本揭示內(nèi)容大致上是關(guān)于治療感染的領(lǐng)域。更具體來(lái)說(shuō)，本揭示內(nèi)容是關(guān)于一種用以治療或預(yù)防a型流感病毒感染的方法。

背景技術(shù)：

a型流感病毒(influenzaavirus,iav)是一種負(fù)向(negative-sense)、單股(single-stranded)且分段(segmented)的rna病毒。季節(jié)性的iav感染具有高發(fā)病率及高死亡率，每年導(dǎo)致全球約250,000–500,000個(gè)體死亡，并造成全美超過(guò)35,000個(gè)體死亡。對(duì)健康的孩童及成人而言，iav感染通常僅會(huì)造成中等嚴(yán)重程度的病狀。然而，對(duì)免疫功能不足或缺損(immunocompromised)的個(gè)體(例如不健康的個(gè)體或老年人)來(lái)說(shuō)，iav感染可能會(huì)造成非常嚴(yán)重的病狀。其中一種與iav相關(guān)且會(huì)導(dǎo)致個(gè)體高死亡風(fēng)險(xiǎn)的病征為慢性肺部疾病(例如氣喘(asthma)、肺氣腫(emphysema)、慢性支氣管炎(chronicbronchitis)、支氣管擴(kuò)張癥(bronchiectasis)或囊腫纖維化(cysticfibrosis))，其多數(shù)是由過(guò)量發(fā)炎反應(yīng)所造成。已知除了可作為iav感染及復(fù)制的主要標(biāo)的細(xì)胞的支氣管及肺泡上皮細(xì)胞外，巨噬細(xì)胞(macrophage)亦在由iav所引發(fā)的肺部發(fā)炎反應(yīng)中扮演著重要的角色。一旦遭受iav感染，巨噬細(xì)胞會(huì)快速地產(chǎn)生第i型干擾素(typeiinterferon，例如干擾素-α及干擾素-β)、促發(fā)炎細(xì)胞激素(pro-inflammatorycytokine，例如tnf-α、il-6及il-1β)及趨化激素(chemokine，例如mcp-1、mip-1α、rantes及ip-10)，進(jìn)而吸引白血球浸潤(rùn)至肺部組織，造成組織損傷、水腫(edema)及肺功能障礙。因此，巨噬細(xì)胞常被認(rèn)為對(duì)由iav所引發(fā)的肺部損傷及個(gè)體死亡具有關(guān)鍵性的影響。

誘餌受體3(decoyreceptor3,dcr3)亦稱為腫瘤壞死因子受體超家族成員6b(tumornecrosisfactorreceptorsuperfamilymember6b,tnfrsf6b)、tr6或m68，是tnf受體超家族的一員。由于缺少跨膜域(transmembranedomain)，dcr3會(huì)表達(dá)為可溶性蛋白的形式。目前已知該蛋白在不同的訊號(hào)傳遞路徑中扮演著調(diào)控者的角色，且參與不同的細(xì)胞作用：(1)抑制由fas所引發(fā)的細(xì)胞死亡；(2)抑制由light所傳遞的t細(xì)胞活化；(3)引發(fā)血管新生；以及(4)調(diào)控單核球(monocyte)活化及分化為樹突細(xì)胞(dendriticcell)、巨噬細(xì)胞及蝕骨細(xì)胞(osteoclast)。此外，亦發(fā)現(xiàn)dcr3會(huì)過(guò)量表達(dá)在不同的腫瘤及發(fā)炎組織。

由于iav感染持續(xù)對(duì)人類造成重大的威脅，且目前尚不清楚該如何預(yù)防或調(diào)控因感染所造成的組織損傷，相關(guān)領(lǐng)域因此亟需一種經(jīng)改良的方法，以治療或預(yù)防iav感染，并據(jù)以使被感染的個(gè)體免于產(chǎn)生后續(xù)的組織損傷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明內(nèi)容旨在提供本揭示內(nèi)容的簡(jiǎn)化摘要，以使閱讀者對(duì)本揭示內(nèi)容具備基本的理解。此發(fā)明內(nèi)容并非本揭示內(nèi)容的完整概述，且其用意并非在指出本發(fā)明實(shí)施例的重要/關(guān)鍵組件或界定本發(fā)明的范圍。

本揭示內(nèi)容的第一方面是關(guān)于一種在一個(gè)體體內(nèi)治療或預(yù)防iav感染的方法。該方法包含對(duì)該個(gè)體投予一治療有效量的融合蛋白，其包含一由seqidno：4所組成的第一肽及一與該第一肽連結(jié)的人類igg1fc區(qū)域。

本揭示內(nèi)容的另一方面是關(guān)于一種用以減緩一有需要個(gè)體的肺部損傷的方法；具體來(lái)說(shuō)，該個(gè)體遭受iav感染，且產(chǎn)生由iav所引發(fā)的過(guò)量發(fā)炎反應(yīng)。該方法包含對(duì)該個(gè)體投予一治療有效量的融合蛋白，其包含一由seqidno：4所組成的第一肽及一與該第一肽連結(jié)的人類igg1fc區(qū)域。

依據(jù)本揭示內(nèi)容某些實(shí)施方式，該融合蛋白更包含一由seqidno：5所組成的第二肽，及一由seqidno：6所組成的第三肽，其中該第二及第三肽分別位于及連接于該由seqidno：4所組成的第一肽的上游及下游。

