白頭翁素在制備治療骨性關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了白頭翁素在制備治療骨性關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用，將白頭翁素處理骨性關(guān)節(jié)炎小鼠后能夠抑制關(guān)節(jié)軟骨降解和抑制軟骨肥大化，并降低MMP13和Collagen X的表達(dá)量；本發(fā)明拓寬了白頭翁素的醫(yī)藥用途，為通過(guò)防治軟骨基質(zhì)降解和軟骨細(xì)胞異常肥大分化來(lái)治療骨性關(guān)節(jié)炎提供了新藥，可以從骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制上靶向治療疾病，對(duì)臨床治療骨性關(guān)節(jié)炎具有重要意義。
【專利說(shuō)明】白頭翁素在制備治療骨性關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及白頭翁素在制備治療骨性關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，0A)的治療主要為物理治療、藥物治療及手術(shù) 治療。其中手術(shù)治療（全關(guān)節(jié)置換）是晚期骨性關(guān)節(jié)炎患者的唯一有效治療手段，但手術(shù) 費(fèi)用昂貴，并發(fā)癥多，并且到此階段，患者已經(jīng)歷了較長(zhǎng)時(shí)間的疼痛及功能障礙，生活質(zhì)量 受到嚴(yán)重影響。所以篩選早期干預(yù)骨性關(guān)節(jié)炎的藥物靶點(diǎn)，進(jìn)而研發(fā)相應(yīng)治療措施是防治 骨性關(guān)節(jié)炎，改善患者生活質(zhì)量的重要策略。目前臨床治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物主要圍繞緩解 疼痛、抑制炎癥等方面，如口服留體類抗炎鎮(zhèn)痛藥、物理治療，對(duì)于持續(xù)性的疼痛則采取關(guān) 節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸（HA)、類固醇激素（CS)與富含血小板的血漿（PRP)等。但這些治療主 要是對(duì)癥，有效緩解癥狀時(shí)間較短，難以從根本上緩解OA病情的發(fā)展，今后重點(diǎn)發(fā)展方向 是基于OA的分子機(jī)制研發(fā)分子靶向藥物。目前已對(duì)多個(gè)潛在藥物靶點(diǎn)進(jìn)行研究，如IL-I 受體、前列腺素 E2合酶（PGES)、TNF-a、Bmp7等，但由于藥物靶點(diǎn)本身的有效性及安全性等 問(wèn)題，仍需要進(jìn)一步研究，離最終開(kāi)發(fā)出有效防治骨性關(guān)節(jié)炎藥物的目標(biāo)還很遠(yuǎn)。
[0003] 在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)代謝異常與軟骨細(xì)胞異常肥大分 化是兩個(gè)重要的致病因素。軟骨細(xì)胞外基質(zhì)主要是由II型膠原（Collagen II)與軟骨 聚集蛋白聚糖（Aggrecan，最為豐富的蛋白聚糖）組成。軟骨基質(zhì)的降解主要由胞外蛋白 水解酶完成。關(guān)節(jié)軟骨蛋白水解酶主要分為兩類，一類是降解蛋白聚糖的aggrecanases， 此家族中最重要的為Adamts4和Adamts5 ;而另一類是主要降解膠原纖維的MMPs (Matrix Metalloproteinase)，主要包括 MMP1、MMP3、MMP9 與 MMP13 等，其中以 MMP13 降解 II 型膠原 的能力最強(qiáng)。從上述骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生機(jī)制的介紹中可看出，阻斷軟骨基質(zhì)降解和防治軟骨細(xì) 胞異常肥大分化是防治骨關(guān)節(jié)炎的重要策略。
[0004] 白頭翁素（Anemonin)是從我國(guó)中草藥毛莨科植物中提取，有顯著的抗菌作用，對(duì) 葡萄球菌、鏈球菌、白喉?xiàng)U菌的抑菌濃度為1:12500,對(duì)結(jié)核桿菌為1:50000,對(duì)大腸桿菌也 有類似抑菌作用。并且對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)是先興奮后麻痹，臨床曾作治療痢疾及鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛藥 用。但是，未見(jiàn)白頭翁素對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎具有保護(hù)作用的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供白頭翁素在制備促進(jìn)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨修復(fù)的藥 物中的應(yīng)用。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0007] 白頭翁素在制備治療骨性關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。
[0008] 優(yōu)選的，白頭翁素在制備抑制關(guān)節(jié)軟骨降解和/或軟骨肥大化的藥物中的應(yīng)用。
[0009] 優(yōu)選的，白頭翁素在制備下調(diào)骨性關(guān)節(jié)炎MMP13和/或Collagen X表達(dá)量的藥物 中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明公開(kāi)了白頭翁素在制備治療骨性關(guān)節(jié)炎的藥物中 的應(yīng)用，利用白頭翁素特異性的阻斷軟骨基質(zhì)降解和防治軟骨細(xì)胞異常肥大分化，可以從 骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制上靶向治療疾病，為臨床治療骨性關(guān)節(jié)炎提供有效的藥物。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0012] 圖1為DMM模型小鼠膝關(guān)節(jié)組織切片藏紅固綠染色結(jié)果。
