本發(fā)明涉及一種用于制備包含膜蛋白的疫苗抗原的方法，并且還涉及疫苗抗原和疫苗及其用途。本發(fā)明在醫(yī)療領(lǐng)域且特別是在疫苗制備領(lǐng)域中具有工業(yè)用途。在下面的描述中，括號([])之間的引用請查閱本文末尾出現(xiàn)的參考文獻列表。
背景技術(shù)：
：疫苗接種在于通常通過向人或動物施用疫苗來使人或動物免疫傳染病。刺激免疫系統(tǒng)的疫苗保護人或動物免受感染或疾病。已經(jīng)確定，人類接種疫苗使得其有能夠抵抗和消除可能致命的傳染性疾病，并且據(jù)估計，這種方式每年防止了超過2至3百萬人的死亡。其是在衛(wèi)生領(lǐng)域中最盈利的投資之一。疫苗是抗原制劑，其使得能夠在接種疫苗的人或動物中誘導(dǎo)致病劑特異性免疫應(yīng)答，這種免疫應(yīng)答能夠保護它們免受自然感染或減弱自然感染的后果。流感是一種由流感病毒引起的常見的病毒性呼吸道感染并且在世界各地都能見到，其在溫和地區(qū)的流行性冬季發(fā)作中發(fā)展。世界衛(wèi)生組織(who)認為，它們在全世界每年造成300至500萬例嚴重病例和250000至500000例死亡(http://www.pasteur.fr/fr/institut-pasteur/presse/fiches-info/grippe#sthash.pwunmj10.dpuf)。造成人類病理狀況的流感病毒是a型和b型流感病毒。b型流感病毒以譜系形式傳播，同時根據(jù)主要兩種表面糖蛋白、血凝素(ha)和神經(jīng)氨酸酶(na)的抗原性質(zhì)，將a型流感病毒以病毒亞型分類。流感病毒在其表面上具有300至800個糖蛋白，這與范圍可以是1至10的na/ha比率相關(guān)聯(lián)。在人類中傳播并且造成季節(jié)性流行病的病毒是病毒a(h1n1)和a(h3n2)。由于流感病毒的主要傳染源是動物傳染源(禽類和豬)，動物病毒可以穿過物種屏障并感染人類。病毒如禽類病毒a(h5n1)和大流行性病毒a(h1n1)可導(dǎo)致嚴重公共健康問題。事實上，疫苗接種目前是保護群體免受流感病毒侵害的唯一有效手段?！凹竟?jié)性”疫苗使得可以獲得針對季節(jié)性傳播的病毒a如(h1n1)和(h3n2)以及病毒b的各種譜系的免疫。它每年根據(jù)前一年的原型菌株進行定義，并含有a型和b型季節(jié)性病毒的抗原。宿主的免疫應(yīng)答主要是體液型，具有針對病毒的ha和na蛋白的中和抗體的表達。由于這兩種蛋白質(zhì)中相當大的抗原遷移，疫苗組合物必須每年重新評估。用于生產(chǎn)疫苗的常規(guī)方法，首先基于通過在a/pr8/34(h1n1)菌株和季節(jié)性病毒菌株之間的基因重配，以在蛋上獲得用于由who確定的每年一次原型a菌株的每一種的疫苗種(vaccineseed)。大多數(shù)疫苗制造商通常使用主要來自親本a/pr/8/34病毒的這些重配病毒。因此，每個疫苗種源自原型a菌株和在蛋中具有最佳復(fù)制能力的a/pr8/34(h1n1)病毒之間的基因重配的過程。這種b型病毒的產(chǎn)生直接在蛋上進行，不需要與pr8重配。病毒顆粒含有八個不同的基因片段，該基因片段由與核蛋白連接并與聚合酶復(fù)合物相關(guān)的單一rna鏈組成，每個基因編碼一至三個給定的病毒的蛋白：ha、na、m1、m2、np、ns1、nep、pb1、pb1f2、pb1n40、pb2和pa。因此，長的選擇過程使得可以獲得疫苗重配，其至少包含在pr8病毒的遺傳背景上編碼原型菌株的ha和na的基因片段(組合物“6+2)。然后，在蛋上擴增由2個原型菌株和親本a/pr/8/34菌株之間的基因重配產(chǎn)生的2個疫苗重配株。從尿囊生產(chǎn)中提取ha和na抗原，并任選地與佐劑組合以產(chǎn)生疫苗劑量。這種用于生產(chǎn)疫苗劑量的工業(yè)方法較長(4至6個月)。然而，在生產(chǎn)大流行前疫苗，特別是針對人流感的大流行前疫苗的情況下，who已評估，如果要實施防治流感大流行的計劃，則大約10億人將必須接種疫苗。事實上，這樣的防治計劃將部分地取決于大量且快速生產(chǎn)疫苗的效率。為了面對針對季節(jié)性傳播菌株的疫苗的日益增長的需求，并且為了面對難于預(yù)測的對針對一種(或多種)潛在大流行性新興菌株的疫苗的需求，蛋的可用性可以被證明是一個限制因素，尤其是因為禽流感在家畜中的風(fēng)險仍然存在。然而，在蛋中產(chǎn)生良好產(chǎn)量的b菌株以及一些不是6+2而是5+3或4+4的a型重配體，一直存在困難。因此，為了減少傳播的原型菌株的選擇和疫苗劑量生產(chǎn)之間的時間，已經(jīng)開發(fā)了替代策略。也可以在細胞系統(tǒng)中產(chǎn)生流感病毒(barrettpn,portsmouthd,ehrlichhj.developingcellculture-derivedpandemicvaccines.curropinmolther.2010feb；12(1):21-30([1])；lerua,jacobd,transfiguracionj,ansorges,henryo,kamenaa.scalableproductionofinfluenzavirusinhek-293cellsforefficientvaccinemanufacturing.vaccine.2010may7；28(21):3661-71([2]))?？梢允褂霉I(yè)生物反應(yīng)器在細胞上進行疫苗菌株的生產(chǎn)及其擴增。實際上，使用細胞系擴增疫苗菌株使得尤其可以不再依賴于“蛋”系統(tǒng)(蛋的數(shù)量和生產(chǎn)產(chǎn)量不足以控制大流行)，減少了在尿囊生產(chǎn)中經(jīng)常觀察到的表面抗原修飾，并且不引起過敏。這種策略使得可以更容易地滿足在大流行性流感病毒(例如ah1n1)出現(xiàn)期間對疫苗的需求。盡管如此，這些系統(tǒng)，特別是登記的細胞系(mdck、vero、perc6、eb66等)不提供流感病毒的最佳復(fù)制，從而在疫苗種生產(chǎn)方面構(gòu)成了主要的限制因素。細胞系統(tǒng)中的生產(chǎn)產(chǎn)量目前仍然低于尿囊系統(tǒng)中獲得的產(chǎn)量。因此，當前，很少有制造商選擇這種新的生產(chǎn)方法，因為當前工業(yè)過程遠不如蛋那樣有效。為了盡可能多地減少疫苗劑量生產(chǎn)時間并且為了在劑量數(shù)量方面獲得相當?shù)漠a(chǎn)量水平，可以通過使用反向遺傳技術(shù)來獲得疫苗種，使得可以更快速地獲得“6+2”組成的疫苗重配株，從而消除所有的選擇步驟。通過反向遺傳學(xué)生產(chǎn)重組病毒為有效滿足疫苗需求提供了最現(xiàn)實的選擇。其次，通過反向遺傳學(xué)產(chǎn)生重組病毒提供了產(chǎn)生“優(yōu)化的”pr8病毒的可能性，當通過與原型菌株的基因重配的過程使用時，使得可以產(chǎn)生對于蛋內(nèi)或細胞內(nèi)疫苗劑量生產(chǎn)具有優(yōu)化的病毒特征的疫苗重配株。這種類型的方法也可以應(yīng)用于細胞內(nèi)生產(chǎn)。用于優(yōu)化尿囊和細胞系統(tǒng)中的疫苗生產(chǎn)的另一策略，旨在基于疫苗種的遺傳修飾和/或使用靶向宿主細胞的小化學(xué)分子，增加病毒生產(chǎn)的產(chǎn)量。這些方法正在進行評估(fr10/55716([3])、wo2012007380([4])、fr10/59132([5])、wo2012059696([6]))。