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      藥物組合物、其制備和用途的制作方法

      文檔序號(hào):11440330閱讀:371來源:國知局
      藥物組合物、其制備和用途的制造方法與工藝

      本發(fā)明涉及一種藥物組合物,其包含(i)至少一種生物相容性納米粒子與(ii)至少一種目標(biāo)化合物、通常是至少一種藥物化合物的組合,所述藥物組合物待被給藥到需要這種目標(biāo)化合物的受試者,其中所述納米粒子增強(qiáng)所述目標(biāo)化合物的效率。所述至少一種生物相容性納米粒子的最長維度通常在約4至約500nm之間,其絕對(duì)表面電荷值為至少10mv(|10mv|),并且其楊氏模量低于100kpa。

      本發(fā)明還涉及這種組合物的用途,其用于在需要的受試者中給藥所述至少一種目標(biāo)化合物,其中所述至少一種生物相容性納米粒子和所述至少一種目標(biāo)化合物在所述受試者中順序給藥,通常彼此相隔在超過5分鐘至約72小時(shí)之間。

      與所述目標(biāo)化合物在以標(biāo)準(zhǔn)藥物劑量下給藥時(shí)所誘導(dǎo)的藥物(即治療、預(yù)防或診斷)益處和毒性相比,所述至少一種生物相容性納米粒子和至少一種目標(biāo)化合物向所述受試者的組合并且通常是順序的給藥在所述受試者中以降低的毒性維持所述目標(biāo)化合物的藥物益處,或以等同或降低的毒性提高其藥物益處。

      本發(fā)明的藥物組合物通常允許所給藥的目標(biāo)化合物的藥物劑量與所述化合物的標(biāo)準(zhǔn)藥物劑量相比減少至少10%,同時(shí)對(duì)于所述受試者以等同的毒性、優(yōu)選地降低的毒性維持相同的藥物益處,或者同時(shí)對(duì)于所述受試者以等同或降低的毒性提高藥物益處。



      背景技術(shù):

      在需要的受試者中,為了確保安全性和效能,藥物化合物需要以最適的速率選擇性遞送到它們的靶位點(diǎn)。

      藥代動(dòng)力學(xué)(pk)是藥物學(xué)的一個(gè)分支,致力于確定外部給藥到活生物體的物質(zhì)的命運(yùn)。這種確定包括在足夠長的一段時(shí)間內(nèi)測量所有主要組織中的化合物濃度的步驟,優(yōu)選地直至所述化合物消除。藥代動(dòng)力學(xué)對(duì)于高效描述所述化合物的體內(nèi)行為,包括它的吸收和分配的機(jī)制以及它在所述生物體內(nèi)的化學(xué)變化來說,是必需的。血液中的pk情況可以使用各種不同程序來擬合,以獲得定量描述身體如何處理所述化合物的關(guān)鍵pk參數(shù)。重要的參數(shù)包括最高濃度(cmax)、半衰期(t1/2)、清除率、曲線下面積(auc)和平均駐留時(shí)間(mrt),即化合物停留在生物體內(nèi)的平均時(shí)間。當(dāng)觀察到化合物配方的血液循環(huán)延長時(shí),它通常與t1/2增加、清除率降低、auc增加和mrt增加相關(guān)。pk數(shù)據(jù)通常被用于決定維持所需血液濃度以便提高治療劑效率并具有最小副作用的最適劑量和劑量方式。另外,正如專業(yè)技術(shù)人員公知的,在大多數(shù)情況下,通常對(duì)于游離藥物來說,化合物的血液濃度與其效能和毒性兩者相關(guān)。

      治療劑以及預(yù)防性化合物的生理化學(xué)性質(zhì)對(duì)它們的藥代動(dòng)力學(xué)和在體內(nèi)的代謝命運(yùn)具有重要影響。因此,當(dāng)設(shè)計(jì)這種化合物時(shí),適合的生理化學(xué)性質(zhì)的選擇是關(guān)鍵的。然而,由于所述化合物不總是由生物體自身內(nèi)源提供,并且通常是外部給藥的,因此它的生物分布情況必須被優(yōu)化,以便適合并優(yōu)選地優(yōu)化其所需的藥理作用。

      已經(jīng)探索了幾種優(yōu)化化合物向其靶位點(diǎn)的遞送的方法。一種策略是設(shè)計(jì)具有隱身性能的治療化合物,以延長其血液半衰期并因此增加它向靶位點(diǎn)的積累。一種有利方法是將聚乙二醇(peg)共價(jià)附連到所述治療化合物,這已被證明提高了所述循環(huán)化合物的體內(nèi)半衰期(t1/2),體內(nèi)半衰期提高的水平部分隨著所述化合物的本質(zhì)和涂層的本質(zhì)而變。此外,已開發(fā)了藥物載體例如脂質(zhì)體、乳液或膠束,以通過修改藥物在受試者體內(nèi)的生物分布情況來提高它們的治療效能。

      然而,治療化合物的生物分布缺乏選擇性仍然令人擔(dān)憂。迄今為止,不良的藥代動(dòng)力學(xué)和高毒性是治療化合物開發(fā)失敗的重要原因。

      作為實(shí)例,在癌癥治療的情形中,故意抑制身體的基本功能以便殺死癌細(xì)胞,在正常細(xì)胞中引起毒性,并且臨床醫(yī)生必須依賴腫瘤和正常組織之間劑量響應(yīng)和治療化合物分布的差異來尋找可能的治療窗口。值得注意的是,肝毒性仍然是由肝中藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的直接和間接機(jī)制造成的藥物開發(fā)和臨床應(yīng)用中停藥的主要原因。

      為納米粒子化合物例如藥物載體提出的一種方法[criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems11(1):31-591994]是預(yù)先注射誘餌載體以降低、飽和或甚至失活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(res)的細(xì)胞吞噬能力。損傷或阻滯也可能與調(diào)理素分子的血漿水平降低相關(guān)。已證實(shí),在試驗(yàn)粒子給藥之前靜脈內(nèi)給藥某些藥劑例如脂肪酸的烷基酯、葡聚糖硫酸酯、稀土元素的鹽(例如gdcl3)、藥物載體、空的或包封的氯膦酸鹽,誘導(dǎo)枯否細(xì)胞攝入的中度到急劇的減少。

      例如,在“納米粒子向腫瘤歸巢的生物模擬擴(kuò)增”(biomimeticamplificationofnanoparticlehomingtotumors)[pnas2007]中,作者報(bào)道了res在他們的納米粒子“creka-spio”的清除中的作用。初始實(shí)驗(yàn)顯示,靜脈內(nèi)(iv)注射的“creka-spio”納米粒子不有效積累在mda-mb-435乳腺癌異種移植物中。相反,在res組織中看到了高濃度的粒子。通過用脂質(zhì)體氯膦酸鹽剝奪肝中的res巨噬細(xì)胞,他們發(fā)現(xiàn)他們的粒子的半衰期延長5倍。然而,氯膦酸鹽藥劑誘導(dǎo)來自于肝和脾的巨噬細(xì)胞的凋亡,并且這被認(rèn)為是整體有害的,因?yàn)榫奘杉?xì)胞剝奪提高了與免疫抑制和感染相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中,作者試驗(yàn)了用螯合的ni(ii)包被的脂質(zhì)體作為潛在的誘餌粒子,這假設(shè)氧化鐵和ni(ii)將吸引相似的血漿調(diào)理素,并且因此ni-脂質(zhì)體可以在系統(tǒng)循環(huán)中剝奪它們。事實(shí)上,靜脈內(nèi)(iv)注射的ni-脂質(zhì)體,不論是在creka-spio納米粒子注射之前5分鐘還是48小時(shí)給藥,都允許所述納米粒子的血液半衰期增加5倍。然而,觀察到高毒性,在腫瘤小鼠中引起死亡。也用空白脂質(zhì)體代替ni-脂質(zhì)體進(jìn)行了試驗(yàn)。然而,盡管與所述ni-脂質(zhì)體相比降低了毒性,但空白脂質(zhì)體的效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于它們。事實(shí)上,血液半衰期僅僅增加約2倍。

      wo2005086639涉及將所需藥劑選擇性給藥到受試者中的靶位點(diǎn)的方法,通常是在超聲波或x-射線暴露的情形中,或在磁共振成像(mri)的情形中,以及在治療的情形中。所描述的方法的目的是提高或維持目標(biāo)藥劑的效率,并在同時(shí)由于誘餌無活性載體的同時(shí)給藥而降低具體給藥的藥劑的總劑量。