依據(jù)本揭示內(nèi)容某些實(shí)施方式，該融合蛋白每劑投予劑量約為每公斤體重0.5到5毫克。在一較佳實(shí)施例中，該融合蛋白每劑投予劑量約為每公斤體重0.8到1毫克。依據(jù)本揭示內(nèi)容其他實(shí)施方式，在一完整的療程中，該融合蛋白的總投予劑量約為每公斤體重1到10毫克；較佳的情況是，該融合蛋白的總投予劑量約為每公斤體重1.6到2毫克。

依據(jù)本揭示內(nèi)容一實(shí)施方式，該融合蛋白可由口服(oral)、腸內(nèi)(enteral)、鼻腔(nasal)、局部(topical)、穿透黏膜(transmucosal)或非口服(parenteral)方式投予至該個(gè)體。一般來(lái)說(shuō)，非口服方式可以是肌肉注射(intramuscularinjection)、靜脈注射(intravenousinjection)或腹腔注射(intraperitonealinjection)。

在參閱下文實(shí)施方式后，本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者當(dāng)可輕易了解本發(fā)明的基本精神及其他發(fā)明目的，以及本發(fā)明所采用的技術(shù)手段與實(shí)施方式。

附圖說(shuō)明

為讓本發(fā)明的上述與其他目的、特征、優(yōu)點(diǎn)與實(shí)施例能更明顯易懂，所附圖式的說(shuō)明如下：

圖1a-1c是依據(jù)本揭示內(nèi)容實(shí)施例1所繪示的組織化學(xué)染色(histochemiscalstaining)及酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)結(jié)果，分別闡述在野生型(wild-type,wt)及dcr3轉(zhuǎn)基因(dcr3-tg)小鼠中，dcr3于肺臟組織(圖1a)、血清(圖1b)及支氣管肺泡沖洗液(bronchoalveolarlavagefluid，balf，圖1c)的表達(dá)；

圖2a-2g是依據(jù)本揭示內(nèi)容實(shí)施例1所繪示的elisa結(jié)果，分別闡述在取自野生型及dcr3轉(zhuǎn)基因小鼠的balf中，總細(xì)胞(圖2a)、巨噬細(xì)胞(圖2b)、嗜中性球(neutrophil，圖2c)、cd4+t細(xì)胞(圖2d)、cd8+t細(xì)胞(圖2e)、b細(xì)胞(圖2f)或nk細(xì)胞(圖2g)的細(xì)胞數(shù)量；

圖3a-3e是依據(jù)本揭示內(nèi)容實(shí)施例1所繪示的elisa結(jié)果，分別闡述在取自野生型及dcr3轉(zhuǎn)基因小鼠的balf中，腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-alpha，tnf-α，圖3a)、白介素-6(interleukin-6，il-6，圖3b)、il-1β(圖3c)、干擾素-α(interferon-alpha，ifn-α，圖3d)或單核球化學(xué)趨化蛋白-1(monocytechemoattractantprotein-1，mcp-1，圖3e)的表達(dá)；

圖4a-4b是依據(jù)本揭示內(nèi)容實(shí)施例1所繪示的折線圖，分別闡述野生型及dcr3轉(zhuǎn)基因小鼠的體重(圖4a)及存活百分比(圖4b)，其中是先以iav分別感染該些小鼠后，再連續(xù)監(jiān)測(cè)14天以了解其體重變化；以及

圖5a-5b依據(jù)本揭示內(nèi)容實(shí)施例2所繪示的折線圖，分別闡述野生型小鼠的體重(圖5a)及存活百分比(圖5b)，其中是先以iav分別感染該些小鼠后，分別投予igg1、dcr3.fc及hbd.fc進(jìn)行治療；感染后，連續(xù)監(jiān)測(cè)14天以了解其體重變化。

根據(jù)慣常的作業(yè)方式，圖中各種特征與組件并未依比例繪制，其繪制方式是為了以最佳的方式呈現(xiàn)與本發(fā)明相關(guān)的具體特征與組件。此外，在不同圖式間，以相同或相似的組件符號(hào)來(lái)指稱相似的組件/部件。

具體實(shí)施方式

為了使本揭示內(nèi)容的敘述更加詳盡與完備，下文針對(duì)了本發(fā)明的實(shí)施方式與具體實(shí)施例提出了說(shuō)明性的描述；但這并非實(shí)施或運(yùn)用本發(fā)明具體實(shí)施例的唯一形式。實(shí)施方式中涵蓋了多個(gè)具體實(shí)施例的特征以及用以建構(gòu)與操作這些具體實(shí)施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實(shí)施例來(lái)達(dá)成相同或均等的功能與步驟順序。

為便于讀者了解，本說(shuō)明書收集部分闡述于說(shuō)明書、實(shí)施例及權(quán)利要求范圍的詞匯。除非本說(shuō)明書另有定義，此處所用的科學(xué)與技術(shù)詞匯的含義與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文沖突的情形下，本說(shuō)明書所用的單數(shù)名詞涵蓋該名詞的復(fù)數(shù)型；而所用的復(fù)數(shù)名詞時(shí)亦涵蓋該名詞的單數(shù)型。具體來(lái)說(shuō)，除非另有所指，否則在本說(shuō)明書及權(quán)利要求范圍中，單數(shù)型的“一”包含其復(fù)數(shù)型。此外，在本說(shuō)明書及權(quán)利要求范圍中，“至少一”及“一或多”具有相同意義，且包含一、二、三或更多。