另一策略在于通過添加佐劑來改善疫苗抗原的功效，由此使得對于相同有限數(shù)量的蛋和產(chǎn)生的相同量的糖蛋白，可以產(chǎn)生更多的疫苗劑量(ellebedyah,webbyrj.influenzavaccines.vaccine.2009nov5；27suppl4:d65-8([7]))。這種方法更適合于具有免疫系統(tǒng)缺陷的人。此外，公眾輿論對佐劑的使用是相當不利的。最后，一種策略在于優(yōu)化生產(chǎn)過程下游的提取疫苗抗原(“分裂”)的步驟：目的是獲得更好和更多的提取疫苗抗原，同時更有效地保持它們的構(gòu)象結(jié)構(gòu)，并從而保持疫苗的保護力直接依賴的抗原性。更具體地，在蔗糖梯度上，對使用感染的胚胎雞蛋(收獲尿囊液)或在生物反應(yīng)器中使用感染的細胞系培養(yǎng)物(培養(yǎng)基的收獲)獲得的病毒生產(chǎn)進行純化，然后通過化學(xué)處理(優(yōu)選用福爾馬林，以獲得根據(jù)規(guī)定的15log的病毒滴度下降)進行滅活。該方法隨后涉及使用洗滌劑以破壞/片段化(“破壞/片段化”)病毒(“分裂病毒粒子”)和通過滲濾純化疫苗抗原.將獲得的分裂或片段化病毒與部分或完全溶解的病毒蛋白組合，由此改變病毒的(傳染性)的完整性和功能。分裂還構(gòu)成了補充該化學(xué)方法的滅活的方法；由此使用術(shù)語正交滅活。分裂可以通過使用各種洗滌劑特別是使用非離子和離子(例如陽離子)表面活性劑處理經(jīng)純化的病毒來獲得，表面活性劑例如烷基糖苷、烷基硫代糖苷、酰基糖、磺基甜菜堿、甜菜堿、聚氧亞甲基烷基醚、n,n-二烷基葡糖酰胺、甲基葡萄糖苷、烷基苯氧基聚乙氧基乙醇、季銨化合物、十二烷基肌氨酸鈉、ctab(十六烷基三甲基溴化銨)、磷酸三正丁酯、塞太弗倫(cetavlon)、肉豆蔻基三甲基銨鹽、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(lipofectin)、陽離子脂質(zhì)體(lipofectamine)、dot-ma(十二烷基三甲基溴化銨)、辛基或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如tritonx-100或tritonnl01)、聚氧乙烯脫水山梨醇酯(tween表面活性劑)、聚氧乙烯醚、乙醚、聚山梨醇酯80、脫氧膽酸鹽、np9等。在這方面，已知有許多方法用于分裂(片段化)流感病毒。文獻wo02/28422([8])描述了例如通過選自月桂醇聚醚9、nadoc、肌氨酸鈉組、tween80tm和tritonx100的分裂劑的分裂方法。文獻wo02/067983([9])在其一部分中描述了通過脫氧膽酸鈉的分裂方法。表面活性劑(或洗滌劑)是由在水中具有顯著溶解度的明顯不同的極性和非極性結(jié)構(gòu)域組成的兩親性分子。超過稱為臨界膠束濃度(cmc)的精確濃度時，膠束化現(xiàn)象由疏水效應(yīng)引導(dǎo)(m.rosen,“surfactantsandinterfacialphenomena”,3rded.,hoboken:johnwiley&sons,inc.,2004([10]))。疏水尾部的性質(zhì)、其長度、其不飽和度和支化度、芳香核的存在或不存在以及鏈的數(shù)量影響表面活性劑單體的化學(xué)性質(zhì)及其在水溶液中的自組裝(cmc，幾何形式的聚集體的聚集數(shù)、大小和性質(zhì))。親水基團(中性或帶電的、小或大體積)的性質(zhì)對表面活性劑的性質(zhì)及其生物應(yīng)用具有強烈影響。根據(jù)其親水部分的性質(zhì)，表面活性劑被分為三個主要族(a.m.schwartz,j.w.perry,j.berch,“surfaceactiveagentsanddetergents”,volii,r.kriegerpub.co.,newyork,1977([11]))：離子(陽離子或陰離子)表面活性劑、兩性離子(或兩性)表面活性劑以及中性表面活性劑。它們通常被稱為軟或粗糙的(硬的，harsh)。在這個意義上，可以根據(jù)洗滌劑的最粗糙類別至最軟類別對洗滌劑進行分類排序：離子>兩性>中性。離子表面活性劑，例如ctab，通常是變性的。它們破壞蛋白質(zhì)的分子內(nèi)庫侖相互作用，從而擾亂它們的三維構(gòu)象。兩性離子表面活性劑(磺基甜菜堿、甜菜堿)在其親水部分中同時含有正電荷和負電荷，并且是電中性的。中性表面活性劑(特別是包括烷基糖苷和聚氧亞甲基烷基醚)的特征在于不帶電的親水性頭部。它們是軟的且非變性的表面活性劑，然而，其破壞蛋白質(zhì)-脂質(zhì)和脂質(zhì)-脂質(zhì)相互作用，但對蛋白質(zhì)的分子內(nèi)庫侖相互作用沒有影響。在生物化學(xué)中常用包含聚乙二醇型親水部分的洗滌劑(tritonx100、tween等)。它們具有被認為是在其peg(聚乙二醇)基團上具有可變聚合指數(shù)n的化學(xué)異相分子的缺點。因此，這些批次的商業(yè)洗滌劑不是以在溶液中化學(xué)明確定義的物種的形式，這可導(dǎo)致其物理化學(xué)性質(zhì)的變化。在目前大流行性致病病毒出現(xiàn)的背景下，感染(例如流感感染)僅在工業(yè)化國家即可導(dǎo)致130萬到200萬人的住院治療和280000到650000萬人的死亡人數(shù)(who數(shù)據(jù))。因此，主要的經(jīng)濟挑戰(zhàn)之一是能夠降低制造疫苗劑量的成本(每次產(chǎn)生更多的劑量和/或獲得相同量劑量所需的時間減少)。在這種背景下和從經(jīng)濟的角度，尋找并開發(fā)用于生產(chǎn)疫苗種的新的優(yōu)化過程是合理的，特別是在如下方面：(i)提高生產(chǎn)產(chǎn)量、(ii)減少時間和/或降低成本、(iii)產(chǎn)生更具免疫原性的抗原。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的正是滿足這些需要，其通過提供一種用于制備疫苗抗原的方法，使得在工業(yè)生產(chǎn)過程中，特別是在細胞或尿囊系統(tǒng)中，能夠定性和定量地優(yōu)化疫苗抗原(例如流感疫苗抗原)的提取步驟。事實上，令人驚訝和出乎意料地，申請人已經(jīng)證明式(i)的杯芳烴并且有利地是式(ii)的杯芳烴或它們的藥物學(xué)上可接受的鹽能夠被用來片段化(分裂)病毒，特別是通過替換通常用于使膜片段化的洗滌劑，例如tritonx100或tween80。特別地，本發(fā)明的方法具有更好地保持膜糖蛋白(諸如表面疫苗抗原)的構(gòu)象的優(yōu)點。令人驚訝地，與已知技術(shù)相比，本發(fā)明在片段化(特別是(“分裂”))病毒的步驟期間能夠更好地保持抗原的構(gòu)象.在這種情況下，從產(chǎn)生免疫性的觀點，其使用使得能夠產(chǎn)生更有效的疫苗抗原，并從而減少用于相同或相當保護的疫苗批次中所需的抗原的量。另外，這些更有效的抗原被更好地保存，有利地使得可以完全或部分地替代已知的佐劑?？商鎿Q地，杯芳烴可以在疫苗組合物中用作佐劑和/或賦形劑，以改善疫苗抗原的性質(zhì)。與常規(guī)使用的tritonx100洗滌劑分子相比，本發(fā)明尤其可以提高產(chǎn)生的疫苗抗原的質(zhì)量和/或數(shù)量。本發(fā)明的使用可以適用于存在的各種生產(chǎn)模式(蛋，即尿囊系統(tǒng)，和細胞)，而且可適用于生產(chǎn)優(yōu)化的其他補充方法(前文提及的)，以及適用于正在開發(fā)的生產(chǎn)模式，例如涉及煙草葉、原生動物的方法，這一列舉不是限制性的。