藥、抗組胺藥、消炎藥、抗感染藥、創(chuàng)傷愈合劑、傷口密封劑、細胞引誘劑、細胞因子及其類似物。下面對于本發(fā)明的上述各技術(shù)方案進行進一步的詳細描述和說明。本發(fā)明提供一種三維多孔的培養(yǎng)物插入件，所述插入件由一種非降解性的聚合物材料制造，所述材料優(yōu)選為聚苯乙烯或其它聚合物，該材料已用于制造組織培養(yǎng)平板和燒瓶。所述細胞培養(yǎng)插入件由多層互相連接的支柱和/或結(jié)實的纖維組成，該支柱或纖維按照一種預(yù)先設(shè)計的方式或圖案而結(jié)合在一起。這種構(gòu)型允許所述細胞培養(yǎng)插入件具有iooy。的孔聯(lián)通性。除了所述細胞培養(yǎng)插入件之外，本發(fā)明還提供所述細胞培養(yǎng)插入件的制造方法，以及在一種細胞培養(yǎng)研究裝置中使用所述細胞培養(yǎng)插入件的方法。構(gòu)形本發(fā)明的細胞培養(yǎng)插入件可以形成用于實現(xiàn)具體的應(yīng)用目的的任何大小和形狀，所述應(yīng)用目的是例如，適合細胞/組織培養(yǎng)平板、燒瓶和生物反應(yīng)器的大小和形狀。在一種實施方式中，本發(fā)明提供一種由支柱和/或纖維組成的三維細胞培養(yǎng)插入件。所述支柱和纖維按照一種預(yù)先設(shè)計的方式或圖案結(jié)合在一起。通過所述插入件的設(shè)計來確定細胞培養(yǎng)插入件的表面積、孔隙率和孔徑尺寸，所述插入件的設(shè)計包括支柱的尺寸和幾何結(jié)構(gòu)，每單位體積內(nèi)支柱的數(shù)目，以及該三維插入結(jié)構(gòu)中支柱的結(jié)構(gòu)圖案。在一種實施方式中，本發(fā)明提供一種由支柱和/或結(jié)實的纖維在連接處相互垂直結(jié)合而組成的三維細胞培養(yǎng)插入件。在一種實施方式中，本發(fā)明提供一種由支柱和/或纖維組成的三維細胞培養(yǎng)插入件，在該插入件中，所述支柱和/或纖維在連接處并不都是彼此垂直的，而是以不同的角度結(jié)合。在一種具體的實施方式中，所述細胞培養(yǎng)插入件是一種三維的圓盤形多孔結(jié)構(gòu)。在另一種具體的實施方式中，所述細胞培養(yǎng)插入件是一種三維的立方體形多孔結(jié)構(gòu)。尺寸本發(fā)明所述的細胞培養(yǎng)插入件可以預(yù)先加工成標(biāo)準(zhǔn)尺寸，或者可以定估文成適合具體的細胞培養(yǎng)平板孔、箱、燒瓶、生物反應(yīng)器的尺寸。在一種實施方式中，本發(fā)明才是供一種具有一種尺寸(直徑和高度)的細胞培養(yǎng)插入件，其適合一種可商購的組織培養(yǎng)平板的圓形孔。在另一種實施方式中，本發(fā)明提供一種具有一種立方形尺寸(長x寬x高)的細胞培養(yǎng)插入件，其適合一種組織培養(yǎng)平板的矩形孔。在另一種實施方式中，該細胞培養(yǎng)插入件具有適合一種生物反應(yīng)器的腔室的尺寸和形狀。在一種具體實施方式中，該細胞培養(yǎng)插入件的尺寸適合一種組織培養(yǎng)燒瓶的立方空間。該三維細胞培養(yǎng)插入件的支柱/纖維的直徑可以為50nm-lmm。細胞培養(yǎng)插入件的平均孔徑可以為50nm-lmm。材料本發(fā)明的細胞培養(yǎng)插入件主要或?qū)ｉT地由一種非降解性的聚合物來制造。這種非降解性的聚合物包括，舉例來說，非降解性的合成聚合物，例如，但不限于，聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚酰胺等。細胞培養(yǎng)插入件的表面可以用本領(lǐng)域已知的表面改性技術(shù)進一步處理，例如，但不限于，通過等離子體或輝光放電技術(shù)進一步表面處理來改善其表面性質(zhì)，從而實現(xiàn)更好的細胞貼附效果。