      所描述的發(fā)明利用了基于概率的方法。將非靶向無活性藥劑(“無活性載體”)與表現(xiàn)出相似物理特性的靶向目標(biāo)藥劑(以“活性組合物”存在)同時(shí)給藥(即“基本上同時(shí)地”),以便促進(jìn)所述靶向目標(biāo)藥劑避開res系統(tǒng),由此允許提高目標(biāo)藥劑在所需位點(diǎn)處的攝入。這種方法導(dǎo)致患者較少暴露于所述目標(biāo)藥劑,并因此降低所述目標(biāo)藥劑的每劑成本。所述活性組合物和誘餌無活性載體彼此在5分鐘內(nèi),優(yōu)選地彼此在2分鐘或甚至更短時(shí)間內(nèi)給藥。這種方法依賴于大大過量的非靶向“載體”或“誘餌”介質(zhì)的存在,并依賴于當(dāng)在靶向所需位置的介質(zhì)存在下供應(yīng)時(shí),該過量的誘餌載體與所述靶向目標(biāo)藥劑競爭被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝入的概率。被res捕獲的粒子的半衰期是劑量依賴性的,即粒子的循環(huán)半衰期隨著劑量增加而增加。與較高劑量相伴的較慢清除,據(jù)認(rèn)為有利于維持總藥劑的高濃度,允許降低待給藥的目標(biāo)藥劑的劑量。換句話說,根據(jù)wo2005086639的作者,由于總體更高的劑量而造成的總藥劑的增加的半衰期,將有利于所述靶向藥劑。這種方法涉及的要求是所述活性藥劑和無活性藥劑不論其相應(yīng)組成如何,在它們?cè)趓es中的清除特性方面表現(xiàn)相近。

      在這種方法中,需要所述無活性藥劑和活性藥劑的準(zhǔn)同時(shí)注射來提高血液中存在的藥劑的總量,并因此延長它們的血液半衰期。這種明顯依賴于基于概率的方法的策略,必然需要所述活性藥劑與靶向劑締合,以便通過為所述活性藥劑提供超越無活性藥劑的優(yōu)勢,實(shí)現(xiàn)它在靶位點(diǎn)上的成功積累。此外,由于所述準(zhǔn)同時(shí)注射,取決于所述活性組合物的目標(biāo)用途,可能需要無活性載體的特殊設(shè)計(jì)。

      wo2005/063305涉及一種組裝體,其包含氣體填充的微泡(通常具有至少0.5μm的尺寸)和與所述微泡締合的組分(具有小于約100nm的尺寸)。得到的組裝體在診斷和/或治療活性配方中被用作藥物活性組分。所述兩種組分,即氣體填充的微泡和與微泡締合的組分,通常被同時(shí)給藥,用于改進(jìn)超聲波對(duì)比成像領(lǐng)域中的成像,包括定向超聲波成像、超聲波介導(dǎo)的藥物遞送和其他成像技術(shù)。

      正如從現(xiàn)有技術(shù)明顯看出的,并且盡管存在長期的醫(yī)學(xué)需要,但由于其不可接受的毒性或由于其不利的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)而不能最適地使用在患者中的化合物(包括治療、預(yù)防以及診斷化合物)的效率改進(jìn),仍然值得關(guān)注。

      發(fā)明詳述

      現(xiàn)在,本發(fā)明允許優(yōu)化目標(biāo)化合物(在本文中也被簡單地辨識(shí)為“化合物”)的效率,不論其打算使用在治療、預(yù)防還是診斷背景中。本文描述的組合物是(i)至少一種生物相容性納米粒子與(ii)至少一種目標(biāo)化合物、通常為至少一種藥物化合物的組合,其優(yōu)化了所述至少一種目標(biāo)化合物的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),并且因此提供了開發(fā)原本由于例如其不可接受的毒性而不能開發(fā)的藥物化合物的可能性。通常,所述生物相容性納米粒子不被用作藥物化合物,即不被用作治療、預(yù)防或診斷化合物。

      本發(fā)明的典型組合物(在本文中通常被辨識(shí)為“藥物組合物”)是包含(i)至少一種生物相容性納米粒子與(ii)至少一種化合物(“目標(biāo)化合物”)的組合的組合物,其中所述生物相容性納米粒子的最長或最大維度通常在約4nm至約500nm之間,所述生物相容性納米粒子的絕對(duì)表面電荷值為至少10mv,并且所述生物相容性納米粒子的楊氏模量小于100kpa。

      通常,所述(至少一種)生物相容性納米粒子與目標(biāo)化合物之間的比例在0.1/1至1000/1或0.5/1至1000/1之間,優(yōu)選地在0.5/1至500/1之間,甚至更優(yōu)選地在0.5/1至300/1之間。

      當(dāng)與值例如納米粒子的尺寸或時(shí)間間隔相關(guān)聯(lián)時(shí),術(shù)語“約”和“左右”表明所指示的值伴有的被專業(yè)技術(shù)人員認(rèn)為是小變動(dòng)的變動(dòng)對(duì)與它關(guān)聯(lián)的主題內(nèi)容的性質(zhì)沒有實(shí)質(zhì)性影響,并且所述主題內(nèi)容仍然在所要求的發(fā)明的精神之內(nèi)。

      本發(fā)明的優(yōu)選目的是一種藥物組合物,其包含(i)至少一種生物相容性納米粒子與(ii)至少一種藥物化合物的組合,其中所述生物相容性納米粒子的最長或最大維度在約4nm至約500nm之間,所述生物相容性納米粒子的絕對(duì)表面電荷值為至少10mv(|10mv|),并且所述生物相容性納米粒子的楊氏模量小于100kpa,其用于在需要的受試者中給藥所述至少一種藥物化合物,其中所述至少一種納米粒子和至少一種藥物化合物在需要所述藥物化合物的受試者中的給藥彼此相隔在超過5分鐘至約72小時(shí)之間,并且其中所述生物相容性納米粒子不被用作藥物化合物。

      當(dāng)與通常不存在任何納米粒子的情況下由所述化合物的標(biāo)準(zhǔn)藥物劑量所誘導(dǎo)的藥物益處和毒性相比時(shí),所述生物相容性納米粒子和藥物化合物通過本發(fā)明的組合物向所述受試者的組合和順序給藥,通常以對(duì)所述受試者降低的毒性允許(維持)所述化合物的相同的藥物(即治療、預(yù)防或診斷)益處,或者以對(duì)所述受試者等同或降低的毒性(優(yōu)選為降低的毒性)提高所述化合物的藥物益處。

      本發(fā)明的藥物組合物通常允許所給藥的化合物的藥物(即治療、預(yù)防或診斷)劑量與通常在不存在任何納米粒子的情況下所述化合物的標(biāo)準(zhǔn)藥物劑量相比減少至少10%,優(yōu)選地至少15%,并且(i)同時(shí)對(duì)于所述受試者以等同的毒性、優(yōu)選地降低的毒性維持相同的藥物益處,或者(ii)同時(shí)對(duì)于所述受試者以等同或降低的毒性提高藥物益處。

      由于粒子的形狀可以影響其“生物相容性”,因此具有十分均勻的形狀的粒子在本文中是優(yōu)選的。出于藥代動(dòng)力學(xué)原因,因此形狀為基本上球形/圓形或橢圓形的納米粒子是優(yōu)選的。這種形狀也有利于納米粒子與細(xì)胞的相互作用或被細(xì)胞的攝入。球形/圓形形狀是特別優(yōu)選的。

      在本發(fā)明的精神中,術(shù)語“納米粒子”是指尺寸在納米范圍內(nèi),通常在約1nm至約500nm之間,優(yōu)選地在約4nm至約500nm之間,約4至約400nm、約30nm至約300nm、約20nm至約300nm、約10nm至約300nm之間,例如在約4nm至約100nm之間,例如在約10nm、15nm或20nm至約100nm之間,或在約100nm至約500nm之間,通常在約100nm至約300nm之間的產(chǎn)品,特別是合成產(chǎn)品。

      在本文中,術(shù)語“納米粒子的尺寸”、“納米粒子的最大尺寸”和“納米粒子的最長尺寸”通常是指“納米粒子的最長或最大維度”或者當(dāng)形狀為球形/圓形或橢圓形時(shí)“納米粒子的直徑”。透射電子顯微術(shù)(tem)或cryo-tem可用于測量納米粒子的尺寸。此外,動(dòng)態(tài)光散射(dls)也可用于測量納米粒子在溶液中的流體動(dòng)力學(xué)直徑。這兩種方法也可以一個(gè)接一個(gè)使用,以將通過dls測量的納米粒子的流體動(dòng)力學(xué)直徑與通過tem或cryo-tem測量的所述納米粒子的尺寸進(jìn)行比較,以便確認(rèn)所述尺寸。優(yōu)選的方法是dls(參考《國際標(biāo)準(zhǔn)iso22412粒子尺寸分析——?jiǎng)討B(tài)光散射》(internationalstandardiso22412particlesizeanalysis–dynamiclightscattering),internationalorganisationforstandardisation(iso),2008)。

