本發(fā)明涉及依次包含啟動(dòng)子dna、編碼分泌信號(hào)肽的dna、編碼連接肽的dna、編碼異源多肽的dna、終止子dna的在雙歧桿菌屬細(xì)菌內(nèi)表達(dá)的表達(dá)盒。此外,本發(fā)明涉及包含上述表達(dá)盒的載體、通過該載體被轉(zhuǎn)化的雙歧桿菌屬細(xì)菌、包含該細(xì)菌的藥物組合物等。
背景技術(shù):
:近年來(lái),針對(duì)癌等疾病,采用基因運(yùn)輸載體的治療方法的開發(fā)取得了進(jìn)展。例如,針對(duì)腸道厭氧菌,有提出例如一種轉(zhuǎn)化微生物,其利用全身投藥后,會(huì)在低氧的實(shí)體瘤中蓄積的性質(zhì),能夠在目標(biāo)患處表達(dá)一種基因,所述基因表達(dá)具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì),或具有將抗腫瘤物質(zhì)前體轉(zhuǎn)換為抗腫瘤物質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)(例如,參照專利文獻(xiàn)1)。另外,有提出包含啟動(dòng)子、編碼信號(hào)序列的dna、編碼多肽的dna、或用于插入該dna的克隆位點(diǎn)的表達(dá)盒(例如,參照專利文獻(xiàn)2);在可表達(dá)的狀態(tài)下包含編碼含有信號(hào)肽、單鏈抗體及1個(gè)或2個(gè)以上的異源多肽的融合蛋白的核酸的重組專性厭氧革蘭氏陽(yáng)性菌(例如,參照專利文獻(xiàn)3)。但是,上述文獻(xiàn)中提出的信號(hào)肽是在膜蛋白或分泌蛋白中發(fā)現(xiàn)的信號(hào)肽,期待確定一種分泌效率更優(yōu)異的信號(hào)肽?,F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)【專利文獻(xiàn)1】國(guó)際公開wo2006/109619號(hào)小冊(cè)子【專利文獻(xiàn)2】國(guó)際公開wo2010/126073號(hào)小冊(cè)子【專利文獻(xiàn)3】國(guó)際公開wo2014/010758號(hào)小冊(cè)子技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:發(fā)明要解決的問題本發(fā)明的課題是,提供:在通過雙歧桿菌屬細(xì)菌的異源多肽的產(chǎn)生中,能夠?qū)⒃摦愒炊嚯母咝Х置诘骄w外的信號(hào)肽、能夠利用該信號(hào)肽將異源多肽有效分泌到菌體外的異源多肽的表達(dá)盒、重組有該表達(dá)盒的異源多肽表達(dá)載體、通過該異源多肽表達(dá)載體被轉(zhuǎn)化而能夠分泌異源多肽的雙歧桿菌屬細(xì)菌。用于解決問題的方案本發(fā)明人已經(jīng)在開發(fā)一種使用在實(shí)體瘤中特異地累積、生長(zhǎng)的雙歧桿菌屬細(xì)菌的抗癌療法,所述雙歧桿菌屬細(xì)菌是通過使用重組有將5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)換為具有抗腫瘤活性的5-氟尿嘧啶的酶、即胞嘧啶·脫氨酶基因的載體而被轉(zhuǎn)化的。此次,本發(fā)明人基于通過用雙歧桿菌屬細(xì)菌使特異地識(shí)別靶細(xì)胞的抗體肽與異源多肽局部地表達(dá)·分泌、從而能夠治療各種疾病的認(rèn)識(shí),嘗試去確定一種能夠比可以適用于雙歧桿菌屬細(xì)菌的現(xiàn)有公知的分泌信號(hào)肽更有效地表達(dá)·分泌異源多肽的分泌信號(hào)肽。結(jié)果,發(fā)現(xiàn)了以命名為sp7的分泌信號(hào)肽為代表的多個(gè)分泌信號(hào)肽。并且確認(rèn)了,使用插入了依次包含在雙歧桿菌屬細(xì)菌中發(fā)揮作用的啟動(dòng)子dna、和編碼上述分泌信號(hào)肽的dna、和編碼連接肽的dna、和編碼具有抗腫瘤活性的單鏈抗體(singlechainfragmentvariableantibody:scfvantibody)的dna、和在雙歧桿菌屬細(xì)菌中發(fā)揮作用的終止子dna的表達(dá)盒的載體而轉(zhuǎn)化的長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)有效地將單鏈抗體分泌到菌體外。進(jìn)一步地,確認(rèn)了該分泌到菌體外的單鏈抗體,由于上述分泌信號(hào)肽序列的種類、與其下游的連接肽序列的氨基酸數(shù)的不同,在向菌體外的分泌量、被分泌的單鏈抗體的與抗原的結(jié)合能力、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制活性能力方面會(huì)出現(xiàn)差異,從而完成了本發(fā)明。即,本發(fā)明如下所述。[1]一種在雙歧桿菌屬細(xì)菌內(nèi)表達(dá)的表達(dá)盒,其特征在于,依次包含下述(1)~(4)的dna,(1)在雙歧桿菌屬細(xì)菌中發(fā)揮作用的啟動(dòng)子dna;(2)編碼由下述a)或b)所示的氨基酸序列組成的分泌信號(hào)肽的dna;a)序列號(hào)6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、和16的任意一個(gè)所示的氨基酸序列;b)序列號(hào)6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、和16的任意一個(gè)所示的氨基酸序列中缺失、替換或附加1或數(shù)個(gè)氨基酸的氨基酸序列,且由該氨基酸序列組成的肽在雙歧桿菌屬細(xì)菌中作為分泌信號(hào)肽發(fā)揮作用的氨基酸序列;(3)編碼異源多肽的dna;(4)在雙歧桿菌屬細(xì)菌中發(fā)揮作用的終止子dna。[2]根據(jù)上述[1]所述的表達(dá)盒,其特征在于,在編碼分泌信號(hào)肽的dna的下游連接有編碼連接肽的dna。[3]根據(jù)上述[2]所述的表達(dá)盒,其特征在于,連接肽由自序列號(hào)25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、和35的任意一個(gè)所示的氨基酸序列的c末端缺失0~29個(gè)氨基酸殘基的各氨基酸序列組成。[4]根據(jù)上述[2]所述的表達(dá)盒,其特征在于,連接肽由自序列號(hào)25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、和35的任意一個(gè)所示的氨基酸序列的c末端缺失10~29個(gè)氨基酸殘基的各氨基酸序列組成。[5]根據(jù)上述上述[1]~[4]的任一項(xiàng)所述的表達(dá)盒,其特征在于,異源多肽是單鏈抗體[6]根據(jù)上述[5]所述的表達(dá)盒,其特征在于,單鏈抗體是抗pd-1抗體。[7]根據(jù)上述[5]所述的表達(dá)盒,其特征在于,單鏈抗體是抗ctla-4抗體。[8]一種載體,其包含上述[1]~[7]的任一項(xiàng)所述的表達(dá)盒。[9]一種雙歧桿菌屬細(xì)菌,其通過上述[8]所述的載體被轉(zhuǎn)化。[10]根據(jù)上述[9]所述的雙歧桿菌屬細(xì)菌,其為長(zhǎng)雙歧桿菌。[11]一種藥物組合物,其包含上述[9]或[10]所述的雙歧桿菌屬細(xì)菌。[12]一種由序列號(hào)6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、和16的任意一個(gè)所示的氨基酸序列組成的分泌信號(hào)肽。[13]一種編碼上述[12]所述的分泌信號(hào)肽的dna。[14]一種分泌信號(hào)肽-接頭連接體,其由自序列號(hào)105、106、107、108、109、110、111、112、113、114和115的任意一個(gè)所示的氨基酸序列的c末端缺失0~29個(gè)氨基酸殘基的各氨基酸序列組成。[15]根據(jù)上述[14]所述的分泌信號(hào)肽-接頭連接體,其特征在于,其由自序列號(hào)105、106、107、108、109、110、111、112、113、114和115的任意一個(gè)所示的氨基酸序列的c末端缺失10~29個(gè)氨基酸殘基的各氨基酸序列組成。[16]一種編碼上述[14]或[15]所述的分泌信號(hào)肽-接頭連接體的dna。作為其他的實(shí)施方式,還可以列舉出,以向?qū)ο笫┯蒙鲜鯷9]或[10]所述的雙歧桿菌屬細(xì)菌的有效量為特征的治療方法;上述[9]或[10]所述的雙歧桿菌屬細(xì)菌用于制備治療藥的用途;用于疾病的治療的上述[9]或[10]所述的雙歧桿菌屬細(xì)菌;等等。