煙粉虱C型溶菌酶Btlys-c基因及所編碼蛋白的制備與應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，旨在提供一種煙粉虱C型溶菌酶Btlys-c基因及所編碼蛋白的制備與應(yīng)用。該煙粉虱c型溶菌酶Btlys-c基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明所提供的煙粉虱C型溶菌酶(Btlys-c)基因及其編碼的核苷酸序列，使其能夠應(yīng)用在大腸桿菌中表達(dá)新的蛋白、編碼序列。所述抗菌活性的重組蛋白純化后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明：重組的煙粉虱C型溶菌酶(Btlys-c)基因原核表達(dá)的重組蛋白具有抗革蘭氏陽(yáng)性菌的能力。進(jìn)一步的，利用本發(fā)明的方法通過(guò)現(xiàn)有基因工程方法生產(chǎn)，在開(kāi)發(fā)抗菌類(lèi)藥物、食品保鮮劑和飼料添加劑等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】煙粉虱C型溶菌酶Btlys-C基因及所編碼蛋白的制備與應(yīng) 用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明涉及一種煙粉虱溶菌酶 (Lysozyme)基因及其所編碼蛋白的應(yīng)用，尤其涉及一種煙粉風(fēng)溶菌酶（Lysozyme)的體外 重組表達(dá)技術(shù)、活性重組蛋白的分離純化以及對(duì)微生物抗菌作用研究。

【背景技術(shù)】
[0002] 溶菌酶（Lysozyme)是一種專(zhuān)門(mén)作用于微生物細(xì)胞壁的水解酶，又稱(chēng)細(xì)胞壁溶 解酶。由Flemming于1922年發(fā)現(xiàn)的，它廣泛存在于真核生物和原核生物中，能切斷肽 聚糖中的N-已酰葡萄糖胺和N-已酰胞壁酸之間的β-1，4糖苷鍵，引起細(xì)胞裂解。根據(jù) 溶菌酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)、分子量和生物來(lái)源，可以將溶菌酶分為6種類(lèi)型，S卩：噬菌體Τ4溶菌 酶（phage-type)、植物溶菌酶（plant-type)、微生物溶菌酶（bacteria-type)和3種動(dòng)物 型溶菌酶，即溶菌酶 C型（chicken-lysozyme type)、I 型（invertebrate-type)和 G型 (goose-type)。其中，G型溶菌酶主要存在于脊椎動(dòng)物中，I型溶菌酶只存在于無(wú)脊椎動(dòng)物 中，而C型溶菌酶則是唯一同時(shí)存在于脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中的類(lèi)型，也是目前研究得 最廣泛、最透徹的類(lèi)型。溶菌酶作為一種天然安全的食品防腐劑，受到許多國(guó)家和組織的青 睞。早在二十世紀(jì)七十年代，歐洲國(guó)家已開(kāi)始將溶菌酶用于保存嬰兒食品。溶菌酶加入乳 中具有類(lèi)似于凝乳酶的作用，可以降解酪蛋白，使牛乳人乳化。此外，溶菌酶也可用于花生 醬、面條、面包、蛋糕等食品的防腐。
[0003] 煙粉風(fēng)Bemisia tabaci (Gennadius)已成為一種世界性的入侵性災(zāi)害性昆蟲(chóng)，在 世界各地暴發(fā)成災(zāi)，造成慘重的損失。該蟲(chóng)不僅大量取食植物汁液，導(dǎo)致植物枯萎，而且傳 播多種植物病毒，是重要的病毒傳播媒介，常導(dǎo)致植物病毒病大流行，使作物嚴(yán)重減產(chǎn)或絕 收。溶菌酶在傳毒媒介昆蟲(chóng)煙粉虱中的研究，有利于更好的揭示其在免疫反應(yīng)以及傳播植 物病毒中的作用及其工作機(jī)制，同時(shí)也為開(kāi)發(fā)和篩選抗菌藥物提供依據(jù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種煙粉虱C型溶菌 酶Btlys-C基因及所編碼蛋白的制備與應(yīng)用。
[0005] 為解決技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的解決方案是：
[0006] 提供一種煙粉虱C型溶菌酶Btlys-C基因，該基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0007] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述煙粉虱c型溶菌酶Btlys-C基因編碼的蛋白，其氨基酸 序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了利用前述煙粉虱c型溶菌酶Btlys-C基因制備具有抗菌活性 的重組蛋白的方法，是通過(guò)基因重組技術(shù)使所述基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，獲得具有抗 菌活性的重組蛋白。