      為了可以在本發(fā)明的情形中使用,所述生物相容性納米粒子的絕對(duì)靜電表面電荷(在本文中也被辨識(shí)為“電荷”或“表面電荷”)應(yīng)該高于|10mv|(絕對(duì)值)。納米粒子的表面電荷通常在水性介質(zhì)中通過ζ電位測量來確定,其中納米粒子濃度在0.2至10g/l之間,ph在6至8之間,并且通常所述水性介質(zhì)中的電解質(zhì)濃度在0.001至0.2m之間,例如0.01m或0.15m。

      通常,本發(fā)明的生物相容性納米粒子具有至少|(zhì)10mv|,即低于–10mv或高于+10mv,例如低于–12mv或–15mv至–20mv之間或高于+12mv或+15mv至+20mv之間,通常低于–15mv或高于+15mv的靜電表面電荷。優(yōu)選地,本發(fā)明的生物相容性納米粒子具有高于10mv的絕對(duì)電子表面電荷值(“絕對(duì)表面電荷值”),甚至更優(yōu)選地所述電荷是負(fù)電荷。

      為了可以在本發(fā)明的情形中使用,反映出所述生物相容性納米粒子的彈性的所述生物相容性納米粒子的楊氏模量應(yīng)低于500kpa,通常低于400kpa,更優(yōu)選地低于300或200kpa,優(yōu)選地低于100kpa。所述生物相容性納米粒子的楊氏模量可以例如低于70kpa或低于60、50、40、30、20或10kpa。

      楊氏模量通常使用原子力光譜(afm)技術(shù)來測量。在典型的實(shí)驗(yàn)中,將生物相容性納米粒子附著或固定在平面表面例如硼硅酸鹽板上。將固定到所述表面的生物相容性納米粒子浸泡在適合的介質(zhì)中,通常為pbs或hepes緩沖液中。力的測量通常使用“膠體探針法”來進(jìn)行[用于膠體探針顯微術(shù)的微粒和納米粒子在無尖端懸臂上的附連(attachmentofmicro-andnano-particlesontiplesscantileversforcolloidalprobemicroscopy),j.colloidandinterfacescience.426(2014)190-198],其中將膠體粒子、通常為二氧化硅微球,附連到原子力顯微鏡(afm)的懸臂。在本發(fā)明的情形中,所述懸臂的彈簧常數(shù)適應(yīng)于所述納米粒子的彈性,并通常低于500mn.m-1。納米粒子在表面上的定位通常通過掃描表面來進(jìn)行。途徑和收縮力曲線使用通常低于100nm.s-1的恒定的尖端速度來記錄。通過將力曲線用適合的模型擬合,從實(shí)驗(yàn)曲線提取楊氏模量?!癶erzt模型”通常是用于所述計(jì)算的確立的模型[使用原子力顯微術(shù)確定生物樣品的彈性模量(determiningtheelasticmodulusofbiologicalsamplesusingatomicforcemicroscopy),jpkinstrumentsapplicationnote]。

      也可以使用“改良的hertz模型”來計(jì)算所述生物相容性納米粒子的楊氏模量。在論文“通過原子力顯微術(shù)力測量確定表面結(jié)合的脂質(zhì)體的楊氏模量”(young’smoduliofsurface-boundliposomesbyatomicforcemicroscopyforcemeasurements)(langmuir2008,24;2009-2014)中,作者報(bào)道了脂質(zhì)體的楊氏模量通常小于40kpa,優(yōu)選地小于10kpa。為了比較,活細(xì)胞通常具有小于100kpa的楊氏模量值。凝膠的楊氏模量可以隨著交聯(lián)程度而變。在他們的論文“水凝膠納米粒子的機(jī)械性質(zhì)對(duì)巨噬細(xì)胞攝入的影響”(effectofmechanicalpropertiesofhydrogelnanoparticlesonmacrophagescelluptake)(softmatter,2009,5;3984-3991)中,作者報(bào)道了在他們的由用n,n’-亞甲基-雙丙烯酰胺交聯(lián)的n,n-二乙基丙烯酰胺和甲基丙烯酸2-羥基乙基酯制成的生物相容性納米粒子中,隨著交聯(lián)增加(mol%),楊氏模量的值增加(從18.04kpa直至211.39kpa)。

      所述納米粒子的組合的性質(zhì)、尺寸、表面電荷和彈性,允許納米粒子的血液循環(huán)時(shí)間短,并外溢到肝器官中。此外,在細(xì)胞與它們的微環(huán)境之間的復(fù)雜互動(dòng)中,機(jī)械過程作為重要的調(diào)控物出現(xiàn)。細(xì)胞與周圍的細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)的相互作用對(duì)于它們的正確功能以及組織的體系結(jié)構(gòu)和內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持來說是必不可少的。細(xì)胞已發(fā)展出能夠結(jié)合到ecm的大的受體庫。它們提供了與ecm的物理連接,并通過使它們的行為適應(yīng)于這種復(fù)雜環(huán)境的性質(zhì),允許它們轉(zhuǎn)導(dǎo)從ecm傳出的信號(hào)。值得注意的是,細(xì)胞行為受到ecm的組成、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和機(jī)械性質(zhì)影響。細(xì)胞通常具有100pa至100kpa之間的彈性模量(即楊氏模量)[demichelisa.等,用于活細(xì)胞的彈性模量測量的afm力光譜學(xué)方法的研究(studyofafmforcespectroscopymethodforelasticmodulusmeasurementoflivingcells),journalofphysics:conferenceseries459(2013)012050]。在本發(fā)明的情形中,為了與細(xì)胞安全地相互作用(即不影響細(xì)胞的功能),所述生物相容性納米粒子通常具有不超過細(xì)胞彈性的彈性(即彈性模量或楊氏模量)。因此,通過順序給藥本發(fā)明的生物相容性納米粒子和目標(biāo)化合物,實(shí)現(xiàn)了兩種化合物(即所述生物相容性納米粒子和目標(biāo)化合物)的非共同循環(huán)或有限的共同循環(huán)。因此,當(dāng)與通常不存在任何納米粒子的情況下所述化合物的標(biāo)準(zhǔn)藥物劑量所誘導(dǎo)的藥物益處和毒性相比時(shí),所述生物相容性納米粒子的尺寸、表面電荷和彈性的組合性質(zhì),允許安全地使用所述目標(biāo)化合物,同時(shí)以對(duì)所述受試者降低的毒性允許(維持)所述化合物的相同的藥物(即治療、預(yù)防或診斷)益處,或者換句話說,同時(shí)以對(duì)所述受試者等同或降低的毒性(優(yōu)選為降低的毒性)提高所述化合物的藥物益處。

      所述納米粒子通??梢允怯袡C(jī)納米粒子,例如基于脂類的納米粒子(糖脂、磷脂、甾類脂等)如固體脂類納米粒子,基于蛋白質(zhì)的納米粒子,在本文中也被稱為“蛋白質(zhì)-納米粒子”(例如白蛋白),基于聚合物的納米粒子(“聚合物納米粒子”),基于共聚物的納米粒子(“共聚物納米粒子”),基于碳的納米粒子,病毒樣納米粒子(例如病毒載體)。

      所述有機(jī)納米粒子也可以是納米球(普通納米粒子)或納米膠囊(中空納米粒子)例如脂質(zhì)體、凝膠、水凝膠、膠束、樹枝狀聚合物等。也可以使用本文中描述的有機(jī)納米粒子的混合物。

      所述聚合物或共聚物可以是天然或合成來源的。

      可以在本發(fā)明的情形中用于制備有機(jī)納米粒子的合成(人造)和天然聚合物或共聚物的實(shí)例,可以選自聚乳酸(pla)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(plga)、聚乙二醇(peg)、聚糖乳酸(polyglactin)、聚丙交酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚丙二醇、聚山梨酸酯、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚乳酸酯-乙醇酸酯共聚物、聚酰胺-胺、聚乙烯亞胺、藻酸鹽、纖維素和纖維素衍生物聚合物、膠原蛋白、透明質(zhì)酸、聚谷氨酸(pga)、肌動(dòng)蛋白、多糖和明膠。

