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本申請(qǐng)根據(jù)35usc§119(e)要求2014年11月21日提交的美國(guó)系列號(hào)62/082,848的權(quán)益。上述申請(qǐng)的完整內(nèi)容通過(guò)引用方式明確地并入本文。

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本發(fā)明受美國(guó)政府支持根據(jù)美國(guó)國(guó)家健康研究所(nih)資助的合同號(hào)ai037657做出。美國(guó)政府在本發(fā)明中享有某些權(quán)利。

背景技術(shù)：

膽固醇依賴(lài)性細(xì)胞溶素(cdc)是一個(gè)龐大的成孔毒素家族，由來(lái)自屬梭菌屬(clostridium)、鏈球菌屬(streptococcus)、李斯特氏菌屬(listeria)、芽孢桿菌屬(bacillus)和隱秘桿菌屬(arcanobacterium)的超過(guò)20個(gè)種產(chǎn)生。這些毒素的成孔機(jī)制顯示兩個(gè)標(biāo)志性特征：絕對(duì)依賴(lài)于膜膽固醇的存在和形成十分大的孔。每種cdc作為ii型分泌系統(tǒng)分泌的可溶性單體蛋白質(zhì)產(chǎn)生，一個(gè)成員例外。一旦遇到真核細(xì)胞，cdc發(fā)生可溶性單體蛋白質(zhì)至膜嵌入型超分子孔復(fù)合體的轉(zhuǎn)化。單體轉(zhuǎn)化成低聚體膜插入型孔復(fù)合體需要單體結(jié)構(gòu)的某些特別變化。

盡管cdc作為β-溶血蛋白熟知，已經(jīng)變得日益明顯的是，較之用作單純的溶血素或通用細(xì)胞溶解物質(zhì)，細(xì)菌病原體以復(fù)雜得多的方式利用這些蛋白質(zhì)。cdc結(jié)構(gòu)還顯示可塑性，所述可塑性已經(jīng)允許某些cdc的獨(dú)特特征進(jìn)化，而不破壞根本的成孔機(jī)制。在激活補(bǔ)體、利用非甾體受體、顯示ph敏感性成孔機(jī)制或可以作為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)通道發(fā)揮作用的cdc中反映這些特征中的某些。

cdc是富含β片層的四結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)。結(jié)構(gòu)域4中存在一個(gè)高度保守的富含色氨酸的十一肽，其參與某些cdc與富含膽固醇的膜結(jié)合。此外，已經(jīng)顯示在結(jié)構(gòu)域4頂端靠近所述十一肽的三個(gè)其他疏水性短環(huán)(環(huán)l1、l2和l3)還插入膜表面并以垂直取向令cdc錨定至膜。在膜結(jié)合后，cdc單體橫向地?cái)U(kuò)散以啟動(dòng)膜低聚物的形成。

一旦前孔復(fù)合體達(dá)到巨大的尺寸，假定地達(dá)到完整環(huán)結(jié)構(gòu)，則它隨后轉(zhuǎn)變成孔復(fù)合體。當(dāng)前孔復(fù)合體內(nèi)部每種單體的結(jié)構(gòu)域3中的兩個(gè)α-螺旋束轉(zhuǎn)化成兩個(gè)延長(zhǎng)的兩親性跨膜β-發(fā)夾(tmh)時(shí)，形成跨膜孔。一旦前孔轉(zhuǎn)化成孔，前孔結(jié)構(gòu)的高度發(fā)生約40埃的垂直塌陷。前孔結(jié)構(gòu)的塌陷導(dǎo)致結(jié)構(gòu)域3tmh處于膜表面的驚人距離范圍內(nèi)，此時(shí)它們協(xié)調(diào)地插入膜中，導(dǎo)致巨大的跨膜β-桶孔形成。cdc孔巨大：它由35至50個(gè)單體組成并且顯示250至300埃的直徑。

在cdc單體與膜相互作用過(guò)程期間，一旦cdc單體與膜表面相互作用，則結(jié)構(gòu)域4β-夾心的頂端的十一肽和三個(gè)其他短環(huán)(l1、l2、和l3)插入膜中。這些環(huán)并不深入穿透膜中并且表面上不直接參與跨膜孔的結(jié)構(gòu)。這些環(huán)的一個(gè)功能似乎是令單體以直立位置錨定至膜中。結(jié)構(gòu)域4以垂直于膜的取向存在并且由含水環(huán)境包圍，甚至在低聚狀態(tài)下也如此。

cdc的結(jié)構(gòu)域4介導(dǎo)膜識(shí)別，無(wú)論它借助膽固醇或另一個(gè)受體發(fā)揮作用，如在ily(中間鏈球菌溶素)的情形。

cdc還能夠在體外溶解多種類(lèi)型的有核細(xì)胞類(lèi)型，并且這種能力轉(zhuǎn)而已經(jīng)由多位研究者用來(lái)以cdc透化各種真核細(xì)胞類(lèi)型。盡管這些毒素具有作為通用細(xì)胞溶解物質(zhì)在體外發(fā)揮作用的能力，尚未證實(shí)細(xì)胞溶解是感染期間cdc的主要功能。已經(jīng)例如在單核增生李斯特菌(listeriamonocytogenes)、化膿性鏈球菌(streptococcuspyogenes)、肺炎鏈球菌(streptococcuspneumoniae)、化膿隱秘桿菌(arcanobacteriumpyogenes)和產(chǎn)氣莢膜梭菌(clostridiumperfringens)中研究了cdc對(duì)感染的貢獻(xiàn)。這些研究中某些研究的結(jié)果表明，較之用作通用溶細(xì)胞物質(zhì)，細(xì)菌以更復(fù)雜的方式利用cdc。還顯而易見(jiàn)，cdc結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生某些獨(dú)特的進(jìn)化轉(zhuǎn)變，所述轉(zhuǎn)變促進(jìn)這些細(xì)菌物種的致病機(jī)制。

肺炎鏈球菌是人類(lèi)中、尤其嬰兒、老年人、患慢性疾病的人和免疫受損人員當(dāng)中重要的病原體。它是頻繁從侵襲性疾病如菌血癥/敗血癥、肺炎和腦膜炎患者分離的細(xì)菌，全球發(fā)病率和死亡率高。甚至在適宜抗生素治療的情況下，肺炎球菌感染仍導(dǎo)致許多死亡。盡管抗微生物藥物的到來(lái)已經(jīng)降低因肺炎球菌病所致的總體死亡率，但是耐藥性肺炎球菌菌株的存在如今已經(jīng)變成全球重大問(wèn)題并且強(qiáng)調(diào)需要通過(guò)抗微生物藥之外的方法治療及防止肺炎球菌感染。有效的肺炎球菌疫苗可能對(duì)肺炎鏈球菌病相關(guān)的發(fā)病率和死亡率產(chǎn)生重大影響。這疫苗將還潛在地可用于嬰兒和幼兒中防止中耳炎。迫切需要提供長(zhǎng)期免疫力的新型免疫原性肺炎球菌疫苗，特別對(duì)于2歲以下兒童，因?yàn)檫@個(gè)年齡組中疾病發(fā)生率高并且針對(duì)多糖疫苗抗原的抗體應(yīng)答不良。

每年在美國(guó)，肺炎球菌病估計(jì)占據(jù)3,000例腦膜炎、50,000例菌血癥、500,000例肺炎和7百萬(wàn)例中耳炎。

重度肺炎球菌感染因細(xì)菌散布至血流和中樞神經(jīng)系產(chǎn)生。在1997年，來(lái)自基于社區(qū)的研究的數(shù)據(jù)顯示，在美國(guó)，肺炎球菌菌血癥的年總體發(fā)病率估計(jì)為每100,000人15-30例；對(duì)于大于或等于65歲的人(每100,000人50-83例)和年齡小于或等于2歲的兒童(每100,000人160例)，該比率更高。在成人中，60％-87％的肺炎球菌菌血癥與肺炎相關(guān)；在幼兒中，原發(fā)性感染部位往往未確定。

在美國(guó)，白種人當(dāng)中罹患菌血癥的風(fēng)險(xiǎn)比其他族裔/人種群體(即，黑人、阿拉斯加原住民和美國(guó)印第安人)當(dāng)中更低。與白人相比，成年黑人具有高三倍至五倍的菌血癥總體發(fā)病率(每100,000人49-58例)。侵襲性肺炎球菌病的比率在阿拉斯加原住民和美國(guó)印第安人當(dāng)中很高。通過(guò)前瞻性監(jiān)護(hù)研究確定阿拉斯加原住民和2歲以下阿拉斯加土著兒童當(dāng)中，年齡修正的侵襲性肺炎球菌感染年度發(fā)病率分別是每100,000人74例和624例。全部年齡的阿拉斯加原住民當(dāng)中腦膜炎和菌血癥肺炎的比率比其他美國(guó)人群高八倍至十倍。已經(jīng)在特定美國(guó)印第安群體(例如，apache)當(dāng)中報(bào)道了對(duì)任何美國(guó)人群而言最高的發(fā)病率。這類(lèi)群體的年總體發(fā)病率是每100,000人156例；這些群體中1-2歲兒童的發(fā)病率是每100,000人2,396例。

在美國(guó)，估計(jì)的肺炎球菌腦膜炎年總體發(fā)病率是每100,000人一至二例。肺炎球菌腦膜炎的發(fā)病率在年齡6-24個(gè)月的兒童和年齡大于或等于65歲的人當(dāng)中最高。黑人的發(fā)病率兩倍于白人和西班牙人。因?yàn)閮和衎型流感嗜血桿菌(hib)腦膜炎的發(fā)病率在引入hib綴合物疫苗后迅速降低，所以肺炎鏈球菌已經(jīng)變成美國(guó)最常見(jiàn)的細(xì)菌性腦膜炎病因(26)。

耐藥性肺炎鏈球菌菌株(drsp)已經(jīng)在美國(guó)和世界其他部分變得日益常見(jiàn)。在一些地區(qū)中，已經(jīng)報(bào)道多達(dá)35％的肺炎球菌分離株具有中等水平(最低抑菌濃度{mic}等于0.1-1.0μg/ml)或高水平(mic大于或等于2μg/ml)的青霉素耐藥性。許多抗青霉素型肺炎球菌還抵抗其他抗微生物藥物(例如，紅霉素、甲氧芐啶-磺胺甲基異惡唑和超廣譜頭孢菌素類(lèi)抗生素)。高水平的青霉素耐藥性和多藥耐藥經(jīng)常令肺炎球菌感染的管理復(fù)雜化并且致使針對(duì)腦膜炎、肺炎和中耳炎疑似病例選擇經(jīng)驗(yàn)性抗微生物療法日益困難。治療遭不敏感生物感染的患者可能需要使用昂貴的替代性抗微生物藥并且可能導(dǎo)致住院延長(zhǎng)和醫(yī)療費(fèi)用增加。并未清晰確定抗微生物藥耐藥性對(duì)死亡率的影響。新出現(xiàn)的抗微生物藥耐藥性進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)需要通過(guò)接種防止肺炎球菌感染。

目前可用的肺炎球菌疫苗，23(merck&co.,inc.,kenilworth,n.j.)和23(lederle-praxisbiologicals,pearlriver,ny)，包含23種純化的肺炎鏈球菌(血清型1、2、3、4、5、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f和33f)莢膜多糖抗原。這些疫苗在1983年于美國(guó)注冊(cè)并且替代1977年注冊(cè)的較早14價(jià)制劑。一劑(0.5ml)23價(jià)疫苗含有25μg溶解于等滲鹽水溶液中的每種莢膜多糖抗原，具有作為防腐劑添加的苯酚(0.25％)或硫柳汞(0.01％)并且無(wú)佐劑。截至1997年，該疫苗中的23種莢膜類(lèi)型代表至少85％-90％在美國(guó)兒童和成人當(dāng)中造成侵襲性肺炎球菌感染的血清型。在這個(gè)23價(jià)疫苗中代表了截至1997在美國(guó)最頻繁造成侵襲性耐藥性肺炎球菌感染的六個(gè)血清型(6b、9v、14、19a、19f和23f)。如下文所示，僅由莢膜多糖組成的疫苗的滿(mǎn)意度有限。

肺炎球菌溶血素尤其是鏈球菌肺炎(其每年全球殺死超過(guò)一百萬(wàn)人)發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵組分。肺炎球菌溶血素作為肺炎鏈球菌肺部感染和中耳炎的疫苗組成部分的用途可能提供重要益處，原因是基于莢膜多糖的疫苗正在因遺傳性變異喪失有效性并且因?yàn)榇嬖诙嘤?0種不同的肺炎鏈球菌莢膜血清型而難以生產(chǎn)。針對(duì)一個(gè)莢膜類(lèi)型的免疫力不針對(duì)另一個(gè)莢膜類(lèi)型提供保護(hù)。上文討論的目前可用的肺炎球菌疫苗，包含來(lái)自最頻繁造成疾病的菌株的23種莢膜多糖，具有主要與某些莢膜多糖的免疫原性不良、血清型多樣和血清型分布隨時(shí)間、地理區(qū)域和年齡組的差異相關(guān)的明顯缺點(diǎn)。目前，肺炎球菌溶血素的點(diǎn)突變變體已經(jīng)用于疫苗開(kāi)發(fā)。這種肺炎球菌溶血素突變體(稱(chēng)作“pd-b”)在位置433處含有單突變(其中已經(jīng)將天然色氨酸殘基改變成苯丙氨酸)。肺炎球菌溶血素中的這種突變是在結(jié)構(gòu)域4的保守性十一肽中，其長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為是介導(dǎo)與哺乳動(dòng)物膜結(jié)合的膽固醇依賴(lài)性細(xì)胞溶素(cdc)中的結(jié)構(gòu)。

盡管肺炎球菌溶血素pd-b突變體常規(guī)地用于疫苗開(kāi)發(fā)，但是這種蛋白質(zhì)仍能夠發(fā)生與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的膜結(jié)合后出現(xiàn)的多種結(jié)構(gòu)性轉(zhuǎn)變。這些變化大幅度改變其結(jié)構(gòu)并且可能降低其在患者中刺激有效的中和免疫應(yīng)答的能力，主要原因是患者免疫系統(tǒng)可以“看到”的肺炎球菌溶血素的結(jié)構(gòu)將是終末細(xì)胞結(jié)合型低聚復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，而非可溶性單聚肺炎球菌溶血素的初始結(jié)構(gòu)。更重要地，現(xiàn)有以遺傳方式類(lèi)毒素化的肺炎球菌溶血素仍受到不可接受水平的毒性阻礙。這種毒性的基礎(chǔ)尚不清晰，但是或許因以下事實(shí)所致：這種類(lèi)毒素仍可以與哺乳動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合并在其上寡聚化。

因此，膽固醇依賴(lài)性細(xì)胞溶素(如(但不限于)肺炎球菌溶血素)的突變體將具有巨大益處，所述突變體具有降低的毒性和降低的溶血活性，仍刺激針對(duì)相應(yīng)疾病生物的免疫應(yīng)答。

附圖簡(jiǎn)述

本公開(kāi)的幾種實(shí)施方案由此在附圖中說(shuō)明。然而應(yīng)當(dāng)指出，附圖僅說(shuō)明了幾個(gè)常見(jiàn)實(shí)施方案并且因此不意在視為限制本公開(kāi)的范圍。另外，在附圖中，相似或相同的附圖標(biāo)記可以用來(lái)確定共同或相似的要素，并且并非全部這些要素可以如此編號(hào)。附圖不必然是按比例的并且附圖的某些特征和某些視圖可以在比例上夸張顯示并且為清晰和簡(jiǎn)潔起見(jiàn)以示意圖顯示。

圖1a-e含有各種膽固醇依賴(lài)性細(xì)胞溶素的天然氨基酸序列的氨基酸比對(duì)比較。本文中確定的每種蛋白質(zhì)的氨基酸序列對(duì)應(yīng)于表1中的seqidno；例如，圖1a-e中的臘狀芽孢桿菌溶素(cereolysin)對(duì)應(yīng)于表1中的seqidno:2，并且表1中的seqidno:18(paf)對(duì)應(yīng)于圖1a-e中的草綠色鏈球菌溶素。

圖2顯示ily(中間鏈球菌溶素)的晶體結(jié)構(gòu)以及ily和pfo(產(chǎn)氣莢膜桿菌溶素)的d4晶體結(jié)構(gòu)比較。(a)中顯示了ily²⁵晶體結(jié)構(gòu)的帶狀圖，所述帶狀圖指出這些研究中提到的多種結(jié)構(gòu)和殘基的位置。(b)中基于ily和pfo的晶體結(jié)構(gòu)顯示了兩種蛋白質(zhì)的d4結(jié)構(gòu)的帶狀圖疊加^23,24。顯示了兩種蛋白質(zhì)的十一肽的相對(duì)位置以及ily和pfo的l1-l3環(huán)殘基(后者在括號(hào)中)。使用vmd生成結(jié)構(gòu)圖像²⁵。