所述細胞培養(yǎng)插入件的表面可以進一步用生物分子表面涂覆，所述生物分子是，例如，但不限于，膠原(I、II、III、IV、V、VI型，等等)、纖連蛋白、層粘連蛋白或其它的胞外基質(zhì)分子。所述生物分子或者以共價鍵結(jié)合于所述細胞培養(yǎng)插入件表面，或者物理吸附于插入件表面。為了提高所述生物分子涂層的穩(wěn)定性，該涂層可以使用各種交聯(lián)技術(shù)如化學(xué)交聯(lián)、輻射或熱處理等進行交聯(lián)。所述細胞培養(yǎng)插入件的表面可以進一步地表面涂覆一種合成聚合物，該合成聚合物是例如，但不限于，聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinylpyropirilidone)、聚(L-乳酸)、聚賴氨酸等。所述合成聚合物或者以共價鍵結(jié)合于所述細胞培養(yǎng)插入件表面，或者物理吸附于插入件表面。為了提高所述合成聚合物涂層的穩(wěn)定性，該涂層可以使用各種交聯(lián)技術(shù)如化學(xué)交聯(lián)、輻射或熱處理等進行交聯(lián)。在一種具體的實施方式中，所述細胞培養(yǎng)插入件用一種由兩種或多種有機材料組成的復(fù)合涂料涂覆，該涂料是例如但不限于，明膠和脫乙酰殼多糖，聚丙烯酸和聚乙二醇，聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮，等等。在一種具體的實施方式中，所述細胞培養(yǎng)插入件用一種無機材料涂覆，該無機材料是例如磷酸釣、Ti02、A1A等。該無機涂層或者化學(xué)地鍵合到該細胞培養(yǎng)物插入件表面，或者物理吸附于插入件表面。在一種具體的實施方式中，所述細胞培養(yǎng)插入件用一種復(fù)合的無機材料涂覆，該復(fù)合無機材料是例如磷酸釣和Ti02，磷酸鉀和A1A等。該無機復(fù)合物涂層或者化學(xué)地4建合到該細胞培養(yǎng)物插入件表面，或者物理吸附于插入件表面。在一種具體的實施方式中，所述細胞培養(yǎng)插入件用一種無機和有機材料組成的復(fù)合涂料涂覆，該復(fù)合涂料是例如，但不限于，磷酸鈣/膠原、磷酸鈣/凝膠、磷酸鈣/聚乙二醇，等等。該復(fù)合物涂層或者化學(xué)地鍵合到該細胞培養(yǎng)物插入件表面，或者物理吸附于插入件表面。在一種具體的實施方式中，所述細胞培養(yǎng)插入件的涂層用一種或多種生物分子浸漬，該生物分子是例如治療劑，包括但不限于，抗生素、激素、生長因子、抗肺瘤劑、抗真菌劑、抗病毒劑、止痛藥、抗組胺藥、消炎藥、抗感染藥、創(chuàng)傷愈合劑、傷口密封劑、細胞引誘劑、細胞因子和類似物。制造細胞培養(yǎng)插入件的方法該細胞培養(yǎng)插入件必需是便宜的，從而其制造方法必需是非常經(jīng)濟合算并且適合于批量生產(chǎn)。該方法是一種我們稱為支架組裝技術(shù)的方法。一個示范性的制造本發(fā)明細胞培養(yǎng)插入件的方法包括下列步驟。步驟I、根據(jù)其結(jié)構(gòu)設(shè)計，支架的每一層通過一種適宜的聚合物加工技術(shù)預(yù)先加工成預(yù)制件。所述聚合物加工技術(shù)可以是，但不限于，注塑法以及纖維織造和粘合，上述聚合物加工技術(shù)為制造聚合物部件和聚合物篩網(wǎng)的最有效與經(jīng)濟的方式。步驟II、然后，通過將支架的若干層的預(yù)制件相互疊放于彼此之上，將支架的各層組裝到一起。支架的每一層可以具有不同的結(jié)構(gòu)，并且可以在尺寸上比最終的產(chǎn)品更大。在其尺寸比最終產(chǎn)品更大的情況下，通過^f吏用例如沖模切割機的機械裝置(mechanicaldevice)，或激光束進行切割，最終的產(chǎn)品可以從組裝的更大尺寸的構(gòu)建體纟皮切割成合適的尺寸和形狀。