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明,通過利用在異源多肽的分泌方面優(yōu)異的表達(dá)盒,能夠提供可以將異源多肽有效分泌到菌體外的雙歧桿菌屬細(xì)菌,上述異源多肽為pd-1、ctla-4等具有抗癌作用的抗體時(shí),該雙歧桿菌屬細(xì)菌作為抗癌劑是非常有用的。附圖說明【圖1】本發(fā)明的表達(dá)盒的略圖。(a)表示使用抗pd-1抗體作為單鏈抗體的情況,(b)表示使用抗ctla-4抗體作為單鏈抗體的情況?!緢D2】顯示抗pd-1或抗ctla-4單鏈抗體分泌質(zhì)粒:phusp3l22-scfv-pd-1-1、phusp7l20-scfv-pd-1-1、phusp23l27-scfv-pd-1-1、phusp7l20-scfv-pd-1-2、phusp7l20-scfv-pd-1-3、phusp7l20-scfv-ctla-4-1、phusp7l20-scfv-ctla-4-2的制作概要的圖?!緢D3】顯示使用各種信號(hào)肽-接頭連接體時(shí)的抗pd-1-1單鏈抗體分泌質(zhì)粒的制作概要的圖。【圖4】顯示被分泌在使用插入有包含各種信號(hào)肽-連接肽連接體和抗pd-1-1單鏈抗體的表達(dá)盒的載體而轉(zhuǎn)化的雙歧桿菌屬細(xì)菌培養(yǎng)上清中的抗pd-1-1單鏈抗體的蛋白質(zhì)印跡分析的結(jié)果的圖?!緢D5】顯示被分泌在使用插入有包含各種信號(hào)序列和抗pd-1-1單鏈抗體的表達(dá)盒的載體而轉(zhuǎn)化的雙歧桿菌屬細(xì)菌培養(yǎng)上清中的抗pd-1-1單鏈抗體的蛋白質(zhì)印跡分析的結(jié)果的圖。【圖6】顯示被分泌在雙歧桿菌屬細(xì)菌培養(yǎng)上清中的各種抗體的蛋白質(zhì)印跡分析的結(jié)果的圖?!緢D7】顯示自雙歧桿菌屬細(xì)菌分泌出的抗pd-1-2單鏈抗體、抗ctla-4-1單鏈抗體、抗ctla-4-2單鏈抗體的有無(wú)與人pd-1固相板的結(jié)合的結(jié)果的圖表。【圖8】顯示自雙歧桿菌屬細(xì)菌分泌出的抗pd-1-2單鏈抗體與抗ctla-4-1單鏈抗體、抗ctla-4-2單鏈抗體的有無(wú)與人ctla-4固相板的結(jié)合的結(jié)果的圖表?!緢D9】顯示自雙歧桿菌屬細(xì)菌分泌出的抗pd-1-2單鏈抗體、抗pd-1-3單鏈抗體、抗ctla-4-2單鏈抗體與小鼠pd-1固相板的結(jié)合的有無(wú)結(jié)果的圖表?!緢D10】顯示自雙歧桿菌屬細(xì)菌分泌出的抗pd-1-2單鏈抗體、抗pd-1-3單鏈抗體和抗ctla-4-2單鏈抗體的有無(wú)與人ctla-4固相板的結(jié)合的結(jié)果的圖表?!緢D11】通過流式細(xì)胞儀顯示自雙歧桿菌屬細(xì)菌分泌出的抗pd-1-2單鏈抗體的與人pd-1表達(dá)jurkat細(xì)胞的結(jié)合的圖。【圖12】通過流式細(xì)胞儀顯示自雙歧桿菌屬細(xì)菌分泌出的抗pd-1-2單鏈抗體的與人pd-1表達(dá)hek293t細(xì)胞的結(jié)合的圖?!緢D13】顯示抗ctla-4-1單鏈抗體、抗ctla-4-2單鏈抗體對(duì)于人cd80與人ctla-4的結(jié)合抑制率的圖表?!緢D14】顯示抗ctla-4-1單鏈抗體、抗ctla-4-2單鏈抗體對(duì)于人cd86與人ctla-4的結(jié)合抑制率的圖表?!緢D15】顯示相對(duì)于小鼠pd-1與小鼠pd-l1的結(jié)合反應(yīng)的抗小鼠pd-1單鏈抗體的競(jìng)爭(zhēng)性抑制活性的圖表??v軸表示抑制活性,橫軸表示抗體濃度。【圖16】顯示根據(jù)流式細(xì)胞儀解析的圖。在通過向cd4陽(yáng)性t細(xì)胞的cd3/cd28刺激得到的mpd-1的表達(dá)誘導(dǎo)中,a中,使抗小鼠pd-1抗體與未刺激cd4陽(yáng)性細(xì)胞反應(yīng),通過fitc進(jìn)行檢測(cè)。b中,使抗小鼠pd-1抗體與cd3/cd28刺激cd陽(yáng)性細(xì)胞反應(yīng),通過fitc進(jìn)行檢測(cè)。在根據(jù)流式細(xì)胞儀解析的抗小鼠pd-1單鏈抗體的與cd3和cd28刺激cd4陽(yáng)性細(xì)胞的結(jié)合中,c中,使抗小鼠pd-1單鏈抗體與未刺激cd4陽(yáng)性細(xì)胞反應(yīng),使alexa488-抗his-tag抗體相對(duì)于其his反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。d中,使抗小鼠pd-1單鏈抗體與cd3/cd28刺激cd陽(yáng)性細(xì)胞反應(yīng),使alexa488-抗his-tag抗體相對(duì)于其his反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)?!緢D17】(a)是抗小鼠pd-1單鏈抗體分泌雙歧桿菌給藥小鼠的腫瘤組織的免疫組織染色圖,(b)是未處理小鼠的腫瘤組織的免疫組織染色圖。【圖18】顯示單劑給藥組與未處理組的ct26腫瘤體積變化的圖表?!緢D19】顯示單劑給藥組與雙劑合用組與未處理組的ct26腫瘤體積變化的圖表?!緢D20】顯示單劑給藥組與雙劑合用組的ct26腫瘤體積變化的圖表?!緢D21】顯示各長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp69ly-h(huán)pd-1scfv03菌株的抗體分泌的有無(wú)的圖。【圖22】顯示長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp69l5-h(huán)pd-1scfv03菌株與長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp69l20-h(huán)pd-1scfv03菌株的根據(jù)elisa的結(jié)合量的圖表。【圖23】顯示未被長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp69l5-h(huán)pd-1scfv03菌株與長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp69l20-h(huán)pd-1scfv03菌株分泌的scfv競(jìng)爭(zhēng)性抑制的pd-l1的根據(jù)elisa的結(jié)合量的圖?!緢D24】(a)(b)是顯示各長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phuspxl20-h(huán)pd-1scfv03菌株的抗體分泌的有無(wú)的圖?!緢D25】(a)~(d)是顯示各長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phuspxly-h(huán)pd-1scfv03菌株(其中,y=5、10、15、20)抗體分泌的有無(wú)的圖?!緢D26】(a)~(c)是顯示各長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phuspxly-h(huán)pd-1scfv03菌株的抗體分泌的有無(wú)的圖?!緢D27】顯示各長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phuspxly-h(huán)pd-1scfv03菌株的抗體分泌的有無(wú)的圖?!緢D28】顯示各長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/pp30spxl20-h(huán)ctla-4scfv02菌株的抗體分泌的有無(wú)的圖?!緢D29】(a)~(c)是顯示各長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/pp30spxly-h(huán)ctla-4scfv02菌株的抗體分泌的有無(wú)的圖。