本發(fā)明涉及用于減輕、預(yù)防或逆轉(zhuǎn)由氧化應(yīng)激誘發(fā)的眼損傷(干眼癥、白內(nèi)障、視網(wǎng)膜變性等)的局部用組合物，特別涉及一種抗氧化眼藥水，其卡波姆凝膠載體中含有四種營(yíng)養(yǎng)素。

背景技術(shù)：

年齡相關(guān)性眼部疾病，如白內(nèi)障、年齡相關(guān)性黃斑變性以及干燥性角結(jié)膜炎(俗稱干眼癥)，其患病率隨年齡增加而升高。在可逆老年性視力喪失病例中，白內(nèi)障占大多數(shù)，而黃斑變性是不可逆致盲的主要原因。干燥性角結(jié)膜炎通?？捎绊懘蟛糠值?5歲以上人群，導(dǎo)致嚴(yán)重眼部不適以及視覺功能障礙。干燥性角結(jié)膜炎不會(huì)導(dǎo)致視力喪失，但如果不對(duì)其加以治療的話，會(huì)發(fā)展成淺層角膜炎，使患者非常痛苦，可導(dǎo)致角膜潰瘍或角膜瘢痕。

年齡相關(guān)性疾病在獸醫(yī)界也是一個(gè)日益嚴(yán)重的問題。白內(nèi)障引起的視力喪失是貓犬致盲的主要原因。并且，許多伴侶寵物在6月齡至10歲以上年齡段可能會(huì)患上漸進(jìn)性視網(wǎng)膜萎縮。并且，這些視網(wǎng)膜變性與遺傳有很大關(guān)系。犬干眼癥的發(fā)病率在犬7-9歲時(shí)開始升高。與年長(zhǎng)雄犬相比，干燥性角結(jié)膜炎在年長(zhǎng)雌犬身上的發(fā)病率更高，并且其在絕育的雄犬及雌犬身上的發(fā)病率都很高。與犬類相比，干燥性角結(jié)膜炎在貓身上的發(fā)病率比較低。

老年性白內(nèi)障不能通過藥物治療，患者視力僅能通過手術(shù)恢復(fù)。據(jù)估計(jì)，通過將白內(nèi)障的發(fā)病及發(fā)展推遲10年，白內(nèi)障手術(shù)需求可降低50％。研究發(fā)現(xiàn)，白內(nèi)障手術(shù)提高了晚期黃斑變性的發(fā)病率，所以研究支持能推遲白內(nèi)障的非手術(shù)治療需求。目前還沒有醫(yī)療手段能夠預(yù)防或減輕地圖狀萎縮(干性年齡相關(guān)性黃斑變性)擴(kuò)大。

白內(nèi)障和年齡相關(guān)性黃斑變性的發(fā)病機(jī)制還沒有確立。但白內(nèi)障和年齡相關(guān)性黃斑變性都是多因性疾病，其風(fēng)險(xiǎn)因素包括吸煙，與活性氧簇的產(chǎn)生和組織鐵含量升高有關(guān)。干眼癥也是多因性疾病，其與氧化應(yīng)激有關(guān)。并且，抽煙增加了罹患干眼癥的風(fēng)險(xiǎn)，而且會(huì)加劇干眼癥病情。根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，伴隨鐵含量的升高，氧化損傷增加與白內(nèi)障和年齡相關(guān)性黃斑變性的發(fā)病及發(fā)展有關(guān)。鐵產(chǎn)生的活性氧簇通過芬頓反應(yīng)生成羥自由基，并導(dǎo)致線粒體功能障礙。高鐵蛋白血癥(一種與鐵含量升高有關(guān)的鐵紊亂)患者也可能罹患白內(nèi)障。鐵代謝及轉(zhuǎn)鐵蛋白失調(diào)也與年齡相關(guān)性黃斑變性的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，其標(biāo)志是在年齡相關(guān)性黃斑變性患者視網(wǎng)膜內(nèi)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞及布魯赫氏膜內(nèi)發(fā)現(xiàn)螯合鐵增加。此外，鐵過載也與臨床上類似于年齡相關(guān)黃斑變性的黃斑病變有關(guān)，其癥狀包括多發(fā)性視網(wǎng)膜下黃白色病灶的發(fā)生及發(fā)展，以及無銅藍(lán)蛋白血癥患者視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞萎縮。