圖3顯示ily十一肽插入膽固醇耗盡的膜中。ily殘基ala-486突變成半胱氨酸(ily^a486c)并且用nbd(碘代乙酰氨基-n,n’-二甲基-n-(7-硝基-2-氧雜-1,3-二唑基)乙二胺)衍生化。當(dāng)ily^a486c-nbd單獨(dú)溫育(實(shí)線(xiàn))、與人紅細(xì)胞(hrbc-短劃線(xiàn))溫育或與耗盡膽固醇的hrbc(點(diǎn)線(xiàn))溫育時(shí)，測(cè)定nbd的熒光發(fā)射。

圖4顯示ily的環(huán)l1、l2和l3不插入膽固醇耗盡的膜中。將已知插入膜中的每個(gè)d4環(huán)殘基置換為半胱氨酸并用nbd修飾。將ily^a428c-nbd(a)、ily^a464c-nbd(b)或ily^l518c-nbd(c)單獨(dú)溫育(實(shí)線(xiàn))、與hrbc(短劃線(xiàn))溫育或與耗盡膽固醇的hrbc(點(diǎn)線(xiàn))溫育。隨后恢復(fù)膜膽固醇并測(cè)定環(huán)l1、l2和l3的插入。將ily^a428c-nbd(d)、ily^a464c-nbd(e)或ily^l518c-nbd(f)單獨(dú)溫育(實(shí)線(xiàn))或與膽固醇充足的膜溫育(短劃線(xiàn))。

圖5顯示l1-l3環(huán)介導(dǎo)pfo與富含膽固醇的脂質(zhì)體結(jié)合，(a)天然pfo(實(shí)線(xiàn))和nem修飾的pfo(短劃線(xiàn))的結(jié)合作用的spr分析，(b)天然pfo(實(shí)線(xiàn))、pfo^a401d(長(zhǎng)短劃線(xiàn))、pfo^a437d(短短劃線(xiàn))和pfo^l491d(點(diǎn)線(xiàn))的結(jié)合作用的spr分析。

圖6顯示化學(xué)修飾pfo十一肽半胱氨酸硫氫基阻斷十一肽色氨酸插入膜和前孔轉(zhuǎn)化成孔。pfo十一肽色氨酸的內(nèi)在熒光發(fā)射增加已經(jīng)用來(lái)測(cè)量它們向膜中的插入^20,21。(a)當(dāng)天然pfo中色氨酸從其可溶性形式(實(shí)線(xiàn))變成其膜結(jié)合狀態(tài)(短劃線(xiàn))，顯示其內(nèi)在熒光發(fā)射增加。(b)用已經(jīng)在cys-459經(jīng)nem修飾的天然pfo重復(fù)(a)中所示的相同實(shí)驗(yàn)。

圖7顯示用突變肺炎球菌溶血素多肽和野生型肺炎球菌溶血素免疫、隨后用肺炎鏈球菌免疫接種的小鼠中的免疫原性應(yīng)答。

發(fā)明詳述

在通過(guò)示例性附圖、實(shí)驗(yàn)、結(jié)果和實(shí)驗(yàn)室程序詳細(xì)解釋發(fā)明構(gòu)思的至少一個(gè)實(shí)施方案之前，應(yīng)當(dāng)理解本公開(kāi)不限于如以下描述中所述或附圖、實(shí)驗(yàn)和/或結(jié)果中所示的組成、組分和方法的細(xì)節(jié)。本公開(kāi)能夠由其他實(shí)施方案或按多種方式實(shí)施或開(kāi)展。因而，本文所用的語(yǔ)言意在按照最廣的可能范圍和含義給出，并且實(shí)施方案意在為示例性質(zhì)，而非窮舉性質(zhì)。另外，應(yīng)當(dāng)理解本文中所用的措辭和術(shù)語(yǔ)意在描述并且不應(yīng)當(dāng)視為限制性。

除非本文另外定義，否則本公開(kāi)中使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。另外，除非上下文所要求，單數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)包括復(fù)數(shù)并且復(fù)數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)包括單數(shù)。通常，與本文所述的細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)及寡核苷酸或多核苷酸化學(xué)及雜交相聯(lián)系所使用的命名及其技術(shù)是本領(lǐng)域熟知和通常使用的那些。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于重組dna、寡核苷酸合成和組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化(例如，電穿孔法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法)。酶促反應(yīng)和純化技術(shù)根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明或如本領(lǐng)域中通常所完成或如本文所述那樣進(jìn)行。前述技術(shù)和方法通常根據(jù)本領(lǐng)域熟知和如本說(shuō)明書(shū)通篇范圍內(nèi)引用及討論的多種普通和更具體參考文獻(xiàn)中所述的常規(guī)方法進(jìn)行。參見(jiàn)，例如，greenandsambrook(molecularcloning:alaboratorymanual(第4版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(2012))和coligan等人(currentprotocolsinimmunology,currentprotocols,wileyinterscience(1994))，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用的方式明確并入本文。與本文所述的分析化學(xué)、合成有機(jī)化學(xué)和醫(yī)用化學(xué)和藥物化學(xué)結(jié)合所用的命名以及實(shí)驗(yàn)室方法和技術(shù)是本領(lǐng)域熟知并常用的那些。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于化學(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制備、配制和遞送及患者治療。

本說(shuō)明書(shū)中提到的全部專(zhuān)利、公開(kāi)的專(zhuān)利申請(qǐng)和非專(zhuān)利出版物均表示本公開(kāi)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的技術(shù)水平。在本申請(qǐng)的任何部分中提及的全部專(zhuān)利、公開(kāi)的專(zhuān)利申請(qǐng)和非專(zhuān)利出版物均明確通過(guò)引用方式完整并入本文至相同的程度，如同專(zhuān)門(mén)且個(gè)別地指出通過(guò)引用的方式并入每份單獨(dú)的專(zhuān)利或出版物。特別地，以下專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)的完整內(nèi)容因而通過(guò)引用的方式明確并入本文：2012年2月21日提交的美國(guó)系列號(hào)13/401,460；2008年4月14日提交的美國(guó)系列號(hào)12/102,696，2012年3月6日頒布的當(dāng)前美國(guó)專(zhuān)利號(hào)8,128,939；2007年4月13日提交的美國(guó)系列號(hào)60/923,281；和2014年11月21日提交的美國(guó)系列號(hào)62/082,848。

可以在不進(jìn)行過(guò)多實(shí)驗(yàn)的情況下根據(jù)本公開(kāi)制得并實(shí)施本文描述和/或否則構(gòu)思的全部組合物和/或方法。雖然已經(jīng)根據(jù)具體實(shí)施方案描述了本文中公開(kāi)和/或否則構(gòu)思的組合物和/或方法，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)，變型可以適用于本文描述和/或否則構(gòu)思的組合物和/或方法中以及用于本文描述和/或否則構(gòu)思的方法的各步驟或系列步驟中而不脫離本公開(kāi)的構(gòu)思、精神和范圍。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的全部這類(lèi)相似的代用品和修改形式視為處于所附權(quán)利要求限定的發(fā)明構(gòu)思的精神、范圍和設(shè)想范圍內(nèi)。

如根據(jù)本公開(kāi)所用，除非另外說(shuō)明，否則以下術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)理解成具有以下含義：

在權(quán)利要求書(shū)和/或本說(shuō)明書(shū)中與術(shù)語(yǔ)“包含”聯(lián)合使用時(shí)，詞“一個(gè)(a)”或“一種(an)”的用途可以意指“一個(gè)(one)”，但是它還符合以下意思：“一個(gè)或多個(gè)”、“至少一個(gè)”和“一個(gè)或多于一個(gè)”。雖然本公開(kāi)內(nèi)容支持僅指替代物和“和/或”的定義，但是除非明確指示僅指替代物或替代物是互斥的，否則術(shù)語(yǔ)“或”在權(quán)利要求書(shū)中的用途用來(lái)意指“和/或”。在本申請(qǐng)通篇范圍內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“約”用來(lái)表示某個(gè)值包括正在用來(lái)測(cè)定該值的裝置、方法的內(nèi)在誤差變異或在研究受試者之間存在的變異。例如但不限于，當(dāng)使用術(shù)語(yǔ)“約”時(shí)，指定的值可以變動(dòng)正或負(fù)12％，或11％，或10％，或9％，或8％，或7％，6％，或5％，或4％，或3％，或2％，或1％。術(shù)語(yǔ)“至少一個(gè)”的運(yùn)用將理解為包括一個(gè)以及多于一個(gè)的任何量，包括但不限于2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100個(gè)等。術(shù)語(yǔ)“至少一個(gè)”可以擴(kuò)展直至100或1000個(gè)或更多，這取決于與之相聯(lián)系的術(shù)語(yǔ)；此外，100/1000的量不視為限制性，因?yàn)楦叩南拗狄部赡墚a(chǎn)生令人滿(mǎn)意的結(jié)果。此外，術(shù)語(yǔ)“x、y和z至少之一”的運(yùn)用將理解為包括單獨(dú)的x、單獨(dú)的y和單獨(dú)的z以及x、y和z的任何組合。使用序數(shù)術(shù)語(yǔ)(即，“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等)的目的僅區(qū)分兩個(gè)或更多個(gè)項(xiàng)并且例如不意在暗示任何順序或次序或一項(xiàng)超過(guò)另一項(xiàng)的重要性或任何增加次序。

如本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中所用，詞“包含”(以及包含的任何形式，如“包含了”及“包含著”)、“具有”(以及具有的任何形式，如“具有了”及“具備”)、“包括”(以及包括的任何形式，如“包括了”及“包括”)或“含有”(以及含有的任何形式，如“含有”及“含有”)是包含性的或開(kāi)放式的并且不排除額外的、未提到的因素或方法步驟。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“或其組合”指在該術(shù)語(yǔ)之前所列各項(xiàng)的全部排列和組合。例如，“a、b、c或其組合”意在包括以下至少一種情況：a、b、c、ab、ac、bc或abc，并且如果次序在特定情境下重要，還包括ba、ca、cb、cba、bca、acb、bac或cab。續(xù)上例，明確包括了含有一個(gè)或多個(gè)項(xiàng)或條目的重復(fù)的組合，如bb、aaa、aab、bbc、aaabcccc、cbbaaa、cababb等。技術(shù)人員將理解，一般不限制任意組合中項(xiàng)或條目的數(shù)目，除非從語(yǔ)境中顯而易見(jiàn)。

本說(shuō)明書(shū)通篇范圍內(nèi)和權(quán)利要求書(shū)，除非語(yǔ)境下需要，否則術(shù)語(yǔ)“基本上”和“約”將理解為不限于這些形容詞/副詞定性的具體條目，而是理解為某值包括正在用來(lái)測(cè)定該值的裝置、方法的內(nèi)在誤差變異和/或在研究受試者之間存在的變異。因此，所述術(shù)語(yǔ)允許對(duì)其不產(chǎn)生顯著影響的少量變異和/或偏差。例如，在某些情況下，術(shù)語(yǔ)“約”用來(lái)表示某個(gè)值包括正在用來(lái)測(cè)定該值的裝置、方法的內(nèi)在誤差變異和/或在研究受試者之間存在的變異。類(lèi)似地，術(shù)語(yǔ)“基本上”還可以指80％或更高，如85％或更高，或90％或更高，或95％或更高，或99％或更高等。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“純化的蛋白質(zhì)”或“分離的蛋白質(zhì)”意指蛋白質(zhì)或片段基本上不含正常情況下隨蛋白質(zhì)一起出現(xiàn)的污染物或細(xì)胞組分，從而區(qū)分開(kāi)蛋白質(zhì)與污染物或細(xì)胞組分。未構(gòu)思“純化的”需要具有技術(shù)上完全純(均勻)的制品，但如本文所用的“純化的”意指蛋白質(zhì)或多肽片段與正常情況下隨蛋白質(zhì)一起出現(xiàn)的污染物或細(xì)胞組分充分分離，旨在以該蛋白質(zhì)可以用于測(cè)定法如免疫沉淀法或elisa的狀態(tài)下提供該蛋白質(zhì)。例如，純化的蛋白質(zhì)可以位于電泳凝膠中。

在本文中用來(lái)描述多肽時(shí)，術(shù)語(yǔ)“突變體”指與相應(yīng)野生型(天然)多肽的氨基酸序列小于100％相同的多肽，并且尤其指其中已經(jīng)置換野生型多肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基位置的合成多肽或重組多肽。術(shù)語(yǔ)“變體”可以與術(shù)語(yǔ)“突變體”互換地使用。

本文所述的突變cdc可以與一種或多種可藥用賦形劑(包括載體、溶媒和稀釋劑)組合以形成免疫原性組合物。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“可藥用賦形劑”意指可以在其中布置本文公開(kāi)的突變cdc(例如，突變肺炎球菌溶血素多肽)以改善溶解度、遞送、分散、穩(wěn)定性和/或構(gòu)象完整性的溶劑或其他材料。這類(lèi)可藥用賦形劑的例子包括但不限于水、鹽水溶液(如生理鹽水溶液和中性ph的緩沖鹽水溶液(如磷酸鹽緩沖鹽水(pbs))、乙醇、糖、右旋糖、甘油和/或多元醇(如甘露糖醇和山梨醇)。其他類(lèi)型的載體包括脂質(zhì)體或聚合物等。

術(shù)語(yǔ)“可藥用的”指并非生物上不利或另外不利的材料，即，該材料可以隨所選擇的化合物一起施用至個(gè)體，不造成任何不利的生物學(xué)效果或不與藥物組合物含有的任何其他組分以不利方式相互作用。

突變cdc或含有所述突變cdc的免疫原性組合物還可以與佐劑如(但不限于)弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑、明礬、單磷酸酯類(lèi)脂a、磷酸鋁或氫氧化鋁、qs-21、鹽即alk(so4)2、alna(so4)2、alnh4(so4)2、二氧化硅、高嶺土、和/或碳多核苷酸(即聚ic和聚au)組合。佐劑的非限制性例子包括quila、alhydrogel等。術(shù)語(yǔ)“佐劑”指隨免疫原組合物一起給予時(shí)，能夠增強(qiáng)、加速或延長(zhǎng)免疫應(yīng)答的物質(zhì)。任選地，本文構(gòu)思的突變cdc可以與免疫調(diào)節(jié)劑和免疫刺激劑(如但不限于白介素、干擾素等)組合。許多疫苗和其他藥物制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。

“生物學(xué)上有活性的”意指調(diào)節(jié)生物的生理系統(tǒng)的能力。分子可以因其自身功能性而有生物活性，或可以基于其激活或抑制具有自身生物學(xué)活性的分子的能力而有生物活性。

在本文中使用的情況下，術(shù)語(yǔ)“免疫原性的”意指物質(zhì)激發(fā)免疫應(yīng)答的能力。例如，“免疫原性組合物”是包含突變cdc如突變肺炎球菌溶血素多肽的組合物，所述的組合物能夠在施用至主題動(dòng)物時(shí)在該動(dòng)物中激發(fā)免疫應(yīng)答，如產(chǎn)生抗體。術(shù)語(yǔ)“疫苗”指施用至受試者以激發(fā)對(duì)特定抗原的免疫應(yīng)答的免疫原性組合物。例如，包含本文公開(kāi)的一種或多種突變肺炎球菌溶血素多肽的疫苗是用于治療細(xì)菌肺炎鏈球菌所致疾病或病狀的疫苗。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“患者”或“受試者”包括人類(lèi)和獸醫(yī)受試者。出于治療目的，“哺乳動(dòng)物”指劃分為哺乳動(dòng)物的任何動(dòng)物，包括(但不限于)人、家養(yǎng)動(dòng)物(如，但不限于犬和貓)、家畜(如，但不限于奶牛、馬、豬、山羊和綿羊)、實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物(如，但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠和栗鼠)、非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)和任何其他具有乳腺組織的動(dòng)物。

“治療”指治療性治療和預(yù)防性或防止性措施。需要治療的那些個(gè)體包括但不限于已經(jīng)患有特定疾病或病癥的個(gè)體以及面臨患有特定疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體(例如，需要預(yù)防性/防止性措施的那些)。術(shù)語(yǔ)“治療著”指出于治療性和/或預(yù)防性/防止性目的，向患者施用某藥劑。

“治療性組合物”或“藥物組合物”指可以在體內(nèi)施用以引起治療性和/或預(yù)防性/防止性效果的藥劑。

短語(yǔ)“施用治療有效量”或“施用預(yù)防有效量”意在治療中提供治療益處、減少疾病發(fā)生、預(yù)防或管理疾病。治療有效的具體量可以容易地由普通醫(yī)療執(zhí)業(yè)者確定，并且可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的因素變動(dòng)，如疾病/癌癥的類(lèi)型、患者病史和年齡、疾病階段和其他藥劑的共施用。