具體實(shí)施方式作為本發(fā)明的表達(dá)盒,只要是依次包含(1)在雙歧桿菌屬細(xì)菌中發(fā)揮作用的啟動(dòng)子dna、(2)編碼分泌信號(hào)肽的dna、(3)編碼連接肽的dna、(4)編碼異源多肽的dna、和(5)在雙歧桿菌屬細(xì)菌中發(fā)揮作用的終止子dna的各dna,上述分泌信號(hào)肽由a)序列號(hào)6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、和16的任意一個(gè)所示的氨基酸序列;或b)序列號(hào)6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、和16的任意一個(gè)所示的氨基酸序列中缺失、替換或附加1或數(shù)個(gè)氨基酸的氨基酸序列,且由該氨基酸序列組成的肽在雙歧桿菌屬細(xì)菌中作為分泌信號(hào)肽發(fā)揮作用的氨基酸序列組成,用于在異源多肽的雙歧桿菌屬細(xì)菌內(nèi)的表達(dá)的表達(dá)盒,則無(wú)特別限制。只要能夠獲得本發(fā)明的效果,上述各dna片段的3’末端與其下游的各dna的5’末端也可以不是直接連接,但優(yōu)選直接連接。作為上述啟動(dòng)子dna,只要是在雙歧桿菌屬細(xì)菌中發(fā)揮作用的啟動(dòng)子dna,則無(wú)特別限制,可以列舉出:作為與編碼來(lái)源于長(zhǎng)雙歧桿菌的組蛋白樣dna結(jié)合蛋白的基因的表達(dá)相關(guān)的啟動(dòng)子的hu啟動(dòng)子dna、來(lái)源于短雙歧桿菌的gap基因的啟動(dòng)子dna(biotechnol.lett.200830:1983-1988)、來(lái)源于長(zhǎng)雙歧桿菌的amyb基因的啟動(dòng)子dna(biotechnol.lett.200628:163-168)、16srrna啟動(dòng)子dna(biotechnol.lett.200830:165-172)、gapdh(pr-bl1363)基因的啟動(dòng)子dna(applenvironmicrobiol.200672(11):7401-7405)、prpl啟動(dòng)子dna(cancergenether.200714:151-157)、p572(β-glycosidasefromb.animalissubsplactis)基因的啟動(dòng)子dna(jmicrobiolbiotechnol.2012dec;22(12):1714-23)、p919(rplmpromoter)dna(jmicrobiol.2012aug;50(4):638-43)、p895(rplrpromoter)dna(jmicrobiol.2012aug;50(4):638-43)。作為上述分泌信號(hào)肽,如前所述,可以列舉出a)由序列號(hào)6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16的任意一個(gè)所示的氨基酸序列組成的肽,即分別為sp7、sp45、sp50、sp52、sp55、sp58、sp64、sp66、sp67、sp68、sp69、或可以列舉出b)由序列號(hào)6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、和16的任意一個(gè)所示的氨基酸序列中缺失、替換或附加1或數(shù)個(gè)氨基酸的氨基酸序列組成的肽,且該肽在雙歧桿菌屬細(xì)菌中作為分泌信號(hào)肽發(fā)揮作用的肽(突變分泌信號(hào)肽)。上述“缺失、替換或附加1或數(shù)個(gè)氨基酸的氨基酸序列”表示缺失、替換或附加例如1~5個(gè)、優(yōu)選1~3個(gè)、更優(yōu)選1~2個(gè)、更進(jìn)一步優(yōu)選1個(gè)氨基酸的氨基酸序列,作為上述突變分泌信號(hào)肽的氨基酸序列,與序列號(hào)6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、和16所示的氨基酸序列的任意一個(gè)的序列同源性優(yōu)選為90%以上,更優(yōu)選為95%以上,更進(jìn)一步優(yōu)選為98%以上。作為編碼由上述a)所示的氨基酸序列組成的分泌信號(hào)肽的dna,只要是具有與上述a)所示的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的堿基序列的dna則無(wú)特別限制,因此,也包含由于密碼子的簡(jiǎn)并而不同的dna,例如可以列舉出序列號(hào)116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、和126的任意一個(gè)所示的堿基序列組成的dna,這些dna可以通過化學(xué)合成、基因工程方法等本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制作。作為編碼由上述b)所示的氨基酸序列組成的分泌信號(hào)肽的dna,只要是具有與上述b)所示的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的堿基序列的dna則無(wú)特別限制,因此也包含由于密碼子的簡(jiǎn)并而不同的dna,這些dna也可以通過化學(xué)合成、基因工程方法、突變誘導(dǎo)等本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制作。例如,針對(duì)序列號(hào)116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、和126的任意一個(gè)所示的堿基序列組成的dna,通過使用與作為突變?cè)乃巹┙佑|作用的方法、照射紫外線的方法、基因工程方法等,向這些dna中導(dǎo)入突變,可以獲得突變dna。作為基因工程方法的一種的位點(diǎn)特異性突變誘導(dǎo)法,由于其是向特定的位點(diǎn)導(dǎo)入特定的突變的方法,因此有用,可以按照molecularcloning:alaboratorymanual、2nded.、coldspringharborlaboratory、coldspringharbor、ny.、1989.、currentprotocolsinmolecularbiology、supplement1~38、johnwiley&sons(1987-1997)等中記載的方法進(jìn)行。上述分泌信號(hào)肽,從異源多肽的表達(dá)·分泌效率的觀點(diǎn)出發(fā),優(yōu)選作為與連接肽連接的信號(hào)肽-接頭連接體使用。作為該連接肽,只要是連接在上述分泌信號(hào)肽的c末端使用,能夠提高異源多肽的表達(dá)·分泌效率的肽則無(wú)特別限制,可以優(yōu)選列舉出由1~30個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列組成的肽。具體來(lái)說,對(duì)于連接在由長(zhǎng)雙歧桿菌105-a菌株而鑒定的上述各分泌信號(hào)肽之后的下述所示的11種氨基酸序列,可以列舉出各序列的第1~第30的任意一個(gè)為止的氨基酸序列組成的連接肽,例如第1~第5、第1~第10、第1~第15、第1~第20的氨基酸序列組成的連接肽。1)序列號(hào)25所示的連接肽序列(sp7的下游);2)序列號(hào)26所示的連接肽序列(sp45的下游);3)序列號(hào)27所示的連接肽序列(sp50的下游);4)序列號(hào)28所示的連接肽序列(sp52的下游);5)序列號(hào)29所示的連接肽序列(sp55的下游);6)序列號(hào)30所示的連接肽序列(sp58的下游);7)序列號(hào)31所示的連接肽序列(sp64的下游);8)序列號(hào)32所示的連接肽序列(sp66的下游);9)序列號(hào)33所示的連接肽序列(sp67的下游);10)序列號(hào)34所示的連接肽序列(sp68的下游);11)序列號(hào)35所示的連接肽序列(sp69的下游);作為本發(fā)明的編碼分泌信號(hào)肽-接頭連接體的dna,指的是包含自所述(2)編碼分泌信號(hào)肽的dna的5’末端至所述(3)編碼連接肽的dna的3’末端的dna領(lǐng)域,由于(2)編碼分泌信號(hào)肽的dna的3’末端與(3)編碼連接肽的dna的5’末端是連接的,故而有時(shí)也稱分泌信號(hào)肽-接頭連接體為spxly(其中,x是分泌信號(hào)肽在本說明書中的序號(hào),y是連接肽的氨基酸殘基數(shù))。作為該分泌信號(hào)肽-接頭連接體,具體地可以列舉出下述所示的11種。