研究顯示，針對(duì)與這些年齡相關(guān)性疾病相關(guān)的氧化途徑有益于治療。含有天然抗氧化劑和/或維生素的大部分劑型(用于眼睛抗氧化以及預(yù)防白內(nèi)障)是口服的。例如，天然抗氧化劑和ω-3必需脂肪酸的混合劑型的臨床口服給藥顯著改善了干眼癥的主觀癥狀；口服針對(duì)年齡相關(guān)性眼病的天然抗氧化劑配方可使晚期年齡相關(guān)性黃斑變性的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低25％。然而，幾項(xiàng)口服營(yíng)養(yǎng)素配方的大型臨床研究顯示，所有觀察到的這些用于預(yù)防白內(nèi)障發(fā)病的抗氧化劑的治療效果均不佳，可能沒有臨床或公共健康意義。也可通過降低組織鐵含量來降低活性氧簇，活性氧簇能通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生活性羥自由基。利用螯合劑降低鐵含量的研究表明，可減少晶狀體中的活性氧簇，因?yàn)橥ㄟ^藥物(如去鐵胺)進(jìn)行螯合治療的β地中海貧血患者白內(nèi)障發(fā)病率較低。類似地，在大鼠身上進(jìn)行去鐵胺治療，可減輕煙草煙霧引起的白內(nèi)障。一個(gè)年齡相關(guān)性黃斑變性的模型顯示，新型多功能抗氧化劑能獨(dú)立清除自由基和螯合鐵，從而推遲白內(nèi)障形成，并能保護(hù)視網(wǎng)膜對(duì)抗光損傷。

因此，需要一種能解決上述問題的抗氧化眼藥水。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

該抗氧化眼藥水是一種局部眼藥配方，其包括四種營(yíng)養(yǎng)素(即蝦青素、白藜蘆醇、丙酮酸以及表沒食子兒茶素沒食子酸酯)，具有抗氧化、抗發(fā)炎的功效，并且卡波姆凝膠載體中的乙二胺四乙酸具有螯合能力。這些活性成分可通過其自由基清除活性以及螯合活性減少氧化應(yīng)激。

該局部眼藥水配方由一種混合物組成，其包含蝦青素、白藜蘆醇、丙酮酸(或丙酮酸乙酯)以及山茶(含表沒食子兒茶素沒食子酸酯的綠茶提取物)，這些混合物位于一個(gè)粘性載體內(nèi)，該載體由去離子水溶液組成，包含0.4％卡波普980nf、5.7％山梨醇、0.01％溴棕三甲銨、0.01％乙二胺四乙酸以及足量的氯化鈉和氫氧化鈉，以調(diào)節(jié)局部載體的粘度和ph，將其ph調(diào)節(jié)到7.0-7.4?？ú份d體與市場(chǎng)上出售的optixcare類似，促進(jìn)了眼表的粘附作用，并適合將醛糖還原酶抑制劑kinostattm運(yùn)送到糖尿病病犬身上。每種營(yíng)養(yǎng)成分的重量百分比在0.1％-5％不等。建議劑量為每眼1滴，每天2次。該局部眼藥配方能推遲人類或其他動(dòng)物身上由氧化應(yīng)激誘發(fā)的白內(nèi)障的發(fā)病時(shí)間，并減少由氧化應(yīng)激誘發(fā)的視網(wǎng)膜變性。其對(duì)視網(wǎng)膜的療效可通過額外口服膠囊增強(qiáng)，該口服膠囊包含蝦青素、白藜蘆醇、丙酮酸和表沒食子兒茶素沒食子酸酯。該局部眼藥配方還能預(yù)防或減輕干眼癥中淚流量降低的癥狀。

關(guān)于本發(fā)明的這些特性以及其他特性的詳細(xì)說明，請(qǐng)查看以下說明書和附圖。

附圖說明

圖1展示了大鼠糖性白內(nèi)障的發(fā)病對(duì)比情況，以大鼠患糖尿病后周數(shù)的函數(shù)來表示，包括對(duì)照試樣(未經(jīng)治療)、使用本發(fā)明(optixcareeh)抗氧化眼藥水治療的試樣、使用其他兩種市售(或快上市的)護(hù)眼配方治療的試樣。

圖2為對(duì)應(yīng)于圖1的糖尿病大鼠的晶狀體的顯微照片的比較矩陣，其展示了四個(gè)試樣組的大鼠白內(nèi)障相對(duì)發(fā)病情況。

圖3展示了谷胱甘肽含量在四組年輕雌鼠中的對(duì)比情況，其將一只眼睛暴露在紫外光輻射中，遮蔽對(duì)側(cè)的另一只眼睛作為未輻射對(duì)照。四組年輕雌鼠包括一組對(duì)照試樣(未經(jīng)治療)、一組使用本發(fā)明(optixcareeh)抗氧化眼藥水治療的試樣、其他兩組使用其他護(hù)眼配方治療的試樣。

圖4展示了對(duì)應(yīng)圖3的四個(gè)試樣組，4-羥基壬烯醛(4-hne)在晶狀體中的含量。

圖5a展示了三組大鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜中的4-羥基壬烯醛-組氨酸加合物的含量，三組大鼠在2周的黑暗適應(yīng)后暴露在光照下，包含一組對(duì)照試樣(未經(jīng)治療)、一組使用本發(fā)明(optixcareeh)抗氧化眼藥水治療的試樣。

圖5b展示了對(duì)應(yīng)圖5a的三組大鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜中的硝基酪氨酸加合物含量。

圖6a圖表展示了對(duì)應(yīng)圖5a的三組大鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜中的硫氧還蛋白表達(dá)水平。

圖6b圖表展示了對(duì)應(yīng)圖6a的三組大鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜中的硫氧還蛋白還原酶表達(dá)水平。