一種或多種最終的細胞培養(yǎng)插入件可以由單獨組裝而成的更大構(gòu)建體切割而得到。在支架的每一層以正確的尺寸預(yù)先加工的情況下，該細胞培養(yǎng)構(gòu)建體可以在一種機械裝置的輔助下組裝在一起，所述機械裝置在裝配過程中起著引導(dǎo)和定向各層預(yù)制件的作用。例如，在制造一種推間盤細胞培養(yǎng)插入件時，該機械裝置是一種具有適當(dāng)直徑的中空管狀物，其可容納若干預(yù)先加工的圓形支架部件。該管狀導(dǎo)向裝置也可具有一種機械結(jié)構(gòu)，其將預(yù)先加工的部件按照確定的方式排列，從而在組裝后得到預(yù)先確定的構(gòu)造。在一種機械組裝裝置的幫助下，將支架各部件在適當(dāng)?shù)奈恢蒙辖M裝，然后將所述各部件用非細胞毒性的聚合物纖維或夾子等連接固定在一起，該聚合物纖維或夾子等優(yōu)選是用與細胞培養(yǎng)插入件相同類型的材料制造的。在制造一種正方形或矩形截面的細胞培養(yǎng)插入件時也可^f吏用一種^L械組裝導(dǎo)向裝置，該裝置具有一種正方形或矩形的橫截面，相同的組裝方法可以用來組裝立方形的細胞培養(yǎng)插入件。所述組裝導(dǎo)向裝置也可以是預(yù)先對準(zhǔn)的聚合物纖維。這些預(yù)先對準(zhǔn)的纖維將穿過預(yù)制的支架部件的一些洞或孔，并且最后^1奪這些部件連接在一起，從而在組裝以后獲得預(yù)先確定的構(gòu)型。所述部件經(jīng)組裝后也可使用塑料超聲焊接或熔融焊接的方式連接固定在一起。通過將若干預(yù)制的具有若干不同結(jié)構(gòu)設(shè)計的部件組裝在一起，該支架組裝技術(shù)還提供組裝一種不均勻結(jié)構(gòu)的細胞培養(yǎng)物插入件的可能性。還可以通過改變一個部件相對于其它部件的相對位置，例如^走轉(zhuǎn)一些部件到確定的角度，從而改變該細胞培養(yǎng)插入件的結(jié)構(gòu)。使用上述組裝技術(shù)制造的細胞培養(yǎng)插入件的好處在于，通過筒單去除將單獨層部件固定在一起的組裝夾或組裝纖維，該插入件可以在用于細胞培養(yǎng)后被容易地拆開。該拆開的部件可以容易地通過常》見顯微技術(shù)來評價，所述常規(guī)顯微技術(shù)例如是光學(xué)顯微鏡法、掃描電子顯孩t鏡法等。該組裝的細胞培養(yǎng)插入件可以通過各種表面改性技術(shù)進行進一步的表面處理，所述的表面改性技術(shù)是例如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的等離子體和輝光放電技術(shù)。該細胞培養(yǎng)插入件還可以用無機、有機和無機/有機材料通過浸涂、化學(xué)接枝和/或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它技術(shù)涂覆。最后，可以對所述最后表面處理過的細胞培養(yǎng)插入件進行包裝和滅菌。成套用具(kit)本發(fā)明進一步包括提供在一個包裝容器內(nèi)具有一個或多個所述細胞培養(yǎng)插入件和組織培養(yǎng)平板的成套用具。本發(fā)明的成套用具包括一個或多個細胞培養(yǎng)插入件，并且可以包括其它組件，例如一種用于將所述細胞培養(yǎng)插入件從所述組織培養(yǎng)平^反取出和插入的機械裝置、無菌包裝泡沫或其他一次性材料，及其類似物。本發(fā)明的成套用具可以包括單獨的細胞培養(yǎng)插入件，無菌包裝，并且能開包即用。在一種實施方式中，本發(fā)明的成套用具可以包括兩個或多個相同尺寸的細胞培養(yǎng)插入件。在另一種實施方式中，本發(fā)明的成套用具可以包括兩個或多個不同尺寸的細胞培養(yǎng)插入件。