      在本文描述的組合物中使用的納米粒子應(yīng)該是生物相容的,即與活組織相容。當(dāng)它們的組成有要求時(shí),納米粒子可以因此用生物相容性材料包被,以變得可用。在本發(fā)明的特定實(shí)施方式中,本文中提到的納米粒子因此用生物相容性涂層覆蓋。

      所述生物相容性材料可以是允許與生物靶相互作用的試劑。這種試劑通常在納米粒子表面上帶有正或負(fù)電荷,此時(shí)所述納米粒子的絕對(duì)電荷為至少10mv。

      在納米粒子表面上形成正電荷的試劑可以例如選自氨基丙基三乙氧基硅烷或聚賴氨酸。在納米粒子表面上形成負(fù)電荷的試劑可以例如選自磷酸鹽(例如多聚磷酸鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽等)、羧酸鹽(例如檸檬酸鹽或二羧酸,特別是琥珀酸)或硫酸鹽。

      在特定實(shí)施方式中,只要納米粒子的絕對(duì)電荷為至少10mv(|10mv|),所述納米粒子就可以用選自表現(xiàn)出空間位阻基團(tuán)的試劑的生物相容性材料包被。這種基團(tuán)可以例如選自聚乙二醇(peg);聚氧化乙烯;聚乙烯醇;聚丙烯酸酯;聚丙烯酰胺(聚n-異丙基丙烯酰胺);聚脲;生物聚合物;多糖例如葡聚糖、木聚糖和纖維素;膠原蛋白;兩性離子化合物例如聚磺基甜菜堿等。

      有利情況下,所述生物相容性涂層可以是“完全涂層”(完整的單層)。這暗示在所述納米粒子的所有表面上存在非常高密度的生物相容性分子,產(chǎn)生適當(dāng)?shù)碾姾伞?/p>

      所述生物相容性涂層還可以包含標(biāo)記試劑,通常為允許使用標(biāo)準(zhǔn)的成像設(shè)備觀察顏色的試劑。

      當(dāng)與通常不存在任何納米粒子的情況下所述化合物的標(biāo)準(zhǔn)藥物、通常為治療劑量所誘導(dǎo)的藥物益處和毒性相比時(shí),所述至少一種生物相容性納米粒子與所述至少一種目標(biāo)化合物一起的組合給藥,通常當(dāng)在需要所述目標(biāo)化合物的受試者中以彼此間隔超過5分鐘至約72小時(shí)之間的時(shí)間給藥時(shí),對(duì)所述受試者來說,以降低的毒性維持所述目標(biāo)化合物的藥物(即治療、預(yù)防或診斷)、通常為治療益處,或者以等同或降低的毒性提高所述化合物的藥物益處。

      在特定實(shí)施方式中,所述至少一種生物相容性納米粒子和至少一種目標(biāo)化合物的組合給藥,通常當(dāng)在需要所述目標(biāo)化合物的受試者中以彼此間隔超過5分鐘至約72小時(shí)之間的時(shí)間給藥時(shí),允許所給藥的化合物的治療劑量與所述化合物的標(biāo)準(zhǔn)治療劑量相比減少至少10%、優(yōu)選地至少15%,并且與通常在不存在任何納米粒子的情況下相比,同時(shí)以等同的毒性或降低的毒性(優(yōu)選為降低的毒性)維持所述化合物對(duì)所述受試者的相同的治療益處,或在同時(shí)以等同或降低的毒性提高所述化合物對(duì)所述受試者的治療益處。

      在特定實(shí)施方式中,納米粒子伴隨著幾種目標(biāo)化合物、通常為至少兩種目標(biāo)化合物給藥。

      優(yōu)選地,所述納米粒子通常在被給藥到需要所述至少一種目標(biāo)化合物的受試者后的1小時(shí)至6周內(nèi),例如1個(gè)月(4周)內(nèi),1小時(shí)至1個(gè)月內(nèi),例如1小時(shí)至3周之間或1小時(shí)至2周之間或1小時(shí)至1周之間,從它被給藥到的受試者中清除。

      構(gòu)成所述納米粒子(包括如果存在的話它的生物相容性涂層)的材料,在決定納米粒子的生物持久性(即在受試者體內(nèi)的持久性)中是重要的。當(dāng)例如由生物可降解聚合物如plga或pla構(gòu)成時(shí),所述納米粒子可以被視為生物可降解的。生物可降解性促進(jìn)納米粒子從受試者的快速清除。

      根據(jù)本發(fā)明的教示,不同的分子或試劑可用作與上文中所描述的至少一種生物相容性納米粒子組合給藥的至少一種目標(biāo)化合物,通常用作至少一種目標(biāo)藥物化合物。這種化合物可以是前面所解釋的治療、預(yù)防或診斷化合物。它可以是有機(jī)化合物或無機(jī)化合物。

      可用作目標(biāo)化合物的有機(jī)化合物的實(shí)例可以選自生物化合物、抗體、寡核苷酸、合成的肽、小分子靶向治療劑、溶瘤病毒、細(xì)胞毒性化合物及其任何相應(yīng)的前體藥物或衍生物等。

      在特定實(shí)施方式中,在本發(fā)明的情形中使用的目標(biāo)化合物是有機(jī)化合物,其優(yōu)選地選自生物化合物、小分子靶向治療劑、溶瘤病毒和細(xì)胞毒性化合物。在另一個(gè)特定實(shí)施方式中,所述目標(biāo)化合物選自抗體、寡核苷酸和合成的肽。

      生物化合物是例如抗體、抗體藥物偶聯(lián)物,優(yōu)選為單克隆抗體(“mab”),例如英夫利昔單抗、阿達(dá)木單抗、貝伐單抗、利妥昔單抗、曲妥珠單抗、蘭尼單抗、西妥昔單抗、帕尼單抗,蛋白或重組蛋白例如enbrel(依那西普)或干擾素β-1a,肽或重組肽例如甘精胰島素或倍泰龍,疫苗例如prevnar13或加德西(gardasil),生物類似物例如epogin,酶或重組酶例如replagal或creon等。

      寡核苷酸是例如反義寡核苷酸、適體例如米泊美生鈉或pursennid等。

      合成或人造肽是例如醋酸格拉替雷或醋酸亮丙瑞林。

      溶瘤病毒是選擇性感染并損壞癌組織而對(duì)正常組織不造成損傷的治療上有用的病毒。溶瘤病毒選自例如腺病毒如onyx-015、柯薩奇病毒如catavak、單純性皰疹病毒例如talimogenelaherparepvec、maesla病毒例如mv-cea、新城疫病毒、細(xì)小病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、呼腸孤病毒、塞內(nèi)加谷病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒、水泡性口炎病毒。

      小分子靶向治療劑通常抑制惡性細(xì)胞內(nèi)突變的、過表達(dá)的或以其他方式重要的蛋白(癌癥治療情形中的潛在靶)上的酶結(jié)構(gòu)域。一些治療劑包括靶向細(xì)胞分裂(例如極光激酶抑制劑或周期蛋白依賴性激酶抑制劑)以及其他生物機(jī)制例如蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)和染色質(zhì)修飾(例如組蛋白脫乙酰酶抑制劑)的藥劑。小分子靶向治療劑是例如伊馬替尼、雷帕霉素、吉非替尼、埃羅替尼、索拉非尼、舒尼替尼、尼羅替尼、達(dá)沙替尼、拉帕替尼、硼替佐米、阿托伐他汀等。

      細(xì)胞毒性化合物是例如dna修飾劑例如蒽環(huán)類藥物(例如多柔比星、柔紅霉素等)、烷基化劑(例如美法侖或替莫唑胺),以及非常精確地干擾確定的生理機(jī)制例如微管聚合(例如紫杉醇)或代謝物合成(例如甲氨蝶呤)的藥物??杉せ畹募?xì)胞毒性化合物通常用于光動(dòng)力療法的背景中(例如卟吩姆),并且被外部源例如激光源激活以產(chǎn)生其療效。其他典型的細(xì)胞毒性化合物通常選自本文中所描述的或?qū)I(yè)腫瘤學(xué)家所知的化療劑。

      前體藥物(例如卡培他濱或伊立替康)在體內(nèi)被代謝成其活性形式,以產(chǎn)生其預(yù)期療效。

      可用作所述至少一種目標(biāo)化合物的無機(jī)化合物的實(shí)例可以選自過渡金屬配合物、放射性藥物化合物、納米粒子等。

      當(dāng)所述目標(biāo)化合物是納米粒子時(shí),所述納米粒子不同于在所要求的藥物組合物中提到的所述“至少一種生物相容性納米粒子”。

      過渡金屬配合物提供了超過更常見的基于有機(jī)化合物的藥物的潛在優(yōu)點(diǎn),包括廣范圍的配位數(shù)和幾何形狀、可接近的氧化還原狀態(tài)、配體取代的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)的“調(diào)制能力”以及廣泛的結(jié)構(gòu)多樣性。基于金屬的物質(zhì)與細(xì)胞分子靶相互作用,影響引起惡性細(xì)胞破壞的生物化學(xué)功能。過渡金屬配合物通常是作用于dna結(jié)構(gòu)的細(xì)胞毒性劑(例如鉑配合物:順鉑、卡鉑、草酸鉑,或釕或金配合物)。