“病癥”是將從多肽治療中獲益的任何病狀。這包括慢性和急性病癥或疾病，包括使哺乳動(dòng)物易罹患所討論病癥的那些病理狀況。

術(shù)語(yǔ)“治療有效量”指生物活性分子或綴合物或其衍生物的數(shù)量，所述數(shù)量足以在按照本發(fā)明構(gòu)思的方式使用時(shí)顯示與合理收益/風(fēng)險(xiǎn)比相稱(chēng)的所需治療作用，無(wú)過(guò)度的不良副作用(如毒性、刺激作用和變態(tài)反應(yīng))。治療作用可以包括，例如但不限于，抑制不想要的組織或惡性細(xì)胞生長(zhǎng)。受試者的有效量將取決于受試者類(lèi)型、受試者的體格大小和健康、待治療病狀的性質(zhì)和嚴(yán)重程度、施用方法、治療持續(xù)時(shí)間、并存療法的性質(zhì)(如果有的話(huà))、所用的具體制劑等。因此，不可能事先規(guī)定確切的“有效量”。然而，基于本文提供的信息，給定情況的有效量可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員僅使用例行實(shí)驗(yàn)確定。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“并存療法”與術(shù)語(yǔ)“聯(lián)合療法”和“輔助療法”互換使用斌給將理解成意指采用與本公開(kāi)的藥物組合物結(jié)合的另一種針對(duì)疾病的藥物治療需要治療的患者或給予其這種藥物。這種并存療法可以是依次療法，其中首先用一種藥物并且隨后用另一種藥物治療患者，或者同時(shí)給予兩種藥物。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“施用”和“施用著”將理解成包括本領(lǐng)域已知的全部施用途徑，包括但不限于口服、局部、經(jīng)皮、腸胃外、皮下、鼻內(nèi)、粘膜、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、玻璃體內(nèi)和靜脈內(nèi)途徑，包括局部施加和全身施加。此外，本公開(kāi)的組合物(和/或其施用方法)可以設(shè)計(jì)成使用本領(lǐng)域熟知的配制技術(shù)，提供延遲釋放、控釋或緩釋。

術(shù)語(yǔ)“置換”、“插入”、“添加”和“缺失”在本文中用來(lái)指氨基酸序列或核苷酸序列。“置換”指將一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸分別替換為不同的核苷酸或氨基酸?！安迦搿被颉疤砑印笔呛塑账嵝蛄谢虬被嵝蛄兄信c天然存在的序列相比，已經(jīng)導(dǎo)致分別添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基或氨基酸殘基的變化。簡(jiǎn)而言之，"缺失"定義為核苷酸序列或氨基酸序列中分別不存在一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基或氨基酸殘基的變化。

氨基酸置換一般是單個(gè)殘基性質(zhì)的；插入通常將在約1至20個(gè)氨基酸殘基的級(jí)別上，不過(guò)可以耐受明顯更大的插入。缺失是從約1至約20個(gè)殘基，不過(guò)在一些情況下，缺失可以大得多。

置換、缺失、插入或其任意組合可以用來(lái)實(shí)現(xiàn)最終的突變多肽。通常，改變一些氨基酸以最大限度減少對(duì)分子的改變。然而，在某些情況下可以耐受較大的改變。

在某些實(shí)施方案中，氨基酸置換可以是將一個(gè)氨基酸替換為具有相似結(jié)構(gòu)的和/或化學(xué)特性的另一種氨基酸結(jié)果，如將異亮氨酸替換為纈氨酸，即，保守性氨基酸替換。插入或缺失可以任選地處于1至5個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)。

在實(shí)施方案中，可以根據(jù)已知的“保守性置換”進(jìn)行置換?！氨Ｊ匦灾脫Q”指將一個(gè)類(lèi)別中的氨基酸置換成相同類(lèi)別中的氨基酸，其中類(lèi)別由氨基酸側(cè)鏈的常見(jiàn)物理化學(xué)特性和自然界存在的同源蛋白中的高置換頻率定義。

相反，在某些實(shí)施方案中，置換是非保守的?！胺潜Ｊ匦灾脫Q”指將一個(gè)類(lèi)別中的氨基酸置換成源自另一個(gè)類(lèi)別的氨基酸。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“多肽”指由肽鍵連接的氨基酸殘基的單鏈組成的化合物。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”可以同義于術(shù)語(yǔ)“多肽”或可以另外指兩條或多條多肽的復(fù)合物。

術(shù)語(yǔ)“核酸分子”包括rna、dna和cdna分子。應(yīng)當(dāng)理解，作為遺傳密碼簡(jiǎn)并性的結(jié)果，可以產(chǎn)生編碼給定的突變cdc蛋白的多種核苷酸序列。本公開(kāi)包括其每種可能的變體核苷酸序列，鑒于遺傳密碼簡(jiǎn)并性，所述變體核苷酸序列均是可能的。

“異源”核酸構(gòu)建體或序列具有其相對(duì)于表達(dá)它的細(xì)胞而言并非天然的部分。相對(duì)于控制序列，術(shù)語(yǔ)“異源”指這樣的控制序列(即，啟動(dòng)子或增強(qiáng)子)，所述控制序列在自然界中不發(fā)揮作用以調(diào)節(jié)該控制序列目前正在調(diào)節(jié)其表達(dá)的相同基因。通常，異源核酸序列相對(duì)于其中存在它們的細(xì)胞并非內(nèi)源或不是其中存在它們的天然基因組的組成部分，反而，已經(jīng)通過(guò)感染、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、微量注射、電穿孔等添加至細(xì)胞?！爱愒础焙怂針?gòu)建體可以含有與天然細(xì)胞存在的控制序列/dna編碼序列組合相同或不同的控制序列/dna編碼序列組合。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“載體”指為了不同宿主細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移所設(shè)計(jì)的核酸構(gòu)建體。“表達(dá)載體”指具有在外來(lái)細(xì)胞中并入并表達(dá)異源dna片段的能力的載體。眾多原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體是市售的。適宜表達(dá)載體的選擇處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。

因此，“表達(dá)盒”或“表達(dá)載體”指重組或合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體具有一系列允許特定核酸在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的指定核酸元件。重組表達(dá)盒可以并入質(zhì)粒、染色體、線(xiàn)粒體dna、質(zhì)體dna、病毒或核酸片段。一般而言，表達(dá)載體的重組表達(dá)盒部分包括待轉(zhuǎn)錄的核酸序列和啟動(dòng)子，連同其他序列。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“質(zhì)?！敝缸鳛榭寺≥d體使用并且在許多細(xì)菌和某些真核生物中形成染色體外自我復(fù)制型遺傳元件的環(huán)狀雙鏈(ds)dna構(gòu)建體。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“編碼選擇標(biāo)記的核苷酸序列”指這樣的核苷酸序列，它能夠在細(xì)胞中表達(dá)并且其中該選擇標(biāo)記的表達(dá)引起含有所表達(dá)基因的細(xì)胞在相應(yīng)選擇劑存在下或相應(yīng)選擇性生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的能力。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”指發(fā)揮作用以指導(dǎo)下游基因轉(zhuǎn)錄的核酸序列。啟動(dòng)子通常將適用于其中正在表達(dá)靶基因的宿主細(xì)胞。啟動(dòng)子，連同其他轉(zhuǎn)錄性和翻譯性調(diào)節(jié)核酸序列(也稱(chēng)作“控制序列”)，是表達(dá)給定基因必需的。通常，該轉(zhuǎn)錄性和翻譯性調(diào)節(jié)序列包括，但不限于啟動(dòng)子序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列和增強(qiáng)子或激活蛋白序列。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“嵌合基因”或“異源核酸構(gòu)建體”指可以由不同基因的部分(包括調(diào)節(jié)元件)組成的非天然基因(即，已經(jīng)引入宿主的那種)。用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的嵌合基因構(gòu)建體一般由與異源蛋白編碼序列或在選擇標(biāo)記嵌合基因中與選擇標(biāo)記基因有效連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)(啟動(dòng)子)組成，其中所述選擇標(biāo)記基因編碼向轉(zhuǎn)化的細(xì)胞賦予抗生素耐藥性的蛋白質(zhì)。本公開(kāi)的供轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞的常見(jiàn)嵌合基因包括組成型或誘導(dǎo)性型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)、蛋白質(zhì)編碼序列和終止子序列。如果需要分泌靶蛋白，則嵌合基因構(gòu)建體還可以包含編碼信號(hào)肽的第二dna序列。

當(dāng)一種核酸與另一個(gè)核酸序列處于功能性關(guān)系時(shí)，該核酸是“有效連接的”。例如，編碼分泌性前導(dǎo)序列的dna有效連接于編碼多肽的dna，若前者作為參與所述多肽分泌的前蛋白表達(dá)；啟動(dòng)子或增強(qiáng)子有效連接于編碼序列，若前者影響該序列的轉(zhuǎn)錄；或核糖體結(jié)合位點(diǎn)有效連接于編碼序列，若該結(jié)合位點(diǎn)如此安置，從而促進(jìn)翻譯。通常，“有效連接的”意指連接的dna序列是連續(xù)的，并且，在分泌性前導(dǎo)序列情況下，是連續(xù)并符合可讀框的。然而，增強(qiáng)子不必是連續(xù)的。連接通過(guò)在便利的限制性位點(diǎn)處連接而完成。如此類(lèi)位點(diǎn)不存在，則根據(jù)常規(guī)實(shí)踐使用pcr的合成性寡核苷酸銜接子、接頭或引物。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基因”意指這樣的dna區(qū)段，所述dna區(qū)段涉及多肽鏈的產(chǎn)生，可以包含或可以不包含編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域，例如，5'非翻譯(5'utr)或“前導(dǎo)序列”和3'utr或“尾隨序列”，以及各個(gè)編碼區(qū)段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“重組”包括對(duì)細(xì)胞或載體的指稱(chēng)，其中所述的細(xì)胞或載體已經(jīng)因異源核酸序列引入而修飾；此外，術(shù)語(yǔ)“重組”還可以指從如此修飾的細(xì)胞衍生的細(xì)胞。因而，例如，重組細(xì)胞表達(dá)在該細(xì)胞的天然(非重組)形式中不以相同形式存在的基因或表達(dá)否則因人類(lèi)故意干預(yù)而異常表達(dá)、不足表達(dá)或根本不表達(dá)的天然基因。

如本文所用，指稱(chēng)細(xì)胞時(shí)，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”、“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)基因”意指該細(xì)胞具有整合入其基因組中的非天然(例如，異源)核酸序列或具有經(jīng)多個(gè)世代維持的附加型質(zhì)粒。

如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”指基于基因的核酸序列而產(chǎn)生多肽的過(guò)程。該過(guò)程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯。

向細(xì)胞插入核酸序列的語(yǔ)境下，術(shù)語(yǔ)“引入”涉及向細(xì)胞插入核酸序列的任何方法，包括但不限于“轉(zhuǎn)染”、“轉(zhuǎn)化”和/或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”法。術(shù)語(yǔ)“引入”還包括將核酸序列并入真核或原核細(xì)胞，其中所述核酸序列可以并入該細(xì)胞的基因組(例如，染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線(xiàn)粒體dna)，轉(zhuǎn)化成自主復(fù)制子或瞬時(shí)表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)染的mrna)。

現(xiàn)在轉(zhuǎn)向本公開(kāi)，某些實(shí)施方案涉及包含一種或多種無(wú)毒突變體膽固醇依賴(lài)性細(xì)胞溶素(cdc)的組合物。組合物可以例如在針對(duì)相應(yīng)疾病病原體的疫苗中使用，或可以用于診斷或篩查方法或其他分析方法如檢測(cè)方法中。

產(chǎn)生天然形式cdc的生物具有各種病理影響，包括但不限于下文所列的那些。

產(chǎn)氣莢膜梭菌(clostridiumperfringens)是經(jīng)常以腸毒素血癥或軟組織感染如氣性壞疽為特征的多種人類(lèi)疾病和動(dòng)物疾病的致病因子。實(shí)驗(yàn)證據(jù)提示了產(chǎn)氣莢膜桿菌溶素o在通過(guò)影響嗜中性粒細(xì)胞功能而減弱免疫應(yīng)答中的作用。

蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)(臘狀芽孢桿菌溶素o的來(lái)源)是嚴(yán)重非胃腸道感染的不常見(jiàn)病因，尤其是藥癮者、免疫抑制的新生兒和術(shù)后患者中、尤其當(dāng)插入假體植入物如心室分流器時(shí)嚴(yán)重非胃腸道感染的不常見(jiàn)病因。眼感染是最常見(jiàn)類(lèi)型的重度感染，包括眼內(nèi)炎(一種眼炎)和角膜炎，通常伴以特征性形成角膜環(huán)膿腫。

蜂房芽孢桿菌(bacillusalvei)可以造成眼內(nèi)炎并且可以造成肺炎和積膿。

已經(jīng)顯示停乳鏈球菌似馬亞種(streptococcusdysgalactiaesubsp.equisimilis)涉及許多不同類(lèi)型的人類(lèi)疾病綜合征。

犬鏈球菌(streptococcuscanis)一般在動(dòng)物中、主要在犬造成疾病。它可以在人類(lèi)中造成疾病，最經(jīng)常是軟組織感染、菌血癥、尿路感染、骨感染或肺炎。

鏈球菌造成多種疾病，包括鏈球菌性喉炎、風(fēng)濕熱、軟組織感染(即，食肉菌)和許多其他疾病。已經(jīng)顯示鏈球菌溶素o是這些疾病中多者的主要致病因子。

破傷風(fēng)溶素由作為破傷風(fēng)病因的破傷風(fēng)梭菌(clostridiumtetanus)產(chǎn)生。

伊氏李斯特氏菌(listeriaivanovii)是一種動(dòng)物感染并主要在羊中造成流產(chǎn)。

單核增生李斯特菌(listeriamonocytogenes)造成人類(lèi)中的食源性疾病；因其所致的最嚴(yán)重食源性疾病是腦膜炎。它對(duì)孕婦尤其帶來(lái)問(wèn)題，其中感染可能在母親中呈亞臨床性，但對(duì)胎兒致命。李斯特菌溶素是這些疾病的關(guān)鍵致病因子，沒(méi)有它，細(xì)菌無(wú)毒力。

豬鏈球菌(streptococcussuis)是豬中敗血癥、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎和偶爾地其他感染的病因，并且日益地成為人類(lèi)中的問(wèn)題，正在報(bào)道越來(lái)越多的暴發(fā)，伴以多種癥狀，所述癥狀包括高熱、不適感、惡心和嘔吐、隨后是神經(jīng)癥狀、皮下出血、敗血性休克和昏迷。

本公開(kāi)的某些實(shí)施方案提供肺炎鏈球菌的天然(野生型)肺炎球菌溶血素(“ply”；seqidno:1)的無(wú)毒突變體(由seqidno:20的突變體編碼)。這些ply突變體顯示出幾個(gè)勝過(guò)先前已經(jīng)用于疫苗開(kāi)發(fā)的肺炎球菌溶血素突變體(pd-b)的潛在優(yōu)點(diǎn)，特別地在于相比野生型ply蛋白，它們基本上缺少溶血活性。例如，本公開(kāi)的ply突變體缺少與哺乳動(dòng)物膜結(jié)合的能力，并且因此將不發(fā)生當(dāng)野生型ply毒素與膜結(jié)合(如上文描述的pd-b突變體(trp433phe)所做那樣)時(shí)通常出現(xiàn)的任何結(jié)構(gòu)性變化。