雖然用以界定本發(fā)明較廣范圍的數(shù)值范圍與參數(shù)皆是約略的數(shù)值，此處已盡可能精確地呈現(xiàn)具體實(shí)施例中的相關(guān)數(shù)值。然而，任何數(shù)值本質(zhì)上不可避免地含有因個(gè)別測(cè)試方法所致的標(biāo)準(zhǔn)偏差。在此處，“約”通常指實(shí)際數(shù)值在一特定數(shù)值或范圍的正負(fù)10％、5％、1％或0.5％之內(nèi)。或者是，“約”一詞代表實(shí)際數(shù)值落在平均值的可接受標(biāo)準(zhǔn)誤差之內(nèi)，視本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者的考慮而定。除了實(shí)驗(yàn)例之外，或除非另有明確的說(shuō)明，當(dāng)可理解此處所用的所有范圍、數(shù)量、數(shù)值與百分比(例如用以描述材料用量、時(shí)間長(zhǎng)短、溫度、操作條件、數(shù)量比例及其他相似者)均經(jīng)過(guò)“約”的修飾。因此，除非另有相反的說(shuō)明，本說(shuō)明書與附隨權(quán)利要求書所揭示的數(shù)值參數(shù)皆為約略的數(shù)值，且可視需求而更動(dòng)。至少應(yīng)將這些數(shù)值參數(shù)理解為所指出的有效位數(shù)與套用一般進(jìn)位法所得到的數(shù)值。在此處，將數(shù)值范圍表示成由一端點(diǎn)至另一段點(diǎn)或介于二端點(diǎn)之間；除非另有說(shuō)明，此處所述的數(shù)值范圍皆包含端點(diǎn)。

在本說(shuō)明書中，”肽”(peptide)一詞是指一至少具有二個(gè)氨基酸殘基的直鏈，其中該至少二個(gè)氨基酸殘基是以肽鍵(peptidebond)相互連接。組成肽的氨基酸可以是20種標(biāo)準(zhǔn)基因編碼氨基酸、其他自然產(chǎn)生的氨基酸、非自然產(chǎn)生的氨基酸或化學(xué)衍生的氨基酸，且可以以l形式的異構(gòu)物(isomer)或d形式的異構(gòu)物存在。在本揭示內(nèi)容中，肽可以包含2到300個(gè)氨基酸殘基；較佳是包含2到260個(gè)氨基酸殘基?？捎杀舅鶎兕I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的慣用技術(shù)來(lái)制得肽。舉例來(lái)說(shuō)，可以合成方式或經(jīng)酶切割自然或重組蛋白來(lái)制得肽。

“蛋白”(protein)及”多肽”(polypeptide)在本說(shuō)明書為可互換的詞匯，指一由一或多條肽所組成的生物分子，而不論其轉(zhuǎn)譯后的修飾。蛋白中的各肽可以是一個(gè)亞單元(subunit)。所述蛋白或多肽可以是自然或經(jīng)修飾的形式，且可以具有生物活性或特性。

“融合蛋白”(fusionprotein)一詞在本說(shuō)明書是指二蛋白或肽勝的組合，其可以共價(jià)交互作用、靜電交互作用、疏水性交互作用、親和鍵結(jié)等任一方式或形式連結(jié)，藉以維持蛋白/肽間的鍵結(jié)關(guān)系、防止在后續(xù)操作步驟中鍵結(jié)的斷裂，且大致上不會(huì)改變蛋白的結(jié)合特性。本發(fā)明較佳的融合蛋白是由重組基因編碼而成的肽，其中該重組基因包含二或多個(gè)不同基因的部分序列；相互連接的基因的編碼序列是位于同一閱讀框架中，即基因表達(dá)裝置(geneticapparatus)會(huì)將基因融合視為單一個(gè)基因。此類型的融合蛋白亦稱為雜合蛋白(hybridprotein)或嵌合蛋白(chimericprotein)。

“fc區(qū)域”(fcregion)及“可結(jié)晶區(qū)域片段”(fragmentcrystallizableregion)在本說(shuō)明書為可互換的詞匯，指一免疫球蛋白(immunoglobulin，例如igg1、igg2、igg3或igg4)重鏈的c端區(qū)域，包含自然序列fc區(qū)域及變異fc區(qū)域。即使一免疫球蛋白重鏈的fc區(qū)域的邊界可能不盡相同，人類igg重鏈fc區(qū)域常是指由cys226位置或pro230位置的氨基酸殘基延伸至其c端的片段。fc區(qū)域可以包含絞鏈區(qū)域(hingeregion，例如自然或經(jīng)修飾的絞鏈區(qū)域)的任何部分。fc可以源自任一種包含人類的哺乳動(dòng)物，且可經(jīng)轉(zhuǎn)譯后修飾(例如糖化)。在一非限定的實(shí)施例中，fc區(qū)域是人類igg1的區(qū)域，且具有seqidno：7的氨基酸序列。

本所屬領(lǐng)域技術(shù)人員當(dāng)可了解”發(fā)炎”(inflammation)一詞包含任何由感染引發(fā)的局部保護(hù)反應(yīng)所造成的癥狀，通常具有明顯的熱、腫、痛、紅、血管擴(kuò)張、血流增加、白血球浸潤(rùn)感染部位、功能受損及/或任何已知與發(fā)炎癥狀相關(guān)的病征。在本說(shuō)明書及權(quán)利要求書中，”發(fā)炎”(inflammation)一詞是指促發(fā)炎介質(zhì)(例如細(xì)胞、細(xì)胞激素及趨化激素)于個(gè)體組織及/或器官(例如肺臟)中的累積、增加及/或誘發(fā)。