1)序列號(hào)105所示的分泌信號(hào)肽-接頭連接體(sp7l30);2)序列號(hào)106所示的分泌信號(hào)肽-接頭連接體(sp45l30);3)序列號(hào)107所示的分泌信號(hào)肽-接頭連接體(sp50l30);4)序列號(hào)108所示的分泌信號(hào)肽-接頭連接體(sp52l30);5)序列號(hào)109所示的分泌信號(hào)肽-接頭連接體(sp55l30);6)序列號(hào)110所示的分泌信號(hào)肽-接頭連接體(sp58l30);7)序列號(hào)111所示的分泌信號(hào)肽-接頭連接體(sp64l30);8)序列號(hào)112所示的分泌信號(hào)肽-接頭連接體(sp66l30);9)序列號(hào)113所示的分泌信號(hào)肽-接頭連接體(sp67l30);10)序列號(hào)114所示的分泌信號(hào)肽-接頭連接體(sp68l30);11)序列號(hào)115所示的分泌信號(hào)肽-接頭連接體(sp69l30);另外,例如編碼序列號(hào)25所示的氨基酸序列組成的連接肽中的c末端的氨基酸殘基缺失了0~29,如10~29、15~29、20~29、或25~29個(gè)的連接肽的dna的5’末端,與編碼序列號(hào)6所示的氨基酸序列組成的分泌信號(hào)肽的dna的3’末端連接,同樣地,編碼序列號(hào)26~35的任意一個(gè)所示的氨基酸序列組成的連接肽中的c末端的氨基酸殘基缺失了0~29,如10~29、15~29、20~29、或25~29個(gè)的連接肽的各dna的5’末端與編碼序列號(hào)7~16的任意一個(gè)所示的氨基酸序列組成的分泌信號(hào)肽的各dna的3’末端分別連接。該編碼分泌信號(hào)肽-接頭連接體的dna,可以根據(jù)例如序列號(hào)116+序列號(hào)127(sp7l30)、序列號(hào)117+序列號(hào)128(sp45l30)、序列號(hào)118+序列號(hào)129(sp50l30)、序列號(hào)119+序列號(hào)130(sp52l30)、序列號(hào)120+序列號(hào)131(sp55l30)、序列號(hào)121+序列號(hào)132(sp58l30)、序列號(hào)122+序列號(hào)133(sp64l30)、序列號(hào)123+序列號(hào)134(sp66l30)、序列號(hào)124+序列號(hào)135(sp67l30)、序列號(hào)125+序列號(hào)136(sp68l30)、序列號(hào)126+序列號(hào)137(sp69l30)的任意一個(gè)所示的堿基序列信息,通過化學(xué)合成、基因工程方法等本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制作。本發(fā)明的表達(dá)盒中的,自序列號(hào)25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、和35的任意一個(gè)所示的氨基酸序列的c末端缺失0~29個(gè)氨基酸殘基的各氨基酸序列組成的連接肽中,上述ly中的y可以通過30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1的任意一個(gè)來(lái)表示。作為本發(fā)明的分泌信號(hào)肽-接頭連接體(spxly),具體地,可以列舉出sp7ly(y=1~30的任意的整數(shù)(下同),如y=1~20、y=1~15、y=1~10、y=1~5)、sp45ly(y=1~30,如y=1~20、y=1~15、y=1~10、y=1~5)、sp50ly(y=1~30,如y=1~20、y=1~15、y=1~10、y=1~5)、sp52ly(y=1~30,如y=1~20、y=1~15、y=1~10、y=1~5)、sp55ly(y=1~30,如y=1~20、y=1~15、y=1~10、y=1~5)、sp58ly(y=1~30,如y=1~20、y=1~15、y=1~10、y=1~5)、sp64ly(y=1~30,如y=1~20、y=1~15、y=1~10、y=1~5)、sp66ly(y=1~30,如y=1~20、y=1~15、y=1~10、y=1~5)、sp67ly(y=1~30,如y=1~20、y=1~15、y=1~10、y=1~5)、sp68ly(y=1~30,如y=1~20、y=1~15、y=1~10、y=1~5)、sp69ly(y=1~30,如y=1~20、y=1~15、y=1~10、y=1~5)。通過本發(fā)明的包含在分泌信號(hào)肽、分泌信號(hào)肽-接頭連接體的下游重組有抗hpd-1scfv03的表達(dá)盒的載體而被轉(zhuǎn)化的長(zhǎng)雙歧桿菌105-a菌株中,作為確認(rèn)了抗hpd-1scfv03的分泌的分泌信號(hào)肽-接頭連接體的具體例,可以列舉出sp69l1、sp69l2、sp69l3、sp69l4、sp69l5、sp69l6、sp69l7、sp69l8、sp69l9、sp69l10、sp69l15、sp69l20、sp7l20、sp45l20、sp50l20、sp52l20、sp55l20、sp58l20、sp64l20、sp66l20、sp67l20、sp68l20、sp7l5、sp7l10、sp7l15、sp45l5、sp45l10、sp45l15、sp50l5、sp50l10、sp50l15、sp52l5、sp52l10、sp52l15、sp55l5、sp55l10、sp55l15、sp58l15、sp64l5、sp64l10、sp64l15、sp66l5、sp66l10、sp66l15、sp67l5、sp67l10、sp67l15、sp68l5、sp68l10、sp68l15、sp69l5、sp69l10、sp69l15、sp45l0、sp45l1、sp45l2、sp45l3、sp50l0、sp50l1、sp50l2、sp50l3、sp50l4、sp64l0、sp64l1、sp64l2、sp64l3、sp64l4、sp68l0、sp68l1、sp68l2、sp68l3、sp68l4、sp67l10、sp69l7等,尤其可以優(yōu)選列舉出抗hpd-1scfv03的分泌量多的spsp50l0、sp50l1、sp50l2、sp50l3、sp50l4、sp50l5、sp50l10、sp50l15、sp50l20、sp64l0、sp64l1、sp64l2、sp64l3、sp64l4、sp64l5、sp64l10、sp64l15、sp64l20、sp68l1、sp68l2、sp68l3、sp68l4、sp68l5、sp68l10、sp68l15、sp68l20、sp69l7、sp69l8、sp69l9、sp69l10、sp69l15、sp69l20。另外,在被同樣轉(zhuǎn)化的長(zhǎng)雙歧桿菌105-a菌株中,作為被分泌的抗hpd-1scfv03的與pd-1的結(jié)合能力得到了確認(rèn)的分泌信號(hào)肽-接頭連接體的具體例,可以列舉出sp7l5、sp7l20、sp68l5、sp68l20、sp69l5、sp69l20、sp45l20、sp50l20、sp52l20、sp55l20、sp58l20、sp64l20、sp66l20、sp67l20,尤其可以優(yōu)選列舉出被分泌的抗hpd-1scfv03的與pd-1的結(jié)合量較多的sp7l5、sp68l5、sp69l5。并且,在被同樣轉(zhuǎn)化的長(zhǎng)雙歧桿菌105-a菌株中,作為確認(rèn)了被分泌的抗hpd-1scfv03抑制hpd-1與pd-l1的結(jié)合的分泌信號(hào)肽-接頭連接體的具體例,可以列舉出sp69l5、sp69l20、sp50l5、sp64l5、sp67l10、sp68l1、sp68l5、sp69l1、sp69l7,優(yōu)選sp50l5、sp68l1、sp69l1,其中特別優(yōu)選50%抑制hpd-1與pd-l1的結(jié)合的抗體濃度(ic50)低的sp50l5。通過本發(fā)明的包含在分泌信號(hào)肽、分泌信號(hào)肽-接頭連接體的下游重組有抗hctla-4scfv02的表達(dá)盒的載體而被轉(zhuǎn)化的長(zhǎng)雙歧桿菌105-a菌株中,作為確認(rèn)了抗hctla-4scfv02的分泌的分泌信號(hào)肽-接頭連接體的具體例,可以列舉出sp7l20、sp45l20、sp50l20、sp52l20、sp55l20、sp58l20、sp64l20、sp66l20、sp67l20、sp68l20、sp69l20、sp45l0、sp45l1、sp45l2、sp45l3、sp45l4、sp45l5、sp50l0、sp50l1、sp50l2、sp50l3、sp50l4、sp50l5、sp64l0、sp64l1、sp64l2、sp64l3、sp64l4、sp64l5、sp68l1、sp68l2、sp68l3、sp68l4、sp68l5、sp69l0、sp69l1、sp69l2、sp69l3、sp69l4、sp69l5、sp69l6、sp69l7、sp69l8、sp69l9、sp69l10。