因此，在本發(fā)明的上下文中，描述了一種制備疫苗抗原的方法，包含使與所述疫苗抗原相關(guān)的生物膜與至少一種式(i)的杯芳烴或其藥物學(xué)上可接受的鹽接觸以片段化所述生物膜的步驟：其中-n是等于1、3、5或6的整數(shù)；-r1、r2、r3和r4彼此獨立地表示氫原子；直鏈或支鏈(c1-c18)烷基，其任選地被一個或多個選自o、s、n和p原子的組的雜原子取代；直鏈或支鏈(c1-c18)烷基，其任選地取代有-coor基團，其中r是直鏈或支鏈(c1-c4)烷基；包含6至20個碳原子的芳基；-x1、x2和x3彼此獨立地表示-(ch2)m-coor'或-so3或-(ch2)mpo(oh)o或-(ch2)m-nr’3基團，其中-m是0至20范圍內(nèi)的整數(shù)，-r'表示氫原子或者直鏈或支鏈(c1-c4)烷基；其中疫苗抗原不是hiv(人類免疫缺陷病毒)抗原或cmv(巨細胞病毒)病毒。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“疫苗抗原”意指包含至少一種能夠被病毒表達的膜蛋白的任何制劑。疫苗抗原也可以包含生物膜的片段。在這方面，膜蛋白可以與生物膜相關(guān)。疫苗抗原也被理解為是叢生有(bristlingwith)疫苗抗原的生物膜片段，例如在生物膜的內(nèi)表面和/或外表面上。疫苗抗原能夠有利地刺激施用有其的人或動物個體針對表達這種抗原的病毒且特別是針對膜蛋白的免疫應(yīng)答。疫苗抗原可有利地使得個體針對抗原且特別是針對膜蛋白能夠完全或部分免疫。對于本發(fā)明的目的，術(shù)語“膜蛋白”意指與生物膜相關(guān)的蛋白質(zhì)，也就是說錨定的或整體的，不能在水性介質(zhì)中自由擴散并且在這些介質(zhì)中不穩(wěn)定。在膜蛋白中，例如可以提及血漿膜蛋白和細胞內(nèi)膜蛋白(例如，線粒體膜蛋白、網(wǎng)狀蛋白、高爾基體蛋白、溶酶體蛋白，這一列舉不是限制性的)。膜蛋白可以是多穿蛋白(polytopicprotein)或單穿蛋白(monotopicprotein)。術(shù)語“多穿蛋白”意指穿過膜一次或多次的蛋白質(zhì)。術(shù)語“單穿蛋白”意指僅與膜的一側(cè)相互作用的蛋白質(zhì)。膜蛋白也可以是整合蛋白質(zhì)或外周蛋白質(zhì)。術(shù)語“整合蛋白質(zhì)”意指單穿蛋白或多穿蛋白，其與膜強烈相互作用，特別是通過疏水相互作用。這些蛋白質(zhì)也稱為“內(nèi)在蛋白質(zhì)”。術(shù)語“外周蛋白質(zhì)”意指單穿蛋白，其與膜弱相互作用，即通過靜電鍵或通過其它膜蛋白。這些蛋白質(zhì)也被稱為“外在蛋白質(zhì)”。膜蛋白可以是由感染劑表達的抗原蛋白，需要針對該感染劑其接種疫苗。它可以是病毒或微生物來源的蛋白質(zhì)。換句話說，膜蛋白可以是由感染劑的基因組編碼的蛋白質(zhì)。在這一方面，感染劑可以是病毒，特別是包膜病毒。當它是病毒時，它可以是選自包括以下的組的任何類型的菌株的野生型或重組病毒：-正粘液病毒科，特別地包括流感病毒，例如哺乳動物流感病毒，更特別是人流感病毒、豬流感病毒、馬流感病毒、貓流感病毒、禽流感病毒，例如天鵝流感病毒，-副粘液病毒科，包括呼吸道病毒(仙臺病毒，牛副流感病毒3，人副流感病毒1和3)、腮腺炎病毒(人副流感病毒2、4、4a、4b，人腮腺炎病毒，5型副流感病毒)、禽腮腺病毒(新城疫病毒(ndv))、肺病毒(人類和牛呼吸道合胞病毒)、偏肺病毒(動物和人類偏肺病毒)、麻疹病毒(麻疹病毒、瘟熱病毒和牛瘟病毒)和亨尼帕病毒(亨德拉病毒，尼帕病毒等)，-冠狀病毒科，特別地包括人冠狀病毒(特別是nl63,sars-cov,mers-cov)和動物冠狀病毒(犬、豬、牛冠狀病毒和禽傳染性支氣管炎冠狀病毒)，-黃病毒科，特別地包括蟲媒病毒(蜱媒腦炎病毒)、黃病毒(登革熱病毒，黃熱病毒，圣路易腦炎病毒，日本腦炎病毒，西尼羅病毒包括kunjin亞型，muray谷病毒，rocio病毒，ilheus病毒，蜱傳腦膜腦炎病毒)、丙型肝炎病毒(丙型肝炎病毒，甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒)和瘟病毒(邊緣病病毒，牛腹瀉病毒，天鵝熱病毒)，-彈狀病毒科，特別地包括水泡性病毒(水泡性口炎病毒)、狂犬病病毒(澳大利亞，歐洲拉各斯蝙蝠病毒，狂犬病病毒)、短暫病毒(牛短暫熱病毒)、新生彈狀病毒(蛇頭病毒，出血性敗血癥病毒和造血性壞死病毒)，-披膜病毒科，特別地包括風(fēng)疹病毒屬(風(fēng)疹病毒)、甲病毒屬(特別是辛德比斯病毒、西門利克森林病毒、o'nyong'nyong病毒、基孔肯雅病毒、馬雅羅病毒、羅斯河病毒、東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒)，-皰疹病毒科，特別地包括人類皰疹病毒(hsv-1、hsv-2、水痘病毒、埃-巴二式病毒(eb病毒)、巨細胞病毒、玫瑰疹病毒、hhv-7和kshv)，-痘病毒科，特別地包括正痘病毒(例如特別是駱駝痘、牛痘(cowpox)、天花、牛痘(vaccinia))、腕痘病毒(特別是包括羊痘)、禽痘病毒(特別是包括禽痘)、副痘病毒(尤其包括牛丘疹性口炎病毒)和左旋蛋白病毒(特別是包括粘液瘤病毒)，-逆轉(zhuǎn)錄病毒科，特別是包括慢病毒(特別是包括人類、貓和猴免疫缺陷病毒1和2，山羊關(guān)節(jié)炎性腦膜炎病毒或梅迪-維納斯病病毒(maedi-visna病病毒))和逆轉(zhuǎn)錄病毒(特別是包括勞斯肉瘤病毒，人淋巴細胞性病毒1、2和3)，該列舉不是限制性的。其還可以是通過反向遺傳學(xué)在細胞系統(tǒng)中產(chǎn)生的經(jīng)修飾的、重配或原型病毒。其特別地可以是病毒糖蛋白(例如神經(jīng)氨酸酶或血凝素)，或m1和m2膜蛋白，核蛋白，流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白(ns1)，或例如副粘液病毒科病毒f融合蛋白或任何其它病毒蛋白，特別是與上述病毒的膜相關(guān)的任何蛋白質(zhì)。其也可以是修飾的病毒蛋白，例如在文獻wo2010/058100([26])或wo2010/058099([27])中描述的融合蛋白f的突變體。當膜蛋白衍生自原核感染劑時，其可以例如是選自來自沙門氏菌的百日咳桿菌粘附素外表面膜抗原和百日咳博德特菌百日咳桿菌粘附素抗原，這一列舉并非限制性的。對于本發(fā)明的目的，術(shù)語“生物膜”意指任何將分子組裝成將細胞與其環(huán)境隔開的雙層片，其由兩親性脂質(zhì)(特別是磷脂)的雙層組成，每個膜脂質(zhì)由指向膜外部的親水極性頭部和指向膜內(nèi)部的疏水尾部組成。其可以是原核細胞、真核、動物或植物細胞或病毒的膜。其可以例如是囊泡膜，例如vlp(病毒樣顆粒)的膜(例如wo2007132790([29])、wo1999036085([30])、wo2005058357([31])或wo2008092153([32])描述的)、溶酶體的膜、外來體或蛋白脂質(zhì)體的膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜或高爾基體膜，這一列舉不是限制性的。在真核細胞膜的情況下，其可以是囊泡膜、粗糙的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、高爾基體膜、光滑的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜或質(zhì)膜，這一列舉不是限制性的。