本發(fā)明的成套用具可以包括一個細胞培養(yǎng)插入件或多個細胞培養(yǎng)插入件，其插入在一個或多個細胞/組織培養(yǎng)平板的孔中，以及無菌包裝，并且能開包即用。使用所述細胞培養(yǎng)插入件培養(yǎng)細胞與聚笨乙錄組織培養(yǎng)平板一起使用本發(fā)明還提供使用所述細胞培養(yǎng)插入件在一種聚苯乙烯組織培養(yǎng)平板內(nèi)培養(yǎng)活細胞的方法。該細胞培養(yǎng)插入件可以是一種圓盤或立方體的形狀，以適合組織培養(yǎng)平板的孔?？梢允褂脛討B(tài)接種或靜態(tài)接種方法，將細胞接種于所述細胞培養(yǎng)插入件中。在一個實施例中，使用靜態(tài)接種方法，將一定體積的細胞懸浮液用吸量管從所述細胞培養(yǎng)插入件的上表面加入，并讓細胞有一定的時間貼附到其上，然后再用培養(yǎng)液灌洗。接種細胞以后，將所述細胞培養(yǎng)插入件放入含有細胞培養(yǎng)液的孔板中，在37。C下，相對濕度9(W、二氧化;灰含量5-10°/。的氣氛中于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在另一個實施例中，使用動態(tài)接種方法，所述接種是通過在一種旋轉(zhuǎn)燒瓶中，將所述細胞培養(yǎng)插入件浸入細胞懸浮液中來進行的。在接種后，將細胞培養(yǎng)插入件放置到帶有培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)平板的孔內(nèi)，在37。C下、5°/。二氧化碳的培養(yǎng)箱內(nèi)進行進一步的培養(yǎng)。定期替換細胞培養(yǎng)基。當(dāng)在某一確定的時間點完成細胞培養(yǎng)以后，將所述細胞培養(yǎng)插入件從該細胞培養(yǎng)平板中取出，并進行常規(guī)的試驗。將細胞培養(yǎng)插入件拆開，以便在顯微鏡下觀察在所述細胞培養(yǎng)插入件的不同層或者不同位置上的細胞貼附和細力包活性。在所述細胞需要回收的情形下，使用胰蛋白酶-EDTA溶液對所述細胞進行胰酶消化。當(dāng)細胞從所述細胞培養(yǎng)插入件上分離后，將細胞再次懸浮在小體積的新鮮的包含血清的培養(yǎng)基中，從而使胰蛋白酶失活。然后可以將這些細胞清洗回收后用于其它目的。與生物反應(yīng)器一起^吏用本發(fā)明還提供使用所述細胞培養(yǎng)插入件在生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)活細胞的方法。該細胞培養(yǎng)插入件可以是一種圓盤形或立方形，其尺寸和形狀適合放置于所述生物反應(yīng)器。在使用靜態(tài)接種方法的一個實施例中，將一定體積的細胞懸浮液用吸量管從所述細胞培養(yǎng)插入件的上表面加入，并且在用培養(yǎng)基灌洗前允許細胞貼附一定的時間。在使用靜態(tài)接種方法接種以后，將這些接種了細胞的細胞培養(yǎng)物插入件放入充滿細胞培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中，在37。C下、90%濕度、5-10%二氧化碳的氣氛中培養(yǎng)。在整個細胞培養(yǎng)過程中，細胞培養(yǎng)液持續(xù)地流通過細胞培養(yǎng)插入件的孔洞，并被定期更換。當(dāng)在某一確定的時間點完成細胞培養(yǎng)以后，將所述細月包培養(yǎng)插入件從該生物反應(yīng)器中取出，并進行常規(guī)的試驗。將細胞培養(yǎng)插入件拆開，以便在顯微鏡下觀察在所述細胞插入件的不同層或者不同位置上的細胞貼附和細胞活性。在所述細胞需要回收的情形下，使用胰蛋白酶-EDTA溶液對所述細胞進行胰酶消化。當(dāng)細胞從所述細胞培養(yǎng)插入件上分離后，將細胞再次懸浮在小體積的新鮮的包含血清的培養(yǎng)基中，從而使胰蛋白酶失活。