      放射性藥物化合物發(fā)射輻射用于診斷目的或以便選擇性破壞惡性細(xì)胞。典型的放射性藥物可能含有例如鍶-89、鉈-201、锝-99、釤-83等。

      納米粒子通??梢赃x自金屬氧化物納米粒子(參見例如wo2009/147214和wo2007/118884)、金屬納米粒子(例如金、鉑或銀納米粒子)、金屬硫化物納米粒子(例如bi2s3)及其任何混合物(例如用氧化鉿材料覆蓋的金納米粒子)。所述納米粒子是例如可以通過外部源例如電磁輻射源、超聲源或磁源等激活的納米粒子。

      與上文中所描述的生物相容性納米粒子組合給藥(通常如本文中所述順序給藥)的目標(biāo)化合物,可以按照專業(yè)技術(shù)人員已知的手段被包封在載體中或接枝(或結(jié)合)到這種載體。典型的載體是例如脂質(zhì)體(例如doxil或使用熱敏脂類的thermodox)、膠束、聚合(或“聚合物”)載體、水凝膠、凝膠、共聚物載體、蛋白質(zhì)載體、無機(jī)載體。

      本發(fā)明的藥物組合物(由目標(biāo)化合物與納米粒子的組合所定義)可用于許多領(lǐng)域,特別是在人類或獸醫(yī)醫(yī)藥中。這種組合物通常用于被鑒定為動(dòng)物、優(yōu)選為哺乳動(dòng)物(例如在獸醫(yī)醫(yī)藥的情形中)、甚至更優(yōu)選為人類的受試者中,不論其年齡或性別如何。

      本發(fā)明的藥物組合物可用于預(yù)防或治療選自心血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)疾病、胃腸疾病、遺傳障礙、血液障礙、激素障礙、免疫障礙、傳染病、代謝障礙、肌肉骨骼障礙、癌癥、呼吸疾病和中毒等的疾病或障礙。在優(yōu)選實(shí)施方式中,所述藥物組合物用于預(yù)防或治療選自心血管疾病、cns疾病、癌癥、傳染病和代謝障礙的疾病或障礙。

      在本發(fā)明的情形中,有利情況下,所述至少一種納米粒子和藥物化合物在需要所述化合物的受試者中的給藥彼此相隔的時(shí)間在超過5分鐘至約72小時(shí)之間、通常在超過5分鐘至約24小時(shí)之間、優(yōu)選在超過5分鐘或30分鐘至約12小時(shí)之間,以便優(yōu)化所述化合物的藥物效能。

      在本發(fā)明中,當(dāng)所述至少一種納米粒子和化合物在需要所述化合物的受試者中的給藥彼此相隔的時(shí)間在超過5分鐘至約72小時(shí)之間時(shí),所述生物相容性納米粒子的絕對(duì)表面電荷值為至少10mv(|10mv|)。

      在本發(fā)明的特定實(shí)施方式中,當(dāng)所述至少一種納米粒子和化合物在需要所述化合物的受試者中的給藥彼此相隔的時(shí)間在超過5分鐘至約24小時(shí)之間時(shí),所述生物相容性納米粒子的絕對(duì)表面電荷值有利地為至少15mv(|15mv|)。

      在本發(fā)明的另一個(gè)特定實(shí)施方式中,當(dāng)所述至少一種納米粒子和化合物在需要所述化合物的受試者中的給藥彼此相隔的時(shí)間在超過5分鐘至約12小時(shí)之間時(shí),所述生物相容性納米粒子的絕對(duì)表面電荷值為至少20mv(|20mv|)。

      本文中還描述了一種對(duì)懷疑對(duì)疾病例如本文中提到的疾病易感或患有所述疾病的受試者進(jìn)行預(yù)防或治療的方法,其中所述方法包括向所述受試者給藥根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物,通常為本文中所描述的至少一種生物相容性納米粒子和至少一種目標(biāo)化合物??梢詫⑺鲋辽僖环N納米粒子或至少一種目標(biāo)化合物中的任一者首先給藥到所述受試者,只要作為一方的所述生物相容性納米粒子和作為另一方的所述目標(biāo)化合物以通常超過5分鐘至約72小時(shí)之間的時(shí)間間隔分開給藥即可。所述至少一種納米粒子或至少一種目標(biāo)化合物的給藥可以是每一者的單次給藥,每一者的重復(fù)給藥,例如每一者的幾次連續(xù)給藥。所述至少一種生物相容性納米粒子可以給藥一次并且所述至少一種目標(biāo)化合物可以給藥超過一次,反之亦然。

      在特定實(shí)施方式中,所述生物相容性納米粒子至少在包含所述至少一種目標(biāo)化合物的幾次給藥的流程開始時(shí)、即至少在所述至少一種目標(biāo)化合物的第一次給藥時(shí)給藥,或在其給藥之前或之后給藥。

      在另一個(gè)特定實(shí)施方式中,所述至少一種生物相容性納米粒子不在包含目標(biāo)化合物的幾次給藥的流程開始時(shí)給藥,并且不在所述目標(biāo)化合物的第二次或第三次給藥之前和所述給藥之前或之后給藥。

      在后兩個(gè)實(shí)施方式的情形中,所述生物相容性納米粒子也可以在所述目標(biāo)化合物的部分或所有后續(xù)給藥期間,與所述目標(biāo)化合物一起(正如以前解釋的,之前或之后)給藥。

      在特定實(shí)施方式中,本發(fā)明的至少一種納米粒子在所述至少一種目標(biāo)化合物給藥到所述受試者之前,通常在所述至少一種目標(biāo)化合物給藥之前在超過5分鐘至約72小時(shí)之間,給藥到所述受試者。

      在這種情形中,術(shù)語“納米粒子”可以更具體地指稱尺寸在約4nm至約100nm之間,例如約10nm、15nm或20nm至約100nm之間的產(chǎn)品,特別是合成的產(chǎn)品。與這種納米粒子一起使用的目標(biāo)化合物的實(shí)例是有機(jī)化合物,通常為生物化合物。有利情況下,它選自抗體、寡核苷酸、合成的肽、小分子靶向治療劑、溶瘤病毒和細(xì)胞毒性化合物,并且優(yōu)選為抗體、小分子靶向治療劑和/或細(xì)胞毒性化合物。在其他情況下,術(shù)語“納米粒子”可以指稱尺寸在約100nm至約500nm之間、通常在約100nm至約300nm之間的產(chǎn)品,特別是合成的產(chǎn)品。與這種納米粒子一起使用的目標(biāo)化合物的實(shí)例是無機(jī)化合物,通常選自金屬納米粒子、金屬氧化物納米粒子、金屬硫化物納米粒子及其任何混合物,或包封在載體中或接枝到這種載體的任何目標(biāo)化合物。

      本發(fā)明的藥物組合物的生物相容性納米粒子可以通過不同途徑給藥,例如皮下、靜脈內(nèi)(iv)、真皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、氣道(吸入)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)和/或口服途徑(經(jīng)口),優(yōu)選地通過靜脈內(nèi)(iv)、動(dòng)脈內(nèi)和/或腹膜內(nèi)途徑。

      本發(fā)明的藥物組合物的目標(biāo)化合物可以通過不同途徑給藥,例如皮下、靜脈內(nèi)(iv)、真皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、氣道(吸入)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)和/或口服途徑(經(jīng)口)。

      下面的實(shí)施例示出了本發(fā)明但不限制其范圍。

      附圖簡述

      圖1:治療性化合物取決于所述化合物的尺寸(最長維度)從血液循環(huán)移除的可能途徑的示意圖。

      圖2:包含(i)實(shí)施例3的生物相容性納米粒子和(ii)的藥物組合物在mda-mb-231-lucd3h2ln異種移植物中的治療日程表的示意圖。

      圖3:包含實(shí)施例3的生物相容性納米粒子和的藥物組合物在mda-mb-231-lucd3h2ln異種移植物中的腫瘤重新生長延遲(平均rtv±sd)。

      圖4:n-(3-羧基-1-氧代丙基)-l-谷氨酸1,5-雙十六烷基酯(sa-脂)的化學(xué)式。

      實(shí)施例

      實(shí)施例1:作為生物相容性納米粒子的脂質(zhì)體的1號(hào)合成

      脂質(zhì)體使用脂質(zhì)膜重新水合方法來制備:

      a)將脂類溶解在氯仿中。氯仿最終在氮?dú)饬飨抡舭l(fā)掉。脂質(zhì)膜與ph7.4的hepes20mm和nacl140mm的重新水合在50℃下進(jìn)行,使得脂質(zhì)濃度為5mm。