其可以是衍生自細胞系的分離的轉(zhuǎn)基因宿主細胞，其中細胞系例如通過重組dna或rna遺傳工程技術(shù)或通過用表達一種或多種目的疫苗抗原的病毒載體感染細胞，表達一種或多種疫苗抗原?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的可以使得在細胞中表達轉(zhuǎn)基因的任何遺傳工程技術(shù)。其可包括涉及表達通過轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如電穿孔、顯微注射、超聲、感染或轉(zhuǎn)染)引入細胞中的dna或rna(例如合成編碼mrna)的技術(shù)。例如文獻wo02090533([33])中所描述的，表達可以是至少一種目的抗原的瞬時和/或誘導(dǎo)型和/或組成型表達。該細胞可以是任何細胞，特別是除了人胚胎干細胞之外的細胞，例如分離的人細胞(例如排除人胚胎干細胞)，或分離的非人動物或植物細胞。分離的細胞可以來源于選自以下的細胞系：vero(atccno.ccl-81)諸如vero76(atccno.crl-1587)、cho諸如cho-kl(ccl61，atcc)、bhk諸如bhk-21[c-13](ccl-10tm)、hela、(crucell)、hek293(crl-1573tm)、sf9(atcc，crl-1711)、(valneva/vivalis，描述于文獻wo2008129058([12])中)、mdck例如mdck(nbl-2)(ccl-34tm)，這一列舉不是限制性的。在從細胞系分離的細胞的情況下，該方法包含下列步驟：-用含有病毒的流體接種分離的細胞，-在細胞中繁殖病毒，-將由此繁殖的病毒收集在細胞培養(yǎng)上清液中，-任選地將由此收集的病毒滅活，-將病毒膜片段化。在從細胞系分離的細胞的情況下，本發(fā)明的方法可替代地包含下列步驟：-用含有病毒的流體接種分離的細胞，-在細胞中繁殖病毒，-收集在其表面表達抗原的細胞，-通過膜分離方法例如通過破碎細胞并隨后離心從細胞中分離出膜，例如質(zhì)膜，-將膜片段化。或另外可替代地：-通過遺傳工程方法在分離的細胞中表達抗原，-擴增表達抗原的細胞；-收集在其表面表達抗原的細胞，-通過膜分離方法例如通過破碎細胞并隨后離心從細胞中分離出膜，例如質(zhì)膜，-將膜片段化。可替換地，該細胞可以源自胚胎的尿囊系統(tǒng)。在這一方面，這種胚胎系統(tǒng)可以是任何動物種類(例如雞蛋)或任何其他動物(特別是禽類)的尿囊系統(tǒng)，其允許病毒進入的。例如，為了獲得產(chǎn)生如上所定義的膜蛋白的含胚雞蛋，步驟可以如下：-將例如200μl的濃度為10-3pfu/ml的病毒接種在來自無菌室里飼養(yǎng)的母雞的11天齡的含胚雞蛋的尿囊液中，-然后將這些雞蛋在約33℃下溫育2至3天，在此期間，病毒在尿囊液中積累，-將雞蛋切開，將其中感染劑的濃度已經(jīng)倍增的尿囊液抽出。在病毒膜的情況下，其可以是通過感染的宿主細胞的細胞質(zhì)或漿細胞膜出芽而衍生的包膜，這取決于病毒和/或所表達的疫苗抗原的病毒來源。在這種情況下，包膜是感染的細胞的細胞質(zhì)或細胞漿來源的膜，其通過在病毒發(fā)芽過程中與這些膜相關(guān)的病毒糖蛋白的表達來修飾，并且包膜的脂質(zhì)本身是細胞來源的。在這種情況下，其可以是病毒的膜，針對該病毒期望接種疫苗和/或免疫。對于本發(fā)明的目的，術(shù)語“杯芳烴”旨在是指杯芳烴家族的超分子表面活性劑。在這一方面，本發(fā)明中使用的杯芳烴可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)合成。例如，其可以涉及文獻wo2009/144419([28])中描述的方法。對于本發(fā)明的目的，術(shù)語“烷基”旨在是指包含1至12個碳原子的飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的任選被取代的碳基基團。作為指示，可以提及甲基、乙基、丙基、丁基、異丁基、戊基、己基、辛基、壬基、癸基、十一烷基和十二烷基(docecanyl)及其支化異構(gòu)體。該烷基可以任選地取代有選自基團o、s、n和p的組的一個或多個雜原子。術(shù)語“芳基”通常表示包含6至20個碳原子的環(huán)狀芳族取代基。在本發(fā)明的上下文中，芳基可以是單環(huán)或多環(huán)的，其任選地被取代。在這方面，可以提及芐基或苯基。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“藥物學(xué)上可接受的鹽”包括取決于化合物上存在的取代基用無毒的酸或堿制備的鹽。當本發(fā)明的化合物包含酸官能團時，相應(yīng)的鹽可以通過任選在溶劑存在下向中性形式的該化合物中加入有機或無機堿來獲得，溶劑優(yōu)選是惰性的。堿的加成鹽的實例可以是鈉、鉀、鈣、銨、氨基(有機)或鎂鹽。當本發(fā)明的化合物包含堿性官能團時，相應(yīng)的鹽可通過任選在(優(yōu)選為惰性的)溶劑中添加有機或無機酸來獲得。無機酸加成鹽的實例可以是鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸、一氫碳酸、磷酸、一氫磷酸、二氫磷酸、硫酸、一氫硫酸或氫碘酸的鹽。有機酸加成鹽的實例可以是乙酸、丙酸、異丁酸、馬來酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富馬酸、乳酸、扁桃酸、苯二甲酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸、酒石酸或甲磺酸的鹽。在一個特定實施方式中，可以使用至少一種式(i)的杯芳烴或其藥物學(xué)上可接受的鹽來進行所述片段化步驟，其中：-n是等于1的整數(shù)；-r1、r2、r3和r4彼此獨立地表示氫原子；或直鏈或支鏈(c1-c18)烷基；-x1、x2和x3彼此獨立地表示-(ch2)m-coor’或-so3y或-(ch2)m-po(oh)oy或-(ch2)m-nr’3基團，其中-m是0至20范圍內(nèi)的整數(shù)，-r’表示氫原子。一種用于制備疫苗抗原的方法，包含步驟：使與所述疫苗抗原相關(guān)的生物膜與至少一種式(iii)的杯芳烴或其藥物學(xué)上可接受的鹽接觸以將所述生物膜片段化：其中：-x是-(ch2)o-co2y基團，-o是1至3的整數(shù)，-r4是直鏈或支鏈(c1-c4)烷基，并且-y是堿金屬，其中獲得的所述疫苗抗原還包含生物膜的片段，所述片段與該抗原相關(guān)。本發(fā)明的主題涉及一種用于制備疫苗抗原的方法，包含步驟：使與所述疫苗抗原相關(guān)的生物膜與至少一種式(ii)的杯芳烴或其藥物學(xué)上可接受的鹽接觸以將所述生物膜片段化：其中：-x是-(ch2)o-co2y基團，-o是1至3的整數(shù)，并且-y是堿金屬，其中所獲得的所述疫苗抗原還包含生物膜的片段，所述片段與這種抗原相關(guān)，所述片段化步驟是在這種抗原上進行的。根據(jù)本發(fā)明的一個特定實施方式，o等于1。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，杯芳烴被稱為calx133ace。在其中杯芳烴為calx133ace的這種情況下，除了前文描述的疫苗的片段化之外，本發(fā)明的方法及其用途可以包含片段化cmv和hiv。在一個替代實施方式中，疫苗抗原不是hiv(人類免疫缺陷病毒)抗原或cmv(巨細胞病毒)抗原。