“有效量”(effectiveamount)一詞在此是指一種足以產(chǎn)生一期望治療反應(yīng)的成份的使用量。一有效量亦指一種化合物或組合物，其治療利益效果超越其毒性或有害影響。具體的有效量取決于多種因素，如所欲治療的特定狀況、患者的生理?xiàng)l件(如，患者體重、年齡或性別)、接受治療的哺乳動(dòng)物或動(dòng)物種類、治療持續(xù)時(shí)間、目前療法(如果有的話)的本質(zhì)以及所用的具體配方。舉例來(lái)說(shuō)，可將有效量表示成藥物的總重量(譬如以克、毫克或微克為單位)或表示成藥物重量與體重的比例(其單位為毫克/公斤(mg/kg))。亦或是，有效量可以醫(yī)藥組合物中活性成份的濃度來(lái)表示，例如摩爾濃度(molarconcentration)、重量濃度(massconcentration)、體積濃度(volumeconcentration)、重量摩爾濃度(molality)、摩爾分率(molefraction)、重量分率(massfraction)及混合比例(mixingratio)。具體來(lái)說(shuō)，“治療有效量”(therapeuticallyeffectiveamount)一詞在本說(shuō)明書是指足以減緩個(gè)體體內(nèi)與iav感染相關(guān)的癥狀的融合蛋白劑量。本領(lǐng)域技術(shù)人員可依據(jù)美國(guó)食品藥物管理局(usfoodanddrugadministration,fda)所公告的“估算成人健康志愿者在初始臨床治療測(cè)式的最大安全起始劑量”(estimatingthemaximumsafestartingdoseininitialclinicaltrialsfortherapeuticsinadulthealthyvolunteers)來(lái)估算人體使用的最高安全劑量。

“個(gè)體”(subject)一詞是指包含人類的動(dòng)物，其是依據(jù)本揭示內(nèi)容的方法，能接受本揭示內(nèi)容的融合蛋白的治療。除非特定指出，否則“個(gè)體”(subject)一詞同時(shí)意指男性及女性。

有鑒于iav感染會(huì)造成嚴(yán)重的組織損傷，進(jìn)而威脅人類健康，本揭示內(nèi)容的主旨為提供一種可保護(hù)人類免于罹患與iav感染相關(guān)的病狀的方法。

據(jù)此，本揭示內(nèi)容的第一方面是關(guān)于一種可在一個(gè)體體內(nèi)治療或預(yù)防a型流感病毒感染的方法。該方法包含對(duì)該個(gè)體投予一治療有效量的融合蛋白，其包含一功能性肽及一人類igg1fc區(qū)域。依據(jù)本揭示內(nèi)容某些實(shí)施方式，該功能性肽是人類dcr3蛋白的硫酸肝素蛋白多糖結(jié)合域(heparinsulfateproteoglycanbindingdomain,hbd)肽。為制備該種包含hbd肽及人類igg1fc區(qū)域的融合蛋白(以下標(biāo)記為hbd.fc)，將用以編碼hbd肽的seqidno：1的多核苷酸以同閱讀框架方式(inframe)建構(gòu)于表達(dá)載體中用以編碼人類igg1fc區(qū)域的seqidno：3的多核苷酸的5’端。當(dāng)可想見，該表達(dá)載體可以是任何適用于表達(dá)外源性基因的表達(dá)載體；舉例來(lái)說(shuō)，該載體可以是pcdna3或pbacpak9。在本揭示內(nèi)容一實(shí)施方式中，用以表達(dá)融合蛋白hbd.fc的表達(dá)載體是pcdna3，可將其轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞以表達(dá)融合蛋白。依據(jù)實(shí)驗(yàn)室常用的表達(dá)系統(tǒng)，該哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是freestyle293-f細(xì)胞。制得的融合蛋白hbd.fc因此包含一hbd肽及一人類igg1fc區(qū)域，其分別具有seqidno：4及7的氨基酸序列。

依據(jù)本揭示內(nèi)容其他實(shí)施方式，該融合蛋白包含一人類dcr3蛋白及一人類igg1fc區(qū)域(以下標(biāo)記為dcr3.fc)。與上述建構(gòu)步驟相似，將用以編碼dcr3蛋白的seqidno：2的多核苷酸以同閱讀框架方式(inframe)建構(gòu)于表達(dá)載體中用以編號(hào)人類igg1fc區(qū)域的seqidno：3的多核苷酸的5’端。如同上述，表達(dá)載體可以是任何適用于表達(dá)外源性基因的表達(dá)載體。在本揭示內(nèi)容一實(shí)施例中，用以表達(dá)融合蛋白dcr3.fc的表達(dá)載體是pbacpak9，可將其轉(zhuǎn)染至昆蟲細(xì)胞以表達(dá)融合蛋白。例示性的適合表達(dá)外源性基因的昆蟲細(xì)胞包含，但不限于，sf9、sf21及high-five細(xì)胞。依據(jù)一特定實(shí)施例，該昆蟲細(xì)胞是sf21細(xì)胞。制得的融合蛋白dcr3.fc因此包含彼此相互連結(jié)的dcr3蛋白及人類igg1fc區(qū)域；更具體來(lái)說(shuō)，該人類igg1fc區(qū)域具有seqidno：7的氨基酸序列，而該dcr3蛋白包含一由seqidno：5所組成的n端肽、一由seqidno：4所組成的hbd肽，以及一由seqidno：6所組成的c端肽，其中該n端及c端肽是分別位于及連接于由seqidno：4所組成的肽的上游及下游。