      使用下述脂質(zhì)組合物來制備帶電荷的脂質(zhì)體:dppc(二棕櫚?;字D憠A):86%mol;mppc(單棕櫚?;字D憠A):10%mol;dspe-peg(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-[甲氧基聚乙二醇-2000]):4%mol。

      b)然后通過連續(xù)地將樣品投入到液氮中并投入到調(diào)節(jié)到50℃的水浴中,進(jìn)行6次凍融循環(huán)。

      c)使用熱桶擠出機(jī)(lipextm擠出機(jī),northernlipids)來校準(zhǔn)脂質(zhì)體在受控溫度和壓力下的尺寸。在所有情況下,擠出在50℃和10巴壓力下進(jìn)行。

      如上所制備的脂質(zhì)體的尺寸分布通過動(dòng)態(tài)光散射(dls),使用zetasizernanozs(malverninstrument)和633nmhene激光器以90°的角度來測定。將脂質(zhì)體懸液在ph7.4的hepes20mm和nacl140mm中稀釋100倍。脂質(zhì)體尺寸(即流體動(dòng)力學(xué)直徑)等于約170nm(強(qiáng)度分布)并且多分散指數(shù)(pdi)等于約0.1。

      正如專業(yè)技術(shù)人員可以理解的,由于所選的脂質(zhì)組合物,獲得了所需的表面電荷,并且其值使用zetasizernanozs(malverninstrument)通過ζ電位測量得以確認(rèn)。

      將所述脂質(zhì)體在水中稀釋100倍,并將得到的懸液的ph調(diào)整到ph7.4。在ph7.4下,所述脂質(zhì)體的表面電荷等于約–14mv。

      實(shí)施例2:允許將在受試者中給藥的治療化合物的劑量減少至少10%并同時(shí)在所述受試者中具有等同的治療效能的方法

      將包含生物相容性納米粒子和當(dāng)暴露于電離輻射例如x-射線時(shí)可以產(chǎn)生電子和/或高能光子的用于抗癌療法的可激活的氧化物納米粒子(被用作“所述化合物”或“藥物化合物”)的根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物,以下述方式給藥到帶有異種移植的腫瘤的裸小鼠中:

      a)向每只裸小鼠給藥(通過靜脈內(nèi)注射)所述生物相容性納米粒子;

      b)在步驟a)后在超過5分鐘至72小時(shí)之間,在步驟a)的每只小鼠中以與當(dāng)前使用的劑量相比更低的劑量(10%)給藥(通過靜脈內(nèi)注射)所述治療化合物;

      c)測量每只小鼠的血液或血漿樣品中治療化合物的濃度,以獲得所述治療化合物的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),所述濃度在所述治療化合物給藥后1分鐘至24小時(shí)之間測量一次或優(yōu)選地測量幾次;

      d)在所述藥物組合物給藥后,評(píng)估毒性的任何臨床征兆;以及

      e)測量在靜脈內(nèi)(iv)給藥后24小時(shí)所述治療化合物的腫瘤積累。

      實(shí)施例3:作為生物相容性納米粒子的脂質(zhì)體的2號(hào)合成

      脂質(zhì)體使用脂質(zhì)膜重新水合方法來制備:

      a)將脂類溶解在氯仿中。氯仿最終在氮?dú)饬飨抡舭l(fā)掉。脂質(zhì)膜與ph7.4的hepes20mm和nacl140mm的重新水合在60℃下進(jìn)行,使得脂質(zhì)濃度為25mm。

      使用下述脂質(zhì)組合物來制備帶電荷的脂質(zhì)體:dppc(二棕櫚?;字D憠A)62%mol;hspc(氫化大豆磷脂酰膽堿)20%mol;chol(膽甾醇)16%mol;pops(1-棕櫚?;?2-油?;柞ヵ=z氨酸)1%mol;dspe-peg(二硬脂?;字R掖及?[甲氧基聚乙二醇-2000])1%mol。

      b)然后通過連續(xù)地將樣品投入到液氮中并投入到調(diào)節(jié)到60℃的水浴中,進(jìn)行6次凍融循環(huán)。

      c)使用熱桶擠出機(jī)(lipextm擠出機(jī),northernlipids)來校準(zhǔn)脂質(zhì)體在受控溫度和壓力下的尺寸。首先,在5巴壓力下5次通過孔眼尺寸為0.45μm的聚醚砜(pes)膜,然后在10巴壓力下12次通過孔眼尺寸為0.22μm的pes膜,最后在15巴壓力下12次通過0.1μm聚偏氟乙烯(pvdf)膜。如上制備的脂質(zhì)體的尺寸分布通過動(dòng)態(tài)光散射(dls),使用zetasizernanozs(malverninstrument)和633nmhene激光器以90°的角度來測定。將脂質(zhì)體懸液在ph7.4的hepes20mm和nacl140mm中稀釋100倍。脂質(zhì)體尺寸(即流體動(dòng)力學(xué)直徑)等于約145nm(強(qiáng)度分布)并且多分散指數(shù)(pdi)等于約0.1。

      正如專業(yè)技術(shù)人員可以理解的,由于所選的脂質(zhì)組合物,獲得了所需的表面電荷,并且其值使用zetasizernanozs(malverninstrument)通過ζ電位測量得以確認(rèn)。

      將所述脂質(zhì)體在1mm氯化鈉溶液中稀釋100倍,并將得到的懸液的ph調(diào)整到ph7.4。在ph7.4和nacl1mm下,所述脂質(zhì)體的表面電荷等于約–25mv。

      實(shí)施例4:包含實(shí)施例3的生物相容性納米粒子懸液和的藥物組合物在mda-mb-231-lucd3h2ln異種移植物中的腫瘤重新生長延遲(圖2和3)

      進(jìn)行本研究是為了調(diào)查包含(i)來自于實(shí)施例3的生物相容性納米粒子和(ii)作為治療性目標(biāo)化合物的(脂質(zhì)體包封的多柔比星)的藥物組合物,在異種移植在nmri裸小鼠上的mda-mb-231-luc-d3h2ln腫瘤模型中的效能。

      人乳腺腺癌mda-mb-231-luc-d3h2ln細(xì)胞系在caliperlifescience(villepinte,france)購買。將所述細(xì)胞培養(yǎng)在含有earl's平衡鹽溶液的最低必需培養(yǎng)基mem/ebss培養(yǎng)基中,所述培養(yǎng)基增補(bǔ)有10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%l-谷氨酰胺和1%丙酮酸鈉(gibco)。

      6-7周齡的nmri裸小鼠(20-25g)從janvierlabs(france)訂購。在接種用于異種移植的癌細(xì)胞之前一天,使用銫-137輻射裝置對(duì)小鼠進(jìn)行3gy的全身輻射。

      通過在小鼠的右下側(cè)腹皮下注射50μl含有4.106個(gè)細(xì)胞的注射液,獲得mda-mb-231-luc-d3h2ln腫瘤。將所述腫瘤生長至達(dá)到約100mm3的體積。使用數(shù)顯卡尺測量腫瘤直徑,并使用下述公式計(jì)算腫瘤體積,單位為mm3

      將小鼠隨機(jī)分配到分開的籠子中,并用數(shù)字辨識(shí)(爪刺字)。四個(gè)組如圖2上所示進(jìn)行處理。

      -第1組:5%無菌葡萄糖(對(duì)照(介質(zhì))組)

      在第1日、第7日和第14日,將四(4)只小鼠用5%無菌葡萄糖溶液靜脈內(nèi)(iv)注射。每個(gè)時(shí)間(每日)進(jìn)行兩次5%葡萄糖的注射。在第一次5%葡萄糖溶液注射后4小時(shí),進(jìn)行第二次注射。

      -第2組:來自于實(shí)施例3的生物相容性納米粒子(對(duì)照組)

      在第1日、第7日和第14日,將四(4)只小鼠用5%無菌葡萄糖溶液和來自于實(shí)施例3的生物相容性納米粒子(10ml/kg)靜脈內(nèi)(iv)注射。每個(gè)時(shí)間(每日),在來自于實(shí)施例3的生物相容性納米粒子注射后4小時(shí),進(jìn)行5%葡萄糖溶液的注射。