有利地是，在方法中杯芳烴(特別是式(iii)的杯芳烴，特別是calx133ace)的使用允許最佳保持疫苗抗原的構(gòu)象，例如通過保持疫苗抗原在其分裂的病毒膜內(nèi)的構(gòu)象。有利地是，事實上，通過實施本發(fā)明的方法獲得的疫苗抗原包含生物膜的片段，所述片段與疫苗抗原相關(guān)，其允許最佳保存疫苗抗原的構(gòu)象。有利地是，與特別是通過洗滌劑的方式片段化的現(xiàn)有技術(shù)方法相比，根據(jù)本發(fā)明的病毒抗原的構(gòu)象的保存能夠獲得更佳的根據(jù)本發(fā)明的方法片段化的病毒抗原的功效，特別是疫苗功效。對于本發(fā)明的目的，術(shù)語“堿金屬”是指任何堿金屬，例如選自鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、(有機)氨基鹽或鎂鹽。在一個特定的實施方式中，o等于1，和/或y是鈉。有利地是，與其它表面活性劑(特別是tritonx100和脫氧膽酸鹽)相比，本發(fā)明中使用的杯芳烴提供了改善保存的膜糖蛋白(例如表面疫苗抗原)的構(gòu)象。在本上下文中，使用其使得可以特別有利地產(chǎn)生從免疫原性觀點更有效的疫苗抗原，并因此減少疫苗批次中用于相同保護所需的抗原的量。另外，在本發(fā)明的一個特定實施方式中，因為這些抗原得到了更好的保存所以更有效，因此使得這些抗原可以完全或部分替代佐劑。對于本發(fā)明的目的，術(shù)語“生物膜的片段化”旨在是指將整個膜解離(decomplexification)成膜片段的任何脫復(fù)化。有利地是，生物膜的片段化(也稱為分裂)使得能夠獲得包含膜蛋白的生物膜片段。有利地，通過本發(fā)明的方法將膜蛋白保持在生物膜片段中，或換言之保持在膜范圍內(nèi)，從而使得能夠保存所述膜蛋白的構(gòu)象并且能夠生成從產(chǎn)生免疫性觀點看比使用現(xiàn)有技術(shù)方法更有效的疫苗抗原。接觸步驟可以在5.5至10的ph范圍內(nèi)進行，優(yōu)選6至9，例如約7.95。片段化步驟可以在0至100℃的溫度范圍內(nèi)進行，優(yōu)選4至25℃，特別是4℃。片段化步驟可以使用10-6至10-2m范圍內(nèi)的杯芳烴例如calx133ace濃度。由于杯芳烴的表面活性劑性質(zhì)，所以其可以使用溶液形式的杯芳烴或膠體聚集體形式的杯芳烴進行片段化步驟。對于本發(fā)明的目的，術(shù)語“膠體聚集體”旨在是指幾十至幾百個杯芳烴分子的組裝，杯芳烴分子根據(jù)相對于溶劑的排斥力而組織化。考慮到它們的性質(zhì)，杯芳烴(例如calx133ace)能夠在合適的介質(zhì)中(例如在水中、在水溶液中、在等滲介質(zhì)中或在生物介質(zhì)中)形成聚集體。聚集體優(yōu)選可以是膠束的形式。術(shù)語“膠束”指示根據(jù)所使用的溶劑而組織化的式(i)的杯芳烴分子的球形聚集體。例如，在水或水性溶劑中，親脂端面向膠束，而親水端形成膠束與溶劑的界面。在有機溶劑，例如油中，排列反轉(zhuǎn)。術(shù)語“脂質(zhì)體”指示小的人工產(chǎn)生的囊泡，其特別地由通過水性區(qū)室彼此分隔開的磷脂條帶組成。它們可以具有非常接近細胞膜的結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“納米顆?！笔侵笖?shù)百至數(shù)千個式(i)的杯芳烴分子的組裝，產(chǎn)生至少一個維度為納米尺寸例如1至300nm的物體。在本發(fā)明的方法中，使包含待提取的膜蛋白的水性懸浮液與式(i)的杯芳烴接觸的步驟，任選地可以在存在至少一種選自包括以下的組的共溶質(zhì)的存在下進行：i)選自包括藥物學(xué)上可接受的鹽的組的有機和無機鹽；ii)選自氨基酸、維生素、脂質(zhì)、類固醇、碳水化合物或代謝物的組的小生物活性分子；iii)選自肽、寡核苷酸和寡糖的寡聚的組的低聚生物活性分子；iv)選自蛋白質(zhì)、多核苷酸和多糖的組的聚合生物分子。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，接觸步驟之前可以進行如下步驟，其中：-將待提取的膜蛋白或含有其的膜部分溶解在緩沖溶液中，和-根據(jù)前文描述的溫度、ph和濃度條件加入式(i)的杯芳烴。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式中，接觸步驟之后可以是離心步驟，使得能夠?qū)⑴c式(i)的杯芳烴復(fù)合的膜蛋白與非復(fù)合的膜蛋白分離開。與式(i)的杯芳烴復(fù)合的膜蛋白及非復(fù)合的膜蛋白可以通過離心來分離，例如在4℃和在100000g的速度下離心1小時。離心條件可取決于蛋白質(zhì)的性質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠了解如何選擇最佳的離心條件，例如lenoir,g.,menguy,t.,corre,f.,montigny,c.,pedersen,p.a.,thinès,d.,lemaire,m.,andfalson,p.(2002)overproductioninyeastandrapidandefficientpurificationoftherabbitsercaiaca2+-atpase,biochim.biophys.acta1560,67-83([13])中的描述。有利地是，在片段化步驟之前和/或之后可以存在通過本領(lǐng)域技術(shù)人員任何已知的方法進行滅活的步驟，例如通過甲醛、通過β-丙內(nèi)酯、通過紫外線輻射、或用福爾馬林滅活，任選地之后或之前進行部分純化的步驟，例如通過超速離心，如文獻us2009/0060950([14])和us6,048,537([15])中的描述。本發(fā)明的方法可以屬于任何常規(guī)的工業(yè)疫苗抗原生產(chǎn)方法，例如文獻wo2011051235([16])、us2011/0014230([17])、wo2002/028426([18])、us2009/0060950([14])、wo02/067983([9])、us4,206,014([19])、wo2009/115917([20])或wo2005/113756([21])中描述的方法，不同之處在于將用于片段化(分裂)的化合物替換為式(i)的杯芳烴或其鹽。根據(jù)一個實施方式，可以進行滲濾步驟。有利地是，其使得可以除去表面活性劑或其它雜質(zhì)。該步驟可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進行。例如，其可以是選自滲析、稀釋、柱上的緩沖液交換、酶作用、使用聚合物例如biobead特別是sm2或dowex、沉淀的技術(shù)或是ollivonetal.(ollivonm1,lesieurs,grabielle-madelmontc,paternostrem.:"vesiclereconstitutionfromlipid-detergentmixedmicelles"biochimbiophysacta.2000nov23；1508(1-2):34-50([25]))描述的技術(shù)；這一列舉不是窮盡的。有利地是，可以進行無菌過濾步驟。有利地是，該步驟使得可以去除更多的雜質(zhì)。該步驟可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進行。其可以例如是過濾，例如通過孔隙率小于0.22μm的過濾膜。在一個實施方式中，本發(fā)明的方法還可以包括滲析所述疫苗抗原的步驟。有利地是，該步驟使得可以去除更多的雜質(zhì)。