一種牦牛胃溶菌酶的分離方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種牦牛胃溶菌酶的分離純化方法，包括如下步驟：(1)勻漿，得勻漿液(2)粗純，得粗純液；(3)CM-Sepharose FF柱層析，得層析液；(4)Sephadex G-75柱層析，得牦牛胃溶菌酶溶液；(5)凍干，即得牦牛胃溶菌酶。采用本發(fā)明方法可以從牦牛胃黏膜組織中分離得到純品牦牛皺胃溶菌酶，其酶活高，應(yīng)用范圍廣，還具有抑菌作用，可以作為抗菌藥物使用。同時，本發(fā)明方法得率高，操作簡便，具有工業(yè)應(yīng)用價值。
【專利說明】一種牦牛胃溶菌酶的分離方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種牦牛胃溶菌酶的分離方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 溶菌酶是一種堿性蛋白質(zhì)，其廣泛分布于動物、植物和微生物中，在哺乳動物的血 漿、氣管、腸道、胃、腎和肝等組織細胞中均有所表達。溶菌酶通過破壞肽聚糖中N-乙酰胞 壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1，4糖苷鍵，導(dǎo)致細胞壁結(jié)構(gòu)改變，從而使細菌溶解。溶 菌酶由于具有抗菌性，并且無毒、副作用，可作為潛在的抗生素替代品運用于食品、生物工 程、醫(yī)療和畜禽飼料等領(lǐng)域。從家畜疾病控制方面考慮，溶菌酶作為添加劑而使用于飼料 中，可有效防治家畜腹瀉，同時為其提供營養(yǎng)和腸道保護，從而減少家畜的腹瀉導(dǎo)致的死 亡，提高其出欄率。
[0003] 牦牛作為分布于高寒地區(qū)的反芻動物，是青藏高原地區(qū)最重要的家畜。由于其與 內(nèi)陸地區(qū)動物生存環(huán)境間的差異，造就了牦牛自身的遺傳特異性和對環(huán)境的獨特適應(yīng)性。 但迄今為止，未見關(guān)于分離純化牦牛胃溶菌酶的文獻報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種牦牛皺胃溶菌酶的分離純化方法。
[0005] 本發(fā)明一種牦牛胃溶菌酶的分離純化方法，包括如下步驟：
[0006] (1)勻漿：取牦牛皺胃粘膜組織，搗碎，加入粘膜組織2倍（v/w)的醋酸銨溶液，勻 漿，離心，分離上清液和沉淀，再在沉淀中再加入沉淀2倍重量（w/w)的醋酸銨溶液，離心， 合并上清液，即為勻漿液；其中，醋酸銨溶液的濃度為IOmM ;
[0007] (2)粗純：調(diào)節(jié)勻漿液的pH至4,離心，取上清液，在沸水浴中加熱2min，待溫度降 至室溫，再調(diào)PH至5,離心，得上清，即為粗純液；
[0008] (3) CM-Sepharose FF柱層析：米用濃度為IOmM的醋酸銨溶液平衡CM-Sepharose FF柱，取步驟（2)的粗純液上樣，用濃度為IOmM的醋酸銨洗脫雜蛋白，再用濃度為IOmM? 300mM的醋酸銨溶液線性梯度洗脫，根據(jù)洗脫圖譜，收集第二個峰對應(yīng)的溶液，即為層析 液；
[0009] (4) S印hadex G-75柱層析：采用濃度為0· 2% (v/v)醋酸溶液平衡S印hadex G-75 柱，取步驟（3)的層析液上樣，用濃度為0.2% (v/v)的醋酸溶液洗脫，根據(jù)洗脫圖譜，收集 最后一個峰對應(yīng)的溶液，即得牦牛胃溶菌酶溶液；
[0010] (5)凍干，即得牦牛胃溶菌酶。
[0011] 步驟（1)和步驟（2)中，所述離心采用的離心力為27000g，離心時間為15min。
[0012] 步驟（2)中，第一次調(diào)pH采用冰醋酸，第二次調(diào)pH采用氨水。
[0013] 步驟（3)中，洗脫的速率為lml/min。
[0014] 步驟（3)中，所述線性梯度洗脫時，洗脫液的總體積為20CV。
[0015] CV，表示柱體積。
[0016] 步驟⑷中，洗脫的速率為0· 2ml/min。
[0017] 步驟（4)中，先在層析柱上滴加 Iml濃度為0. 2%的醋酸溶液，再洗脫。
[0018] 本發(fā)明還提供了前述方法制備的牦牛胃溶菌酶，及其在制備飼料添加劑或抗菌藥 物中的用途。