[0013] 圖2為免疫組化檢測(cè)DMM模型小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨MMP13表達(dá)情況。
[0014] 圖3為免疫組化檢測(cè)DMM模型小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Collagen X表達(dá)情況。
[0015] 圖4為檢測(cè)炎癥環(huán)境中的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞MMP-13表達(dá)量。
[0016] 圖5為檢測(cè)炎癥環(huán)境中的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Aggrecan表達(dá)量。

【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0018] 本發(fā)明實(shí)施例中使用的白頭翁素（Anemonin)購(gòu)于美國(guó)ChromaDex公司，化學(xué)名稱 為：7-Dioxadispiro [4. 0· 4. 2] dodeca-3, 9-diene_2, 8-dione，trans，分子式為 C10H2O4,分 子量為192. 16。
[0019] -、內(nèi)側(cè)半月板的不穩(wěn)定模型建立
[0020] 米用顯微外科手術(shù)實(shí)施內(nèi)側(cè)半月板的不穩(wěn)定（Destabilization of the medial meniscus，DMM)手術(shù)構(gòu)建小鼠膝關(guān)節(jié)炎模型。手術(shù)主要步驟如下：將小鼠固定、消毒后，用 顯微刀片切開(kāi)髕骨韌帶內(nèi)側(cè)，暴露關(guān)節(jié)腔，鈍性分離股骨髁間的脂肪墊，暴露髁間區(qū)域，用 顯微刀片挑斷內(nèi)側(cè)半月板脛骨韌帶，縫合組織與皮膚。術(shù)中注意避免損傷關(guān)節(jié)軟骨，術(shù)后不 固定手術(shù)肢體，籠內(nèi)自由活動(dòng)，腹腔注射青霉素預(yù)防感染。對(duì)照組小鼠不做處理。
[0021] 二、Anemonin 處理 DMM 模型小鼠
[0022] 構(gòu)建的DMM模型于手術(shù)后2周向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射Anemonin(AEN)，具體方法如下：先 把Anemonin溶液（濃度為5mg/mL)或者生理鹽水（對(duì)照）與纖維蛋白原溶液（3 μ g/ μ L) 混合后取10 μ L注射在關(guān)節(jié)腔中；接著注射1 μ L凝血酶（0.2unit)使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w 維蛋白，同時(shí)按照相同的方法向?qū)φ战M小鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射Anemonin。然后在手術(shù)后第8周 處死小鼠，取小鼠膝關(guān)節(jié)進(jìn)行組織切片，將組織切片采用藏紅固綠染色，并于顯微鏡下觀察 軟骨組織學(xué)特征，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，相比注射生理鹽水的對(duì)照組，DMM手術(shù)后注 射了 Anemonin的小鼠的關(guān)節(jié)軟骨破壞程度明顯降低，表明Anemonin化合物可以使DMM模 型小鼠的軟骨降解過(guò)程延遲。
[0023] 免疫組化（Immunohistochemistry，IHC)檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨 MMP13 和 Collagen X 表 達(dá)情況：取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠膝關(guān)節(jié)組織切片，用二甲苯脫蠟，梯度濃度的酒精復(fù)水，然 后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的H 2O2消除內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶的活性，胰酶孵育修復(fù)抗原，山羊血清封 閉，然后用兔MMP13多克隆抗體（I :100稀釋；ProteinTech公司）或兔Collagen X多克隆 抗體（I :150稀釋；Calbiochem Merck公司）孵育過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液洗凈切片，再用辣根 過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育，最后用二氨基聯(lián)苯胺顯色，甲基綠復(fù)染，觀察MMP13和肥大化 細(xì)胞標(biāo)志物Collagen X(ColX)在小鼠關(guān)節(jié)軟骨的表達(dá)情況，結(jié)果分別如圖2和圖3所示。 由圖2和圖3可知，DMM手術(shù)后小鼠關(guān)節(jié)軟骨的MMP13和Collagen X表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明在骨 性關(guān)節(jié)炎進(jìn)程中關(guān)節(jié)軟骨降解增加并發(fā)生過(guò)度軟骨肥大化，而DMM手術(shù)后注射Anemonin， MMP13和Collagen X的表達(dá)又下調(diào)，表明Anemonin對(duì)關(guān)節(jié)軟骨降解和軟骨肥大化具有抑制 作用。