在某些非限制性實(shí)施方案中，本公開(kāi)包括這樣的肺炎球菌溶血素突變體，其中(seqidno:1的)的位置293和294的至少一個(gè)氨基酸和在位置458、459和460處的至少一個(gè)氨基酸已經(jīng)用不同于野生型ply序列(seqidno:1)中所存在的氨基酸置換。更具體地，位置293和294處的任一個(gè)或兩個(gè)gly殘基可以用具有側(cè)鏈的氨基酸置換，所述氨基酸包括但不限于ala、leu、ile、val、pro、trp、asn、gln、phe、tyr、met、cys、thr、ser、asp、glu、arg、his和lys。另外，位置458和459處的任一個(gè)或兩個(gè)thr殘基可以用gly、ala、leu、ile、val、pro、trp、asn、gln、phe、tyr、met、cys、ser、asp、glu、arg、his和lys置換。另外，位置460處的leu殘基可以用gly、ala、ile、val、pro、trp、asn、gln、phe、tyr、met、cys、thr、ser、asp、glu、arg、his和lys置換。例如，在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，位置293處的甘氨酸已經(jīng)用ala、leu、ile、val、pro、trp、asn、gln、phe、tyr、met、cys、thr、ser、asp、glu、arg、his和lys之一替換，并且位置460處的亮氨酸已經(jīng)用gly、ala、ile、val、pro、trp、asn、gln、phe、tyr、met、cys、thr、ser、asp、glu、arg、his和lys之一替換。在突變肺炎球菌溶血素的具體非限制性實(shí)施方案中，位置293和294處的甘氨酸殘基至少之一已經(jīng)突變成絲氨酸殘基或蘇氨酸殘基，和位置458，459，和460處的蘇氨酸殘基、蘇氨酸殘基和亮氨酸殘基至少之一已經(jīng)分別突變成天冬氨酸殘基、天冬酰胺殘基或谷氨酸殘基。例如，當(dāng)位置293已經(jīng)突變成絲氨酸并且位置460處的亮氨酸已經(jīng)突變成天冬氨酸時(shí)，肺炎球菌溶血素突變體命名為ply-g293s/l460d(或ply-l460d/g293s)；其氨基酸序列作為seqidno:40提供。在替代性非限制性實(shí)施方案中，位置460可以用d、e或n置換，并且位置293可以用s或t置換，從而雙突變體可以在位置460處包含d、e或n并且在位置293處包含s或t。

除肺炎球菌溶血素的突變體之外，本公開(kāi)還提供在結(jié)構(gòu)域4的環(huán)1、環(huán)2和/或環(huán)3中的同功位置具有置換的其他突變cdc，包括以下溶素的突變體：臘狀芽孢桿菌溶素(蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus))、芽孢桿菌溶素(炭疽芽孢桿菌(bacillusanthracis))、蘇云金芽孢桿菌溶素(蘇云金芽孢桿菌(baccillusthuringiensis))、產(chǎn)氣莢膜桿菌溶素(產(chǎn)氣莢膜梭菌(clostridiumperfringens))、蜂房芽孢桿菌溶素(蜂房芽孢桿菌(bacillusalvei))、犬鏈球菌溶素(犬鏈球菌(streptococcuscanis))、類(lèi)馬鏈球菌溶素(馬鏈球菌(streptococcusequisimilis))、鏈球菌溶素o(化膿性鏈球菌(streptococcuspyogenes))、破傷風(fēng)溶素(破傷風(fēng)梭菌(clostridiumtetani))、伊萬(wàn)諾夫李斯特菌溶素(伊氏李斯特氏菌(listeriaivanovii))、李斯特菌溶素(單核增生李斯特菌(listeriamonocytogenes))、斯氏李斯特菌溶素(斯氏李斯特菌(listeriaseeligeri))、豬溶素(豬鏈球菌(streptococcussuis))、緩癥鏈球菌溶素(緩癥鏈球菌(streptococcusmitis))、血小板聚集因子(又稱(chēng)作paf和草綠色鏈球菌溶素)(緩癥鏈球菌(streptococcusmitis))、中間鏈球菌溶素(中間鏈球菌(streptococcusintermedius))、化膿隱秘桿菌溶素(化膿隱秘桿菌(arcanobacteriumpyogenes))和諾維氏梭菌溶素，又稱(chēng)作破傷風(fēng)溶素nt(諾維氏梭菌(clostridiumnovyi))。

臘狀芽孢桿菌溶素(cereolysin)、芽孢桿菌溶素(anthrolysin)、蘇云金芽孢桿菌溶素(thuringiolysin)(又稱(chēng)作蘇云金溶素或臘狀芽孢桿菌溶素形式bt)、產(chǎn)氣莢膜桿菌溶素(perfringolysin)、蜂房芽孢桿菌溶素(alveolysin)、犬鏈球菌溶素(caniolysin)、類(lèi)馬鏈球菌溶素(caniolysin)、鏈球菌溶素o(streptolysino)、諾維氏梭菌溶素(novyiolysin)、破傷風(fēng)溶素(tetanolysin)、伊萬(wàn)諾夫李斯特菌溶素(ivanolysin)、李斯特菌溶素(listeriolysin)、斯氏李斯特菌溶素(seeligeriolysin)、豬溶素(suilysin)、緩癥鏈球菌溶素(mitilysin)、中間鏈球菌溶素(intermedilysin)、血小板聚集因子(又稱(chēng)作草綠色鏈球菌溶素(viridanolysin)或paf)和化膿隱秘桿菌溶素(pyolysin)的野生型氨基酸序列分別在seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18和seqidno:19中顯示。

本公開(kāi)的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種鏈球菌溶素o突變體，所述突變體在seqidno:9的位置561和562至少之一中及其位置395和396至少之一中包含置換并且與野生型鏈球菌溶素o蛋白至少90％相同。位置561和562中的置換可以是本文所述的可以在ply(seqidno:1)的位置458-460中作出的任何置換，并且位置395和396中的置換可以是本文所述的可以在ply的位置293或294中作出的任何置換。

也可以根據(jù)本公開(kāi)突變的seqidno:18(血小板聚集因子)的變體是凝集素溶素，其也從緩癥鏈球菌獲得。l1、l2和l3的氨基酸序列與paf相同。凝集素溶素在12個(gè)位置不同于paf，所述位置包括67、158、211、303、305-307、311、319、327、447和556，其中在凝集素溶素中，這些位置處的氨基酸分別是t、d、t、h、e、n、k、n、e、k、t和i。本公開(kāi)因此包括與本文構(gòu)思的那些其他突變體相似的凝集素溶素突變體和編碼這些突變體的核酸，以及包含這些突變體的組合物。

本文構(gòu)思的肺炎球菌溶血素突變體還消除了毒素的任何毒力活性，原因在于它們不能與哺乳動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合。盡管肺炎球菌溶血素突變體pd-b的毒性比天然肺炎球菌溶血素低約21,000倍，但它仍顯示在開(kāi)發(fā)包含它的任何疫苗時(shí)棘手的足夠毒性。開(kāi)發(fā)對(duì)抗肺炎鏈球菌的現(xiàn)代疫苗似乎以使用肺炎球菌溶血素連同其他肺炎鏈球菌衍生的蛋白質(zhì)為中心；因此，無(wú)論疫苗中所用的其他蛋白質(zhì)是什么，似乎在對(duì)抗肺炎鏈球菌的全部有效疫苗中均將包含肺炎球菌溶血素，原因在于其對(duì)疾病建立和進(jìn)展的重要性。

如下文描述，在產(chǎn)氣莢膜桿菌溶素(一種與肺炎球菌溶血素相關(guān)的毒素)中顯示該蛋白質(zhì)的十一肽不介導(dǎo)這些毒素與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的結(jié)合，有悖于傳統(tǒng)觀點(diǎn)。介導(dǎo)結(jié)合的結(jié)構(gòu)是靠近十一肽的三個(gè)疏水性短環(huán)。作為本公開(kāi)的部分，現(xiàn)在已知，如果將帶負(fù)電荷的天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基(例如)置入內(nèi)部任意單個(gè)疏水性環(huán)(在尚未包含天冬氨酸或谷氨酸的位置)，則阻斷cdc與膜的結(jié)合。因此，這個(gè)單點(diǎn)突變消除了cdc(包括肺炎球菌溶血素)與哺乳動(dòng)物膜的結(jié)合。例如，將單個(gè)天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基置換肺炎球菌溶血素的亮氨酸460實(shí)際上徹底地消除其溶血活性。由于已知在其他系統(tǒng)(下文描述)中，這種突變阻斷與細(xì)胞的膜結(jié)合，它基本上消除任何毒力活性(例如令其毒性比pd-b突變體低至少200倍)，還消除了可能由其與哺乳動(dòng)物膜表面結(jié)合引起的任何可能的副作用。

在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的突變肺炎球菌溶血素缺少肺炎鏈球菌肺炎球菌溶血素蛋白中天然存在的溶血活性和成孔能力。通常，多肽組分顯示小于約30％、小于約20％、小于約10％、小于約5％、小于約1％、小于約0.1％、小于約0.001％或更小的天然存在性肺炎鏈球菌肺炎球菌溶血素蛋白的溶血活性。

在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的突變肺炎球菌溶血素在位置293、370、406或460(包括位置290、291、292、294、295、296、367、368、369、371、372、373、403、404、405、407、408、409、457、458、459、461、462和463)的任一旁側(cè)分布的三個(gè)殘基中一個(gè)或多個(gè)殘基處具有置換。

例如，這些殘基可以用帶負(fù)電荷的氨基酸、谷氨酸或天冬氨酸(例外是在位置403中，所述位置已經(jīng)包含天冬氨酸)或帶正電荷的氨基酸賴(lài)氨酸、精氨酸或組氨酸(例外是在位置367和407中，所述位置已經(jīng)包含組氨酸殘基)置換。備選地，這些殘基可以用消除突變體的結(jié)合活性、成孔活性和/或溶血活性的任何其他天然氨基酸(包括gly、ala、leu、ile、val、pro、trp、asn、gln、phe、tyr、met、cys、thr或ser)置換。

如上文所示，野生型肺炎球菌溶血素的氨基酸序列是seqidno:1，并且編碼seqidno:1的肺炎球菌溶血素的cdna的反向互補(bǔ)物作為seqidno:20顯示。本公開(kāi)還包括本文所述的突變肺炎球菌溶血素(及其反向互補(bǔ)物)和其他突變cdc的cdna，其中必要時(shí)，置換所述cdna以編碼本文所述或否則能夠?qū)崿F(xiàn)的置換型蛋白質(zhì)(突變體)，并且所述cdna可以轉(zhuǎn)而包含任何保守堿基(核苷酸)置換以產(chǎn)生編碼這類(lèi)突變體的cdna。

將可以理解，編碼本文構(gòu)思的多肽的多核苷酸序列可以用簡(jiǎn)并密碼子改變，然而仍編碼本公開(kāi)的突變多肽。因此，本公開(kāi)還提供與本文所述的多核苷酸序列(或其互補(bǔ)序列)雜交的多核苷酸，所述多核苷酸序列在各序列之間具有至少90％同一性、或至少95％同一性、或至少99％同一性。

圖1a至圖1e顯示本文鑒定的天然形式cdc的氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果。序列沿著三個(gè)疏水性環(huán)比對(duì)，所述的疏水性環(huán)對(duì)應(yīng)于肺炎球菌溶血素的位置367-373(第二環(huán)，l2)、403-409(第三環(huán)，l3)和457-463(第一環(huán)、l1)，在圖1a-e中作為位置586-592(第二環(huán)，l2)、622-628(第三環(huán)，l3)和676-682(第一環(huán)，l1)表示。如上文所示，這些cdc的突變體的某些具體(但是非限制性)實(shí)施方案可以在這些位置的一個(gè)或多個(gè)位置處包含帶負(fù)電荷的氨基酸-谷氨酸或天冬氨酸置換(在該位置已經(jīng)具有天冬氨酸時(shí)例外)或帶正電荷的氨基酸組氨酸、賴(lài)氨酸或精氨酸置換(例外是其中該位置已經(jīng)具有組氨酸時(shí)的組氨酸置換、其中該位置已經(jīng)具有賴(lài)氨酸時(shí)的賴(lài)氨酸置換、其中該位置已經(jīng)具有精氨酸時(shí)的精氨酸置換)或上文所示的任何其他15種天然氨基酸置換，其中所得到的突變體根據(jù)本公開(kāi)發(fā)揮作用。

突變體還可以包含多于一個(gè)在本文所述的置換，從而突變體在單個(gè)環(huán)(l1、l2、l3)中具有1，2、3、4、5、6或7個(gè)置換的殘基，或突變體可以在兩個(gè)環(huán)(例如，l1和l2、l1和l3、l2和l3)中具有一個(gè)或多個(gè)(1至7個(gè))置換的殘基，或在三個(gè)環(huán)(l1、l2和l3)的每個(gè)環(huán)中具有一個(gè)或多個(gè)(1至7個(gè))置換的殘基，其中置換選自本文中列出的那些；例如，突變體可以在第一環(huán)(l1)中具有1至7個(gè)置換，和/或在第二環(huán)(l2)中具有1至7個(gè)置換，和/或在第三環(huán)(l3)中的具有1至7個(gè)置換。例如，在某些實(shí)施方案中，其中天然殘基帶正電荷的情況下，置換的殘基可以帶負(fù)電荷，并且其中天然殘基帶負(fù)電荷的情況下，置換的殘基可以帶正電荷。備選地，天冬氨酸可以用谷氨酸、組氨酸、精氨酸或賴(lài)氨酸置換，或谷氨酸可以用天冬氨酸、賴(lài)氨酸、組氨酸或天冬酰胺置換，或精氨酸可以用不同的帶正電荷的氨基酸置換。

表1中列出了本文所述的每種cdc的環(huán)1、環(huán)2和環(huán)3的氨基酸位置。

表1：與結(jié)構(gòu)域4環(huán)相對(duì)應(yīng)的氨基酸位置

因此，本文中提供純化或分離形式的蛋白質(zhì)突變體及其抗原性片段、這些突變體的包含可藥用賦形劑、佐劑和/或免疫刺激劑的免疫原性組合物及包含本文公開(kāi)或否則構(gòu)思的一種或多種突變體的疫苗和血清。突變體或其抗原性片段可以用于分析方法中，所述分析方法利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)(例如elisa)檢測(cè)生物樣品中可變形式蛋白質(zhì)的存在。本公開(kāi)還提供了包含編碼本文提供的任何突變體的cdna的核酸、宿主細(xì)胞和載體以及使用前者產(chǎn)生本文構(gòu)思的突變體的方法。本公開(kāi)還提供了施用免疫原性組合物以治療由本文所述產(chǎn)生cdc的生物所致病狀、疾病和感染的方法。

如上文所示，本公開(kāi)也涉及編碼本文構(gòu)思的突變cdc的核酸序列。本公開(kāi)提供核酸，所述核酸編碼本文公開(kāi)的蛋白質(zhì)突變體的等位變體，其中蛋白質(zhì)突變體的等位變體與蛋白質(zhì)突變體差異小于15％其氨基酸同一性，例如，等位變體的至少85％氨基酸與蛋白質(zhì)突變體相同，并且第一環(huán)、第二環(huán)和第三環(huán)(l1、l2和l3)中的100％氨基酸與蛋白質(zhì)突變體中的那些氨基酸相同。例如，等位變體可以與本文所述的蛋白質(zhì)突變體差異小于12％其氨基酸同一性、小于10％其氨基酸同一性、小于8％其氨基酸同一性、小于6％其氨基酸同一性、小于4％其氨基酸同一性、小于2％其氨基酸同一性、或小于1％其氨基酸同一性。另外，本公開(kāi)還涉及核酸，所述核酸在嚴(yán)格條件下與編碼本文所述的突變cdc的核酸或與編碼本文所述的突變cdc的核酸的互補(bǔ)物雜交。

在一個(gè)方面，本公開(kāi)的cdc突變多肽或蛋白質(zhì)包含這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列與作為seqidno:1提出的序列具有至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％或更多同一性百分?jǐn)?shù)(如通過(guò)序列比對(duì)程序所測(cè)定)并且具有至少一個(gè)在本文他處所述的突變。

可以使用例如在macvector第6.5版中以默認(rèn)參數(shù)運(yùn)行的clustal-w程序，執(zhí)行所選擇序列的比對(duì)，旨在測(cè)定的兩個(gè)或更多個(gè)序列之間的“同一性％”，所述默認(rèn)參數(shù)包括開(kāi)放空位罰分10.0、延伸空位罰分0.1，和blosum30相似性矩陣。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“序列同一性”意指如下比較序列。使用默認(rèn)(blosum62)矩陣(值-4至+11)，連同空位開(kāi)口罰分-12(對(duì)于開(kāi)口的首個(gè)無(wú)效)和空位延伸罰分-4(空位中每個(gè)額外的連續(xù)無(wú)效)，使用第9版geneticcomputinggroup’sgap(全局比對(duì)程序)比對(duì)序列在比對(duì)后，通過(guò)將匹配數(shù)目表述為所要求的序列中氨基酸數(shù)目的百分?jǐn)?shù)，計(jì)算同一性百分?jǐn)?shù)。

本文所述或否則構(gòu)思的免疫原性組合物可以包括疫苗制劑，所述的疫苗制劑可以按有效在動(dòng)物中激發(fā)(刺激)保護(hù)性免疫應(yīng)答的量使用。例如，可以通過(guò)抗體的形成過(guò)程測(cè)量保護(hù)性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。在某些非限制性實(shí)施方案中，例如，按免疫接種之間約1周至6周的間距，本文構(gòu)思的突變cdc的可以形成保護(hù)性免疫應(yīng)答的量一般處于約0.001μg至100mg/kg體重如但不限于約0.01μg至1mg/kg體重、或約0.1μg至約10μg/kg體重的單位劑量形式。