該步驟可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進行。其可以例如是透過具有小于14000道爾頓孔隙率的膜的滲析。在一個實施方式中，方法還可以包含濃縮膜蛋白的步驟。該步驟可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進行。其可以例如是沉淀(例如使用peg(聚乙二醇)或硫酸銨)、蒸發(fā)、使用濃縮器例如型，例如或(merckmillipore)。本發(fā)明的方法還可以包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的在疫苗制備中的任何步驟，例如文獻wo2011051235([16])、us2011/0014230([17])、wo2002028426([18])、us2009/0060950([14])、wo02/067983([9])、us4,206,014([19])、wo2009/115917([20])、wo2005/113756([21])中的方法中的描述。還描述了可通過實施前文定義的方法生產(chǎn)的疫功抗原，例如其中疫苗抗原不是hiv抗原或cmv抗原。還描述了包含前文描述的疫苗抗原的疫苗，例如其中疫苗抗原不是hiv抗原或cmv抗原。疫苗可以通過適于所需疫苗接種的任何已知途徑施用，例如通過注射(特別是皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、經(jīng)口、鼻內(nèi)、經(jīng)上皮、經(jīng)皮)、通過貼劑、通過粘膜粘附片劑、直腸(例如通過栓劑)施用。疫苗可以是具有佐劑的疫苗，型(gsk)、(novartis)或(sanofipasteur)型，或不具有佐劑的疫苗，三價fluviral(gsk)或四價fluarix(gsk)、(baxter)或(sanofipasteur)型，這一列舉不是限制性的。在這些例子中，病毒可以被替換為根據(jù)本發(fā)明所述的疫苗抗原。在具有佐劑的疫苗的情況下，所述佐劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何佐劑，其可以增加免疫應(yīng)答，例如鋁鹽、溶血卵磷脂、礦物凝膠、氫氧化鋁、微乳液、脂質(zhì)顆?；蚬押塑账帷Ｒ呙缈梢园魏嗡幬飳W(xué)上可接受的載體，例如上述疫苗中包含的那些，或穩(wěn)定鹽、溶解劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、增稠劑、用于保持生理氧化還原電位的氧化還原化合物，該列舉不是限制性的。用于人的疫苗的劑量可以例如對應(yīng)于待注射的0.5ml的體積。疫苗還可以包含式(i)的杯芳烴，特別是以賦形劑的形式。關(guān)于本發(fā)明，術(shù)語“賦形劑”意指意在具有公認效果的物質(zhì)。其可以有利地賦予最終產(chǎn)品給定的構(gòu)象或其它特定的物理特性，同時防止與活性成分的任何不希望的相互作用，特別是化學(xué)相互作用。在這一點上，可以存在地疫苗中的杯芳烴的量可以為0.1至1000μg，例如0.5至700μg或1至600μg或者5至500μg。本發(fā)明的另一個主題涉及杯芳烴或式(ii)的杯芳烴在用于制備疫苗或前文描述的疫苗抗原的用途，例如其中的疫苗抗原不是前文描述的病毒抗原，除了hiv的那些或cmv的抗原。還描述了式(i)的杯芳烴的用途。本發(fā)明的另一主題涉及前文定義的疫苗抗原或疫苗，其在治療或預(yù)防感染性疾病中用作藥物的應(yīng)用，例如其中疫苗抗原不是hiv抗原或cmv抗原。感染性疾病可以例如是由一種或多種選自以下的病毒引起的疾?。?正粘液病毒科，特別地包括流感病毒，例如哺乳動物流感病毒，更特別是人流感病毒、豬流感病毒、馬流感病毒、貓流感病毒、禽流感病毒，例如天鵝流感病毒，-副粘液病毒科，包括呼吸道病毒(仙臺病毒，牛副流感病毒3，人副流感病毒1和3)、腮腺炎病毒(人副流感病毒2、4、4a、4b，人腮腺炎病毒，5型副流感病毒)、禽腮腺病毒(新城疫病毒(ndv))、肺病毒(人類和牛呼吸道合胞病毒)、偏肺病毒(動物和人類偏肺病毒)、麻疹病毒(麻疹病毒、瘟熱病毒和牛瘟病毒)和亨尼帕病毒(亨德拉病毒，尼帕病毒等)，-冠狀病毒科，特別地包括人冠狀病毒(特別是nl63,sars-cov,mers-cov)和動物冠狀病毒(犬、豬、牛冠狀病毒和禽傳染性支氣管炎冠狀病毒)，-黃病毒科，特別地包括蟲媒病毒(蜱媒腦炎病毒)、黃病毒(登革熱病毒，黃熱病毒，圣路易腦炎病毒，日本腦炎病毒，西尼羅病毒包括kunjin亞型，murray谷病毒，rocio病毒，ilheus病毒，蜱傳腦膜腦炎病毒)、丙型肝炎病毒(丙型肝炎病毒，甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒)和瘟病毒(邊緣病病毒，牛腹瀉病毒，天鵝熱病毒)，-彈狀病毒科，特別地包括水泡性病毒(水泡性口炎病毒)、狂犬病病毒(澳大利亞，歐洲拉各斯蝙蝠病毒，狂犬病病毒)、短暫病毒(牛短暫熱病毒)、新生彈狀病毒(蛇頭病毒，出血性敗血癥病毒和造血性壞死病毒)，-披膜病毒科，特別地包括風(fēng)疹病毒屬(風(fēng)疹病毒)、甲病毒屬(特別是辛德比斯病毒、西門利克森林病毒、o'nyong'nyong病毒、基孔肯雅病毒、馬雅羅病毒、羅斯河病毒、東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒)，-皰疹病毒科，特別地包括人類皰疹病毒(hsv-1、hsv-2、水痘病毒、埃-巴二式病毒(eb病毒)、巨細胞病毒、玫瑰疹病毒、hhv-7和kshv)，-痘病毒科，特別地包括正痘病毒(例如特別是駱駝痘、牛痘(cowpox)、天花、牛痘(vaccinia))、腕痘病毒(特別是包括羊痘)、禽痘病毒(特別是包括禽痘)、副痘病毒(尤其包括牛丘疹性口炎病毒)和左旋蛋白病毒(特別是包括粘液瘤病毒)，-逆轉(zhuǎn)錄病毒科，特別是包括慢病毒(特別是包括人類、貓和猴免疫缺陷病毒1和2，山羊關(guān)節(jié)炎性腦膜炎病毒或梅迪-維納斯病病毒(maedi-visna病病毒))和逆轉(zhuǎn)錄病毒(特別是包括勞斯肉瘤病毒，人淋巴細胞性病毒1、2和3)，該列舉不是限制性的。例如，在流感病毒的情況下，疫苗可以包含流感病毒a的一種或多種亞型，所述亞型選自：h1n1、h2n2、h3n2、h5n1、h7n7、h7n9、h1n2、h9n2、h7n2、h7n3和h10n7的人類亞型，豬流感的h1n1、h1n2、h3n1和h3n2亞型，犬流感和馬流感的h7n7和h3n8亞型，或禽流感的h5n1、h7n2、h1n7、h7n3、h13n6、h5n9、h11n6、h3n8、h9n2、h5n2、h4n8、h10n7、h2n2、h8n4、h14n5、h6n5和h12n5亞型，或任何其他人類和/或動物重配病毒。可替換地，在流感病毒的情況下，疫苗可以包含選自流感病毒b的一種或多種人類亞型，例如選自維多利亞譜系和yamagata譜系。在流感病毒b的情況下，其特別是b/massachussetts/2/2012或b/brisbane/33/2008疫苗菌株的問題。本發(fā)明的另一個主題涉及前文定義的杯芳烴在疫苗中作為佐劑的用途。前文定義的杯芳烴可以用于它們的免疫活性，更特別是免疫調(diào)節(jié)活性。取決于受試者、劑量、抗原和施用時間，它們能夠引起免疫刺激。對于本發(fā)明的目的，術(shù)語“佐劑”旨在是指當與抗原一起施用(吞咽、吸入、注射等)時刺激、激活、延長、增強或調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的物質(zhì)，但是該物質(zhì)本身不具有任何抗原性質(zhì)。