圖7圖表展示了在五組成年lewis大鼠中每日兩次進(jìn)行皮下東莨菪堿皮下注射誘發(fā)的淚流量，這五組大鼠包含一組對(duì)照試樣(未經(jīng)治療)、一組使用本發(fā)明(optixcareeh)抗氧化眼藥水治療的試樣。

附圖中相似的參考字符表示一致對(duì)應(yīng)的特征。

具體實(shí)施方式

該抗氧化眼藥水(在本申請(qǐng)中也稱為optixcareeh)是一種局部眼藥配方，由一種混合物組成，其包含蝦青素、白藜蘆醇、丙酮酸(或丙酮酸乙酯)以及山茶(含egcg(表沒食子兒茶素沒食子酸酯)的綠茶提取物)，這些混合物位于一個(gè)粘性載體內(nèi)，該載體由去離子水溶液組成，包含0.4％卡波普980nf、5.7％山梨醇、0.01％溴棕三甲銨、0.01％乙二胺四乙酸以及足量的氯化鈉和氫氧化鈉，以調(diào)節(jié)局部載體的粘度和ph，將其ph調(diào)節(jié)到7.0-7.4。該組合物還可包括1％抗壞血酸?？箟难峥勺鳛樵摶旌衔锏目寡趸栏瘎?。

蝦青素是一種類胡蘿卜素，其抗氧化能力比玉米黃質(zhì)、葉黃素、角黃素和β-胡蘿卜素高10倍。蝦青素被稱為“超級(jí)維生素e”，因?yàn)槠淇寡趸芰Ρ圈?生育酚(維生素e)高100倍。在極性溶劑中，蝦青素以酮-烯醇形態(tài)處于平衡狀態(tài)，具有1個(gè)氫原子，能中斷自由基反應(yīng)，方式類似于α-生育酚。蝦青素有3種構(gòu)型異構(gòu)體，即2對(duì)對(duì)映體和1種內(nèi)消旋態(tài)的蝦青素，其中3s和3’s結(jié)構(gòu)在自然中最為豐富。體外條件下，順式蝦青素，特別是9-順式蝦青素，其抗氧化能力比全反式異構(gòu)體更強(qiáng)。

據(jù)報(bào)道，培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞可隨時(shí)間蓄積蝦青素、葉黃素、玉米黃質(zhì)和α-生育酚這些營(yíng)養(yǎng)素，在保護(hù)人晶狀體上皮細(xì)胞抵御紫外線b輻射引起的氧化應(yīng)激方面，蝦青素、葉黃素、玉米黃質(zhì)比α-生育酚更有效。據(jù)報(bào)道，在9周時(shí)間內(nèi)每日3次在棕色挪威大鼠身上局部施用1％蝦青素懸濁液，可減緩因暴露在紫外線b中(1200mj/cm2)所誘發(fā)白內(nèi)障的形成。給鏈脲霉素致糖尿病大鼠食用含有蝦青素的飲食，其白內(nèi)障發(fā)病率較低，大西洋鮭幼魚中的食用蝦青素也可減緩白內(nèi)障形成。各種研究顯示，正如葉黃素、玉米黃質(zhì)有利于治療年齡相關(guān)性黃斑變性，蝦青素對(duì)視網(wǎng)膜具有保護(hù)作用。蝦青素能減緩視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的減少速度，并對(duì)在玻璃體腔內(nèi)注射n-甲基-d-天冬氨酸引發(fā)的內(nèi)網(wǎng)狀層的厚度減少方面有減緩作用。在另一臨床研究中，非晚期年齡相關(guān)性黃斑變性患者在口服12個(gè)月的azyr藥片(意大利卡塔尼亞sifi制藥公司)后，通過多焦視網(wǎng)膜電流圖檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，中央視網(wǎng)膜功能障礙減輕了。這種藥片成分除了包含4mg蝦青素，還包含10mg葉黃素、1mg玉米黃質(zhì)、180mg維生素c、30mg維生素e、2.5mg鋅以及1mg銅。