本公開(kāi)還提供了刺激針對(duì)至少一種疾病生物的免疫應(yīng)答的方法。在方法中，本文公開(kāi)的任何免疫原性組合物可以施用至遭疾病生物感染或易遭該疾病生物感染的患者。在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含在位置293和460中具有突變?nèi)鏿lyl460d/g293s的肺炎球菌溶血素突變體(seqidno:40)。在該方法中，免疫原性組合物基本上無(wú)毒(或與天然ply蛋白相比基本上無(wú)毒)，基本上與細(xì)胞膜不結(jié)合，基本上無(wú)溶血性，和/或與ply蛋白同樣穩(wěn)定或基本上比ply蛋白更穩(wěn)定。

本公開(kāi)還涉及至少一種在患者中減少感染發(fā)生和/或其嚴(yán)重程度的方法。在該方法中，將本文公開(kāi)或否則構(gòu)思的任何免疫原性組合物施用至感染的患者或易遭感染的患者。在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含在位置293和460中具有突變?nèi)鏿lyl460d/g293s的肺炎球菌溶血素突變體(seqidno:40)。在該方法中，免疫原性組合物基本上無(wú)毒(或與天然ply蛋白相比基本上無(wú)毒)，基本上與細(xì)胞膜不結(jié)合，基本上無(wú)溶血性，和/或與天然ply蛋白同樣穩(wěn)定或基本上比天然ply蛋白更穩(wěn)定。在某些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的突變肺炎球菌溶血素多肽具有比野生型肺炎球菌溶血素多肽低約100,000倍的溶血活性。在其他實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的突變肺炎球菌溶血素多肽具有比野生型肺炎球菌溶血素多肽低約150,000倍的溶血活性。在其他實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的突變肺炎球菌溶血素多肽具有比野生型肺炎球菌溶血素多肽低約200,000倍的溶血活性。在另外的實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的突變肺炎球菌溶血素多肽具有比野生型肺炎球菌溶血素多肽低約250,000倍的溶血活性。在至少某些實(shí)施方案中，相對(duì)于在氨基酸位置293、294、458、459和460中僅一個(gè)氨基酸位置具有置換的突變肺炎球菌溶血素多肽，本文公開(kāi)的在氨基酸位置293、294、458、459和460中具有至少兩個(gè)置換的純化突變肺炎球菌溶血素多肽在純化時(shí)還具有增加的產(chǎn)量。增加的重組產(chǎn)量可以例如是至少約10倍，至少約15倍，至少約17倍，或至少約20倍。

本文公開(kāi)的免疫原性組合物可以施用至遭本文所述的疾病生物感染或可能遭其感染的動(dòng)物，包括但不限于犬、貓、兔、嚙齒類(lèi)、馬、家畜(例如，牛、綿羊、山羊和豬)、動(dòng)物園動(dòng)物、有蹄動(dòng)物、靈長(zhǎng)類(lèi)和人。

如上文所示，當(dāng)突變體是肺炎球菌溶血素突變體時(shí)，本公開(kāi)包括可以施用至受試者以在受試者中刺激免疫原性應(yīng)答的免疫原性組合物(如，但不限于疫苗)。除一種或多種肺炎球菌溶血素突變體之外，免疫原性組合物/疫苗還可以包含來(lái)自肺炎鏈球菌的其他蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基，或可以包含與免疫原性組合物/疫苗中的肺炎球菌溶血素突變體或其他蛋白質(zhì)組合或綴合的莢膜多糖物質(zhì)。例如，莢膜物質(zhì)可以衍生自肺炎鏈球菌血清型1、2、3、4、5、6a、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f、24f、27、33f或34或本領(lǐng)域已知的其他血清型中任一者或多者。如所示，免疫原性組合物/疫苗可以包含佐劑和/或其他可藥用賦形劑。多糖可以綴合于突變體，例如，借助單聚體鍵(僅多糖的一個(gè)末端與多肽連接)、成環(huán)鍵(單一多肽與成環(huán)多糖連接)或交聯(lián)(多個(gè)多糖與多個(gè)多肽連接)綴合。

含有本公開(kāi)的突變肺炎球菌溶血素多肽或其片段的免疫原性組合物或疫苗可以用來(lái)治療與肺炎鏈球菌相關(guān)的疾病和病狀，如，但不限于肺炎、腦膜炎、菌血癥和中耳炎。

在某些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的突變cdc用于刺激t細(xì)胞增殖或通過(guò)刺激b細(xì)胞產(chǎn)生抗體。

如上文所示，可以通過(guò)將本文構(gòu)思的突變cdc與藥物(生理)可接受的賦形劑如(但不限于)生理鹽水或中性ph的緩沖鹽水溶液(如磷酸鹽緩沖鹽水)組合，形成本公開(kāi)的免疫原性組合物。

本公開(kāi)還包括本文所述或否則構(gòu)思的突變cdc的抗原性片段。例如，對(duì)于疫苗組合物，片段大到足以刺激保護(hù)性免疫應(yīng)答。多肽組分必須具有足以誘導(dǎo)這種增強(qiáng)型免疫應(yīng)答的長(zhǎng)度。對(duì)于天然存在的cdc蛋白的片段，這些片段具有至少約8個(gè)、至少約10個(gè)、至少約25個(gè)、至少約50個(gè)、至少約75個(gè)、至少約100個(gè)、至少約125個(gè)、至少約150個(gè)、至少約175個(gè)、至少約200個(gè)、至少約250個(gè)、至少約300個(gè)、至少約350個(gè)、至少約400個(gè)、至少約425個(gè)、至少約450個(gè)、至少約460個(gè)、至少約465個(gè)或更大氨基酸長(zhǎng)度。

片段可以包含來(lái)自突變體不同位置的已經(jīng)連接在一起的肽部分。在某些具體(但非限制性)實(shí)施方案中，片段包含本文中討論的三種環(huán)中的一者或多者。

本文公開(kāi)或否則構(gòu)思的突變cdc還可用于產(chǎn)生中和抗體，所述中和抗體可以作為被動(dòng)免疫血清用來(lái)治療或改善患者中的癥狀。如上文所述的免疫原性組合物可以施用至動(dòng)物(如馬或人)直至生成中和抗體應(yīng)答。隨后可以收獲、純化這些中和抗體并用來(lái)治療顯示癥狀的患者。

將這類(lèi)中和抗體以有效消除病原體影響的量施用至顯示疾病癥狀的患者。中和抗體可以靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、皮下等施用。具體途徑是靜脈內(nèi)施用，或?qū)τ诰窒藁腥?，在組織損傷部位伴隨清創(chuàng)術(shù)一起局部施用。中和抗體也可以與抗生素治療相結(jié)合施用。中和抗體可以按單劑或多劑施用直至實(shí)現(xiàn)休克或組織損傷減少。一般施用的中和抗體的量是約1mg至約1000mg抗體/kg體重，如但不限于，約50mg至約200mg抗體/kg體重。

本公開(kāi)的免疫原性組合物可以作為藥物組合物制備，所述藥物組合物含有處于無(wú)毒和無(wú)菌可藥用賦形劑中的免疫保護(hù)性無(wú)毒量的本發(fā)明公開(kāi)的至少一種突變蛋白。

本公開(kāi)的免疫原性組合物可以按本領(lǐng)域已知的任何適合方式施用至適宜的受試者，所述方式包括(但不限于)口服、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、舌下粘膜、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、皮內(nèi)、腹腔內(nèi)、鼻內(nèi)、肺內(nèi)、眼內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)和/或皮下。可以將它們引入胃腸道或呼吸道，例如，通過(guò)吸入含有免疫原性組合物的溶液劑或散劑。如果使用，腸胃外施用法通常以注射為特征。注射劑可以按常規(guī)形式制備，或者作為液體溶液劑或混懸劑、適于在注射前形成溶液劑或混懸劑的固體形式，或者作為乳劑。

免疫原性組合物(例如，疫苗)以足夠激發(fā)抗體生成作為免疫原性應(yīng)答的組成部分的量施用。對(duì)于任何給定患者的劑量取決于多種因素，包括患者的體格大小、總體健康狀況、性別、身體表面積、年齡、待施用的具體化合物、施用時(shí)間和途徑以及正在同時(shí)施用的其他藥物。最佳劑量的確定完全處于具有普通技術(shù)的藥理學(xué)專(zhuān)家的能力范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，可以施用至受試者的突變cdc的非限制性有效量范圍例如是約10ng蛋白質(zhì)至100mg/kg體重，如約0.1μg蛋白質(zhì)至約1mg/kg體重。在至少一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，提供的劑量處于約0.25μg至約25μg蛋白質(zhì)范圍內(nèi)，伴以或不伴以佐劑。

當(dāng)通過(guò)肌內(nèi)或深皮下途徑腸胃外施用免疫原性組合物時(shí)，突變蛋白可以(在某些具體但非限制性實(shí)施方案中)與任何常規(guī)佐劑混合或用其吸附以吸引或增強(qiáng)免疫應(yīng)答。這類(lèi)佐劑包括但不限于氫氧化鋁、磷酸鋁、胞壁酰二肽、細(xì)菌脂多糖和衍生物和來(lái)自quila的純化皂苷。蛋白質(zhì)也可以在微粒子如脂質(zhì)體或免疫刺激復(fù)合物(iscom)內(nèi)部呈遞至免疫系統(tǒng)。如所示，可以設(shè)計(jì)含有本公開(kāi)的突變蛋白/肽片段的制劑供口腔或鼻內(nèi)攝入。

本公開(kāi)的免疫原性組合物的治療有效和無(wú)毒劑量可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定。例如，任何受試者的具體劑量可能取決于多種因素，包括但不限于)年齡、總體健康狀況、患者的膳食、施用時(shí)間和途徑、與正在施用的其他藥物的協(xié)同效應(yīng)和免疫原性組合物是否反復(fù)施用。如果需要，免疫原性組合物將反復(fù)施用，每個(gè)劑量之間間隔一個(gè)月至三個(gè)月并且稍后時(shí)間任選的加強(qiáng)劑量。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，制備適宜劑型的實(shí)際方法是已知或?qū)@而易見(jiàn)；參見(jiàn)例如，remington'spharmaceuticalsciences最新版。

如上文所示，本公開(kāi)包括編碼本文所述的本公開(kāi)的突變多肽和活性片段的多核苷酸。多核苷酸可以處于rna形式或處于dna形式(包括但不限于，cdna、基因組dna和合成性dna)。dna可以是雙鏈或單鏈的，并且如果是單鏈的，則可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。

表2中顯示了直接編碼(或借助反向互補(bǔ)物編碼)本文構(gòu)思的天然序列cdc并且因此也可以突變以形成本文所述或否則構(gòu)思的突變體形式的dna序列(和相應(yīng)的氨基酸序列)。

表2：天然cdc形式的氨基酸序列和核酸序列

宿主細(xì)胞經(jīng)載體基因工程化(轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化和/或轉(zhuǎn)染)，所述載體包含編碼本公開(kāi)的突變多肽的多核苷酸。載體例如可以處于質(zhì)粒、病毒粒子、噬菌體等形式。工程化的宿主細(xì)胞可以在常規(guī)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中如適宜，可以調(diào)整所述的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基以激活啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增編碼這類(lèi)多肽的多核苷酸。培養(yǎng)條件如溫度、ph等是先前隨被選擇用于表達(dá)的宿主細(xì)胞所用的那些培養(yǎng)條件，并且將對(duì)普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。載體包括染色體性、非染色體性及合成性dna序列，例如sv40的衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體dna；桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；從質(zhì)粒和噬菌體dna的組合中衍生的載體、病毒dna如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒和偽狂犬病病毒。然而，可以使用任何其他的載體，只要它在宿主中是可復(fù)制和有活力的。

適宜的dna序列可以通過(guò)多種方法插入載體。通常，將dna序列通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法插入適宜限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。認(rèn)為此類(lèi)方法和其他方法處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。

表達(dá)載體中的dna序列與適宜的表達(dá)控制序列(啟動(dòng)子)有效連接以指導(dǎo)mrna合成。作為這類(lèi)啟動(dòng)子的代表性例子，可以提到：ltr或sv40啟動(dòng)子、大腸桿菌lac或trp、噬菌體λpl啟動(dòng)子以及已知控制基因在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的其他啟動(dòng)子。表達(dá)載體還含有用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。載體還可以包括用于擴(kuò)增表達(dá)的適宜序列。

此外，在某些非限制性實(shí)施方案中，表達(dá)載體含有一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記基因以提供表型性狀供選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，如用于真核細(xì)胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或如大腸桿菌中的四環(huán)素抗性或氨芐青霉素抗性。

含有如上文所述的適宜dna序列以及適宜啟動(dòng)子或控制序列的載體可以用來(lái)轉(zhuǎn)化適宜的宿主，以引起宿主表達(dá)蛋白質(zhì)。

作為適宜宿主的代表性(但非限制性)例子，可以提到：細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌、鏈霉菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(salmonellatyphimurium)；真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲(chóng)細(xì)胞，如果蠅s2和夜蛾屬(spodoptera)sf9；動(dòng)物細(xì)胞，如cho、cos或bowes黑素瘤；腺病毒；植物細(xì)胞等。從本文的教導(dǎo)內(nèi)容中認(rèn)為適宜宿主細(xì)胞的選擇處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。

更具體地，本公開(kāi)還包括重組構(gòu)建體，所述重組構(gòu)建體包含本文所述和能夠?qū)崿F(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)序列。構(gòu)建體包括已經(jīng)按正向或反向插入多核苷酸序列的載體，如質(zhì)粒或病毒載體。在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，構(gòu)建體還包含調(diào)節(jié)序列，例如，所述調(diào)節(jié)序列包括與該序列有效連接的啟動(dòng)子。大量合適的載體和啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且是市售的。通過(guò)非限制例子提供以下載體。細(xì)菌載體：pqe70、pqe60、pqe-9(qiagen,inc.,hilden,德國(guó))、pbs、pd10、phagescript、psix174、pbluescriptsk、pbs、pnh8a、pnh16a、pnh18a、pnh46a(stratagene、sandiego、ca)；ptrc99a、pkk223-3、pkk233-3、pdr540、prit5(pharmacia,斯德哥爾摩，瑞典)。真核載體：pwlneo、psv2cat、pog44、pxt1、psg(stratagene,sandiego,ca)psvk3、pbpv、pmsg、psvl(pharmacia,斯德哥爾摩，瑞典)。然而，可以使用任何其他的質(zhì)粒或載體，只要它們?cè)谒拗髦惺强蓮?fù)制和有活力的。

使用cat(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)載體或帶選擇標(biāo)記的其他載體，啟動(dòng)子區(qū)可以選自任何目的基因。兩種適宜的載體是pkk232-8和pcm7。具體命名的細(xì)菌啟動(dòng)子包括laci、lacz、t3、t7、gpt、λpr、pl和trp。真核啟動(dòng)子包括cmv立即早期啟動(dòng)子、hsv胸苷激酶啟動(dòng)子、sv40早期和晚期啟動(dòng)子、來(lái)自逆轉(zhuǎn)錄病毒ltr和小鼠金屬硫蛋白-i啟動(dòng)子。選擇適宜載體和啟動(dòng)子完全處于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。

在又一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)包括含有上述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞，如(但不限于)哺乳動(dòng)物細(xì)胞；低等真核細(xì)胞，如(但不限于)酵母細(xì)胞；或原核細(xì)胞，如(但不限于)細(xì)菌細(xì)胞?？梢酝ㄟ^(guò)磷酸鈣轉(zhuǎn)染、deae-葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、電穿孔(davis等人,basicmethodsinmolecularbiology(1986)elseviersciencepublishingco.,inc.,newyork,ny)或任何其他合適的技術(shù)實(shí)現(xiàn)向宿主細(xì)胞引入構(gòu)建體。

可以按常規(guī)方式使用宿主細(xì)胞中的構(gòu)建體以產(chǎn)生重組序列編碼的基因產(chǎn)物。備選地，本公開(kāi)的多肽可以通過(guò)常規(guī)的肽合成儀合成產(chǎn)生。

成熟的蛋白質(zhì)可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞或其他細(xì)胞中在適宜的啟動(dòng)子控制下表達(dá)。使用從本公開(kāi)的dna構(gòu)建體衍生的rna，也可以使用無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生此類(lèi)蛋白質(zhì)。隨原核宿主及真核宿主一起使用的適宜克隆載體和表達(dá)載體由green和sambrook(molecularcloning:alaboratorymanual,第4版,coldspringharbor,n.y.,(2012)描述，所述文獻(xiàn)的完整公開(kāi)內(nèi)容因而通過(guò)引用的方式并入。