[0009] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了前述蛋白在制備抗菌類(lèi)制劑、免疫增強(qiáng)劑或飼料添加劑中的 應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0011] 本發(fā)明所提供的煙粉虱C型溶菌酶（Btlys-c)基因及其編碼的核苷酸序列，使其 能夠應(yīng)用在大腸桿菌中表達(dá)新的蛋白、編碼序列。所述抗菌活性的重組蛋白純化后進(jìn)行抑 菌實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明：重組的煙粉虱C型溶菌酶（Btlys-C)基因原核表達(dá)的重組蛋白具有抗 革蘭氏陽(yáng)性菌的能力。進(jìn)一步的，利用本發(fā)明的方法通過(guò)現(xiàn)有基因工程方法生產(chǎn)，在開(kāi)發(fā)抗 菌類(lèi)藥物、食品保鮮劑和飼料添加劑等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1為基于ML法構(gòu)建的不同生物C型溶菌酶系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
[0013] 圖2為IPTG誘導(dǎo)的pET28a-Btlysc-BL21和純化的重組煙粉虱C型溶菌酶 (Btlys-c)蛋白的 SDS-PAGE凝膠電泳圖。1 :未誘導(dǎo)pET28a-Btlysc-BL21 菌株；Lane 2 :lmM IPTG誘導(dǎo)的pET28a-Btlysc-BL21菌株；3 :純化重組蛋白；M :蛋白Marker。
[0014] 圖3為煙粉虱C型溶菌酶（Btlys-C)重組蛋白對(duì)枯草芽孢桿菌的抗菌作用圖。
[0015] 圖4為煙粉虱C型溶菌酶（Btlys-c)重組蛋白對(duì)大腸桿菌的抗菌作用圖。 具體實(shí)施方案
[0016] 本發(fā)明的煙粉虱C型溶菌酶（Btlys-c)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0017] 由該煙粉虱C型溶菌酶（Btlys-c)基因編碼的蛋白，該蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
[0018] 本發(fā)明所述煙粉虱C型溶菌酶（Btlys-C)基因 cDNA的克隆方法是以煙粉虱總RNA 反轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板，構(gòu)建cDNA文庫(kù)，根據(jù)煙粉虱轉(zhuǎn)錄組篩選得到Btlys-c EST序列， 然后經(jīng)RACE方法擴(kuò)增得到末端序列，最后經(jīng)序列拼接獲得煙粉虱C型溶菌酶（Btlys-c)基 因 cDNA全長(zhǎng)序列。
[0019] 本發(fā)明用于表達(dá)煙粉虱C型溶菌酶（Btlys-C)重組蛋白的成熟肽基因序列是以煙 粉虱肽C型溶菌酶（Btlys-c)全長(zhǎng)基因雙鏈DNA為模板，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增而得到，它來(lái)源于 煙粉虱C型溶菌酶（Btlys-c)全長(zhǎng)基因區(qū)域所對(duì)應(yīng)的基因片段。
[0020] 本發(fā)明上述含有煙粉虱C型溶菌酶（Btlys-C)基因的大腸桿菌基因表達(dá)載體優(yōu)先 由本發(fā)明合成的C型溶菌酶（Btlys-c)基因與大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a構(gòu)建的重組表達(dá) 載體,命名為pET28a-Btlysc。
[0021] 本發(fā)明能表達(dá)煙粉虱C型溶菌酶（Btlys-C)基因的大腸桿菌重組菌株優(yōu)先由含有 煙粉虱C型溶菌酶（Btlys-c)的表達(dá)載體pET28a-Btly SC轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)而得到 的菌株，命名為 pET28a-Btlysc-BL21。
[0022] 上述煙粉虱C型溶菌酶（Btlys-c)的重組蛋白具體制備方法是通過(guò)如下技術(shù)方案 來(lái)實(shí)現(xiàn)：選取大腸桿菌重組菌株pET28a-Btlysc-BL21接種在IOml含有卡那霉素的LB液體 培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，取50 μ 1菌液加入到裝有50ml Kana+LB液體培養(yǎng)基的150ml無(wú)菌 三角瓶中，37°C，150rpm的搖箱中培養(yǎng)6?8h至對(duì)數(shù)期，加入IOOmM IPTG至終濃度為ImM， 27°C，250rpm振蕩培養(yǎng)。當(dāng)重組菌生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期后收集菌體，經(jīng)分離純化得到重組煙粉虱 C型溶菌酶（Btlys-C)蛋白。
[0023] 本發(fā)明所述煙粉虱C型溶菌酶（Btlys-c)基因在制備具有活性的重組蛋白中應(yīng) 用。其中，所述應(yīng)用的方法是通過(guò)基因重組技術(shù)使所述基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)蛋白 純化及對(duì)重組蛋白進(jìn)行透析復(fù)性，獲得具有抗菌活性的重組蛋白。例如：將獲得的煙粉虱C 型溶菌酶（Btlys-c)基因克隆到pET-28a(Novagen公司）表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 細(xì)胞。進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得具有活性的重組蛋白（即煙粉虱C型溶菌酶（Btlys-c)基因編 碼的活性蛋白）。