[0019] 采用本發(fā)明方法可以從牦牛胃黏膜組織中分離得到純品牦牛皺胃溶菌酶，其酶活 高達29, 268U/mg，在較寬的pH范圍和離子強度范圍內(nèi)均有活性，有較好的熱穩(wěn)定性能，對 胃蛋白酶有抗性，應(yīng)用范圍廣，具有商業(yè)應(yīng)用價值，還具有抑菌作用，可以作為抗菌藥物使 用，還可以作為添加劑而用于飼料中，防治家畜腹瀉。同時，本發(fā)明方法得率高，操作簡便， 工業(yè)應(yīng)用前景良好。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1牦牛胃溶菌酶CM-S印harose FF離子交換層析；
[0021] 圖2牦牛胃溶菌酶S印hadex G-75凝膠過濾；
[0022] 圖3純化產(chǎn)物SDS-PAGE電泳圖；
[0023] 圖4純化產(chǎn)物抑菌效果；
[0024] 圖5pH對牦牛胃溶菌酶活性的影響；
[0025] 圖6離子強度對酶活性的影響；
[0026] 圖7離子強度和pH對酶活性的影響；
[0027] 圖8溫度對酶活性的影響；
[0028] 圖9牦牛胃溶菌酶活性隨時間的變化。
[0029]

【具體實施方式】 [0030]
[0031] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進一步的詳細說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi) 容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0032] 實驗材料和試劑：
[0033] 實驗材料
[0034] 麥洼牦牛皺胃
[0035] 試劑
[0036]

【權(quán)利要求】
1. 一種牦牛胃溶菌酶的分離純化方法，其特征在于：包括如下步驟： (1) 勻漿：取牦牛皺胃粘膜組織，搗碎，加入醋酸銨溶液，醋酸銨溶液的加入量為粘膜 組織的2倍（v/w)，勻漿，離心，分離上清液和沉淀，再在沉淀中再加入醋酸銨溶液，醋酸銨 溶液的加入量為沉淀量的2倍（v/w)，離心，合并上清液，即為勻漿液；其中，醋酸銨溶液的 濃度為l〇mM ; (2) 粗純：調(diào)節(jié)勻漿液的pH至4,離心，取上清液，在沸水浴中加熱2min，待溫度降至室 溫，再調(diào)pH至5,離心，得上清，即為粗純液； (3) CM_Sepharose FF柱層析：采用濃度為10mM的醋酸銨溶液平衡CM-Sepharose FF 柱，取步驟（2)的粗純液上樣，用濃度為10mM的醋酸銨洗脫雜蛋白，再用濃度為10mM? 300mM的醋酸銨溶液線性梯度洗脫，根據(jù)洗脫圖譜，收集第二個峰對應(yīng)的溶液，即為層析 液； (4) S印hadex G-75柱層析：采用濃度為0.2% (v/v)醋酸溶液平衡S印hadex G-75柱， 取步驟（3)的層析液上樣，用濃度為0. 2% (v/v)的醋酸溶液洗脫，根據(jù)洗脫圖譜，收集最后 一個峰對應(yīng)的溶液，即得牦牛胃溶菌酶溶液； (5) 凍干，即得牦牛胃溶菌酶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于：步驟（1)和步驟（2)中，離心采 用的離心力為27000g，離心時間為15min。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于：步驟（2)中，第一次調(diào)pH采用 冰醋酸，第二次調(diào)pH采用氨水。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于：步驟（3)中，洗脫的速率為lml/ min〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于：步驟（3)中，線性梯度洗脫時， 洗脫液的總體積為20CV。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于：步驟（4)中，洗脫的速率為 0? 2ml/min〇
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于：步驟（4)中，先在層析柱上滴加 lml濃度為0. 2%的醋酸溶液，再洗脫。
8. 權(quán)利要求1?7任意一項方法制備的牦牛胃溶菌酶。
9. 權(quán)利要求8所述牦牛胃溶菌酶在制備飼料添加劑中的用途。
10. 權(quán)利要求8所述牦牛胃溶菌酶在制備抗菌藥物中的用途。
【文檔編號】A61P31/04GK104371987SQ201410603940
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月31日
【發(fā)明者】江明鋒, 王永, 鄧霄禹 申請人:西南民族大學(xué)