      -第3組:(3mg/kg多柔比星)(治療組)

      在第1日、第7日和第14日,將五(5)只小鼠用5%無菌葡萄糖溶液和(3mg/kg多柔比星)靜脈內(nèi)(iv)注射。每個(gè)時(shí)間(每日),在5%無菌葡萄糖溶液注射后4小時(shí),進(jìn)行(3mg/kg多柔比星)的注射。

      -第4組:藥物組合物,即(i)來自于實(shí)施例3的生物相容性納米粒子與(ii)(3mg/kg多柔比星)的組合(治療組)

      在第1日、第7日和第14日,將五(5)只小鼠用來自于實(shí)施例3的生物相容性納米粒子(10ml/kg)并用(3mg/kg多柔比星)靜脈內(nèi)(iv)注射。每個(gè)時(shí)間(每日),在來自于實(shí)施例3的生物相容性納米粒子注射后4小時(shí),進(jìn)行(3mg/kg多柔比星)的注射。

      (avantipolarlipids–2mg/ml多柔比星hcl在ph6.5-6.8的含有10%w/v蔗糖的10mm組氨酸緩沖液中的脂質(zhì)體配方)不需另外稀釋,以獲得3mg/kg的注射的多柔比星所需的體積進(jìn)行注射。

      來自于實(shí)施例3的生物相容性納米粒子懸液不需任何另外稀釋直接使用。

      和來自于實(shí)施例3的生物相容性納米粒子使用100u(0.3ml)胰島素注射器(terumo,france),經(jīng)側(cè)尾靜脈通過靜脈內(nèi)注射(iv)來給藥。

      跟蹤小鼠的臨床征兆、體重和腫瘤尺寸。

      腫瘤體積從使用數(shù)顯卡尺獲得的二維腫瘤體積測量值,使用下述公式來估算:

      在每個(gè)組中,相對(duì)腫瘤體積(rtv)被表示成vt/v0比率(vt是治療期間給定日的腫瘤體積,v0是治療開始時(shí)的腫瘤體積)。

      治療效能使用兩個(gè)加倍時(shí)間(一個(gè)加倍時(shí)間是腫瘤體積加倍所花費(fèi)的時(shí)間量)內(nèi)的比生長延遲(sgd)和最適t/c百分?jǐn)?shù)值(%t/c)來確定。

      所述sgd如下所示在兩個(gè)加倍時(shí)間內(nèi)計(jì)算:

      其中t4d是腫瘤體積加倍兩次(平均rtv從100mm3直至400mm3)所需的時(shí)間。

      t/c百分?jǐn)?shù)值(“%t/c”)通過用第1、3、7、10、13、15、18、21和24日治療組(第2、3、4組)的相對(duì)腫瘤體積的中值除以對(duì)照組(第1組)的中值,并將所述除法的結(jié)果乘以100來計(jì)算(參見表2)。在治療注射(含有或不含在本發(fā)明的情形中使用的生物相容性納米粒子)后2周內(nèi)獲得的最低%t/c值,對(duì)應(yīng)于最適%t/c值。

      圖3示出了在進(jìn)行下述iv注射后獲得的(在前述條件下)所有組的平均相對(duì)腫瘤體積(平均rtv):

      -介質(zhì)(5%無菌葡萄糖),在第1、7和14日(第1組);

      -來自于實(shí)施例3的生物相容性納米粒子,4小時(shí)后為介質(zhì)(5%無菌葡萄糖)注射,在第1、7和14日(第2組);

      -(3mg/kg多柔比星),在第1、7和14日(第3組);或

      -來自于實(shí)施例3的生物相容性納米粒子,4小時(shí)后是(3mg/kg多柔比星)注射,在第1、7和14日(第4組)。

      正如圖3上所示,當(dāng)與單獨(dú)的(3mg/kg多柔比星)相比時(shí),在包含(i)來自于實(shí)施例3的生物相容性納米粒子和(ii)(3mg/kg多柔比星)的組合的藥物組合物的首次注射后,觀察到顯著的腫瘤生長抑制。

      計(jì)算每個(gè)腫瘤的體積加倍兩次所需的時(shí)間(t4d)(用日為單位表示)(作為治療效果的持續(xù)時(shí)間的度量)。所述藥物組合物的t4d被估算為約31日,相比而言單獨(dú)的為約14日(表1)。此外,從兩個(gè)加倍時(shí)間內(nèi)(從平均rtv為100mm3開始直至400mm3)的腫瘤生長估算的比生長延遲(sgd),對(duì)于所述藥物組合物來說約等于2,對(duì)于單獨(dú)的來說約等于0(表1)。

      表1:腫瘤體積加倍兩次的時(shí)間(t4d)和從兩個(gè)加倍時(shí)間內(nèi)的腫瘤生長估算的比生長延遲(sgd)。td4表示達(dá)到兩個(gè)加倍時(shí)間(平均rtv從100mm3直至400mm3)的天數(shù)。對(duì)照組是單獨(dú)的介質(zhì)(5%葡萄糖)(-)。

      此外,藥物組合物與單獨(dú)的相比,t/c百分?jǐn)?shù)(%t/c)(計(jì)算至第1組被處死的當(dāng)天)降低得更快。這證實(shí)了所述藥物組合物的顯著影響。對(duì)于藥物組合物、即(i)來自于實(shí)施例3的生物相容性納米粒子和(ii)(3mg/kg多柔比星)的組合來說,事實(shí)上獲得了在第24日觀察到的25的最適%t/c,而對(duì)于單獨(dú)的組來說,獲得了在第21日觀察到的38的最適%t/c(表2)。

      表2:t/c百分?jǐn)?shù)(%t/c)通過用第1、3、7、10、13、15、18、21和24日治療組(第2、3、4組)的相對(duì)腫瘤體積的中值除以對(duì)照組(第1組)的中值,并將所述除法的結(jié)果乘以100來計(jì)算。對(duì)照組是第1組(單獨(dú)的介質(zhì),即5%無菌葡萄糖)。%t/c被計(jì)算至第24日,其對(duì)應(yīng)于第1組(對(duì)照組)的處死日。每個(gè)組的最適%t/c指示在灰色格中。

      總的來說,這些結(jié)果顯示出當(dāng)使用本發(fā)明的藥物組合物[對(duì)應(yīng)于(i)來自于實(shí)施例3的生物相容性納米粒子與(ii)(3mg/kg多柔比星)的組合]時(shí)有利的腫瘤生長延遲,這在單獨(dú)使用(3mg/kg多柔比星)時(shí)(即在不存在本發(fā)明的情形中使用的生物相容性納米粒子的情況下)沒有觀察到。當(dāng)來自于實(shí)施例3的生物相容性納米粒子與目標(biāo)化合物順序給藥,所述生物相容性納米粒子在之前4小時(shí)給藥到受試者時(shí),觀察到這種腫瘤生長延遲。

      實(shí)施例5:作為生物相容性納米粒子的脂質(zhì)體的3號(hào)合成

      脂質(zhì)體使用脂質(zhì)膜重新水合方法來制備:

      a)將脂類溶解在氯仿中。氯仿最終在氮?dú)饬飨抡舭l(fā)掉,以在pyrex

      管壁上形成脂質(zhì)膜。脂質(zhì)膜與ph7.4的hepes25mm和nacl150mm的重新水合在60℃下進(jìn)行,使得脂質(zhì)濃度為50mm。

      使用下述脂質(zhì)組合物來制備帶電荷的脂質(zhì)體:dppc(二棕櫚酰基磷脂酰膽堿)58%mol;hspc(氫化大豆磷脂酰膽堿)21%mol;chol(膽甾醇)16%mol;pops(1-棕櫚?;?2-油酰基磷酯酰絲氨酸)5%mol。

      b)然后通過連續(xù)地將樣品投入到液氮中并投入到調(diào)節(jié)到60℃的水浴中,進(jìn)行6次凍融循環(huán)。在每3個(gè)凍融循環(huán)時(shí)和即將擠出之前,對(duì)脂質(zhì)體溶液進(jìn)行30s的超聲處理。

      c)使用熱桶擠出機(jī)(lipextm擠出機(jī),northernlipids)來校準(zhǔn)脂質(zhì)體在受控溫度和壓力下的尺寸。擠出在60℃下進(jìn)行。在10巴壓力下10次通過孔眼尺寸為0.1μm的聚偏氟乙烯(pvdf)膜。