在這一方面，可以存在于疫苗中的杯芳烴的量相對于疫苗的總重量可以為0.1至1000μg，例如0.5至700μg，或1至600μg或5至500μg。在一個特定實施方式中，佐劑可以添加到任何疫苗中，例如加入到滅活或減毒疫苗或分裂疫苗中，而與所使用的生產(chǎn)方法無關(guān)。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，通過閱讀以下通過說明的方式給出的附圖所示的實施例，其它優(yōu)點將變得更加顯而易見。附圖說明-圖1示出了在d-42(感染前的42天)、d-21(感染前的21天)、d0(感染當天及血樣當天)、d4(感染后的4天)和d14(感染后的14天)，在小鼠中的挑戰(zhàn)calx133ace免疫方案。-圖2示出了使用h1n1pdm(10e3)感染并任選地使用以下物質(zhì)(從左到右)免疫的小鼠在d-42("預(yù)備")、d-21("樣品2")和d0("樣品3")的hai(血細胞凝集抑制)滴度的測量：1/5疫苗、tritonx100陰性對照、calx133ace陰性對照、3μg抗原tritonx100、3μg抗原-1劑量tritonx100、3μg抗原calx133ace和0.5μg抗原calx133ace。-圖3示出了使用h1n1pdm(10e3)感染并且任選地使用以下物質(zhì)(從左到右)免疫的小鼠在d-42("預(yù)備")、d-21("樣品2")和d0("樣品3")的mn(微量中和)滴度的測量：1/5疫苗、tritonx100陰性對照、calx133ace陰性對照、3μg抗原tritonx100、3μg抗原-1劑量tritonx100、3μgcalx133ace抗原和0.5μgcalx133ace抗原。-圖4示出了使用h1n1pdm(10e3iu)感染并且施用以下物質(zhì)免疫的小鼠從d0至d14的重量(單位g)的測量：疫苗、劑量1/5(菱形)、陰性對照tritonx100neg.c.(方形)、陰性對照calx133aceneg.c(三角形)、3μg使用tritonx100提取的抗原(十字形)、3μg使用calx133ace提取的抗原(星形)和0.5μg使用calx133ace提取的抗原(圓形)。具體實施方式實施例1：使用calx133ace和calx1103ace分子提取流感疫苗抗原的方案評價了calx133ace和calx1103ace分子(calx1103ace為杯芳烴，其中r4為c10烷基)提取流感疫苗抗原(從疫苗種x-179a，h1n1大流行2009的生產(chǎn)中產(chǎn)生)的能力，并且將它們與疫苗生產(chǎn)者使用的洗滌劑(tritonx100)和兩種商業(yè)洗滌劑(fc12和c12e8)進行比較。評價了多種濃度、ph和提取溫度條件。使用用于測量血細胞凝集活性的工業(yè)參考測試(血細胞凝集測試：hirst,g.k.1942.thequantitativedeterminationofinfluenzavirusandantibodiesbymeansofredcellagglutination.j.exp.med.75:47-64([22])和salk,j.e.1944.simplifiedprocedurefortitratinghemagglutinatingcapacityofinfluenzavirusandthecorrespondingantibody.j.immunol.49:87-98([23]))，以及所提取抗原的定量法(srid；aquantitative,single-radial-diffusiontestforimmunologicalstudieswithinfluenzavirus.schildgc,henry-aymardm,pereirahg.jgenvirol.1972aug；16(2):231-6([24]))，以進行疫苗抗原提取的定量和定性評價。測試的條件如表i中所示：表i：條件號測試的分子濃度溫度po4緩沖劑的ph接觸時間1tritonx1004％室溫7.951h2tritonx1004％37℃7.951h3calx133ace1％室溫7.951h4calx133ace1％37℃7.951h5calx1103ace1％室溫7.951h6calx1103ace1％37℃7.951h7calx133ace1％4℃7.952h8calx1103ace1％4℃7.952h9tritonx1004％37℃7.951h10tritonx1004％37℃6.741h提取之后，在常規(guī)工業(yè)生產(chǎn)過程中(例如[9]、[18])進行相對于1xpbs的片段化抗原(上清液sn和提取團粒)的滲析，從而降低提取產(chǎn)物的鹽和洗滌劑濃度。因此，對每個批交進行了滲析。經(jīng)確定，在滲析過程中未完全除去tritonx100。然而，表現(xiàn)出calx133ace分子可以被滲析，表明其僅能以痕量存在于市售的可能的疫苗產(chǎn)品中。滲析后，將提取產(chǎn)物等分并且滴定其血細胞凝集活性(ha)。數(shù)據(jù)示于下表ii中：結(jié)果顯示，在4℃和ph＝7.95的條件下，在1％濃度下，使用calx133ace和calx1103ace分子提取后獲得的片段化抗原(sn)的血細胞凝集(ha)滴度顯著(分別為512和1024)。這些滴度顯著高于根據(jù)常規(guī)方案使用tritonx100提取的抗原獲得的那些(sn)。由于(i)獲得的血細胞凝集滴度依賴于所使用的calx133ace分子濃度(0.1％比1％)和(ii)非提取的抗原(團粒)的殘留物的ha滴度與tritonx100獲得的值成反比，并且低于tritonx100獲得的值，因此這些結(jié)果更加顯著。提取溫度表現(xiàn)為一個重要的參數(shù)；4℃的溫度表現(xiàn)為使用calx133ace和calx1103ace分子提取疫苗抗原的最佳溫度。這些第一結(jié)果清楚地表明，calx133ace分子適于從疫苗制造商使用的尿囊生產(chǎn)系統(tǒng)中產(chǎn)生的批次病毒中提取流感疫苗抗原。從定性的角度，與使用tritonx100的常規(guī)提取相比，這些calx133ace和calx1103ace分子允許更加有效的提取(更多的提取抗原、更高的血細胞凝集活性、抗原寡聚的天然特性)。實施例2：疫苗抗原片段化的優(yōu)化及其定量，以用于在鼠模型中進行功效測試通過用病毒接種物(疫苗種)接種11天齡的含胚雞蛋，隨后濃縮和純化，以進行病毒生產(chǎn)。與使用calx133ace分子進行比較，使用tritonx100(4％)根據(jù)常規(guī)工業(yè)方法進行片段化。所提取的疫苗抗原的定性評價通過工業(yè)參考測試來進行，其為所述疫苗抗原的血細胞凝集活性的測量(主要抗原、血細胞凝集素的活性，以uha/50ml給出滴度)。定量評價通過工業(yè)參考技術(shù)進行，這種技術(shù)也被藥監(jiān)部門用于疫苗批次的驗證和銷售許可：單向放射免疫擴散法(srid，ha的量，單位mg/ml)。最后，通過itraq質(zhì)譜測定法對ha定量使得能夠獲得在動物測試中待比較的各種樣品之間的相對定量(ha的量，單位mg/ml)。選擇用于片段的分子和條件是：-4％的tritonx100在37℃下1小時。-1％的calx133ace分子在4℃下2小時。在血細胞凝集測試中，calx133ace分子在不存在流感抗原的情況下不引起任何紅細胞溶血。