[0024] 以下結(jié)合實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0025] 實(shí)施案例1 :煙粉虱C型溶菌酶（Btlys-c)基因全長(zhǎng)cDNA克隆
[0026] L 1、TRIzol 法提取總 RNA
[0027] (1)將一定量（200只煙粉虱）冰凍lmin，放入I. 5ml離心管中，加入Iml TRIzol 試劑，充分研磨勻楽，室溫靜置5min。
[0028] (2)向離心管中加入0. 2ml氯仿，振蕩15s，混合液轉(zhuǎn)入TIANGEN離心管中，靜置 2min〇
[0029] (3) 4°C，12000g離心15min，取上清液，將其轉(zhuǎn)入一新I. 5ml的離心管中。
[0030] (4)向離心管中加入0. 5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置lOmin。
[0031] (5) 4°C，12000g 離心 IOmin,棄掉上清液。
[0032] (6)向離心管中加入Iml 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀，4°C，7500g離心5min，棄掉上 清液。（此時(shí)加入無(wú)水乙醇，可于_80°C超低溫冰箱中長(zhǎng)期保存）
[0033] (7)晾干離心管，加入適量的DEPC H2O溶解（65°C促溶），分光光度計(jì)測(cè)量0D260/ 0D280的值，比值在1. 8?2. O之間時(shí)，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
[0034] L 2、cDNA 第一鏈合成
[0035] (1)往0· 5ml無(wú)菌的離心管中分別加入1 μ 1提取的RNA，1 μ I SMART IV /5' PCR 正向引物，1μ I CDS 111/3'PCR反向引物，力口 2μ I DEPC H2O使總體積達(dá)到5μ 1。
[0036] (2)混勻離心管中的試劑并短暫離心，72°C孵育2min。
[0037] (3)迅速將離心管冰浴2min，短暫離心。
[0038] (4)往離心管中分別加入 2 μ I 5XFrist_strand Buffer，1 μ I 20mM 二硫蘇糖醇 φΤΤ)，1μ1 IOmM (ΙΝΤΡ,ΙμΙ Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄酶，反復(fù)吹打混勻，短暫離 心。
[0039] (5) 42-C 孵育 Ih。
[0040] (6)將離心管置于冰上2?3min，終止反應(yīng)。取一部分用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，其余 于-80°C超低溫冰箱冷凍保存。
[0041] 1.3、dsDNA 合成
[0042] (1)往0. 5離心管中分別加入1 μ 1第一鏈合成反應(yīng)產(chǎn)物，5 μ I IOXLA 811打61'(]\^2+打66)，5 4 1]\^2+，8 4 1(1抑13，14 15]\^1?1'1￥/5'？0?正向引物， 14 10^111/3'？0?反向引物，0.54 11^了&8〇嫩聚合酶，29.5以1(1(1!120，充分混勻，短暫 離心。
[0043] (2)?〇?儀中按以下擴(kuò)增程序（95°〇，208;25?28父（951：，58 ;681：，61^11))擴(kuò)增。
[0044] (3)取5μ1 PCR產(chǎn)物用于凝膠檢測(cè)（檢測(cè)條帶所含分子量范圍及條帶亮暗），取 檢測(cè)結(jié)果良好的1 μ 1產(chǎn)物稀釋100倍用于做以后PCR的模板，其余于-80°c超低溫冰箱冷 凍保存。
[0045] 1. 4、PCR擴(kuò)增煙煙粉虱C型溶菌酶（Btlys-c)基因 cDNA 5'和3'末端
[0046] 操作按 Clontech 公司試劑盒 SMARTer?RACE cDNA Amplification Kit 說(shuō)明書(shū)進(jìn) 行。根據(jù)試劑盒的要求，依據(jù)已知的C型溶菌酶（Btlys-c)基因 EST序列分別設(shè)計(jì)兩條上、 下游引物，以進(jìn)行巢式PCR。所用引物分別為：
[0047]

【權(quán)利要求】
1. 一種煙粉虱C型溶菌酶Btlys-C基因，其特征在于，該基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 權(quán)利要求1所述煙粉虱c型溶菌酶Btlys-c基因編碼的蛋白，其特征在于，其氨基酸 序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. 利用權(quán)利要求1所述煙粉虱c型溶菌酶Btlys-c基因制備具有抗菌活性的重組蛋白 的方法，其特征在于，是通過(guò)基因重組技術(shù)使所述基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，獲得具有抗 菌活性的重組蛋白。
4. 權(quán)利要求2所述蛋白在制備抗菌類(lèi)制劑、免疫增強(qiáng)劑或飼料添加劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K38/47GK104498515SQ201410735009
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月7日
【發(fā)明者】陳學(xué)新, 王知知, 時(shí)敏 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)