白藜蘆醇是存在于紅葡萄酒中的氧化劑，被吹捧為一種抗衰老化合物。其抗氧化能力來源于其中所含的羥基偶聯(lián)物。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，口服白藜蘆醇的生物利用度十分有限，因?yàn)槟c/肝中葡萄糖醛酸苷和硫酸結(jié)合反應(yīng)使代謝加快，因此白藜蘆醇可能達(dá)不到有效的靶組織含量。局部施用可避免這種新陳代謝。白藜蘆醇在眼內(nèi)的保護(hù)效果較好，據(jù)報(bào)道，白藜蘆醇具有抗氧化、抗凋亡、抗發(fā)炎、抗血管生成和舒張血管的功效。根據(jù)不同劑量，白藜蘆醇可在原代培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中降低高達(dá)50μm的炎癥因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β以及低氧誘發(fā)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的分泌。在培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮-19細(xì)胞中，分別添加50mmol/l和100mmol/l的白藜蘆醇，結(jié)果表面人視網(wǎng)膜色素上皮-19細(xì)胞的體外增殖分別降低了10％和25％，從而保護(hù)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，避免過氧化氫誘發(fā)細(xì)胞死亡的情況。白藜蘆醇是一種sirt1激活劑，在動(dòng)物模型中上調(diào)sirt1后，顯示出其具有重要保護(hù)作用，能夠抵抗各種眼部疾病(如白內(nèi)障、視網(wǎng)膜變性、視神經(jīng)炎以及葡萄膜炎)。在老鼠身上進(jìn)行白藜蘆醇長(zhǎng)期治療，可減緩老鼠的年齡相關(guān)性變性和機(jī)能減退，包括減緩白內(nèi)障形成。白藜蘆醇還可減輕導(dǎo)致年齡相關(guān)性黃斑變性和青光眼的氧化應(yīng)激。在老鼠身上注射脂多糖來誘發(fā)內(nèi)毒素誘發(fā)的葡萄膜炎，在脂多糖注射前口服白藜蘆醇，可抑制氧化損傷以及氧化還原敏感的nf-κb活化，從而減輕炎癥。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性視網(wǎng)膜脫離的大鼠身上，白藜蘆醇療法上調(diào)了foxo基因家族，并阻止了半胱天冬酶3、8、9的活化。在一個(gè)兔角膜培養(yǎng)模型中，白藜蘆醇減少了金黃色葡萄球菌，而金黃色葡萄球菌與白介素-8基因表達(dá)有關(guān)。

組合物中含有的蝦青素可使該組合物呈深紅色。若想組合物的顏色淡一些，可減少蝦青素的用量，增加白藜蘆醇的用量。例如，一種溶液或凝膠含有1％丙酮酸、1％表沒食子兒茶素沒食子酸酯、2％白藜蘆醇以及0.01％蝦青素，就會(huì)呈現(xiàn)出桃紅色，用brookfielddv-ii粘度計(jì)在每分鐘5轉(zhuǎn)的情況下測(cè)得的粘度為18000-22000cps。該凝膠呈淺桃紅色，并具甜香味。

丙酮酸是一種內(nèi)源性抗氧化劑，施用時(shí)作為一種乙酯前藥，能減少在缺血/再灌注損傷和出血性及內(nèi)毒素休克中對(duì)器官系統(tǒng)的損傷。丙酮酸對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)和促炎基因調(diào)控具有直接療效。據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道的體外晶狀體和糖尿病大鼠研究中，丙酮酸降低了晶狀體山梨醇含量、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并促進(jìn)丙酮酸還原成乳酸，從而延遲了糖性白內(nèi)障的形成。在30％的半乳糖喂養(yǎng)的大鼠中也可以延緩糖性白內(nèi)障。。局部施用的丙酮酸鈉及丙酮酸乙酯可滲透角膜。丙酮酸還具有自由基清除能力，經(jīng)腹腔注射后可減輕大鼠硒性白內(nèi)障。

(-)表沒食子兒茶素沒食子酸酯(egcg)，富含在綠茶中，其抗氧化能力比維生素e高10倍。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，其可螯合具有氧化還原性的鐵和銅，局部施用時(shí)能到達(dá)晶狀體。表沒食子兒茶素沒食子酸酯可在培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞中降低因紫外線b輻射和過氧化氫產(chǎn)生的活性氧簇。它還能保護(hù)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞抵御紫外線a誘發(fā)損傷，保護(hù)視網(wǎng)膜光感受器抵御硝普鈉誘發(fā)氧化應(yīng)激。在培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞中，表沒食子兒茶素沒食子酸酯展現(xiàn)出抗發(fā)炎、抗氧化的功效。局部施用表沒食子兒茶素沒食子酸酯能有效抑制兔角膜新生血管化。該抑制效果可能與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和環(huán)氧合酶-2介導(dǎo)的血管生成受到抑制有關(guān)。局部施用表沒食子兒茶素沒食子酸酯治療老鼠，可抑制炎癥因子表達(dá)以及角膜內(nèi)cd11b+細(xì)胞浸潤(rùn)，從而減少干燥性角結(jié)膜炎的臨床癥狀及炎性病變。

已確定糖尿病大鼠可因山梨醇細(xì)胞內(nèi)蓄積引發(fā)的滲透應(yīng)激快速發(fā)展為糖尿病的“糖性白內(nèi)障”，山梨醇的形成受到了醛糖還原酶的催化。蓄積的山梨醇引發(fā)了滲透應(yīng)激，從而誘發(fā)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激隨后引發(fā)了未折疊蛋白反應(yīng)，導(dǎo)致形成活性氧簇。通過使用醛糖還原酶抑制劑適當(dāng)抑制醛糖還原酶，可防止形成山梨醇，從而防止了糖尿病性白內(nèi)障的形成。相比之下，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減少活性氧簇，僅推遲了白內(nèi)障的形成。