作為編碼上述異源多肽的dna,只要是能夠在本發(fā)明的表達(dá)盒中表達(dá),來(lái)源于雙歧桿菌屬細(xì)菌以外的多肽則無(wú)特別限制,除了可以列舉出編碼干擾素(ifn)-α、β、γ、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)、白細(xì)胞介素(il)-1α、il-1β、il-2、il-3、il-4、il-6、il-7、il-10、il-12、il-13、il-15、il-18、il-27、腫瘤壞死因子(tnf)-α、淋巴毒素(lt)-β、粒細(xì)胞集落刺激因子(g-csf)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(m-csf)、巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(mif)等的細(xì)胞因子的dna、編碼內(nèi)皮抑素、血管抑素等的血管生成抑制物質(zhì)的dna之外,還可以優(yōu)選列舉出編碼將作為5-氟尿嘧啶的前藥的5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)換為5-氟尿嘧啶的酶、即胞嘧啶脫氨酶的dna。另外,也可以使用編碼抗體多肽的dna。在該編碼異源多肽的dna中,為了多肽的分離處理等的方便,也可以適當(dāng)?shù)丶尤刖幋a如組氨酸標(biāo)簽等的親和標(biāo)簽的dna。作為上述抗體,可以列舉出以白介素-6(il-6)受體作為靶向分子的風(fēng)濕癥治療藥物中使用的抗體、以α4-整合素作為靶向分子的多發(fā)性硬化癥治療藥物中使用的抗體、以cd20、cd33、pd-1、ctla-4、cd80、cd86作為靶向的具有抗癌作用的抗體。其中,抗pd-1抗體由于通過與活化的淋巴細(xì)胞(t細(xì)胞、b細(xì)胞)中表達(dá)的pd-1受體的結(jié)合而抑制癌細(xì)胞表達(dá)的pd-l1、pd-l2與pd-1受體結(jié)合,結(jié)果對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)得到了增強(qiáng),故而可以優(yōu)選列舉。另外,認(rèn)為抗ctla-4抗體通過抑制作為自身免疫功能的抑制分子而被熟知的ctla-4的功能,可以增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答,且通過抑制ctla-4與在抗原呈遞細(xì)胞中表達(dá)的cd80、cd86的結(jié)合,可以抑制由于這些分子的相互作用而被誘發(fā)的免疫應(yīng)答的負(fù)的向下調(diào)節(jié),故而可以優(yōu)選列舉。作為編碼上述抗體多肽的dna,可以列舉出編碼嵌合抗體、人源化抗體、fab、fab’、f(ab’)2、單鏈抗體等的dna,其中,優(yōu)選編碼通過其自身可以識(shí)別·結(jié)合靶向物質(zhì)、分子量不過高、被導(dǎo)入至雙歧桿菌屬細(xì)菌內(nèi)時(shí)也可以表達(dá)的單鏈抗體的dna。編碼包含這些抗體的異源多肽的dna,可以從公知的文獻(xiàn)、genbank等的數(shù)據(jù)庫(kù)獲取其序列信息,通過化學(xué)合成、基因工程方法等公知的方法制作。作為上述終止子dna,只要是在雙歧桿菌屬細(xì)菌中發(fā)揮作用的終止子dna則無(wú)特別限制,具體地,可以列舉出來(lái)源于長(zhǎng)雙歧桿菌的hu終止子、t572終止子(jmicrobiolbiotechnol.2012dec;22(12):1714-23)。作為本發(fā)明的表達(dá)盒、優(yōu)選包含編碼連接肽的dna的表達(dá)盒的制作方法,可以列舉出針對(duì)(1)在雙歧桿菌屬細(xì)菌中發(fā)揮作用的啟動(dòng)子dna;(2)編碼由下述a)或b)所示的氨基酸序列組成的分泌信號(hào)肽的dnaa)序列號(hào)6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、和16的任意一個(gè)所示的氨基酸序列;b)由序列號(hào)6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、和16的任意一個(gè)所示的氨基酸序列中缺失、替換或附加1或數(shù)個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列組成的氨基酸序列,由該氨基酸序列組成的肽在雙歧桿菌屬細(xì)菌中作為分泌信號(hào)肽發(fā)揮作用的氨基酸序列;(3)編碼連接肽的dna;(4)編碼異源多肽的dna;(5)在雙歧桿菌屬細(xì)菌中發(fā)揮作用的終止子dna;的各dna,按照以(1)為上游側(cè),(5)為下游側(cè),依次包含(1)~(5)的dna的方式制作的方法,本發(fā)明的表達(dá)盒的制作,可以按照市售的實(shí)驗(yàn)書、例如基因手冊(cè)講談社、高木康敬編基因操作實(shí)驗(yàn)法講談社、molecularcloning[coldspringharborlaboratory(1982)]、molecularcloning第2版[coldspringharborlaboratory(1989)]、methodsinenzymology194(1991)、實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)副刊·利用酵母的基因?qū)嶒?yàn)法、羊土社(1994)等中所記載的方法進(jìn)行。作為本發(fā)明的載體,只要是插入本發(fā)明的表達(dá)盒且轉(zhuǎn)到到雙歧桿菌屬細(xì)菌時(shí)異源多肽能夠表達(dá)的載體則無(wú)特別限制,本發(fā)明的表達(dá)盒,可以在載體中插入1種或2種以上。作為包含在本發(fā)明的載體中的在雙歧桿菌屬細(xì)菌中發(fā)揮作用的質(zhì)粒復(fù)制單元的具體例,可以列舉出ptb6(bioscibiotechnolbiochem.2005feb;69(2):422-5)、pmb1(lettapplmicrobiol.1990oct;11(4):220-3)、ptb4(來(lái)源于bifidobacteriumlongum的質(zhì)粒ptb4的結(jié)構(gòu)解析與應(yīng)用自由演講題目海報(bào)展示項(xiàng)目-日本分子生物學(xué)會(huì)、1994)、pfi2576(jmicrobiolbiotechnol.2009apr;19(4):403-8)、pcibao(applenvironmicrobiol.2007dec;73(24):7858-66)、pbc1(plasmid.2007mar;57(2):165-74)、pdojh10s(applenvironmicrobiol.2006jan;72(1):527-35)、pkj50(microbiology1999mar;145(pt):585-92)的復(fù)制單元,其中可以優(yōu)選列舉來(lái)源于ptb6的oriv領(lǐng)域和repb基因組成的ptb6rep單元。此外,上述載體中也可以包含如藥物抗性基因等的標(biāo)記基因。作為上述標(biāo)記基因,可以列舉出壯觀霉素、氯霉素、紅霉素、氨芐青霉素等。作為將本發(fā)明中的載體導(dǎo)入至雙歧桿菌屬細(xì)菌的方法,可以列舉出電穿孔法。作為本發(fā)明中的雙歧桿菌屬細(xì)菌,可以列舉出長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌(b.breve)、青春雙歧桿菌(b.adolescentis)、兩歧雙歧桿菌(b.bifidum)、假長(zhǎng)雙歧桿菌(b.pseudolongum)、嗜熱雙歧桿菌(b.thermophirum)、嬰兒雙歧桿菌(b.infantis)、動(dòng)物型雙歧桿菌(b.animalis)、角雙歧桿菌(b.angulatum)、星狀雙歧桿菌(b.asteroides)、波恩雙歧桿菌(b.boum)、鏈狀雙歧桿菌(b.catenulatum)、小豬雙歧桿菌(b.choerinum)、棒狀雙歧桿菌(b.coryneforme)、兔雙歧桿菌(b.cuniculi)、齲齒雙歧桿菌(b.denticolens)、齒雙歧桿菌(b.dentium)、高盧雙歧桿菌(b.gallicum)、雞胚雙歧桿菌(b.gallinarum)、球形雙歧桿菌(b.globosum)、印度雙歧桿菌(b.indicum)、異形雙歧桿菌(b.inopinatum)、乳酸雙歧桿菌(b.lactis)、乳雙歧桿菌(b.lactentis)、大雙歧桿菌(b.magnum)、瘤胃雙岐桿菌(b.merycicum)、最小雙歧桿菌(b.minimum)、摩恩格里艾恩斯雙歧桿菌(b.mongoliaenns)、微小粒雙歧桿菌(b.parvulorum)、假鏈狀雙歧桿菌(b.pseudocatenulatum)、噬冷雙歧桿菌(b.psychraerophilum)、雞雙歧桿菌(b.pullorum)、棲瘤胃雙歧桿菌(b.ruminale)、反芻雙歧桿菌(b.ruminantium)、沙庫(kù)來(lái)雙歧桿菌(b.saeculare)、史卡杜維雙歧桿菌(b.scardovii)、沙布提雙岐桿菌(b.subtile)、豬雙歧桿菌(b.suis)、熱嗜酸性雙岐桿菌(b.thermacidophilum)等。