然后可以將這些細胞清洗回收后用于其它目的。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)插入件具有以下優(yōu)點所述細胞培養(yǎng)插入件具有良好明確的結(jié)構(gòu)，包括孔隙率、孔徑尺寸、表面積和表面化學(xué)性質(zhì)。所述細胞培養(yǎng)插入件能夠方便地與常規(guī)二維細胞培養(yǎng)容器配合使用，共同形成一種能l是供目前的二維細胞培養(yǎng)體系的全部侵_捷之處的三維培養(yǎng)體系，對于醫(yī)藥、生命科學(xué)以及生物工程研究領(lǐng)域極具價值。具體地，該理想的三維培養(yǎng)體系具有以下特征1.其具有一種多孔的三維結(jié)構(gòu)，從而所述細胞可以同時貼附于該三維結(jié)構(gòu)的外表面和內(nèi)表面。該100%聯(lián)通的多孔的結(jié)構(gòu)能夠允許營養(yǎng)物和代謝產(chǎn)物容易地進行交換。2.該多孔的三維結(jié)構(gòu)易于與目前的二維細胞培養(yǎng)容器一起使用。它可以很方便地以一種二維細胞培養(yǎng)平板孔內(nèi)放置三維^入件的方式使用。3.該多孔的結(jié)構(gòu)足夠結(jié)實從而能承受細胞培養(yǎng)過程中正常的機械操作，并且在細胞培養(yǎng)期間該多孔的結(jié)構(gòu)不發(fā)生變形和改變。以下，結(jié)合附圖來進一步詳細地說明本發(fā)明的具體實施方式，其中圖l表示本發(fā)明細胞培養(yǎng)插入件的一種實施方式，其包括結(jié)合并組裝在一起的多層排列的聚合物纖維。圖2表示所述細胞培養(yǎng)插入件的一種實施方式的橫截面，顯示所述纖維的取向和所述纖維結(jié)合在一起的方式。圖3表示制造圖1實施方式的預(yù)制層組裝方式。圖4表示細胞培養(yǎng)插入件的另一種實施方式，其包括結(jié)合并組裝在一起的多層排列的聚合物纖維。圖5表示制造不同構(gòu)型的三維細胞培養(yǎng)插入件的預(yù)制層組裝方式。圖6表示制造不同構(gòu)型的三維細胞培養(yǎng)插入件的預(yù)制層組裝方式。圖7表示用于組裝預(yù)制層并確保其在所述三維細胞培養(yǎng)插入件的適當(dāng)位置的纖維連接件(Fiberclap)。圖8表示制造所述的三維細胞培養(yǎng)插入件的引導(dǎo)和定向機構(gòu)。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。但這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，對于下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。實施例i:細胞培養(yǎng)插入件的制造方法使用聚苯乙烯材料制造細胞培養(yǎng)插入件。將圖5所示的細胞培養(yǎng)插入件的各部件，用于組裝在細胞培養(yǎng)插入件中。根據(jù)設(shè)計將這些部件注射成型。在這些部件制得后，首先將第一層放置到組裝導(dǎo)向裝置中，然后依次在導(dǎo)向裝置中放入第二、第三和第四層部件。這樣，各部件的總數(shù)為4。然后使用一種如圖7所示的聚苯乙烯纖維連接件，將這4個部件連接在一起。通過兩端成結(jié)或者兩端變形，將該連接件的兩端進一步固定，從而所述兩端不會從插入件的洞孔中跑出。組裝后，使用一種PolaronPT7300RF等離子體桶狀刻蝕器(QuorumTechnology,EastSussex,UK)，在氬氣氣氛中將所述細胞培養(yǎng)插入件進行等離子體處理。其射頻功率、壓力和處理時間分別固定為296瓦特、lxl0"毫巴和5分鐘。分別地包裝該等離子體處理過的細胞培養(yǎng)插入件，并且最終用2OKGy劑量的Y射線輻射進行滅菌。