[0024] 三、Anemonin處理對(duì)炎癥環(huán)境中的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞
[0025] 人類原代關(guān)節(jié)軟骨組織標(biāo)本取自關(guān)節(jié)置換手術(shù)后切除的正常的膝關(guān)節(jié)軟骨，將 其分離、消化、接種后培養(yǎng)至合適的細(xì)胞密度，得關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。將所得關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞先 用15yg/mLAnemonin處理30分鐘（對(duì)照不處理），再加入10ng/mL IL-Ιβ后處理24 小時(shí)（Anemonin仍然存在于培養(yǎng)基中，對(duì)照不處理），同時(shí)將所得關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞用等量的 Anemonin和IL-I β處理分別處理，接著采用Trizol法提取原代軟骨細(xì)胞總mRNA，反轉(zhuǎn)錄 成cDNA，最后熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)MMP-13和Aggrecan的表達(dá)，各樣本目的基因的表達(dá)強(qiáng) 度利用其對(duì)應(yīng)的內(nèi)參基因（GADPH)的量進(jìn)行校正。熒光實(shí)時(shí)定量PCR所使用的引物如下：
[0026] GADPH 基因上游引物：5, -catggagaaggctggggctc-3，（SEQ ID NO. 1);
[0027] GADPH 基因下游引物：5，-atgaggtccaccaccctgtt-3'（SEQ ID NO. 2);
[0028] MMP-13 基因上游引物：5，-cttcttcttgttgagctggactc-3，（SEQ ID NO. 3);
[0029] MMP-I3 基因下游引物：5，-ctgtggaggtcactgtagact-3，（SEQ ID NO. 4);
[0030] Aggrecan 基因上游引物：5, -tggagaggactgtgtggtga-3，（SEQ ID NO. δ);
[0031] Aggrecan 基因下游引物：5，-ttagatgcggttttgctgat-3'（SEQ ID NO. 6);
[0032] 熒光實(shí)時(shí)定量 PCR 的條件為：95°C 30s ;95°C 5s，57°C 20s，72°C 15s，共 40 個(gè)循環(huán)； 95°C 30s，57°C 30s，95°C 30s。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算MMP-13和Aggrecan表達(dá)量，結(jié)果分別如圖 4和圖5所示。結(jié)果顯示，在未用Anemonin處理的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中，經(jīng)IL-I β處理的細(xì)胞 比未經(jīng)IL-I β處理的細(xì)胞ΜΜΡ13表達(dá)上調(diào)，但Aggrecan的表達(dá)量顯著下調(diào)；提示經(jīng)IL-I β 處理的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞處于一個(gè)炎癥環(huán)境之中，從而模擬了骨關(guān)節(jié)炎的軟骨細(xì)胞環(huán)境。而在 用IL-I β處理的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中，經(jīng)Anemonin處理的細(xì)胞比未經(jīng)Anemonin處理的細(xì)胞 ΜΜΡ13表達(dá)明顯下調(diào)，以及能夠緩解Aggrecan降解。表明Anemonin在處于炎癥環(huán)境的關(guān)節(jié) 軟骨細(xì)胞中起阻滯關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基質(zhì)降解的作用。
[0033] 最后說(shuō)明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通 過(guò)上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在 形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1. 白頭翁素在制備治療骨性關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：白頭翁素在制備抑制關(guān)節(jié)軟骨降解和/ 或軟骨肥大化的藥物中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：白頭翁素在制備下調(diào)骨性關(guān)節(jié)炎MMP13 和/或Collagen X表達(dá)量的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P19/04GK104337804SQ201410583345
【公開(kāi)日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2014年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月24日
【發(fā)明者】陳林, 王祖強(qiáng), 謝楊麗, 黃俊蘭, 羅鳳濤, 周思儒, 徐偉, 孫先定 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院