其中,優(yōu)選使用已知不分年齡長(zhǎng)存于人體腸道內(nèi)的長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌作為宿主細(xì)胞,更優(yōu)選使用長(zhǎng)雙歧桿菌。這些菌均在市場(chǎng)上有銷售,或很容易從保藏機(jī)構(gòu)獲得。另外對(duì)于各個(gè)菌株,也無(wú)特別限制,例如,對(duì)于長(zhǎng)雙歧桿菌,可以列舉出長(zhǎng)雙歧桿菌105-a菌株、長(zhǎng)雙歧桿菌ae-194b菌株、長(zhǎng)雙歧桿菌bs-601菌株、長(zhǎng)雙歧桿菌m101-2菌株、長(zhǎng)雙歧桿菌atcc-15707菌株,其中優(yōu)選長(zhǎng)雙歧桿菌105-a菌株。對(duì)于短雙歧桿菌,例如可以列舉出短雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(jcm1192)、短雙歧桿菌as-1菌株、短雙歧桿菌i-53-8w菌株,其中優(yōu)選短雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)株、短雙歧桿菌as-1菌株。對(duì)于嬰兒雙歧桿菌,例如可以列舉出嬰兒雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(jcm1222)、嬰兒雙歧桿菌i-10-5菌株。對(duì)于乳雙歧桿菌,例如可以列舉出乳雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(jcm1210)。對(duì)于兩歧雙歧桿菌的菌株,例如可以列舉出兩歧雙歧桿菌atcc-11863菌株。本發(fā)明的載體、轉(zhuǎn)化雙歧桿菌屬細(xì)菌等的制作,可以按照市售的實(shí)驗(yàn)書、例如基因手冊(cè)講談社、高木康敬編基因操作實(shí)驗(yàn)法講談社、molecularcloning[coldspringharborlaboratory(1982)]、molecularcloning第2版[coldspringharborlaboratory(1989)]、methodsinenzymology194(1991)、實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)副刊·利用酵母的基因?qū)嶒?yàn)法、羊土社(1994)等中所記載的方法進(jìn)行。上述被轉(zhuǎn)化的雙歧桿菌屬細(xì)菌在正常組織中不增殖,僅在厭氧環(huán)境下的腫瘤組織內(nèi)增殖,可以在腫瘤組織內(nèi)表達(dá)有利于治療的多肽。因此,該被轉(zhuǎn)化的雙歧桿菌屬細(xì)菌,給具有厭氧環(huán)境的腫瘤帶去腫瘤增殖抑制作用、腫瘤體積的抑制作用、優(yōu)選的完全消退作用,可以作為對(duì)實(shí)體瘤的治療有效的藥物組合物,尤其是抗癌劑使用。因此,作為本發(fā)明的藥物組合物,只要是包含以能夠分泌異源多肽、優(yōu)選具有抗癌作用的抗體的上述本發(fā)明的雙歧桿菌屬細(xì)菌作為有效成分,則無(wú)特別限制,只要不妨礙分泌的多肽的作用·效果,也可以包含作為任意成分的藥理學(xué)上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑等。本發(fā)明的藥物組合物為抗癌劑時(shí),作為適用對(duì)象,可以列舉出,大腸癌、頭頸癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽囊癌、膽管癌、胰腺癌、胰島細(xì)胞癌、絨癌、結(jié)腸癌、腎細(xì)胞癌、腎上腺皮質(zhì)癌、膀胱癌、睪丸癌、前列腺癌、睪丸癌、卵巢癌、子宮癌、絨癌、甲狀腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、皮膚癌、腦腫瘤、惡性類癌腫瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、腎母細(xì)胞腫瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、黑色素瘤。作為本發(fā)明的藥物組合物的劑型,可以列舉出液體劑型或固體劑型。液體劑型可以通過純化本發(fā)明的雙歧桿菌屬細(xì)菌的培養(yǎng)液,根據(jù)需要向其中加入適當(dāng)?shù)纳睇}水或補(bǔ)液或藥物添加劑,填充至安瓿或小藥瓶等中來(lái)制備。固體制劑可以通過向液體制劑中添加適當(dāng)?shù)谋Wo(hù)劑,填充至安瓿或小藥瓶等之后進(jìn)行冷凍干燥,或向液體制劑中添加適當(dāng)?shù)谋Wo(hù)劑,冷凍干燥后填充至安瓿或小藥瓶等中來(lái)制備。作為本發(fā)明的藥物組合物的給藥方法,經(jīng)口給藥、非經(jīng)口給藥均可,其中優(yōu)選非經(jīng)口給藥,例如可以列舉出靜脈內(nèi)給藥、局部給藥。對(duì)于本發(fā)明的藥物組合物的給藥量,只要足夠保證本發(fā)明的雙歧桿菌屬細(xì)菌可以在患病部位生長(zhǎng),且表達(dá)有效治療量的活性抗體則無(wú)特別限制,可以根據(jù)疾病的程度、患者的體重、年齡、性別進(jìn)行適當(dāng)選擇,并根據(jù)改善的程度適當(dāng)增減,但從經(jīng)濟(jì)的角度,以及盡可能規(guī)避副作用的角度出發(fā),優(yōu)選在能夠保證所需的治療效果的范圍內(nèi),盡量少量使用。例如,靜脈內(nèi)給藥時(shí),因?yàn)橐蠼档图?xì)菌凝塊引起的栓塞等的風(fēng)險(xiǎn),故而優(yōu)選采用盡量低濃度的注射用制劑分多次注射,或通過適當(dāng)?shù)难a(bǔ)液稀釋之后連續(xù)注射。例如,對(duì)于成人,將本發(fā)明的雙歧桿菌屬細(xì)菌的菌體,按照每1kg體重104~1012cfu的量分成1天1~多次給藥、1~數(shù)天連續(xù)或以適當(dāng)間隔給藥。更具體地來(lái)說,將包含104~1010cfu/ml的本發(fā)明的雙歧桿菌屬細(xì)菌的菌體的制劑,按照成人1人1~1000ml的量直接或是通過適當(dāng)?shù)难a(bǔ)液進(jìn)行稀釋后,分成1天1~多次,連續(xù)1~數(shù)天給藥。另外,例如,對(duì)于直接向病患組織給藥的局部給藥,因?yàn)橐蟊M量使菌在病患組織整體上生長(zhǎng)、增殖,故而優(yōu)選將高濃度的注射劑施用至疾病組織的多處的方式。例如,對(duì)于成人,將本發(fā)明的雙歧桿菌屬細(xì)菌的菌體,按照每1kg體重104~1012cfu的量分成1天1~多次給藥,根據(jù)需要1~數(shù)天連續(xù)或以適當(dāng)間隔給藥。更具體地來(lái)說,將包含104~1010cfu/ml的本發(fā)明的雙歧桿菌屬細(xì)菌的菌體的制劑,按照成人1人0.1~100ml的量直接分成1天多次,根據(jù)需要1~連續(xù)數(shù)天給藥。以下,根據(jù)實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明,但本發(fā)明不受這些實(shí)施例限定。實(shí)施例1[phusp3l22-scfv-pd-1-1、phusp7l20-scfv-pd-1-1、phusp23l27-scfv-pd-1-1的制作]使用公知的分泌信號(hào)肽與新的分泌信號(hào)肽,制作抗pd-1-1單鏈抗體分泌質(zhì)粒。對(duì)于實(shí)施例1、5~8中使用的引物,具體如下表1和表2所示?!