通過進(jìn)行幾個(gè)實(shí)驗(yàn)來確定上述成分的有效性。

實(shí)施例1

制備1kg含4％(重量百分比)活性成分的配方

在室溫下將750g去離子水加入適當(dāng)大小的不銹鋼或玻璃容器中，然后再加入0.1g溴棕三甲銨，使溶液最終濃度為0.01％，攪拌該混合物至溶解。然后加入0.1g乙二胺四乙酸，攪拌至溶解，使最終濃度為0.01％，加入57g的70％美國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)的山梨醇，使溶液最終濃度為5.7％，攪拌該混合物至溶解，然后加入40g白藜蘆醇，使最終濃度為4.0％，待溶液混合均勻后，加入8g卡波普980，使最終濃度為0.80％，攪拌該混合物至完全水化，然后加入40g丙酮酸乙酯和40g茶樹提取物(沒食子兒茶素沒食子酸酯)，分別使最終濃度為4.0％，攪拌該溶液5-10分鐘，再加入40g蝦青素，使最終濃度為4％，待蝦青素?cái)嚢璺稚⒑?，通過5n氫氧化鈉溶液將ph值調(diào)節(jié)到7.0-7.4，再加入適量去離子水，使最終加入的水達(dá)到774.8g(去離子水和氫氧化物溶液)。使用該濃度的溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

實(shí)施例2

糖尿病誘發(fā)白內(nèi)障

在這項(xiàng)研究中，在幼齡(體重約100g)斯普拉格-杜勒大鼠的尾部靜脈注射75mg/kg的鏈脲霉素，以誘發(fā)糖尿病，如randazzo等人在《公共科學(xué)圖書館期刊》(plosone,2011,6(4),p.e18980)中的描述。將所有血糖水平大于300mg/dl的大鼠平均分成4組，每組6只。第一組作為未治療對(duì)照，第二組施用醛糖還原酶抑制劑kinostattm，每眼1滴，每日2次。第三組施用本發(fā)明抗氧化眼藥水組合物(也稱為optixcareeh，其制備如上所述)，每眼1滴，每日2次。第四組每日1次口服1ml的吐溫80ocu-glotm溶液，其制備方法是：將ocu-glotm(animalhealthquest公司，美國(guó)華盛頓貝林哈姆)膠囊中的內(nèi)容物溶解于適量吐溫80中，以便根據(jù)動(dòng)物重量，按照廠商對(duì)營(yíng)養(yǎng)素配方的建議劑量施用1ml的吐溫混合物。每眼使用1％托品酰胺滴眼液進(jìn)行散瞳，然后用手持裂隙燈進(jìn)行晶狀體病變檢測(cè)，每周1次。通過手持裂隙燈評(píng)估晶狀體病變，分0-3級(jí)，0級(jí)表示無晶狀體病變；0.5級(jí)表示裂縫加重；1級(jí)表示細(xì)胞空泡化；2級(jí)表示皮質(zhì)混濁；3級(jí)表示成熟白內(nèi)障。該研究在誘發(fā)糖尿病后8周結(jié)束，采用后路法從每只摘除眼睛中小心取下晶狀體，并進(jìn)行拍照存檔。在研究開始時(shí)通過使用商用血糖儀(therasense公司的freestyle血糖儀，美國(guó)加利福尼亞州阿拉米達(dá)市)測(cè)定血糖水平。糖化血紅蛋白水平用于估量研究中所有大鼠的總體高血糖狀況，在研究結(jié)束后使用拜耳公司的metrikaa1cnowplus系統(tǒng)試劑盒(美國(guó)加利福尼亞州圣地亞哥市)來確定糖化血紅蛋白水平。根據(jù)測(cè)得的結(jié)果(糖化血紅蛋白，均值±，使用掃描電鏡觀察，未治療對(duì)照組為10.7±0.7；kinostattm組為11.48±0.2；optixcareeh組為10.6±0.7；ocu-glotm組為10.4±0.76)，可確定所有組的大鼠都患有相同程度的糖尿病。

如圖1所示，所有幼齡糖尿病大鼠在8周內(nèi)很快患上白內(nèi)障，通過局部施用醛糖還原酶抑制劑kinostattm，防止了白內(nèi)障形成。通過局部施用營(yíng)養(yǎng)素optixcareeh，推遲這些糖尿病大鼠白內(nèi)障的發(fā)病及發(fā)展，并且optixcareeh的推遲效果比口服ocu-glotm更好。在研究結(jié)束時(shí)，通過對(duì)解剖的晶狀體進(jìn)行顯微鏡檢查來確定這些裂隙燈觀察結(jié)果，如圖2所示。在使用醛糖還原酶抑制劑治療的大鼠中未見明顯晶狀體混濁，在未治療對(duì)照組和口服ocu-glotm組中均發(fā)現(xiàn)不同程度(皮質(zhì)白內(nèi)障到成熟白內(nèi)障)的晶狀體病變(如圖2所示)。相比之下，裂縫加重是糖性白內(nèi)障的主要初期癥狀，在使用optixcareeh治療的糖尿病大鼠中就發(fā)現(xiàn)了這一癥狀。