如同上述，iav感染會(huì)造成嚴(yán)重的組織損傷，包含因大量白血球浸潤(rùn)所造成的肺部損傷，且通常伴隨著發(fā)炎細(xì)胞激素的高量表達(dá)。因此，本揭示內(nèi)容的第二方面是關(guān)于一種用以減緩一有需要個(gè)體的肺部損傷的方法；具體來(lái)說(shuō)，該肺部損傷是由與iav感染相關(guān)的過(guò)量發(fā)炎反應(yīng)所導(dǎo)致。該方法包含對(duì)該個(gè)體投予一治療有效量的融合蛋白。在一實(shí)施例中，該融合蛋白是hbd.fc，其包含彼此相互連結(jié)的一由seqidno：4所組成的hbd肽，及一由seqidno：7所組成的人類igg1fc區(qū)域。在另一實(shí)施例中，該融合蛋白是dcr3.fc，其包含彼此相互連結(jié)的一dcr3蛋白及一人類igg1fc區(qū)域；該人類igg1fc區(qū)域具有seqidno：7的氨基酸序列，而該dcr3蛋白則包含一由seqidno：5所組成的n端肽、一由seqidno：4所組成的hbd肽，以及一由seqidno：6所組成的c端肽，其中該n端及c端肽是分別位于及連接于由seqidno：4所組成的肽的上游及下游。

依據(jù)本揭示內(nèi)容一實(shí)施方式，本發(fā)明方法可用以治療或預(yù)防iav感染及/或與iav感染相關(guān)的病征(例如肺部損傷)，其中該iav可以是h1n1、h2n2、h3n2、h5n1、h7n7、h1n2、h9n2、h7n2、h7n3、h10n7或h7n9。在一較佳的實(shí)施例中，該iav是h1n1。

依據(jù)本揭示內(nèi)容的實(shí)施方式，本揭示內(nèi)容的融合蛋白的治療有效量每劑約為每公斤體重0.5到5毫克。舉例來(lái)說(shuō)，該劑量可以是每公斤個(gè)體體重0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0毫克。在一較佳實(shí)施例中，本揭示內(nèi)容的融合蛋白的治療有效量每劑約為每公斤個(gè)體體重0.8到1毫克。為對(duì)個(gè)體產(chǎn)生一治療功效，融合蛋白在一完整療程中的總投予劑量約為每公斤個(gè)體體重1到10毫克；較佳的情況是，總投予劑量約為每公斤個(gè)體體重1.6到2毫克。

在本揭示內(nèi)容的方法中，融合蛋白可由口服、腸內(nèi)、鼻腔、局部、穿透黏膜或非口服方式投予至該個(gè)體，其中非口服方式可以是肌肉注射、靜脈注射或腹腔注射。在本揭示內(nèi)容一特定實(shí)施方式中，是將融合蛋白以靜脈注射方式投予至個(gè)體。

下文提出多個(gè)實(shí)驗(yàn)例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的某些方面，以利本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者實(shí)施本發(fā)明，且不應(yīng)將這些實(shí)驗(yàn)例視為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。據(jù)信本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀了此處提出的說(shuō)明后，可在不需過(guò)度解讀的情形下，完整利用并實(shí)踐本發(fā)明。此處所引用的所有公開文獻(xiàn)，其全文皆視為本說(shuō)明書的一部分。

實(shí)施例

材料及方法

細(xì)胞培養(yǎng)

將購(gòu)買自invitrogen.inc的freestyle293-f細(xì)胞培養(yǎng)于freestyle293表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)液(freestyle293expressionmedium,invitrogen)中，并置于包含8％co2潮濕環(huán)境的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱、轉(zhuǎn)速為135rpm的軌道式搖動(dòng)器(orbitalshaker)平臺(tái)上培養(yǎng)。將sf21細(xì)胞培養(yǎng)于包含10％經(jīng)熱去活化的胎牛血清(fetalbovineserum,fbs)的tnm-fh細(xì)胞培養(yǎng)液中，并放置于37℃、5％co2的環(huán)境中生長(zhǎng)。

動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)是使用8到12周大的野生型c57bl/6(nlac)小鼠及dcr3轉(zhuǎn)基因小鼠(自行飼育且具有c57bl/6的背景)。dcr3轉(zhuǎn)基因小鼠會(huì)持續(xù)表達(dá)dcr3，且可以血清e(cuò)lisa確認(rèn)其表達(dá)量。依據(jù)tai等人所述的方法(“decoyreceptor3enhancestumorprogressionviainductionoftumor-associatedmacrophages”,journalofimmunology2012,188,p2464-2471)取得dcr3轉(zhuǎn)基因小鼠。所有的動(dòng)物皆飼養(yǎng)于國(guó)立陽(yáng)明大學(xué)動(dòng)物中心。本研究所有的實(shí)驗(yàn)流程皆是在國(guó)立陽(yáng)明大學(xué)動(dòng)物飼育及福利委員會(huì)(institutionalanimalcareandwelfarecommittee)許可下進(jìn)行。