實施例2:使用細胞培養(yǎng)插入件來培養(yǎng)細胞本發(fā)明還提供在組織培養(yǎng)聚苯乙烯平板中使用該細胞培養(yǎng)插入件培養(yǎng)活細胞的方法。用于該研究的細胞培養(yǎng)插入件具有10ram寬xl0mm長x0.3mm厚的尺寸，具有200jum的正方形孔和400/am的纖維直徑。使用靜態(tài)接種方法接種平滑肌細胞用移液管將500jil平滑肌細胞懸浮液(^105個細胞/毫升)從所述插入件的上表面加入，使細胞在37。C下貼附2小時后再灌入更多細胞培養(yǎng)基。接種了細胞后，將所述細胞培養(yǎng)插入件放入含有細胞培養(yǎng)基的多孔平板中，并且在37。C下，于一種90°/。濕度的含5-10%C02的空氣氣氛內(nèi)于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。所述生長培養(yǎng)基由包含5%(v/v)胎牛血清的Dulbecco氏改進的Eagle's培養(yǎng)基(Dulbecco，sModifiedEagle'sMedium,DMEM)組成。在使用動態(tài)接種方法的情形下，接種是通過將所述細胞培養(yǎng)插入件浸沒于裝在旋轉(zhuǎn)燒瓶內(nèi)的細胞懸浮液中，于60rpm下攪拌進行的，并且將該旋轉(zhuǎn)燒瓶在37T:下放在濕潤的5。/。C02培養(yǎng)箱中。接種以后，將所述細胞培養(yǎng)插入件;故置到帶有細胞培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)平板的孔中，于37匸下濕潤的5。/。C02培養(yǎng)箱中進一步培養(yǎng)。并定期更換培養(yǎng)基。當(dāng)于某一確定的時間點完成細胞培養(yǎng)后，將所述細胞培養(yǎng)插入件從細胞培養(yǎng)平板中取出，并進行常規(guī)的分析。將所述細胞培養(yǎng)插入件拆開，從而在顯微鏡下觀察在所述細胞培養(yǎng)插入件的不同層或位置上的細胞貼附和細胞活性。在所述細胞需要回收的情形下，使用胰蛋白酶-EDTA溶液(SigmaT4049)對所述細胞進行胰酶消化。當(dāng)細胞從所述細胞培養(yǎng)插入件上脫離后，將細胞再次懸浮在小體積的新鮮的包含血清的培養(yǎng)基中，從而使胰蛋白酶失活。然后可以將這些細JJ包用于其它目的。實施例3:使用細胞培養(yǎng)插入件在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細胞本發(fā)明還提供一種使用所述細胞培養(yǎng)插入件在生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)活細胞的方法。這里使用的細胞培養(yǎng)插入件是圓盤狀的(IO咖直徑的圓盤，厚度為0.8mm、孔隙率80%,并且纖維直徑為200jam)，且適合所述的生物反應(yīng)器。首先將大鼠骨骨逸基質(zhì)細胞(MSCs)靜態(tài)地"t妄種于所述細胞培養(yǎng)物插入件上。將含有250，000只大鼠的MSC的500juL的MSC懸浮液用吸量管從所述細胞培養(yǎng)插入件的上表面加入，使細胞于37。C下貼附2小時，然后再用細胞培養(yǎng)基沖灌。接種細胞以后，將這些接種了的細胞培養(yǎng)物插入件保持在流量灌注細胞培養(yǎng)器中。將這些接種了細胞的細胞培養(yǎng)物插入件浸沒在一種完全的骨分化培養(yǎng)基中，并且于37。C下、90%濕度的、含有5-10%二氧化碳的空氣氣氛中培養(yǎng)。該生物反應(yīng)器體系的流體流動操作是通過一種設(shè)定速度為lml/分鐘的蠕動泵來實現(xiàn)的。在培養(yǎng)期間，所述培養(yǎng)基液流通過插入件的孔從而穿過所述細胞培養(yǎng)插入件。