可以通過(guò)將增強(qiáng)子序列插入載體，增加高等真核生物轉(zhuǎn)錄編碼本公開(kāi)的突變多肽的dna。增強(qiáng)子是作用于啟動(dòng)子以增加其轉(zhuǎn)錄的順式作用dna元件，通常約10至約300bp。例子包括在復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)bp100至270上的sv40增強(qiáng)子、細(xì)胞巨化病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、在復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)上的多瘤增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子。

通常，重組表達(dá)載體將包含允許轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記，例如，大腸桿菌氨芐青霉素耐藥基因和釀酒酵母(s.cerevisiae)trp1基因，和從高度表達(dá)的基因衍生以指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)性序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這類(lèi)啟動(dòng)子可以從編碼糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(pgk)、α-因子、酸性磷酸酶或熱休克蛋白的操縱子等衍生。異源結(jié)構(gòu)性序列在適宜階段中隨翻譯起始序列和終止序列一起裝配。任選地，異源序列可以編碼包含n端辨識(shí)肽的融合蛋白，所述辨識(shí)肽賦予所需的特征，例如，穩(wěn)定作用或簡(jiǎn)化已表達(dá)重組產(chǎn)物的純化。

通過(guò)將編碼所需蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)性dna序列連同合適的翻譯起始信號(hào)和終止信號(hào)在有效讀取階段，隨功能啟動(dòng)子一并插入，構(gòu)建供細(xì)菌使用的有用表達(dá)載體。載體將包含一個(gè)或多個(gè)表型選擇標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)以確保維持載體并且如果需要，以在宿主內(nèi)部提供擴(kuò)增。

作為代表性但非限制性例子，供細(xì)菌使用的有用表達(dá)載體可以包含從市售質(zhì)粒衍生的選擇標(biāo)記和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)，所述市售質(zhì)粒包含熟知克隆載體pbr322(atcc37017)的遺傳元件。這類(lèi)商業(yè)載體例如包括pkk223-3(amershampharmaciabiotech,piscataway,n.j.,美國(guó))和pgem1(promega,madison,wis.,美國(guó))。這些pbr322“主鏈”片段與適宜的啟動(dòng)子和待表達(dá)的結(jié)構(gòu)性序列組合。

在轉(zhuǎn)化合適的宿主菌株和培育宿主菌株至適宜的細(xì)胞密度后，通過(guò)適宜手段(例如，溫度轉(zhuǎn)變或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)所選擇的啟動(dòng)子并且將細(xì)胞培養(yǎng)額外一段時(shí)間。

一般通過(guò)離心收獲細(xì)胞，通過(guò)物理或化學(xué)手段破碎，并且保留所產(chǎn)生的粗提物供進(jìn)一步純化。

可以通過(guò)任何便利方法破碎在表達(dá)蛋白質(zhì)中所用的微生物細(xì)胞，所述方法包括凍融循環(huán)、超聲處理、弗氏壓碎器、機(jī)械破裂或使用細(xì)胞裂解劑，這類(lèi)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。但是，可以想要(但是不限制)使用分泌本公開(kāi)的多肽并允許從培養(yǎng)基回收多肽的宿主細(xì)胞。

多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)也可以用來(lái)表達(dá)重組蛋白。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的例子包括gluzman(cell(1981)23:175)描述的猴腎成纖維細(xì)胞cos-7系，和能夠表達(dá)相容性載體的其他細(xì)胞系，例如，c127、3t3、cho、hela和bhk細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體將包含復(fù)制起點(diǎn)、合適的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，并且還包含任何必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、多腺苷酸化位點(diǎn)、剪接供體位點(diǎn)和受體位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列和5’側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。從sv40剪接(sv40splice)和多腺苷酸化位點(diǎn)衍生的dna序列可以用來(lái)提供必需的非轉(zhuǎn)錄遺傳元件。

可以通過(guò)熟知的蛋白質(zhì)回收和純化方法，從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收和/或純化多肽。這類(lèi)方法學(xué)可以包括硫酸銨或乙醇沉淀法、酸提取法、陰離子或陽(yáng)離子交換色譜法、磷酸纖維素色譜法、疏水相互作用色譜法、親和色譜法、羥基磷灰石色譜法和凝集素色譜法。根據(jù)需要，可以在完成成熟蛋白的構(gòu)象時(shí)使用蛋白質(zhì)再折疊步驟。在這個(gè)方面，伴侶蛋白可以用于這個(gè)再折疊方法中。最后，高效液相色譜法(hplc)可以用于最終純化步驟。

在本公開(kāi)中可用作免疫原的突變多肽可以是化學(xué)合成方法的產(chǎn)物或來(lái)自原核宿主或真核宿主(例如，培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、高等植物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)的重組技術(shù)產(chǎn)物，如先前解釋。取決于重組生產(chǎn)方法中所用的宿主，本公開(kāi)的突變多肽可以是糖基化的或可以是非糖基化的。

可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的重組表達(dá)/分離方法分離單獨(dú)表達(dá)的多肽。這類(lèi)分離方法的常見(jiàn)例子可以利用抗體，所述抗體針對(duì)蛋白質(zhì)的保守區(qū)域或針對(duì)作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的組成部分表達(dá)的his標(biāo)簽或可切割前導(dǎo)序列或尾隨序列。

如所示，本文公開(kāi)或否則構(gòu)思的片段和變體cdc突變蛋白將視為本公開(kāi)的部分。片段是具有下述氨基酸序列的變體多肽，所述氨基酸序列完全與天然或突變多肽的氨基酸序列的部分(而非全部)相同。片段可以是“無(wú)支撐”或含于更大的多肽內(nèi)部，所述多肽的片段形成部分或區(qū)域，如(但不限于)單一連續(xù)區(qū)域。非限制的特定片段是這樣的生物活性片段，它們是介導(dǎo)本公開(kāi)多肽的活性的那些片段，包括活性相似或活性改善或活性降低的那些。還包括是在動(dòng)物、尤其人類(lèi)中有抗原性或免疫原性的那些片段。在這個(gè)方面，本公開(kāi)包括：(i)突變cdc的片段，例如(但不限于)長(zhǎng)度至少約20-100個(gè)氨基酸，或長(zhǎng)度約100-200個(gè)氨基酸的片段，和(ii)包含突變片段的藥物組合物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼本文所述的cdc突變體的核酸與相應(yīng)的天然序列在高嚴(yán)格性雜交條件下雜交。高嚴(yán)格性條件的例子包括在約42℃于50％甲酰胺，5×ssc，5×denhardt溶液，0.5％sds和100μg/ml變性載體dna中雜交，隨后在室溫于2×ssc和0.5％sds中洗滌兩次并且在42℃于0.1×ssc和0.5％sds中額外洗滌兩次。

核酸構(gòu)建體/表達(dá)載體

如所示，可以將本文構(gòu)思的核酸并入能夠向宿主細(xì)胞引入并在其中復(fù)制的異源核酸構(gòu)建體或載體中?？梢允褂萌魏纹渌妮d體，只要該載體在引入它的細(xì)胞中可復(fù)制和有活力。大量合適的載體和啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且是市售的。適宜的dna序列可以通過(guò)多種方法插入質(zhì)?；蜉d體(在本文統(tǒng)稱(chēng)為“載體”)。通常，將dna序列通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法插入適宜限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。認(rèn)為此類(lèi)方法和相關(guān)的亞克隆方法處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。

本公開(kāi)的異源核酸構(gòu)建體可以包含本文構(gòu)思的突變cdc或其片段的編碼性序列，所述編碼性序列(i)處于分離狀態(tài)；(ii)與額外的編碼性序列組合，如(但不限于)融合蛋白編碼性序列或信號(hào)肽編碼性序列，其中突變cdc編碼性序列是優(yōu)勢(shì)的編碼性序列；(iii)與合適的宿主中有效表達(dá)編碼性序列的非編碼序列組合，如(但不限于)內(nèi)含子和控制元件，如啟動(dòng)子元件和終止子元件或5’和/或3'非翻譯區(qū)；和/或(iv)處于其中突變cdc編碼性序列是異源基因的載體或宿主環(huán)境中。

適宜的載體一般配備編碼選擇標(biāo)記的核酸序列、插入位點(diǎn)和合適的控制元件，如啟動(dòng)子序列和終止序列。載體可以包含與編碼性序列有效連接的調(diào)節(jié)序列，所述調(diào)節(jié)序列例如包括非編碼序列如內(nèi)含子和控制元件，即，啟動(dòng)子元件和終止子元件或5'和/或3'非翻譯區(qū)，在宿主細(xì)胞中(和/或在其中修飾的可溶性蛋白抗原編碼性序列正常情況下不表達(dá)的載體或宿主細(xì)胞環(huán)境下)有效表達(dá)編碼性序列。大量合適的載體和啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，其中許多是市售的。

示例性啟動(dòng)子包括組成型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其例子包括cmv啟動(dòng)子、sv40早期啟動(dòng)子、rsv啟動(dòng)子、ef-1α啟動(dòng)子，含有tet-on或tet-off系統(tǒng)中tet反應(yīng)元件(tre)的啟動(dòng)子、β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和可以通過(guò)添加某些金屬鹽上調(diào)的金屬硫蛋白啟動(dòng)子。啟動(dòng)子序列是由用于表達(dá)目的的宿主細(xì)胞識(shí)別的dna序列。它與編碼突變多肽的dna序列有效連接。

除非另外說(shuō)明，否則本公開(kāi)組合物和方法的實(shí)施利用處于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組dna和免疫學(xué)常規(guī)技術(shù)。

實(shí)施例

下文提供實(shí)施例。但是，本公開(kāi)的實(shí)施方案在申請(qǐng)時(shí)不限于本文所述的具體實(shí)驗(yàn)、結(jié)果和實(shí)驗(yàn)室方法。反而，實(shí)施例如多種實(shí)施方案當(dāng)中那樣單純提供并且意在起到示例作用，而非排他作用，并且將可以理解，本公開(kāi)的教授內(nèi)容的額外和不同實(shí)施方案將無(wú)疑向本領(lǐng)域技術(shù)人員自我提示；因此，這類(lèi)其他實(shí)施方案認(rèn)定為已經(jīng)從本公開(kāi)推斷。

實(shí)施例1

膽固醇依賴(lài)性細(xì)胞溶素(cdc)是超過(guò)20種不同物種革蘭氏陽(yáng)性菌產(chǎn)生的成孔多肽毒素大家族¹。最初，細(xì)菌將這些毒素作為穩(wěn)定的水溶性單體分泌。單體與膜結(jié)合并且發(fā)生特定順序的結(jié)構(gòu)性變化，這促進(jìn)寡聚化和孔形成。如名稱(chēng)提示，對(duì)其成孔機(jī)制而言，cdc成孔機(jī)制絕對(duì)依賴(lài)于膜膽固醇。數(shù)十年的學(xué)說(shuō)是，膽固醇是這些毒素的受體并且位于cdc的結(jié)構(gòu)域4(d4)的保守十一肽(圖2)，對(duì)cdc與膽固醇相互作用重要^2-4。但是，其他研究已經(jīng)提示，十一肽不介導(dǎo)這些cdc與富含膽固醇的膜的初始結(jié)合^5，6。因此，在本研究工作之前仍不清這些cdc的介導(dǎo)其與膽固醇結(jié)合的結(jié)構(gòu)性組分。

cdc機(jī)制對(duì)氧化敏感已經(jīng)已知超過(guò)80年⁷，并且這種性狀是最初給予這些毒素的名稱(chēng)“巰基激活的細(xì)胞溶素”的原因(參考文獻(xiàn)8中綜述)。這個(gè)巰基的氧化導(dǎo)致溶細(xì)胞活性顯著喪失，經(jīng)常>99％²。隨后通過(guò)眾多cdc的序列分析顯示，具有敏感巰基的半胱氨酸位于保守的十一肽(ectglawewwr-seqidno:39)中，因?yàn)檫@是大部分測(cè)序的cdc中存在的唯一半胱氨酸。已經(jīng)提出與這個(gè)巰基氧化相關(guān)的溶細(xì)胞喪失活因與富含膽固醇的膜的結(jié)合作用改變所致²，因此確立了膜結(jié)合和十一肽之間的推定性聯(lián)系。十一肽的高度保守性質(zhì)還提示高度保守的功能，其或許介導(dǎo)與膜膽固醇直接相互作用。

膽固醇是cdc的受體的學(xué)說(shuō)因發(fā)現(xiàn)中間鏈球菌溶素(ily)(一種由中間鏈球菌(streptococcusintermedius)分泌的cdc)而復(fù)雜化。與其他cdc相反，ily具有人細(xì)胞特異性^9,10，一種因其與人cd59(補(bǔ)體攻膜復(fù)合體的物種特異性抑制物^11,12)而非富含膽固醇的膜¹³特異性結(jié)合的能力解釋的特征。因此，目前存在至少兩類(lèi)cdc，與特定非固醇受體結(jié)合的ily和與富含膽固醇的膜直接結(jié)合的pfo樣cdc。然而，兩個(gè)類(lèi)型cdc的溶細(xì)胞機(jī)制均對(duì)膜膽固醇敏感并且在膽固醇基本上耗盡的膜上均無(wú)活性¹⁴。因此，這些研究提出一個(gè)謎；膽固醇以顯著不同于pfo樣cdc的方式促進(jìn)ily機(jī)制嗎或存在膽固醇有助于兩類(lèi)cdc的統(tǒng)一分子基礎(chǔ)嗎？

giddings等人¹⁴顯示，hrbc膜膽固醇的耗盡阻斷全部cdc的前孔至孔轉(zhuǎn)化過(guò)程，還影響pfo樣cdc與該膜的結(jié)合。soltani等人¹⁵顯示破壞ily的l1-l3d4環(huán)(圖2)插入膜也阻斷前孔轉(zhuǎn)化成孔。因此，在ily中兩種不同的現(xiàn)象阻斷前孔轉(zhuǎn)化成孔：膜膽固醇耗盡¹⁴和破壞l1-l3環(huán)插入膜¹⁵。

基于這些觀察結(jié)果，對(duì)ily和pfo的d4環(huán)和十一肽與膜的相互作用進(jìn)行詳細(xì)研究。這些研究的結(jié)果顯示，在結(jié)構(gòu)域4基部的l1-l3環(huán)是識(shí)別富含膽固醇的膜而不識(shí)別十一肽的主要結(jié)構(gòu)。這些環(huán)與富含膽固醇的膜的相互作用介導(dǎo)pfo與富含膽固醇的膜的相互作用，而它們插入膜中還是pfo和ily的前孔至孔轉(zhuǎn)化過(guò)程必需的。因此，這些結(jié)果現(xiàn)在提供了cdc的膽固醇敏感性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)并且統(tǒng)一解釋了膽固醇對(duì)利用不同膜受體的ily和pfo樣cdc的影響。

實(shí)施例1的材料和方法

細(xì)菌菌株、質(zhì)粒和化學(xué)品

將ily和pfo的基因如先前所述那樣克隆入ptrchisa(invitrogen)^14,16。在天然ily(半胱氨酸天然較少)或半胱氨酸較少的pfo(pfo^c459a)背景下進(jìn)行全部突變。天然pfo在殘基459含有半胱氨酸，已經(jīng)將所述半胱氨酸變成丙氨酸以產(chǎn)生半胱氨酸較少的pfo衍生物pfo^c459a。pfo和pfo^c459a均顯示出相似的溶細(xì)胞活性¹⁶。全部化學(xué)品和酶均獲自sigma、vwr和researchorganics。全部熒光探針均獲自molecularprobes(invitrogen)。

ily及其衍生物的產(chǎn)生和純化

使用pcrquikchange誘變(stratagene)，在天然ily或pfo^c459a中產(chǎn)生多種氨基酸置換。ily基因的突變形式的dna序列由俄克拉荷馬州醫(yī)學(xué)研究基金dna測(cè)序核心機(jī)構(gòu)分析。來(lái)自大腸桿菌的重組ily及其衍生物的表達(dá)和純化如所述那樣實(shí)施^15,16。將洗脫的蛋白質(zhì)在4℃過(guò)夜透析入緩沖液(300mmnacl，10mmmes，1mmedta，ph6.5)。隨后將蛋白質(zhì)在-80℃儲(chǔ)存于5mmdtt和10％(vol/vol)無(wú)菌甘油中。

用硫氫基特異性試劑化學(xué)修飾ily和pfo及其衍生物

用環(huán)境敏感性探針碘代乙酰氨基-n,n’-二甲基-n-(7-硝基-2-氧雜-1,3-二唑基)乙二胺(nbd)借助硫氫基修飾ily的半胱氨酸衍生物。如先前述那樣實(shí)施反應(yīng)¹⁴。將修飾的蛋白質(zhì)儲(chǔ)存在10％(vol/vol)無(wú)菌甘油中、在液氮中快速冷凍并儲(chǔ)存在-80℃。按75％或更高的效率標(biāo)記蛋白質(zhì)。