載體建構(gòu)

為建構(gòu)用以表達(dá)融合蛋白dcr3.fc的質(zhì)粒pbacpak9-dcr3.fc，先利用seqidno：8的正向引物及seqidno：9的反向引物以rt-pcr方式分離人類dcr3基因的開放閱讀框架(openreadingframe)。將放大的產(chǎn)物以同閱讀框架方式建構(gòu)于包含人類igg1fc的cdna且經(jīng)ecori切割的puc19-igg1-fc載體中。之后再將融合基因次轉(zhuǎn)殖至pbacpak9載體(clontechlaboratories,paloalto,ca)以產(chǎn)生質(zhì)粒pbacpak9-dcr3.fc。在建構(gòu)用以表達(dá)融合蛋白hbd.fc(對(duì)應(yīng)于dcr3的gag結(jié)合模塊(motif))的質(zhì)粒pcdna3-hbd.fc時(shí)，先將seqidno：10及11的互補(bǔ)寡核苷酸結(jié)合以產(chǎn)生一dsdna片段，再利用t4多核苷酸激酶(newenglandbiolabs)對(duì)5-羥基末端進(jìn)行磷酸化反應(yīng)。將磷酸化后的dna片段次轉(zhuǎn)殖至經(jīng)hincii切割的pbluescriptiiks，再以hindiii進(jìn)行切割，之后以同閱讀框架方式建構(gòu)至經(jīng)hindiii切割的pflag-cmv1(sigma-aldrich)中。以pcr放大具有flag標(biāo)記的dcr3_hbd，再將放大片段以同閱讀框架方式與pcdna3的higg1的fc部分連結(jié)，以制得質(zhì)粒pcdna3-hbd.fc。

制備融合蛋白

為制備融合蛋白dcr3.fc，將質(zhì)粒pbacpak9-dcr3.fc與直鏈bacpak6dna(clontechlaboratories)轉(zhuǎn)染至sf21細(xì)胞中以產(chǎn)生重組病毒，其包含dcr3及人類igg1fc區(qū)域的基因，且可于sf21細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制。利用該重組病毒感染sf21細(xì)胞，在病毒復(fù)制的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的融合蛋白。由經(jīng)病毒感染的sf21細(xì)胞的上清液收集融合蛋白，再以蛋白-a瓊脂糖磁珠(protein-asepharosebead,amershambiosciences)進(jìn)行純化，并利用0.1m甘胺酸緩沖液(ph3.0)沖提后，以生理食鹽水進(jìn)行透析。

在制備融合蛋白hbd.fc時(shí)，是依據(jù)使用操作指示將質(zhì)粒pcdna3-hbd.fc轉(zhuǎn)染至freestyle293-f細(xì)胞中。收集經(jīng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液，與蛋白-a瓊脂糖磁珠作用反應(yīng)，以0.1m甘胺酸緩沖液(ph3.0)沖提結(jié)合的蛋白，再以生理食鹽水進(jìn)行透析。

以iav感染小鼠

用以感染小鼠的iav(a/puertorico/8/34,h1n1；pr/8)是依標(biāo)準(zhǔn)流程培養(yǎng)于madin-darby犬腎臟細(xì)胞(madin-darbycaninekidneycell,mdck,ccl-34^tm)。將經(jīng)感染的細(xì)胞的上清液儲(chǔ)存于-80℃，利用于mdck細(xì)胞進(jìn)行的病毒斑試驗(yàn)(plaqueassay)來(lái)檢測(cè)病毒的效價(jià)(titer)。

在以鼻腔吸入方式投予10⁴pfu(溶于20微升的生理食鹽水)前，先以腹腔注射方式投予小鼠戊巴比妥鈉(sodiumpentobarbital)。感染4天后，以聚乙烯管插入氣管，再以總體積為3毫升的生理食鹽水沖洗3次。約可回收2.5毫升的沖洗液；離心后，利用血球計(jì)數(shù)器計(jì)算回收液中的細(xì)胞數(shù)量，或是以elisa分析上清液中細(xì)胞激素的表達(dá)量。以眼后采血(retroorbitalbleeding)收集周邊血后，取得小鼠的血清，同時(shí)摘取經(jīng)犠牲的小鼠的肺臟組織，先以10％甲醛固定后，以石蠟包埋組織，再以5毫米的厚度進(jìn)行切片，利用抗-dcr3抗體(3h5)進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。為測(cè)定融合蛋白的保護(hù)功效，使野生型c57bl/6小鼠(10-12周大)鼻腔吸入iav(5×10³pfu)后，于第0天及第3天分別以尾靜脈注入方式投予igg1(每只小鼠20微克)、dcr3.fc(每只小鼠20微克)或hbd.fc(每只小鼠20微克)。每天或至少每二天監(jiān)測(cè)一次小鼠的體重變化及其存活狀況。

以elisa測(cè)量細(xì)胞激素的表達(dá)量

依據(jù)使用操作指示，利用elisa套組(r&dsystems)來(lái)分別測(cè)量小鼠血清及balf中，dcr3、tnf-α、il-1β、il-6、ifn-α及mcp-1的含量。在進(jìn)行elisa分析前，所有的樣品皆儲(chǔ)存于-80℃的環(huán)境中。