      如上所制備的脂質(zhì)體的尺寸分布通過動(dòng)態(tài)光散射(dls),使用zetasizernanozs(malverninstrument)和633nmhene激光器以173°的角度來測定。將脂質(zhì)體懸液在ph7.4的hepes25mm和nacl150mm中稀釋200倍。脂質(zhì)體尺寸(即流體動(dòng)力學(xué)直徑)等于約170nm(強(qiáng)度分布)并且多分散指數(shù)(pdi)等于約0.2。

      正如專業(yè)技術(shù)人員可以理解的,由于所選的脂質(zhì)組合物,獲得了所需的表面電荷,并且其值使用zetasizernanozs(malverninstrument)通過ζ電位測量得以確認(rèn)。將所述脂質(zhì)體在1mm氯化鈉溶液中稀釋200倍,并將溶液的ph調(diào)整到ph7。在ph7和nacl1mm下,所述脂質(zhì)體的表面電荷等于約–40mv。

      所述脂質(zhì)體溶液的最終脂類濃度通過比色測定法(bartlett方法)來測量。所述方法是基于通過磷脂的酸消化進(jìn)行總磷測定。釋放出的無機(jī)磷酸鹽與鉬酸銨反應(yīng),絡(luò)合物給出強(qiáng)的藍(lán)色。脂類濃度約等于約50mm。

      實(shí)施例6:作為生物相容性納米粒子的脂質(zhì)體的4號(hào)合成

      脂質(zhì)體使用脂質(zhì)膜重新水合方法來制備:

      a)將脂類溶解在氯仿中。氯仿最終在氮?dú)饬飨抡舭l(fā)掉,以在pyrex管壁上形成脂質(zhì)膜。脂質(zhì)膜與ph7.4的hepes25mm和nacl150mm的重新水合在60℃下進(jìn)行,使得脂質(zhì)濃度為50mm。

      使用下述脂質(zhì)組合物來制備帶電荷的脂質(zhì)體:dppc(二棕櫚?;字D憠A)45.15%mol;chol(膽甾醇)45.15%mol;dspe-peg(二硬脂?;字R掖及?[甲氧基聚乙二醇-2000])0.60%mol;n-(3-羧基-1-氧代丙基)-l-谷氨酸1,5-雙十六烷基酯(sa-脂類)9.10%mol。所述sa-脂類在脂質(zhì)體表面上帶有cooh基團(tuán)。

      b)然后通過連續(xù)地將樣品投入到液氮中并投入到調(diào)節(jié)到60℃的水浴中,進(jìn)行6次凍融循環(huán)。

      c)使用熱桶擠出機(jī)(lipextm擠出機(jī),northernlipids)來校準(zhǔn)脂質(zhì)體在受控溫度和壓力下的尺寸。擠出在60℃下進(jìn)行。在3巴壓力下7次通過孔眼尺寸為0.45μm的聚偏氟乙烯(pvdf)膜,并在10巴壓力下10次通過孔眼尺寸為0.22μm的聚偏氟乙烯(pvdf)膜。如上所制備的脂質(zhì)體的尺寸分布通過動(dòng)態(tài)光散射(dls),使用zetasizernanozs(malverninstrument)和633nmhene激光器以173°的角度來測定。將脂質(zhì)體溶液在ph7.4的hepes25mm和nacl150mm中稀釋200倍。脂質(zhì)體尺寸(即流體動(dòng)力學(xué)直徑)等于約230nm(強(qiáng)度分布)并且多分散指數(shù)(pdi)等于約0.2。

      正如專業(yè)技術(shù)人員可以理解的,由于所選的脂質(zhì)組合物,獲得了所需的表面電荷,并且其值使用zetasizernanozs(malverninstrument)通過ζ電位測量得以確認(rèn)。將所述脂質(zhì)體溶液在1mm氯化鈉溶液中稀釋200倍,并將溶液的ph調(diào)整到ph7。在ph7和nacl1mm下,所述脂質(zhì)體的表面電荷等于約–60mv。

      所述脂質(zhì)體溶液的最終脂類濃度通過比色測定法(bartlett方法)來測量。所述方法是基于通過磷脂的酸消化進(jìn)行總磷測定。釋放出的無機(jī)磷酸鹽與鉬酸銨反應(yīng),絡(luò)合物給出強(qiáng)的藍(lán)色。脂類濃度約等于50mm。

      實(shí)施例7:作為生物相容性納米粒子的脂質(zhì)體的5號(hào)合成

      脂質(zhì)體使用脂質(zhì)膜重新水合方法來制備:

      a)將脂類溶解在氯仿中。氯仿最終在氮?dú)饬飨抡舭l(fā)掉,以在pyrex管壁上形成脂質(zhì)膜。脂質(zhì)膜與ph7.4的hepes25mm和nacl150mm的重新水合在60℃下進(jìn)行,并且脂質(zhì)濃度為50mm。使用下述脂質(zhì)組合物來制備帶電荷的脂質(zhì)體:dspc(1,2-二硬脂?;?sn-甘油-3-磷酸膽堿)60%mol;chol(膽甾醇)35%mol;和琥珀酰基pe(1,2-二油?;?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-琥珀酰基)5%mol。

      b)然后通過連續(xù)地將樣品投入到液氮中并投入到調(diào)節(jié)到60℃的水浴中,進(jìn)行6次凍融循環(huán)。在每3個(gè)凍融循環(huán)時(shí)和即將擠出之前,對(duì)脂質(zhì)體溶液進(jìn)行30s的超聲處理。

      c)使用熱桶擠出機(jī)(lipextm擠出機(jī),northernlipids)來校準(zhǔn)脂質(zhì)體在受控溫度和壓力下的尺寸。擠出在60℃下進(jìn)行。在12巴壓力下12次通過孔眼尺寸為0.22μm的聚偏氟乙烯(pvdf)膜。

      d)對(duì)氨基苯基-α-d-吡喃甘露糖苷(man)與琥珀?;鵳e脂質(zhì)體的偶聯(lián):使用碳二亞胺偶聯(lián),將琥珀酰基pe脂質(zhì)體的表面用甘露糖衍生的配體對(duì)氨基苯基-α-d-吡喃甘露糖苷(man)修飾,以開發(fā)甘露糖偶聯(lián)的脂質(zhì)體。man通過其氨基共價(jià)偶聯(lián)到存在于預(yù)先形成的琥珀酰基pe脂質(zhì)體的表面上的琥珀?;鵳e的羧酸基團(tuán)。簡單來說,向預(yù)先形成的琥珀?;鵳e脂質(zhì)體溶液添加edc(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽)(琥珀?;鵳e/edc的摩爾比為1:10)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)(nhs/edc的摩爾比為1:2.5)。然后用naoh1m將懸液的ph調(diào)整到6,并將得到的懸液在室溫下攪拌15分鐘。隨后,用naoh1m將溶液的ph調(diào)整到7,并向所述溶液添加man水溶液(琥珀酰基pe/man的摩爾比為1:2)。使用naoh1m將ph重新調(diào)整到7,并將懸液在室溫下繼續(xù)攪拌2小時(shí)。通過使用50kda纖維素膜以稀釋倍數(shù)(×500;×500;×500)進(jìn)行3個(gè)透析步驟,除去過量的未結(jié)合的man、edc和nhs分子。

      值得注意的是,由于在透析后可能的稀釋,所述脂質(zhì)體溶液可以使用膜超濾,在具有聚醚砜(pes)膜且截留分子量為300kda的vivaspin濃縮器上,通過離心(通常為sigma3-15k離心機(jī),在5℃下;1,200rpm)來濃縮。

      如上所制備的脂質(zhì)體的尺寸分布通過動(dòng)態(tài)光散射(dls),使用zetasizernanozs(malverninstrument)和633nmhene激光器以173°的角度來測定。將脂質(zhì)體溶液在ph7.4的hepes25mm和nacl150mm中稀釋200倍。脂質(zhì)體尺寸(即流體動(dòng)力學(xué)直徑)為約230nm(強(qiáng)度分布)并且多分散指數(shù)(pdi)約為0.2。

      正如專業(yè)技術(shù)人員可以理解的,由于所選的脂質(zhì)組合物,獲得了所需的表面電荷,并且其值使用zetasizernanozs(malverninstrument)通過ζ電位測量得以確認(rèn)。將所述脂質(zhì)體溶液在ph7的1mm氯化鈉溶液中稀釋200倍。在ph7和nacl1mm下,所述脂質(zhì)體的表面電荷為約–70mv。

      所述脂質(zhì)體溶液的最終脂類濃度通過比色測定法(bartlett方法)來測量。所述方法基于通過磷脂的酸消化進(jìn)行的總磷測定。釋放出的無機(jī)磷酸鹽與鉬酸銨反應(yīng),絡(luò)合物給出強(qiáng)的藍(lán)色。脂類濃度約等于50mm。

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