另外，該分子是可滲析的，由此意味著在樣品中可以將calx133ace限制至痕量。實施例3：動物實驗在第一實驗中，使用tritonx100或calx133ace分子作為分裂劑在前文描述的最佳生產(chǎn)條件下，生產(chǎn)了多批抗原。下表iii是用于動物測試的片段材料的概述。在該第一實驗中，對于分裂，計劃測試兩種量的ha抗原(0.5和2.5μg)，并且對于通過超速離心分裂物獲得的上清液，僅測試一種量。對于每種條件，對12只balb.c小鼠肌內(nèi)注射以進行免疫兩次(在d0，然后在d21)(總量100μl)。在d0、d21、d42和d63(心臟穿刺和安樂死)從動物采集多個血液樣品。在每個血液樣品系列之后，收集來自同一組的血清并混合，以便具有足夠的材料用于進行一式兩份的血細胞凝抑制(hai)測試和一式兩份的微量中和測試。下表iv中給出了獲得的結(jié)果：驗證了由calx133ace片段化產(chǎn)生的抗原的實驗(小鼠良好的耐受性、取得的血清的質(zhì)量和量、具有驗證的(+)和(-)對照的hai結(jié)果的耐用性)。hai和微量中和結(jié)果是一致的，并且表明由calx133ace片段化產(chǎn)生的抗原分裂誘導(dǎo)顯著的抗體響應(yīng)(樣品3和心臟穿刺)，不同于通過分裂物的超速離心純化的抗原(在表iii和iv中指示為“上清液”)，這因這些純化的抗原不再處于膜的范圍內(nèi)，由此在定性和定量方面驗證了使用calx133ace分子生產(chǎn)和片段化疫苗抗原的過程。另外，對于0.5μg的注射劑量(樣品3和心臟穿刺)，相對于tritonx100方法，出現(xiàn)了有利于calx133ace方法的顯著差異。在2.5μg的劑量下發(fā)現(xiàn)了相同的趨勢，但是hai的差異不顯著(樣品3和心臟穿刺)。此外，表現(xiàn)出通過0.5μg劑量由calx133ace方法產(chǎn)生的抗原誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答與通過2.5μg由tritonx100方法產(chǎn)生的抗原誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答類似(樣品3和心臟穿刺)。后者的結(jié)果對于本發(fā)明是重要的，因為其強調(diào)，當抗原由calx133ace分子產(chǎn)生時，有可能以低五倍(五分之一，5timesfewer)的抗原獲得抗體應(yīng)答。實施例4：用calx133ace免疫小鼠：在小鼠中評價所生成的疫苗抗原的保護能力在第二個實驗中，使用tritonx100或calx133ace分子作為分裂劑在前文描述的最佳生產(chǎn)條件下生產(chǎn)了多批抗原。下表v是用于該第二動物實驗的片段化材料的概述。計劃是使用calx133ace或tritonx100抗原制劑將balb/c小鼠免疫兩次，然后使用a/h1n1加利福尼亞/7/2009菌株(h1n1pdm09)對小鼠進行感染，從而驗證在動物中的保護。組1：i.m.(肌內(nèi)注射)1/5劑量的(相應(yīng)于每抗原3μgha)，免疫的12只小鼠(陽性對照)。組2：i.m.tritonx100程序無抗原(6只小鼠)或calx133ace程序無抗原(6只小鼠)，免疫的12只陰性對照小鼠("ctrl")。組3：i.m.3μgha制劑與tritonx100免疫的12只小鼠。組4：i.m.3μgha制劑與calx133ace免疫的12只小鼠。組5：i.m.0.5μgha制劑與calx133ace免疫的12只小鼠。圖1中示出了免疫方案。下表v是用于該測試的片段化材料的概述。在d+4(病毒復(fù)制峰)處死小鼠，測量它們的肺病毒滴度。在d+4安樂死后測量經(jīng)免疫并使用h1n1pdm09(10e3iu)感染的小鼠的肺病毒滴度，并且示于下表vi中。表vi：*只1次免疫在使用流感病毒ah1n1pdm09(大流行)以10e3iu/小鼠進行鼻內(nèi)感染后，監(jiān)測balb/c小鼠的重量并且描述于圖4中。測量由hai提供的保護測試以下組的小鼠：-用疫苗1/5免疫的小鼠，-僅用tritonx100免疫的小鼠，-用calx133ace免疫的小鼠，-用3μg以tritonx100制備的病毒抗原免疫的小鼠,-用3μg以calx133ace提取的疫苗抗原免疫的小鼠，-用0.5μg以calx133ace提取的疫苗抗原免疫的小鼠。使用h1n1pdm(10e3)感染這些小鼠。表vi中給出了對小鼠血清進行的hai測試的結(jié)果，小鼠經(jīng)免疫并感染了h1n1pdm(10e3)。表vii：圖2中示出了由hai提供的保護的測量。由mn提供的保護的測量(微量中和)測試以下組的小鼠：-用疫苗1/5免疫的小鼠，-僅用tritonx100免疫的小鼠，-用calx133ace免疫的小鼠，-用3μg以tritonx100制備的病毒抗原免疫的小鼠，-用3μg以calx133ac提取的疫苗抗原免疫的小鼠，-用0.5μg以calx133ace提取的疫苗抗原免疫的小鼠。這些小鼠感染有h1n1pdm(103)。以下表viii中概述了對經(jīng)免疫且感染了h1n1pdm(103)的小鼠的血清進行的mn測試。表viii：圖3中示出了由mn提供的保護的測量。小鼠的保護圖5示出了經(jīng)免疫且感染了h1n1pdm(103iu)的小鼠體重的監(jiān)測。在所有免疫組中(fluviral、tritonx100和calx133ace)：無體重減輕或死亡。只有2個陰性對照組中的小鼠死亡。結(jié)論hai和mn測試：0.5μg抗原分裂/calx133ace的免疫效果與3μg的的免疫效果相同。3μg抗原分裂/calx133ace的免疫比3μg抗原分裂/tritonx100的免疫更有效。保護：0.5μg的抗原分裂/calx133ace的保護效果與3μg的fluviral或3μg的抗原分裂/tritonx100的保護效果相同。參考文獻列表1.barrettpn，portsmouthd，ehrlichhj.developingcellculture-derivedpandemicvaccines.curropinmolther.2010feb；12(1)：21-30。2.lerua，jacobd，transfiguracionj，ansorges，henryo，kamenaa.scalableproductionofinfluenzavirusinhek-293cellsforefficientvaccinemanufacturing.vaccine.2010may7；28(21)：3661-71。3.fr10/55716。4.wo2012007380。5.fr10/59132。6.wo2012059696。7.ellebedyah，webbyrj.influenzavaccines.vaccine.2009nov5；27suppl4：d65-8。8.wo02/28422。9.wo02/067983。10.m.rosen，《surfactantsandinterfacialphenomena》，3rded.，hoboken：johnwiley&sons，inc.，2004。11.a.m.schwartz，j.w.perry，j.berch，《surfaceactiveagentsanddetergents》，volii，r.kriegerpub.co.，newyork，197。12.wo2008129058。13.lenoir，g.，menguy，t.，corre，f.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