流式細(xì)胞儀分析

以與熒光接合的抗體(bdbiosciences)對(duì)取自balf的細(xì)胞進(jìn)行染色?？贵w分別為：與別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin)接合的抗-小鼠f4/80、cd8及nk1.1抗體；與fitc接合的抗-小鼠cd4、b220及gr1抗體。利用facscalibur^tm流式細(xì)胞儀(bdbiosciences)來(lái)分析染色的細(xì)胞，再以cellquest^tm軟件(bectondickinson)分析結(jié)果。

統(tǒng)計(jì)分析

以平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)偏差(standarderrorofmean,s.e.m.)來(lái)表示各實(shí)驗(yàn)數(shù)值。以prism軟件包(graphpadversion5.00)的studentttest分析所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果；若雙尾(2-tailed)p值<.05，則代表具有統(tǒng)計(jì)差異。

實(shí)施例1dcr3轉(zhuǎn)基因小鼠可抑制由iav所引發(fā)的發(fā)炎反應(yīng)

本實(shí)施例是利用由cd68啟動(dòng)子趨動(dòng)的dcr3轉(zhuǎn)基因(dcr3-tg)小鼠來(lái)評(píng)估dcr3蛋白對(duì)iav感染及與iav感染相關(guān)的病征的保護(hù)功效；野生型(wild-type,wt)小鼠的基因組由于不包含dcr3基因，因此在本實(shí)驗(yàn)是作為對(duì)照組。分別對(duì)二組小鼠以鼻腔吸入的方式投予iav；之后，持續(xù)監(jiān)測(cè)支氣管肺泡沖洗液(bronchoalveolarlavagefluid,balf)中細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量及細(xì)胞激素的表達(dá)量，直到感染后第7天。圖1到圖4分別闡述該些實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

如圖1a所示，不論是對(duì)照感染(mock-infected)或是以iav感染的野生型小鼠(圖1a分別標(biāo)記為野生型/對(duì)照組及野生型/pr/8)皆不會(huì)表達(dá)dcr3蛋白。相較之下，可在dcr3轉(zhuǎn)基因小鼠的肺部骨髓細(xì)胞(pulmonarymyeloidcell)、血清及balf中偵測(cè)到dcr3的表達(dá)；且iav感染會(huì)進(jìn)一步增加其表達(dá)量(圖1a-1c)。在感染后第4天(day4postinfection,4dpi)可觀察到浸潤(rùn)至肺部的總細(xì)胞(圖2a)及gr1中f4/80⁺(gr1^intf4/80⁺)巨噬細(xì)胞(圖2b)數(shù)量會(huì)顯著減少，該些細(xì)胞會(huì)在感染后7天回復(fù)到與野生型小鼠相當(dāng)?shù)臄?shù)量；而浸潤(rùn)至肺部的嗜中性球(neutrophil，圖2c)、cd4⁺t細(xì)胞(圖2d)、cd8⁺t細(xì)胞(圖2e)、b細(xì)胞(圖2f)或nk細(xì)胞(圖2g)數(shù)量則與對(duì)照組小鼠的浸潤(rùn)數(shù)量相當(dāng)。此外，于感染后第4天亦可觀察到tnf-α(圖3a)、il-6(圖3b)、il-1β(圖3c)、ifn-α(圖3d)及mcp-1(圖3e)的分泌量會(huì)顯著下降。相較于野生型小鼠，dcr3轉(zhuǎn)基因小鼠自感染后第8天起體重會(huì)較為快速地復(fù)原(圖4a)。此外，dcr3轉(zhuǎn)基因小鼠的存活百分比亦高于野生型小鼠的存活百分比(50％與22％，p＝.042，圖4b)。

該些結(jié)果指出，dcr3可有效抑制由iav所引發(fā)的發(fā)炎反應(yīng)，例如發(fā)炎細(xì)胞激素的分泌及發(fā)炎細(xì)胞(特別是巨噬細(xì)胞)浸潤(rùn)至肺臟組織；據(jù)此，dcr3可提供有效的保護(hù)，使個(gè)體免于罹患由iav造成的會(huì)危及生命的病狀。

實(shí)施例2以dcr3融合蛋白抑制由iav所引發(fā)的發(fā)炎反應(yīng)

為進(jìn)一步了解dcr3于對(duì)抗iav感染時(shí)的保護(hù)功效，以鼻腔吸入方式對(duì)野生型小鼠投予iav，并于第0天及第3天以靜脈注射方式分別投予igg1、dcr3.fc或hbd.fc，其中igg1是作為對(duì)照組。如圖5a所示，投予igg1的小鼠的體重減少趨勢(shì)會(huì)與圖4a所述的野生型小鼠相同。相較之下，遭受iav感染后，投予融合蛋白dcr3.fc或hbd.fc的小鼠的體重則會(huì)較為穩(wěn)定(圖5a)。此外，投予dcr3.fc或hbd.fc的小鼠亦較投予igg1的小鼠擁有較高的存活時(shí)間(100％與62.5％，p＝.0277，圖5b)。

該些結(jié)果指出融合蛋白dcr3.fc或hbd.fc可減緩與iav感染相關(guān)的病征，并保護(hù)個(gè)體免于遭受iav感染。

總結(jié)上述，本揭示內(nèi)容提供了一種藉由抑制iav引發(fā)的發(fā)炎反應(yīng)來(lái)治療或預(yù)防iav感染的方法，其中該發(fā)炎反應(yīng)往往會(huì)危害個(gè)體的健康，甚至性命。本揭示內(nèi)容的dcr3.fc及hbd.fc皆可抑制iav引發(fā)的肺部發(fā)炎反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)遭受iav感染的個(gè)體提供治療及/或保護(hù)的功效。