實(shí)施例3

紫外線誘發(fā)白內(nèi)障

暴露于紫外線輻射是白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制的另一主要風(fēng)險(xiǎn)因素。紫外線輻射產(chǎn)生活性氧簇，其使晶狀中體谷胱甘肽(晶狀體中的主要抗氧化劑)快速減少，隨后幾周發(fā)生晶狀體混濁。在該研究中，將幼齡雌性斯普拉格-杜勒大鼠平均分為五組。第一組作為未受輻射的對(duì)照組，第二組作為未經(jīng)治療的受輻射對(duì)照組。第三組局部施用含有3％的jhx-4(4-(5-羥基嘧啶鹽酸鹽-2-基)-n、n-二甲基-3、5-二酮哌嗪-1-磺酰胺(采用高效液相色譜法測(cè)定純度為99％)的optixcare卡波姆載體，第四組施用本發(fā)明抗氧化眼藥水組合物(也稱為optixcareeh，其制備如上所述)，第五組口服1ml的ocu-glotm灌胃，如上所述。治療在受輻射前3天開始進(jìn)行，并持續(xù)進(jìn)行直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。受輻射之前，對(duì)每只大鼠使用60mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪的混合物進(jìn)行腹腔注射使其麻醉，用1％托品酰胺滴眼液對(duì)右眼進(jìn)行散瞳。對(duì)側(cè)眼睛用眼罩遮住，用黑膠布將眼罩固定好。每只大鼠單眼側(cè)面接受15分鐘1600μw/cm2紫外線輻射(280-360nm,uvmax306nm)，遮住的對(duì)側(cè)眼睛不受紫外線輻射。輻射后兩天，采用二氧化碳窒息法對(duì)每只大鼠進(jìn)行安樂死。摘除雙眼，采用后路法將晶狀體小心取出。使用冰冷的裂解緩沖液(ph7.5)對(duì)每個(gè)晶狀體進(jìn)行均質(zhì)化，在4℃條件進(jìn)行離心，去除不溶蛋白。根據(jù)bradford法測(cè)量一小份上層清液種的蛋白含量。對(duì)另一小份上層清液使用等容量的20％三氯乙酸去除蛋白，按照dtnb法測(cè)得去除蛋白上層清液中谷胱甘肽含量為412nm。

將所有受到紫外線輻射的眼睛晶狀體谷胱甘肽含量(顯著減低，p<0.05)與對(duì)側(cè)未受輻射晶狀體的谷胱甘肽含量做對(duì)比，如圖3所示。受同樣輻射程度的大鼠，在輻射前3天局部施用3％jhx-4(每日2次)、optixcareeh(每日2次)或口服ocu-glo^tm灌胃(每日1次)進(jìn)行預(yù)治療，結(jié)果只在使用ocu-glo^tm治療的大鼠中發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽含量顯著減低。局部施用optixcareeh或3％jhx-4的大鼠中，其受輻射晶狀體中的谷胱甘肽含量沒有明顯降低(圖3)。為了確認(rèn)紫外線輻射后谷胱甘肽含量降低與活化氧簇含量增加有關(guān)，對(duì)余下的勻漿上清液采用競(jìng)爭(zhēng)性elisa法，根據(jù)廠商指示，使用oxiselecthne加合物競(jìng)爭(zhēng)性elisa測(cè)定試劑盒(cellbiolabs有限公司，美國(guó)加利福尼亞州圣地亞哥市)來確定晶狀體中氧化膜脂質(zhì)4-羥基壬烯醛(4-hne)的含量。如圖4所示，紫外線輻射致使4-hne含量增加，使用抗氧化劑治療后4-hne含量降低，降低程度按順序?yàn)椋壕植渴┯胘hx-4>局部施用optixcareeh>口服ocu-glo^tm。與受紫外線輻射且未經(jīng)治療大鼠的晶狀體內(nèi)4-hne含量相比，受紫外線輻射但使用jhx-4(p<0.01)和optixcareeh(p<0.05)進(jìn)行治療的大鼠的晶狀體內(nèi)4-hne含量顯著降低。受輻射但使用ocu-glo^tm治療的大鼠的晶狀體內(nèi)4-hne含量與受輻射且未經(jīng)治療大鼠的晶狀體內(nèi)4-hne含量沒有明顯不同。只在使用jhx-4治療的大鼠中，受紫外線輻射的晶狀體內(nèi)4-hne含量與未受輻射的對(duì)側(cè)眼睛晶狀體內(nèi)4-hne含量統(tǒng)計(jì)相似。

實(shí)施例4

光誘發(fā)視網(wǎng)膜變性

已適應(yīng)黑暗大鼠的神經(jīng)視網(wǎng)膜中，光輻射也能導(dǎo)致活化氧簇的形成、鐵失調(diào)以及鐵蛋白鐵釋放。在年齡相關(guān)性黃斑變性的動(dòng)物模型中，在開始對(duì)威斯塔大鼠進(jìn)行兩周黑暗適應(yīng)時(shí)進(jìn)行治療，口服含有0.05％多功能抗氧化劑jhx-4，或局部每日2次施用optixcareeh。