熒光測(cè)量

全部熒光強(qiáng)度測(cè)量均使用slm-8100光子計(jì)數(shù)熒光光譜儀如先前所述那樣進(jìn)行¹⁶。對(duì)于nbd測(cè)量，使用460-480nm激發(fā)波長(zhǎng)和540nm發(fā)射波長(zhǎng)，帶通為4nm。對(duì)于每份樣品，按分辨率1nm以積分時(shí)間1秒從500-600nm實(shí)施發(fā)射掃描。將含有10μg總毒素的樣品與pbs[10mmna2hpo4，2mmkh2po4，137mmnacl，3mmkcl(ph7.5)]中的人紅細(xì)胞(hrbc)血影膜(等同于303.25μg膜蛋白)在37℃溫育5-10分鐘，之后進(jìn)行廣譜測(cè)量。

脂質(zhì)體制備

如所述那樣制備按比率45:55mol％含有1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酰膽堿(popc；avantipolarlipids)和膽固醇的脂質(zhì)體¹⁶。

hrbc血影膜制備

hrbc血影膜如先前所述那樣制備。還如前述那樣，使用bradford法(bio-radproteinassay,bio-radlaboratories,inc.)定量膜蛋白含量^14,16。

膽固醇消耗和補(bǔ)充

用甲基-β-環(huán)糊精(mβcd)進(jìn)行如先前所述那樣進(jìn)行膽固醇提取¹⁴。簡(jiǎn)而言之，將人hurbc血影膜與終濃度20mm–40mmmβcd(每次使用，新鮮制得)在37℃溫育2小時(shí)。將膜通過(guò)反復(fù)離心(在4℃，14,000轉(zhuǎn)/分鐘持續(xù)20分鐘)洗滌三次并重懸于pbs中，以移除過(guò)量的mβcd。血影膜最終懸浮于pbs中。使用膽固醇/膽固醇酯定量試劑盒(calbiochem,billerica,ma)，測(cè)量膽固醇含量。一般，膜的膽固醇含量由這種方法減少>90％。

使用加載膽固醇的mβcd進(jìn)行膽固醇補(bǔ)充。先前已經(jīng)描述這種方法¹⁴。簡(jiǎn)而言之，向緩沖液a(140mmnacl，5mmkcl，5mmkh2po4，1mmmgso4，10mmhepes，5mm葡萄糖，ph6.5)添加新鮮制得的mβcd添加至終濃度5mm。在1:2(vol/vol)的氯仿:甲醇中制得100mm膽固醇母液。在玻璃容器中加熱緩沖液a+mβcd加熱至80℃。一旦加熱到80℃，添加懸浮的膽固醇至終濃度4mm。通過(guò)超聲處理(4x20秒)均化溶液。隨后使用0.22μm濾器過(guò)濾溶液。將載有膽固醇的mβcd添加至沉淀的耗盡膽固醇的血影膜并在37℃溫育2小時(shí)。如前通過(guò)重復(fù)離心洗滌膜并且最終重懸于pbs中。

在l1spr傳感芯片上固定脂質(zhì)體

使用l1傳感芯片(biacore，烏普薩拉，瑞典)，以biacore3000系統(tǒng)測(cè)量表面等離子體共振(spr)。l1傳感芯片含有與疏水性殘基共價(jià)結(jié)合并且已經(jīng)常規(guī)用于固定脂質(zhì)體的葡聚糖基質(zhì)。為脂質(zhì)體準(zhǔn)備l1芯片時(shí)，將10μl20mmchaps以流量10μl/分鐘注射。脂質(zhì)體(0.5mm脂質(zhì)終濃度)隨后按相同流量注射10分鐘。在注射后脂質(zhì)體，注射50mmnaoh持續(xù)3分鐘以移除多層脂質(zhì)。此后注射0.1mg/mlbsa以包被非特異性結(jié)合位點(diǎn)。全部注射均在25℃進(jìn)行。通過(guò)反復(fù)注射20mmchaps和50mmnaoh再生l1芯片并剝離其脂質(zhì)體，直至達(dá)到原始ru讀數(shù)。再生程序未導(dǎo)致傳感芯片結(jié)合容量損耗。

spr分析

脂質(zhì)體和pfo衍生物之間相互作用的全部分析均在hbs中在25℃進(jìn)行。將野生型pfo(50ng/μl)和pfo天冬氨酸突變體(50ng/μl)在脂質(zhì)體包被的芯片上以流量30μl/分鐘注射4分鐘。

實(shí)施例1的結(jié)果

實(shí)驗(yàn)策略。ily不依賴(lài)于膜膽固醇與天然膜結(jié)合，但是其機(jī)制仍對(duì)膽固醇敏感。不同于不與缺少膽固醇的膜結(jié)合的pfo樣cdc，ily的受體結(jié)合和寡聚化仍在膽固醇耗盡的膜上出現(xiàn)¹⁴。因此，ily用來(lái)首先鑒定負(fù)責(zé)其膽固醇依賴(lài)性的結(jié)構(gòu)。一旦鑒定對(duì)膜膽固醇敏感的ily結(jié)構(gòu)，則在pfo中研究破壞這些結(jié)構(gòu)對(duì)其與富含膽固醇的脂質(zhì)體膜結(jié)合的能力的影響。以這種方式，可以確定是否ily和pfo二者中的相同結(jié)構(gòu)負(fù)責(zé)其膽固醇依賴(lài)性。

ily十一肽插入膜不需要膽固醇。采用ily的先前研究已經(jīng)顯示，十一肽必須插入膜中，以便前孔形成¹⁵。因此，確定其插入過(guò)程是否對(duì)膜膽固醇敏感。將半胱氨酸殘基置換位于十一肽內(nèi)部的ala-486并借助其硫氫基用nbd標(biāo)記。已經(jīng)顯示在天然ily中這個(gè)殘基插入膜¹⁵。在含有膽固醇的膜或膽固醇耗盡的膜不存在和存在情況下測(cè)量ily^a486c-nbd中nbd的熒光強(qiáng)度。如圖3中所示，在hrbc血影膜存在下，十一肽插入膜中，如與針對(duì)可溶性狀態(tài)的ily觀察到的情況相比熒光發(fā)射強(qiáng)度增加所示。當(dāng)膜耗盡膽固醇時(shí)，觀察到相同的熒光發(fā)射增加。這些結(jié)果顯示十一肽區(qū)域在ala-486附近插入膜與膜膽固醇含量無(wú)關(guān)。

環(huán)l1、l2和l3的插入需要膽固醇。在d4頂端的三個(gè)疏水性短環(huán)插入膜(圖2)協(xié)同發(fā)生并且是cdc單體在膜上錨定和恰當(dāng)定向需要的^15,17。與十一肽的插入?yún)f(xié)同，這些環(huán)的插入是d3跨膜β-發(fā)夾(tmhs)后續(xù)插入膜(其導(dǎo)致跨膜β-桶孔形成)必需的¹⁵。膽固醇還是tmh插入和孔復(fù)合體形成需要的¹⁴。因此，膜膽固醇和l1-l3環(huán)插入膜是前孔轉(zhuǎn)化成孔的前提^14,15。由于l1-l3環(huán)插入膜先于d3tmh插入，因此似乎合理的是，膜膽固醇的耗盡可能阻斷l(xiāng)1-l3環(huán)的插入，這轉(zhuǎn)而阻止d3tmh的插入并阻斷前孔轉(zhuǎn)變成孔。因此，假設(shè)l1-l3環(huán)插入膜需要膽固醇。

為了檢驗(yàn)這個(gè)假設(shè)，分別測(cè)量l1-l3環(huán)向天然hurbc血影膜和耗盡膽固醇的hurbc血影膜的膜插入過(guò)程。最近顯示，位于環(huán)l1、l2和l3內(nèi)部的ily殘基leu-518、ala-424和ala-464分別插入膜中¹⁷。為了測(cè)量每個(gè)環(huán)的插入過(guò)程，將每種環(huán)中的殘基突變成半胱氨酸(ily^a428c、ily^a464c、ily^l518c)¹⁵并且用nbd衍生化硫氫基。由于位于這些位點(diǎn)的nbd進(jìn)入膜，其熒光發(fā)射強(qiáng)度顯著增加^15,17。在可溶性單聚體毒素、與hurbc血影膜結(jié)合的毒素和與耗盡膽固醇的血影膜結(jié)合的毒素之間比較nbd的發(fā)射強(qiáng)度。

與每個(gè)環(huán)插入天然hrbc血影的膜時(shí)所見(jiàn)的熒光發(fā)射強(qiáng)度增加形成鮮明對(duì)比，大約90％膜膽固醇的耗盡消除了全部三個(gè)環(huán)插入膜(圖4，小圖a-c)。向膽固醇耗盡的膜恢復(fù)膽固醇恢復(fù)了環(huán)插入膜的能力(圖4，小圖d-f)。因此，膜膽固醇是l1-l3環(huán)插入過(guò)程需要的，并且如先前顯示，這個(gè)插入過(guò)程是前孔轉(zhuǎn)化成孔必需的^14,15。

天冬氨酸置換pfo的環(huán)l1-l3中的殘基阻止其與富含膽固醇的膜結(jié)合。ily的l1-l3環(huán)插入膜對(duì)天然膜中的膽固醇耗盡敏感，顯示在pfo中這些相同的環(huán)可能介導(dǎo)其與富含膽固醇的膜直接結(jié)合。但是，不能在pfo中按照與隨ily所用相似的方式解決這個(gè)問(wèn)題，因?yàn)槟懝檀己谋M減少pfo與膜結(jié)合。因此，確定突變這些相同環(huán)對(duì)pfo與富含膽固醇的脂質(zhì)體結(jié)合的影響。通過(guò)向pfo的環(huán)l1-l3中引入天冬氨酸完成這點(diǎn)，先前在ily中顯示所述引入阻止這些環(huán)插入膜¹⁵。在ily中環(huán)l1-l3的插入是偶聯(lián)的，并且向任何單一環(huán)殘基ala-428(l2)、ala-464(l3)或leu518(l1)引入天冬氨酸阻斷它們插入膜。因此，預(yù)計(jì)如果將天冬氨酸置換pfo中的任一個(gè)類(lèi)似殘基ala-401、ala-437或leu-491，它將破壞pfo與富含膽固醇的脂質(zhì)體結(jié)合。

pfo中類(lèi)似殘基ala-401(l2)、ala-437(l3)和leu-491(l1)的單獨(dú)置換導(dǎo)致每種突變體的溶血活性喪失大于99.7％(數(shù)據(jù)未顯示)。通過(guò)表面等離子體共振(spr)測(cè)量pfo突變體與膽固醇-pc脂質(zhì)體的結(jié)合。如圖5a中所示，通過(guò)spr檢查時(shí)，這些突變顯著減少與膽固醇-pc脂質(zhì)體的結(jié)合。天冬氨酸置換ala-401(l2)或leu-491(l1)徹底地消除pfo與脂質(zhì)體膜結(jié)合，并且因天冬氨酸置換ala-437(l3)所致的結(jié)合作用比野生型低7％(圖5b)。這個(gè)結(jié)果顯示，d4l1-l3環(huán)對(duì)pfo樣cdc與富含膽固醇的膜的相互作用至關(guān)重要。

修飾pfo的cys-459阻斷十一肽色氨酸殘基插入膜，但不阻斷pfo的膜結(jié)合作用。長(zhǎng)久以來(lái)認(rèn)為pfo樣cdc的保守十一肽參與它們與富含膽固醇的膜結(jié)合，主要原因是，據(jù)報(bào)道化學(xué)修飾十一肽的天然半胱氨酸(cys-459)的硫氫基顯著影響pfo與低細(xì)胞數(shù)目的羊rbc結(jié)合，但不影響與高細(xì)胞數(shù)目的羊rbc結(jié)合²。然而，其他已經(jīng)證實(shí)其修飾似乎不影響其他cdc與細(xì)胞的結(jié)合^5,6。因此，通過(guò)spr比較了天然pfo和借助十一肽的cys-459的硫氫基修飾的pfo與膽固醇-pc脂質(zhì)體結(jié)合的能力。

用硫氫基特異性試劑n-乙基馬來(lái)酰亞胺(nem)對(duì)pfo十一肽cys-459巰基的修飾降低溶血活性99％(數(shù)據(jù)未顯示)，這類(lèi)似于其中化學(xué)修飾pfo和slo的半胱氨酸硫氫基的其他報(bào)道^2，18。然而nem修飾型毒素的結(jié)合速率和程度增加超過(guò)天然毒素，如通過(guò)spr分析所測(cè)定(圖6a-b)。因此，化學(xué)修飾cys-459并不破壞pfo與膜結(jié)合。

如果修飾cys-459不影響結(jié)合作用，則它提出以下問(wèn)題：有效阻斷pfo活性的這種修飾對(duì)pfo做了什么。自幾乎90年前發(fā)現(xiàn)cdc以來(lái)，已經(jīng)已知其溶細(xì)胞機(jī)制對(duì)氧化敏感。敏感殘基的氧化最終與高度保守的十一肽半胱氨酸殘基關(guān)聯(lián)¹。進(jìn)一步檢查半胱氨酸修飾對(duì)pfo的結(jié)構(gòu)性影響以確定其修飾是否阻止可能影響其活性的pfo結(jié)構(gòu)變化。十一肽色氨酸464、466和467插入膜在構(gòu)象偶聯(lián)于d3tmh的插入。先前研究已經(jīng)顯示，d3tmh1殘基處的突變?cè)黾悠洳迦胨俾?，還增加十一肽色氨酸殘基插入膜的速率¹⁹。由于cys-459靠近色氨酸殘基，因此確定化學(xué)修飾半胱氨酸巰基是否阻斷色氨酸殘基插入膜。

十一肽色氨酸殘基的膜插入過(guò)程可以通過(guò)這些殘基移入膜的非極性環(huán)境時(shí)其固有熒光強(qiáng)度增加來(lái)監(jiān)測(cè)^20,21。在nem修飾的pfo和天然pfo中測(cè)量這些色氨酸的插入過(guò)程(圖6a和6b)。修飾cys-459阻斷十一肽色氨酸插入，但是不阻止它形成抗sds低聚物，這類(lèi)似于天然pfo(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，這些數(shù)據(jù)顯示，pfo結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化反映為十一肽色氨酸殘基插入過(guò)程的喪失影響前孔低聚物后續(xù)轉(zhuǎn)化成孔復(fù)合體。

用肺炎球菌溶血素突變體leu460asp免疫接種

使用明礬(氫氧化鋁)作為佐劑，在第0天和第14天用5μg肺炎球菌溶血素或肺炎球菌溶血素突變體皮下免疫接種cba/cahn-xid小鼠。在第21天，用單一稀釋劑(無(wú)佐劑)中的蛋白質(zhì)免疫接種小鼠。全部注射均以0.2ml體積給予。在第35天，用莢膜型19f菌株ef3030攻擊小鼠。七天后，用二氧化碳?xì)怏w令小鼠安樂(lè)死。將肺勻漿，并且通過(guò)鍍覆在血瓊脂平板上涂布勻漿的組織確定每只小鼠的肺中菌落形成單位(cfu)數(shù)。還將小鼠放血。血液中未觀察到肺炎球菌，顯示這是肺炎模型并且不是肺炎和敗血癥模型。結(jié)果顯示，野生型和突變肺炎球菌溶血素均能夠在小鼠局灶性肺炎模型中保護(hù)小鼠免遭肺炎。(圖7)。

cdc的兩個(gè)長(zhǎng)期標(biāo)志是其成孔機(jī)制依賴(lài)于膜膽固醇的存在和大部分cdc因十一肽半胱氨酸氧化而可逆性失活。本文的研究解析了兩種現(xiàn)象的分子基礎(chǔ)。不希望受理論約束，位于結(jié)構(gòu)域4基部的l1-l3環(huán)插入膜似乎是ily對(duì)膜膽固醇的存在敏感的主要事件。一旦膽固醇耗盡，則這些環(huán)不插入膜中，并且如先前顯示，從hrbc膜提取膽固醇¹⁵阻止ily的前孔轉(zhuǎn)化成孔。這些結(jié)果表明兩種效應(yīng)也均因這些環(huán)不能插入膽固醇耗盡的膜中所致。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步顯示，pfo中保守半胱氨酸的氧化和假定地其他pfo樣cdc阻斷誘使pfo處于前孔狀態(tài)的色氨酸殘基插入膜，但不影響與富含膽固醇的脂質(zhì)體結(jié)合。