雖然上文實(shí)施方式中揭露了本發(fā)明的具體實(shí)施例，然其并非用以限定本發(fā)明，本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者，在不悖離本發(fā)明的原理與精神的情形下，當(dāng)可對(duì)其進(jìn)行各種更動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)以附隨權(quán)利要求書所界定者為準(zhǔn)。

序列表

<110>中央研究院

<120>一種治療a型流感病毒感染的方法

<130>p2847-pct

<160>11

<170>bissap1.3

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>hbd多核苷酸

<400>1

ctgaagctgcgtcggcggctc21

<210>2

<211>900

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>dcr3多核苷酸

<400>2

atgagggcgctggaggggccaggcctgtcgctgctgtgcctggtgttggcgctgcctgcc60

ctgctgccggtgccggctgtacgcggagtggcagaaacacccacctacccctggcgggac120

gcagagacaggggagcggctggtgtgcgcccagtgccccccaggcacctttgtgcagcgg180

ccgtgccgccgagacagccccacgacgtgtggcccgtgtccaccgcgccactacacgcag240

ttctggaactacctggagcgctgccgctactgcaacgtcctctgcggggagcgtgaggag300

gaggcacgggcttgccacgccacccacaaccgtgcctgccgctgccgcaccggcttcttc360

gcgcacgctggtttctgcttggagcacgcatcgtgtccacctggtgccggcgtgattgcc420

ccgggcacccccagccagaacacgcagtgccagccgtgccccccaggcaccttctcagcc480

agcagctccagctcagagcagtgccagccccaccgcaactgcacggccctgggcctggcc540

ctcaatgtgccaggctcttcctcccatgacaccctgtgcaccagctgcactggcttcccc600

ctcagcaccagggtaccaggagctgaggagtgtgagcgtgccgtcatcgactttgtggct660

ttccaggacatctccatcaagaggctgcagcggctgctgcaggccctcgaggccccggag720

ggctggggtccgacaccaagggcgggccgcgcggccttgcagctgaagctgcgtcggcgg780

ctcacggagctcctgggggcgcaggacggggcgctgctggtgcggctgctgcaggcgctg840

cgcgtggccaggatgcccgggctggagcggagcgtccgtgagcgcttcctccctgtgcac900

<210>3

<211>684

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>higg1.fc多核苷酸

<400>3

gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacccgaactcctggggggaccgtcagtc60

ttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcaca120

tgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac180

ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtac240

cgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaag300

tgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaa360

gggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaag420

aaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag480

tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactcc540

gacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcagggg600

aacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagc660

ctctccctgtctccgggtaaatag684

<210>4

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>hbd肽

<400>4

leulysleuargargargleu

15

<210>5

<211>254

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>dcr3-hbd肽

<400>5

metargalaleugluglyproglyleuserleuleucysleuvalleu

151015

alaleuproalaleuleuprovalproalavalargglyvalalaglu

202530

thrprothrtyrprotrpargaspalagluthrglygluargleuval

354045

cysalaglncysproproglythrphevalglnargprocysargarg

505560

aspserprothrthrcysglyprocysproproarghistyrthrgln

65707580

phetrpasntyrleugluargcysargtyrcysasnvalleucysgly

859095

gluargglugluglualaargalacyshisalathrhisasnargala

100105110

cysargcysargthrglyphephealahisalaglyphecysleuglu

115120125

hisalasercysproproglyalaglyvalilealaproglythrpro

130135140

serglnasnthrglncysglnprocysproproglythrpheserala

145150155160

sersersersersergluglncysglnprohisargasncysthrala

165170175

leuglyleualaleuasnvalproglyserserserhisaspthrleu

180185190

cysthrsercysthrglypheproleuserthrargvalproglyala

195200205

gluglucysgluargalavalileaspphevalalapheglnaspile

210215220

serilelysargleuglnargleuleuglnalaleuglualaproglu

225230235240

glytrpglyprothrproargalaglyargalaalaleugln

245250

<210>6

<211>39

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>hbd-higg1.fc肽

<400>6

thrgluleuleuglyalaglnaspglyalaleuleuvalargleuleu

151015

glnalaleuargvalalaargmetproglyleugluargservalarg

202530

gluargpheleuprovalhis

35

<210>7

<211>227

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>higg1.fc肽

<400>7

asplysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleugly

151015

glyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumet

202530

ileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhis

354045

gluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluval

505560

hisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyr

65707580

argvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasngly

859095

lysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproile

100105110

glulysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnval

115120125

tyrthrleuproproserargaspgluleuthrlysasnglnvalser

130135140

leuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglu

145150155160

trpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrpropro

165170175

valleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrval

180185190

asplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmet

195200205

hisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuser

210215220

proglylys

225

<210>8

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>dcr3正向引物

<400>8

ggaattcaaggaccatgagggcgctg26

<210>9

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>dcr3反向引物

<400>9

ggaattcgtgcacagggaggaagcgc26

<210>10

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>互補(bǔ)序列-1

<400>10

aagcttgggctgaagctgcgtcggcggctcgggaagctt39

<210>11

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>互補(bǔ)序列-2

<400>11

aagcttcccgagccgccgacgcagcttcagcccaagctt39