如randazzo等人在《公共科學(xué)圖書館期刊》(plosone,2011,6(7),p.e21926)中的描述，所有組一共包括12只4-5周大的雄性威斯塔大鼠，第一組喂食正常鼠糧(未治療)，第二組喂食正常鼠糧并局部每日2次施用optixcareeh，第三組經(jīng)口喂食含0.05％多功能抗氧化劑jhx-4的食物，并進(jìn)行為期兩周的黑暗適應(yīng)。然后將每組大鼠單獨(dú)放入亞克力材質(zhì)平底的嚙齒動(dòng)物束縛盒(plas-labs有限公司，美國(guó)密歇根州蘭辛市)中，再放入燈箱中受1000lx冷白熒光燈(lightsofamerica公司，美國(guó)加利福尼亞州洛杉磯市)輻射三小時(shí)。另外一組未治療大鼠也放入燈箱中三小時(shí)，但不暴露在光線下(無光損傷大鼠)。受光輻射后立即對(duì)8只光損傷大鼠和8只無光損傷大鼠實(shí)施安樂死，小心地將其神經(jīng)視網(wǎng)膜從摘除眼睛中剝離，并用干冰冷凍以備隨后分析。隨后，將解凍的視網(wǎng)膜在裂解緩沖液中均質(zhì)化，使用4-hne-his加合物和硝基酪氨酸elisa試劑盒進(jìn)行elisa測(cè)定。將另外一部分解凍的視網(wǎng)膜在總蛋白提取細(xì)胞裂解緩沖液中均質(zhì)化，總蛋白提取細(xì)胞裂解緩沖液中含有halt蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物，用于對(duì)硫氧還蛋白(trx)和硫氧還蛋白還原酶(trxr)的表達(dá)水平進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。蛋白質(zhì)樣品通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。用含有5％乳粉的0.1％tbs-t封閉該硝酸纖維膜后，在4℃條件下使用一級(jí)抗體硫氧還蛋白抗體(稀釋比例1:1000)或硫氧還蛋白還原酶抗體(稀釋比例1:2000)將該硝酸纖維膜孵育過夜。隨后使用tbs-t沖洗該硝酸纖維膜，然后使用辣根過氧化物酶-二級(jí)抗體將硝酸纖維膜孵育1小時(shí)。通過化學(xué)發(fā)光和曝光于x射線膠片的方法，可見蛋白條帶。最后，使用磷酸甘油醛脫氫酶抗體探針探測(cè)該硝酸纖維膜，作為質(zhì)控物。所有可見蛋白質(zhì)含量可使用nihimagej程序(可在網(wǎng)站rsbweb.nih.gov/ij/在線使用)來定量。

總而言之，局部眼部施藥不會(huì)顯著提高視網(wǎng)膜中的藥物含量。因此，對(duì)已適應(yīng)黑暗并受過光輻射的大鼠而言，與口服多功能抗氧化劑jhx-4相比，預(yù)計(jì)局部施用optixcareeh對(duì)視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激不會(huì)產(chǎn)生顯著防御作用。但出乎意料地的是，局部施用optixcareeh可見有利的視網(wǎng)膜抗氧化效果。據(jù)randazzo等人在《公共科學(xué)圖書館期刊》(plosone,2011,6(7),p.e21926)中報(bào)道，將神經(jīng)視網(wǎng)膜暴露于1000lx光輻射下3小時(shí)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激標(biāo)記物增加，該氧化標(biāo)記物包含4-羥基壬烯醛加合物(如圖5a)和改性硝基酪氨酸蛋白(如圖5b)，其中4-羥基壬烯醛加合物由組氨酸構(gòu)成，組氨酸由多不飽和脂肪酸的非酶促氧化生成；改性硝基酪氨酸蛋白由過氧硝酸鹽氧化酪氨酸殘基生成，過氧硝酸鹽由氧化氮與超氧陰離子的反應(yīng)生成。進(jìn)行光輻射后，這兩種標(biāo)記物含量均顯著增加，而在相似受光輻射并使用jhx-4治療的大鼠中，氧化標(biāo)記物含量都沒有顯著增加(圖6a、6b)。對(duì)使用optixcareeh治療的大鼠進(jìn)行測(cè)量顯示這兩種氧化標(biāo)記物含量均有不同程度的增加。但增加程度比那些未治療大鼠要低很多。因?qū)⒁暰W(wǎng)膜暴露于強(qiáng)光下產(chǎn)生的活性氧簇和自由基也可通過硫氧還蛋白/硫氧還蛋白還原酶防御體系得到緩解。因此，也檢查了這些大鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜中硫氧還蛋白/硫氧還蛋白還原酶的表達(dá)水平。如圖6a、6b所示，在受光輻射且未治療大鼠中，硫氧還蛋白/硫氧還蛋白還原酶的表達(dá)都有所增加。在受光輻射但使用jhx-4或optixcareeh治療的大鼠的神經(jīng)視網(wǎng)膜中，硫氧還蛋白還原酶的表達(dá)顯著降低(p<0.05)。但只有使用jhx-4治療的大鼠中硫氧還蛋白的表達(dá)才有所降低。