人細(xì)胞特異性毒素ily的發(fā)現(xiàn)提出如下難題：如果膽固醇是ily的受體，它怎樣區(qū)分人細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞。ily的人細(xì)胞特異性因發(fā)現(xiàn)人cd59(一種晚期階段的物種特異性補(bǔ)體抑制物)是其受體而得到解釋¹³。即使膽固醇不是ily受體，其成孔機(jī)制仍對(duì)膜膽固醇敏感¹⁴，并且顯示膽固醇是ily中成孔機(jī)制的更晚階段需要的；膜膽固醇的實(shí)質(zhì)耗盡阻斷前孔轉(zhuǎn)化成孔。有趣地，還對(duì)slo和pfo¹⁴(兩種可以與富含膽固醇的膜直接結(jié)合的cdc)觀察到這一點(diǎn)。盡管來(lái)自hrbc的膜膽固醇耗盡阻斷pfo前孔轉(zhuǎn)化成孔，它還減少pfo結(jié)合。因此，膽固醇是全部三種cdc的前孔轉(zhuǎn)化成孔必需的，此外，它還有助于pfo樣cdc結(jié)合膜。

最近soltani等人¹⁵顯示ily的l1-l3d4環(huán)插入膜是前孔轉(zhuǎn)化成孔必需的。因此，膽固醇和l1-l3環(huán)插入膜均為ily的前孔轉(zhuǎn)化成孔必需的。不希望受理論約束，本文展示的數(shù)據(jù)表示，對(duì)這些觀察結(jié)果的統(tǒng)一解釋是這些環(huán)插入膜僅在富含膽固醇的膜中出現(xiàn)，并且這個(gè)插入過(guò)程是ily和pfo樣cdc的前孔轉(zhuǎn)化成孔必需的。此外，這些環(huán)插入富含膽固醇的膜中的能力還介導(dǎo)pfo及假定地pfo樣cdc與富含膽固醇的膜表面初始結(jié)合。因此，這些數(shù)據(jù)顯示在ily和pfo樣cdc中，l1-l3環(huán)必須插入膜中以便成功形成孔復(fù)合體。在ily的情況下，結(jié)合作用首先由hucd59介導(dǎo)，接著l1-l3環(huán)插入富含膽固醇的膜中，而這兩個(gè)事件即結(jié)合和插入在pfo中是完全相同的并且主要由l1-l3環(huán)介導(dǎo)。

傳統(tǒng)上已經(jīng)認(rèn)為，十一肽pfo樣cdc有助于或直接介導(dǎo)富含膽固醇的膜的識(shí)別^2,3,21。本文的研究顯示，l1-l3環(huán)是介導(dǎo)cdc和富含膽固醇的膜之間相互作用的主要結(jié)構(gòu)。盡管用nem化學(xué)修飾pfo的十一肽半胱氨酸降低其溶血活性超過(guò)于99％，但是pfo與膽固醇-pc脂質(zhì)體結(jié)合大體上不受損害。因此，與現(xiàn)有學(xué)說(shuō)相反，pfo和其他pfo樣cdc的相互作用主要由環(huán)l1-l3介導(dǎo)而不由十一肽介導(dǎo)。十一肽內(nèi)部的突變可能影響l1-l3與富含膽固醇的膜相互作用。已經(jīng)顯示，突變ily的十一肽trp-491阻斷l(xiāng)1-l3的插入¹⁵，并且改變的天然ily十一肽結(jié)構(gòu)明顯阻止l1-l3與富含膽固醇的膜直接相互作用，因此允許它首先與hucd59結(jié)合。后一種觀點(diǎn)得到以下事實(shí)強(qiáng)化：向ily引入共有的十一肽結(jié)構(gòu)時(shí)，它能夠?qū)崿F(xiàn)與非人類(lèi)細(xì)胞結(jié)合²²。

令人好奇的是，類(lèi)似于pfo，ily的l1-l3環(huán)為何不介導(dǎo)與富含膽固醇的膜結(jié)合。如上文提出，結(jié)構(gòu)域4之間的主要差異似乎是高度保守的十一肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)。顯然ily已經(jīng)喪失與富含膽固醇的膜直接結(jié)合的能力；否則，它將不顯示借助hucd59介導(dǎo)的人細(xì)胞特異性。ily和pfo的d4的晶體結(jié)構(gòu)可以解釋l1-l3環(huán)中介導(dǎo)這兩種cdc與富含膽固醇的膜直接結(jié)合的這種差異。ily的l1-l3殘基(leu-518、ala-428和ala-464)的位置和取向幾乎與pfo中的類(lèi)似殘基(leu-491、ala-401和ala-437)相同(圖4b)。實(shí)際上，兩種cdc的大部分d4結(jié)構(gòu)幾乎相同(rms偏差小于參考文獻(xiàn)23)，例外是結(jié)構(gòu)域4頂部的十一肽環(huán)和β-舌結(jié)構(gòu)。較之pfo十一肽，ily的十一肽環(huán)從d4基部向下進(jìn)一步延伸因此，ily十一肽可能在空間上阻礙ily的l1-l3環(huán)與富含膽固醇的表面相互作用。可能僅與受體結(jié)合后，ily十一肽結(jié)構(gòu)才以如此方式改變，從而允許l1-l3環(huán)的插入。

本公開(kāi)揭示了嚴(yán)重影響十一肽半胱氨酸氧化對(duì)pfo和假定其他pfo樣cdc的溶細(xì)胞機(jī)制所顯示活性的結(jié)構(gòu)性基礎(chǔ)。最初，cdc因這個(gè)特征而稱(chēng)作巰基激活的細(xì)胞溶素，但是這種效應(yīng)的分子基礎(chǔ)未知。早期研究提出與rbc結(jié)合受影響，但與此同時(shí)與膽固醇結(jié)合不受影響，并且仍在細(xì)胞的表面上觀察到無(wú)溶解性的寡聚體²。如本文所示，這種修飾阻止十一肽色氨酸插入并導(dǎo)致截獲前孔的低聚體結(jié)構(gòu)。盡管這種影響的精確結(jié)構(gòu)性基礎(chǔ)未知，但是先前的研究已經(jīng)顯示，形成跨膜-桶孔的結(jié)構(gòu)域3tmh插入膜在構(gòu)象上與結(jié)構(gòu)域4十一肽色氨酸殘基插入膜偶聯(lián)¹⁹。因此，阻止這些色氨酸插入膜可以阻止結(jié)構(gòu)域3tmh的插入，因此誘使pfo處于前孔狀態(tài)。

實(shí)施例2

使用親和柱純化加his標(biāo)簽的ply野生型和ply突變體(plyl460d和plyl460d/g293s)。蛋白質(zhì)平均產(chǎn)率是ply野生型：1mg/ml，plyl460d：1mg/ml，和plyl460d/g293s：4mg/ml。通過(guò)連續(xù)滴定毒素與人紅細(xì)胞(rbc)溫育，對(duì)純化的蛋白質(zhì)測(cè)試溶血活性。從非線(xiàn)性s型劑量-反應(yīng)曲線(xiàn)計(jì)算每種蛋白質(zhì)的ec50(溶解50％rbc所需要的有效濃度)。測(cè)定每種突變體距野生型ply的倍數(shù)變化(倍數(shù)變化＝野生型ec50/突變體ec50)。據(jù)報(bào)道兩種ply突變體的活性低于野生型ply某個(gè)倍數(shù)，因?yàn)樵谶@些衍生物的最高蛋白質(zhì)濃度，精確劑量-反應(yīng)曲線(xiàn)所要求的100％rbc溶胞作用不可實(shí)現(xiàn)。與野生型蛋白相比，突變體的溶血活性下降(活性低于ply野生型的倍數(shù))對(duì)于plyl460d是>10,000倍并且對(duì)于plyl460d/g293s是>260,000倍。

從計(jì)算熔化溫度(50％蛋白質(zhì)已經(jīng)解折疊的溫度)(tm攝氏度)中推斷蛋白質(zhì)的相對(duì)穩(wěn)定性。使用proteinthermalshiftassaydye試劑盒(appliedbiosystems)，生成蛋白質(zhì)熔化曲線(xiàn)。隨著溫度增加，蛋白質(zhì)解折疊并且染料能夠結(jié)合暴露的疏水性區(qū)域并發(fā)出熒光。ply野生型、plyl460d和plyl460d/g293s的tm分別是47.50±0.2、47.69±0.2、47.97±0.2。三種ply蛋白報(bào)告的tm無(wú)顯著差異表明，向ply野生型引入所示的突變不影響這些蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。

如上文所示，在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，本公開(kāi)的肺炎球菌溶血素突變體是命名為ply-l460d/g293s(plyl460d/g293s)的雙突變體，其中位置460的l用d置換并且位置293的g用s置換。g293s置換本身僅降低ply突變體的溶血活性約50倍。l460d置換本身降低ply突變體的活性約5000-10,000倍。但是在具有兩種置換的ply突變體中，活性較天然ply毒素下降超過(guò)260,000倍。這是一種幾何式下降，不僅僅是活性的“加合式”下降。

不希望受理論約束，活性的急劇下降歸因于ply的二種必需功能阻斷。首先，l460d置換阻斷與膽固醇的結(jié)合，并且其次，g293s置換誘使ply處于不能插入β-桶孔的前孔狀態(tài)(前孔定義為已經(jīng)以環(huán)樣結(jié)構(gòu)低聚化，但是不能插入β-桶孔的膜結(jié)合型單體)。因此，抑制作用為幾何式：毒性低50x5000-10,000>250,000倍折疊(溶血性較低)，這符合顯示其毒性較天然ply低>260,000倍的測(cè)量。g293s置換還使l460d突變蛋白的單體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定并且在純化時(shí)增加產(chǎn)率。例如，從1.0升大腸桿菌培養(yǎng)物純化時(shí)，ply-l460d/g293s突變體的產(chǎn)率是大約52mg，而ply–l460d突變體是3mg(多約17倍)。

因此，在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及純化或分離的突變肺炎球菌溶血素多肽，所述多肽包含與seqidno:1至少約90％相同的氨基酸序列并且在氨基酸位置458、459和460至少之一及氨基酸位置293和294至少之一處具有氨基酸置換。如與野生型肺炎球菌溶血素多肽相比，突變肺炎球菌溶血素多肽可以具有減少的溶血活性和減少的成孔活性。氨基酸序列可以與seqidno:1至少約91％相同、至少約92％相同、至少約93％相同、至少約94％相同、至少約95％相同、至少約96％相同、至少約97％相同、至少約98％相同、或至少約99％相同。突變肺炎球菌溶血素多肽可以在氨基酸位置293和458；293和459；293和460；294和458；294和459；或294和460包含氨基酸置換。突變肺炎球菌溶血素多肽可以在氨基酸位置293、458和459；293、459和460；或293、458和460包含氨基酸置換。突變肺炎球菌溶血素多肽可以在氨基酸位置294、458和459；294、459和460；或294、458和460包含氨基酸置換。突變肺炎球菌溶血素多肽可以在氨基酸位置293、294、458和459；293、294、459和460；或293、294、458和460包含氨基酸置換。突變肺炎球菌溶血素多肽可以在氨基酸位置293、294、458、459和460包含氨基酸置換。突變肺炎球菌溶血素多肽可以在氨基酸位置293包含絲氨酸或蘇氨酸并在氨基酸位置460中包含天冬氨酸、谷氨酸或天冬酰胺。純化的突變肺炎球菌溶血素多肽的氨基酸序列可以是seqidno:40。相對(duì)于野生型肺炎球菌溶血素或相對(duì)于在氨基酸位置293、294、458、459和460中僅一個(gè)氨基酸位置具有置換的突變肺炎球菌溶血素多肽，突變肺炎球菌溶血素多肽可以具有增加的產(chǎn)量。突變肺炎球菌溶血素多肽可以具有比野生型肺炎球菌溶血素多肽低約250,000倍的溶血活性。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，上文所述或否則構(gòu)思的一種或多種突變肺炎球菌溶血素多肽可以置于可藥用賦形劑中以形成免疫原性組合物。另一個(gè)實(shí)施方案包括疫苗，所述疫苗包括免疫原性組合物并且可以任選地含有佐劑。又一個(gè)實(shí)施方案是編碼本文所述或否則構(gòu)思的任一突變肺炎球菌溶血素多肽的核酸序列；又一個(gè)實(shí)施方案涉及包括所述核酸序列的宿主細(xì)胞。又一個(gè)實(shí)施方案涉及一種在需要這種治療的受試者中治療、預(yù)防性防止或減少肺炎鏈球菌所致的病狀、疾病或感染出現(xiàn)的方法；在這種的方法中，將治療有效量的本文所述或否則構(gòu)思的任何免疫原性組合物施用至受試者。

在其他實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及純化或分離的突變鏈球菌溶素o多肽，所述多肽包含與seqidno:9至少90％相同的氨基酸序列并且在氨基酸位置561和562至少之一及氨基酸位置395和396至少之一處具有氨基酸置換。如與野生型鏈球菌溶素o多肽相比，突變鏈球菌溶素o多肽可以具有減少的溶血活性和減少的成孔活性。氨基酸序列可以與seqidno:9至少約91％相同、至少約92％相同、至少約93％相同、至少約94％相同、至少約95％相同、至少約96％相同、至少約97％相同、至少約98％相同、或至少約99％相同。突變鏈球菌溶素o多肽可以在氨基酸位置395和561；395和562；396和561；和/或396和562包含氨基酸置換。突變鏈球菌溶素o多肽可以在氨基酸位置395、561和562；396、561和562；395、396和561；395、396和562；和395、396、561和562包含氨基酸置換。相對(duì)于野生型鏈球菌溶素o或相對(duì)于在氨基酸位置395、396、561和562中僅一個(gè)氨基酸位置具有置換的突變鏈球菌溶素o多肽，突變鏈球菌溶素o多肽可以具有增加的產(chǎn)量。突變鏈球菌溶素o多肽可以具有比野生型鏈球菌溶素o多肽低約250,000倍的溶血活性。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，上文所述或否則構(gòu)思的一種或多種突變鏈球菌溶素o多肽可以置于可藥用賦形劑中以形成免疫原性組合物。另一個(gè)實(shí)施方案包括疫苗，所述疫苗包括免疫原性組合物并且可以任選地含有佐劑。又一個(gè)實(shí)施方案是編碼本文所述或否則構(gòu)思的任一突變鏈球菌溶素o多肽的核酸序列；又一個(gè)實(shí)施方案涉及包括所述核酸序列的宿主細(xì)胞。又一個(gè)實(shí)施方案涉及一種在需要這種治療的受試者中治療、預(yù)防性防止或減少化膿性鏈球菌所致的病狀、疾病或感染出現(xiàn)的方法；在這種方法中，將治療有效量的本文所述或否則構(gòu)思的任何免疫原性組合物施用至受試者。

雖然已經(jīng)詳細(xì)描述了本公開(kāi)，但應(yīng)當(dāng)理解可以在本文所述的實(shí)施方案中進(jìn)行各種變化、替換和改變而不脫離本公開(kāi)的精神和范圍。另外，本公開(kāi)的范圍不意在限于本說(shuō)明書(shū)中描述的過(guò)程、物質(zhì)組成、手段、方法和步驟的具體實(shí)施方案，尤其就本文描述或能夠?qū)崿F(xiàn)的具體氨基酸或核酸序列而言是這樣。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將從本發(fā)明的公開(kāi)輕易地領(lǐng)會(huì)目前存在的或后續(xù)待開(kāi)發(fā)的過(guò)程、物質(zhì)組成、手段、方法、序列或步驟，它們基本上執(zhí)行與本文所述的相應(yīng)實(shí)施方案相同的功能或基本上實(shí)現(xiàn)與之相同的結(jié)果。因而，所述所附權(quán)利要求書(shū)意圖將全部這類(lèi)過(guò)程、物質(zhì)組成、方法或方法步驟、氨基酸序列和核酸序列納入其范圍內(nèi)。

參考文獻(xiàn)

以下參考文獻(xiàn)特別通過(guò)引用的方式并入本文，尤其就示例性方法細(xì)節(jié)或補(bǔ)充本文所述那些細(xì)節(jié)的其他細(xì)節(jié)而言通過(guò)引用的方式并入本文。

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序列表

<110>俄克拉何馬大學(xué)董事會(huì)

<120>肺炎球菌溶血素突變體及其使用方法

<130>5835.161wo

<150>62/082,848

<151>2014-11-21

<160>40

<170>patentin版本3.5

<210>1

<211>471

<212>prt

<213>streptococcuspneumoniae

<400>1

metalaasnlysalavalasnasppheileleualametasntyrasp

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202530

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100105110

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370375380

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385390395400

serglyalatyrvalalaglnphegluvaltyrtrpaspglupheser

405410415

tyraspalaaspglyglngluilevalthrarglyssertrpaspgly

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asntrpargaspargseralahispheserthrgluileproleupro

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proasnalalysasnileargilephealaargglucysthrglyleu

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lysservalthrphelysgluleuglnalalysglyvalserasnglu

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1510

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<213>streptococcuspneumoniae

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225230235240

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290295300

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305310315320

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