因此，所述細胞是在動態(tài)剪切條件下培養(yǎng)的。所述細胞在該生物反應(yīng)器中培養(yǎng)4、8和16天，每48小時進行一次完全的培養(yǎng)基更換。說明書第21/21頁在培養(yǎng)期間結(jié)束時，將所有的細胞培養(yǎng)插入構(gòu)建體用PBS沖洗，并在-20°C下貯存于l.5ml的蒸餾的去離子水中，直到進行進一步的分析。在進行進一步的分析時，將所述細胞培養(yǎng)插入件拆開，從而在顯微鏡下觀察在所述細胞培養(yǎng)插入件的不同層或位置上的細胞貼附形態(tài)和細胞活性。權(quán)利要求1.一種三維細胞培養(yǎng)插入件，其特征在于，所述細胞培養(yǎng)插入件由非降解性的無細胞毒性的聚合物材料制成，該插入件具有確定的和規(guī)則的三維多孔結(jié)構(gòu)，并且其由單個多孔片層構(gòu)件構(gòu)成或由多個多孔片層構(gòu)件固定在一起而成，優(yōu)選地，所述三維細胞培養(yǎng)插入件做成適合細胞培養(yǎng)平板孔、培養(yǎng)室、培養(yǎng)瓶和/或生物反應(yīng)器的尺寸。2.權(quán)利要求1所述的三維細胞培養(yǎng)插入件，其特征在于，所述三維細胞培養(yǎng)插入件由恒定或不同直徑的聚合物支柱和/或纖維組成；優(yōu)選地，所述細胞培養(yǎng)插入件的孔隙率可以通過改變所述插入件中的支柱和/或纖維的數(shù)量和尺寸而改變；和/或優(yōu)選地，多孔結(jié)構(gòu)可通過改變支柱和/或纖維的三維定位圖案而改變。3.權(quán)利要求2所述的三維細胞培養(yǎng)插入件，其特征在于，所述支柱和/或纖維具有圓形、三角形、正方形和/或矩形的橫截面。4.權(quán)利要求1-3任一項所述的三維細胞培養(yǎng)插入件，其特征在于，所述非降解性的聚合物材料為聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯和/或聚酰胺，優(yōu)選為聚苯乙烯；和/或所述細胞培養(yǎng)插入件通it^面改性:忮術(shù)處理，從而改善所述細胞插入件的細胞貼附作用，優(yōu)選地，所述表面改性才支術(shù)是物理化學(xué)方式，例如等離子體處理、輝光放電處理，和/或化學(xué)方式，例如使用H2S04、HNO;等強酸處理。5.權(quán)利要求4所述的三維細胞培養(yǎng)插入件，其特征在于，所述的表面改性技術(shù)是一種表面涂覆技術(shù)，通過施加一種不同于用于制備權(quán)利要求l所述構(gòu)建體的聚合物的涂層物質(zhì)，優(yōu)選地，所述涂層物質(zhì)是天然存在的聚合物，例如，蛋白、肽、糖胺聚糖、膠原、粘連蛋白；和/或合成聚合物，例如，聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚賴氨酸；和/或無才幾物質(zhì)，例如，磷酸4丐、Ti02、Si02、A1203;和/或兩種或多種有機材料組成的復(fù)合涂層，例如，凝膠和脫乙酰殼多糖，聚丙烯酸和聚乙二醇，聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮；和/或一種無機/有機的復(fù)合物，例如，磷酸釣/膠原復(fù)合物、鈞磷酸/聚乙二醇復(fù)合物、磷酸釣/胞外基質(zhì)。6.權(quán)利要求5所述的三維細胞培養(yǎng)插入件，其特征在于，所述的表面涂層物質(zhì)是以化學(xué)方式例如共價鍵、氫鍵、離子鍵或范德華力結(jié)合到所述細胞培養(yǎng)插入件的支柱和/或纖維上。7.