通過對(duì)光感受器細(xì)胞層進(jìn)行組織學(xué)測(cè)量，確認(rèn)了jhx-4和optixcareeh可減少氧化應(yīng)激。在如上所述的光輻射之后，在每組中選擇幾只大鼠，將其放回黑暗環(huán)境中停留7天。采用二氧化碳窒息法對(duì)每只大鼠進(jìn)行安樂死，然后在背腹側(cè)每只眼睛上用燒灼工具做標(biāo)記。然后摘除眼睛，以體積比為3:1的甲醇固定；在乙酸溶液中放置一夜，然后采用標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)方法進(jìn)行處理。然后使用zeissaxioplan顯微鏡(carlzeissmicroimaging有限公司，美國(guó)紐約州索恩伍德市)和axiovision軟件獲得he染色區(qū)域的數(shù)字圖像。使用image-proplus軟件(mediacybernetics公司，美國(guó)馬里蘭州銀泉市)測(cè)得外核層厚度(從視神經(jīng)乳頭開始到上下鋸狀緣之間的間隔)為400μm。結(jié)果顯示，強(qiáng)光輻射致使外核層光感受器變薄，上半球損傷比下半球更明顯。使用jhx-4治療的大鼠，上下半球的光感受器細(xì)胞層都只是稍微變薄。相比之下，使用optixcareeh治療的大鼠，光感受器細(xì)胞層僅受到局部保護(hù)。這些結(jié)果說明，雖然是局部施藥，但optixcareeh可局部降低受光損傷大鼠視網(wǎng)膜中的氧化應(yīng)激。

實(shí)施例5

東莨菪堿誘發(fā)干眼癥

optixcare是一種以卡波姆為載體的市售獸醫(yī)用潤(rùn)眼劑，在麻醉過程中防止眼睛脫水，還可作為干眼癥的輔助療法。optixcare屬于一類眼部安慰劑，成分包含聚(丙烯酸)聚合物，聚(丙烯酸)聚合物可通過提高淚膜特性來緩解眼部不適，使淚液量穩(wěn)定留存，同時(shí)使眼表保持潤(rùn)滑。這種類型的安慰劑還包含具有鎖水作用的透明質(zhì)酸。optixcare、optixcareh(含透明質(zhì)酸的optixcare)以及含有透明質(zhì)酸的idropvetplus滴眼液(局部用透明質(zhì)酸，imed制藥公司，加拿大多拉爾-德索莫)都被用于獸醫(yī)市場(chǎng)，減輕干眼癥的臨床癥狀。因?yàn)閛ptixcareeh的成分不僅抗氧化而且具有抗發(fā)炎的療效，所以對(duì)于optixcareeh實(shí)際治療干眼癥的潛在療效進(jìn)行了研究。在30只體重為180-200g的雌性lewis大鼠(分為5組)中進(jìn)行了干眼癥誘發(fā)。一組作為未治療對(duì)照，其他各組分別施用optixcare、optixcareh、idropvetplus滴眼液或本發(fā)明抗氧化眼藥水組合物(optixcareeh)，每眼1滴，每日2次。對(duì)全部大鼠皮下注射0.1ml含24mg東莨菪堿的水溶液(每日2次，每天總劑量為48mg)，進(jìn)行干眼癥誘發(fā)。在用異氟烷麻醉所有大鼠并施用zone-quick^tm苯酚紅線(fciopthalmics公司，美國(guó)馬薩諸塞州彭布羅克)之前測(cè)量淚流量，每周進(jìn)行一次。拉下下眼瞼，使用鑷子將每根線折起的3mm端部放入瞼結(jié)膜內(nèi)距離外眥約1/3處。將線留在睜開的眼睛中15秒鐘，然后取出，取出時(shí)輕輕拉下下眼瞼，朝上取出線。然后，立即測(cè)量線染紅部分的長(zhǎng)度。如圖7所示，所有大鼠的淚流量為雙眼均值，未治療大鼠的淚流量隨時(shí)間增加而降低，而局部施用任何一種安慰劑(optixcare、optixcareh或i-drop透明質(zhì)酸)也沒有改變淚流量的降低趨勢(shì)。相比之下，同樣注射東莨菪堿但施用了本發(fā)明optixcareeh組合物的大鼠，其淚流量得到維持。這表明，營(yíng)養(yǎng)素抗氧化劑的加入提高了optixcare(作為一種干眼癥輔助療法)的療效。

該組合物可置于低密度聚乙烯管和/或從低密度聚乙烯管中分出，例如15g，白色低密度聚乙烯管。該低密度聚乙烯管可具有五層，包括乙烯-乙烯醇共聚物屏障，其夾在每?jī)蓪泳垡蚁┑闹g的粘合劑中。例如，該低密度聚乙烯管可包括具有直徑為0.047的“孔口的分液器吸頭以及直徑為7/8的平滑螺紋封閉件。

需要了解的是，本發(fā)明不限于以上所述實(shí)施例，還包括以下權(quán)利要求范圍內(nèi)的任何實(shí)施例。。