颈?】插入物及載體擴(kuò)增時(shí)的引物序列【表2】插入物及載體擴(kuò)增時(shí)使用的pcr引物引物名序列(5->3)lns_pd-1-1_f1caggtccagctggtccagagcggcagcgaa(序列號(hào)36)lns_pd-1-2_f1caggtccagctgcaggaatcgggcccgggc(序列號(hào)37)lns_pd-1-3_f1gaagtgcgtctgctggaatcgggcggcggc(序列號(hào)38)lns_ctla-4-1_f1caggtccagctggtcgaatcgggcggcggc(序列號(hào)39)lns_pd-1-1_r1acgagcagaaggtcagtggtggtgatgatggtgctt(序列號(hào)40)vec-sp3l20-pd-1-1_r1gaccagctggacctgggtcagcttgcccggcttgta(序列號(hào)41)vec-sp7l20-pd-1-1_r1gaccagctggacctgcaccgaactcgccttcgggaa(序列號(hào)42)vec-sp23l20-pd-1-1_r1gaccagctggacctgacgaatcttcttctcctgcgc(序列號(hào)43)lns_pd-1-2_r1acgagcagaaggtcagtgatgatgatggtggtgacg(序列號(hào)44)vec-sp7l20-pd-1-2_r1ctgcagctggacctgcaccgaactcgccttcgggaa(序列號(hào)45)lns_pd-1-3_r1acgagcagaaggtcagtgatgatggtggtgatggcc(序列號(hào)46)vec-sp7l20-pd-1-3_r1cagcagacgcacttccaccgaactcgccttcgggaa(序列號(hào)47)lns_ctla-4-1_r1acgagcagaaggtcagtgatgatggtgatgatgctt(序列號(hào)48)lns_ctla-4-2_r1acgagcagaaggtcagtgatgatgatgatgatgctt(序列號(hào)49)sp3l22_r1ggcgatggtcagcttgcccggcttgtacgt(序列號(hào)50)sp23l27_r1gatcgtcttgagaatcttcagacgaatcttcttctcctgcgc(序列號(hào)51)tga_hu_terminator_ftgaccttctgctcgtagcgattac(序列號(hào)52)[抗pd-1單鏈抗體表達(dá)盒]抗pd-1單鏈抗體的表達(dá)盒如圖1(a)所示,由hu啟動(dòng)子dna(來(lái)源于長(zhǎng)雙歧桿菌)、編碼分泌信號(hào)肽的dna和編碼連接在所述分泌信號(hào)肽之后的連接肽的dna、編碼抗pd-1單鏈抗體(包含重鏈序列、接頭((ggggs)3)、輕鏈序列)的dna、his標(biāo)簽序列、和hu終止子(來(lái)源于長(zhǎng)雙歧桿菌)構(gòu)成。各表達(dá)盒中的抗pd-1單鏈抗體(包含含有重鏈序列、接頭((ggggs)3)、輕鏈序列的堿基序列),如下所示,參考下述表3所示的文獻(xiàn),使用了2種抗人pd-1單鏈抗體與1種抗小鼠pd-1單鏈抗體?!颈?】關(guān)于scfv-pd-1-1、scfv-pd-1-2和scfv-pd-1-3的各抗pd-1單鏈抗體基因,在genscriptjapan株式會(huì)社被亞克隆至大腸菌用質(zhì)粒puc57上,人工基因合成為質(zhì)粒puc57-scfv-pd-1-1、puc57-scfv-pd-1-2和puc57-scfv-pd-1-3。作為分泌信號(hào)肽序列,使用了分泌信號(hào)肽-接頭連接體sp3l22、sp7l20、和sp23l27。作為上述sp3l22,使用了國(guó)際公開號(hào)wo2011/093467中作為序列號(hào)8而記載的公知的序列,作為sp23l27,使用了國(guó)際公開號(hào)wo2011/093467中作為序列號(hào)25而記載的公知的序列。作為sp7l20,以在國(guó)際公開號(hào)wo2011/093467中記載的序列號(hào)12的堿基序列上,進(jìn)一步加入了5’端上從66堿基上游的atg起的堿基序列:atggcgttgatgatgagcgttaagactattatttccacatcagtggcgattatcgccacgggtgcc的堿基序列為基礎(chǔ),使用了sp7l20(序列號(hào)81)。加入該堿基序列的理由是,已經(jīng)清楚了通過預(yù)測(cè)分泌信號(hào)的有無(wú)的信號(hào)序列預(yù)測(cè)程序signalp4.1server(http://www.cbs.dtu.dk/services/signalp/)解析,預(yù)測(cè)到了sp7蛋白的n末端上具有分泌信號(hào)肽序列。此處,作為連接在sp7之后的連接肽序列,選擇了sp7的c末端側(cè)的20個(gè)氨基酸殘基??筽d-1單鏈抗體分泌質(zhì)粒的制作概要如圖2所示。在圖2左側(cè),scfv-gene是pd-1,在phusp7l20-scfv-pd-1-1的制作中,x=7、n=1。另外,在phusp7l20-scfv-pd-1-2的制作中,x=7、n=2,在phusp7l20-scfv-pd-1-3的制作中,x=7、n=3。進(jìn)一步地,在圖2右側(cè),phusp3l22-scfv-pd-1-1的制作中,x=3、y=22,在phusp23l27-scfv-pd-1-1的制作中,x=23、y=27。詳細(xì)的構(gòu)建方法如下所示。[質(zhì)粒phusp3l22-scfv-pd-1-1的制作]制作質(zhì)粒phusp3l22-scfv-pd-1-1時(shí),首先制作質(zhì)粒phusp3l20-scfv-pd-1-1。[質(zhì)粒phusp3l20-scfv-pd-1-1的制作](抗pd-1-1單鏈抗體插入物的制備)以質(zhì)粒puc57-scfv-pd-1-1500pg為模板,使用表1和表2記載的lns_pd-1-1_f1引物和lns_pd-1-1_r1引物組進(jìn)行pcr擴(kuò)增。引物序列設(shè)計(jì)成插入物片段與載體片段的末端15bp重疊。按照各引物為0.2μm,反應(yīng)體積為30μl,使用primestarhs(premix)(takarabio株式會(huì)社制造)試劑盒進(jìn)行pcr擴(kuò)增。作為擴(kuò)增的程序,以98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下60秒為1個(gè)循環(huán),進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。對(duì)被擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物,通過2%的瓊脂糖凝膠實(shí)施電泳之后,使用qiaquickgelextractionkit(qiagen公司制造)純化,制備得到抗pd-1-1單鏈抗體插入物。(載體片段的制備)以序列號(hào)20中記載的載體直鏈化片段500pg為模板,使用上述表1和表2中記載的tga_h(yuǎn)u_terminator_f引物和vec-sp3l20-pd-1-1_r1引物組成的引物組,按照引物為0.2μm,反應(yīng)體積為30μl,使用primestarhs(premix)試劑盒進(jìn)行pcr擴(kuò)增。作為擴(kuò)增的程序,以98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下5分鐘為1個(gè)循環(huán),進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。對(duì)被擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物,通過0.8%的瓊脂糖凝膠實(shí)施電泳后,使用qiaquickgelextractionkit(qiagen公司制造)純化,制備得到5’-h(huán)u終止子-ptb6repunit-spcmr-pucori-h(huán)u啟動(dòng)子-sp3l20-3’載體片段。上述載體直鏈化片段,在序列號(hào)20的第4~第3845的堿基序列中,按照如下所示構(gòu)成。