—種制造權(quán)利要求l-6任一項所述的三維細胞培養(yǎng)插入件的方法，所述方法包括(A)使用常規(guī)的聚合物加工方法，例如注塑、纖維織造和粘合技術(shù)制造所述插入件的單獨層；(B)根據(jù)結(jié)構(gòu)設(shè)計，將步驟(A)所述的多個多孔片層結(jié)構(gòu)切割或不經(jīng)切割后，組裝成所述的細胞培養(yǎng)插入件，優(yōu)選地，所述組裝使用非細胞毒性的聚合物纖維或夾子等連接件。8.權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法還包括(C)表面處理所述組裝后的細胞培養(yǎng)插入件，所述表面處理是例如等離子體處理和表面涂覆等，優(yōu)選地，所述表面涂覆處理是將所述涂層物質(zhì)化學(xué)交聯(lián)、加熱、真空交聯(lián)和/或輻射交聯(lián)到所述細胞插入件上，進一步優(yōu)選地，所述輻射是電子束輻射、Y輻射和/或紫外線輻射；和/或(D)包裝并利用輻射滅菌進行滅菌。9.一種制造權(quán)利要求l-6任一項所述的三維細胞培養(yǎng)插入件的設(shè)備，其特征在于，所述設(shè)備包括(A)注塑、纖維織造和/或粘合制造聚合物單個多孔片層構(gòu)件的機構(gòu)；當(dāng)所述三維細胞培養(yǎng)插入件由多個多孔片層構(gòu)件構(gòu)成時，所述設(shè)備還包括(B)引導(dǎo)和定向機構(gòu)，為具有適宜橫截面形狀的管狀物，優(yōu)選為矩形、圓形，帶有可調(diào)整旋轉(zhuǎn)角度的導(dǎo)向定位機構(gòu)，使得各個多孔片層構(gòu)件能夠按照預(yù)先確定的相對位置疊放和/或按照確定的方式排列。10.權(quán)利要求9所述的設(shè)備，其特征在于，所述設(shè)備還包括(C)切割機構(gòu)，優(yōu)選為沖模切割機或激光束切割機，在將所述的多孔片層構(gòu)件送入到所述引導(dǎo)和定向機構(gòu)之前切割成為適宜的尺寸；(D)組裝機構(gòu)，將所述疊放好的各個多孔片層構(gòu)件裝配在一起。11.一種成套用具，包括權(quán)利要求1-6任一項所述的三維細胞培養(yǎng)插入件及其它細胞培養(yǎng)支持物，例如組織培養(yǎng)平板、培養(yǎng)室、燒瓶和/或生物反應(yīng)器。12.使用權(quán)利要求1-6任一項所述的三維細胞培養(yǎng)插入件來培養(yǎng)細胞的用途。13.—種使用權(quán)利要求l-6任一項所述的三維細胞培養(yǎng)插入件培養(yǎng)細胞的方法，所述方法包括(A)使用動態(tài)接種或靜態(tài)接種方法，將細胞接種于所述細胞培養(yǎng)插入件中；(B)接種細胞以后，將所述細胞培養(yǎng)插入件保持在浸沒于生長培養(yǎng)基之中的細胞培養(yǎng)支持物，例如組織培養(yǎng)平板、培養(yǎng)室、培養(yǎng)l瓦和/或生物反應(yīng)器中進行培養(yǎng)。全文摘要本發(fā)明涉及一種三維多孔的細胞培養(yǎng)插入件，由非生物降解性的聚合物形成，用于活細胞的貼附、增殖和分化。該插入件由聚合物支柱和/或纖維組成，該支柱和/或纖維按照一種設(shè)計好的三維圖案結(jié)合在一起。該三維的細胞培養(yǎng)插入件將會在標(biāo)準(zhǔn)的細胞培養(yǎng)條件下，與細胞/組織培養(yǎng)平板、組織培養(yǎng)燒瓶、生物反應(yīng)器及其類似物一起使用。本發(fā)明進一步提供制造該三維細胞培養(yǎng)插入件的方法。最后，本發(fā)明提供包括一種或更多種的三維多孔細胞培養(yǎng)插入件與其它細胞培養(yǎng)支持物如組織培養(yǎng)平板和燒瓶，共同在一個包裝內(nèi)的成套用具。文檔編號C12M1/26GK101245313SQ20071030069公開日2008年8月20日申請日期2007年12月21日優(yōu)先權(quán)日2007年2月13日發(fā)明者青劉申請人:青劉