hu終止子:序列號(hào)20的第4~第117的堿基序列雙歧桿菌屬細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)ptb6repunit:序列號(hào)20的第124~第1719的堿基序列壯觀霉素耐性基因spcmr:序列號(hào)20的第1726~第2804的堿基序列大腸菌復(fù)制起點(diǎn)pucori:序列號(hào)20的第2811~第3478的堿基序列hu啟動(dòng)子:序列號(hào)20的第3485~第3845的堿基序列。(in-fusion反應(yīng))使用in-fusion(注冊(cè)商標(biāo))hdcloningkit(takarabio株式會(huì)社制造)連接上述制備的載體片段與上述抗pd-1-1單鏈抗體插入物。即,將上述載體與插入物按照1:5的摩爾比添加至微型管中后,添加2μl的5×in-fusionhdenzymepremix,將反應(yīng)液體積調(diào)整為10μl。將其在50℃下保溫15分鐘。其他的順序遵循試劑盒的產(chǎn)品說明書,制備得到in-fusion反應(yīng)液。(大腸菌的轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒dna的序列確認(rèn))按照產(chǎn)品說明書,使用上述in-fusion反應(yīng)液5μl,實(shí)施大腸菌hst08感受態(tài)細(xì)胞(takarabio株式會(huì)社制造)的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的菌懸液涂布于包含75μg/ml壯觀霉素的lb瓊脂培養(yǎng)基上,在37℃下靜置培養(yǎng)一晚。將形成于上述瓊脂培養(yǎng)基上的大腸菌菌落在包含75μg/ml壯觀霉素的lb液體培養(yǎng)基上于30℃下培養(yǎng)一晚,然后使用qiaprepspinminiprepkit(qiagen公司制造)提取質(zhì)粒。為了確定提取的質(zhì)粒中的抗pd-1-1單鏈抗體表達(dá)盒(包含從hu啟動(dòng)子到hu終止子)序列,使用bigdye(注冊(cè)商標(biāo))terminatorv3.1cyclesequencingkit(appliedbiosystems公司制造)實(shí)施測(cè)序反應(yīng)。將提取的質(zhì)粒命名為phusp3l20-scfv-pd-1-1。[phusp3l22-scfv-pd-1-1的制作](磷酸化引物的制備)對(duì)于表1和表2中記載的ins_pd-1-1_f1引物、sp3l22_r1引物,使用t4多核苷酸激酶(takarabio株式會(huì)社制造),按照產(chǎn)品說明書對(duì)各引物進(jìn)行磷酸化。針對(duì)ins_pd-1-1_f1磷酸化引物和sp3l22_r1磷酸化引物,分別通過0.1×te緩沖液(1mmtris-h(huán)cl、0.1mmedta、ph7.5)將終濃度調(diào)整為20μm。(phusp3l22-scfv-pd-1-1載體直鏈化片段的制備)以上述質(zhì)粒phusp3l20-scfv-pd-1-1500pg為模板,使用上述ins_pd-1-1_f1磷酸化引物和sp3l22_r1磷酸化引物組成的引物組,按照最終濃度為0.2μm,反應(yīng)體積為30μl,使用primestarhs(premix)試劑盒進(jìn)行pcr擴(kuò)增。作為擴(kuò)增的程序,以98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下5分鐘作為1個(gè)循環(huán),進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。對(duì)被擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物通過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳后,使用qiaquickgelextractionkit純化,制備得到phusp3l22-scfv-pd-1-1載體直鏈化片段。(連接反應(yīng))針對(duì)上述載體直鏈化片段,使用t4dna連接酶(thermofisherscientific株式會(huì)社制造),按照產(chǎn)品說明書,實(shí)施連接反應(yīng)。添加附帶的10×bufferfort4dnaligase2μl使反應(yīng)液體積為20μl,將其在22℃下進(jìn)行10分鐘的連接反應(yīng),制備得到連接反應(yīng)液。(大腸菌的轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒dna的序列確認(rèn))使用上述連接反應(yīng)液10μl,進(jìn)行大腸菌hst08感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的菌懸液涂布于含有75μg/ml壯觀霉素的lb瓊脂培養(yǎng)基上,在37℃下靜置培養(yǎng)一晚。轉(zhuǎn)化條件參照大腸菌hst08感受態(tài)細(xì)胞的產(chǎn)品說明書,其概要如下。將形成于上述瓊脂培養(yǎng)基上的大腸菌菌落,在包含75μg/ml壯觀霉素的lb液體培養(yǎng)基上于30℃下培養(yǎng)一晚,然后使用qiaprepspinminiprepkit從其中提取質(zhì)粒。為了確定提取的質(zhì)粒的抗pd-1-1單鏈抗體表達(dá)盒(包含從hu啟動(dòng)子到hu終止子)序列,使用bigdye(注冊(cè)商標(biāo))terminatorv3.1cyclesequencingkit實(shí)施測(cè)序反應(yīng)。將提取的質(zhì)粒命名為phusp3l22-scfv-pd-1-1。(雙歧桿菌屬細(xì)菌的轉(zhuǎn)化)使用從上述轉(zhuǎn)化的大腸菌中提取的1000ng的質(zhì)粒phusp3l22-scfv-pd-1-1,通過電穿孔系統(tǒng)(genepulserii、bio-radlaboratories株式會(huì)社制造)實(shí)施長(zhǎng)雙歧桿菌105-a株的轉(zhuǎn)化。電沖擊(2kv、25μf、200ω)后,立即向反應(yīng)杯(2mm間隙)中添加800μl的imr液體培養(yǎng)基和50μl的維生素c添加液的混合液,將其回收至滅菌完畢的2ml微型管中。針對(duì)各個(gè)管進(jìn)行同樣的操作,然后擰松這些2ml管的蓋子,與脫氧·二氧化碳發(fā)生劑(anaeropack(注冊(cè)商標(biāo))·厭氧、三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社制造)一起加入至密閉容器中,在設(shè)定為37℃的培養(yǎng)器中保溫3小時(shí)。將保溫后的各菌懸液涂布至含有75μg/ml壯觀霉素的imr瓊脂培養(yǎng)基中。將這些板與上述脫氧·二氧化碳發(fā)生劑一起加入至密閉容器中,在設(shè)定為37℃的培養(yǎng)器中培養(yǎng)2天。對(duì)形成于上述含有壯觀霉素的imr瓊脂培養(yǎng)基上的菌落進(jìn)行釣菌,在含有75μg/ml壯觀霉素的bl-bs瓊脂培養(yǎng)基(不包含馬脫纖維血的bl瓊脂培養(yǎng)基)上劃線后,與脫氧·二氧化碳發(fā)生劑一起加入至密閉容器,在設(shè)定為37℃的培養(yǎng)器中培養(yǎng)1天,得到長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp3l22-scfv-pd-1-1菌株。[phusp7l20-scfv-pd-1-1的制作](抗pd-1-1單鏈抗體插入物的制備)按照與上述[質(zhì)粒phusp3l20-scfv-pd-1-1的制作]中的(抗pd-1-1單鏈抗體插入物的制備)相同的順序制備抗pd-1-1單鏈抗體插入物。(載體片段的制備)以序列號(hào)21所記載的載體直鏈化片段500pg為模板,使用上述表1和表2中記載的tga_h(yuǎn)u_terminator_f引物和vec-sp7l20-pd-1-1_r1引物組成的引物組,按照最終濃度為0.2μm,反應(yīng)體積為30μl,使用primestarhs(premix)試劑盒進(jìn)行pcr擴(kuò)增。作為擴(kuò)增的程序,以98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下5分鐘為1個(gè)循環(huán),進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。對(duì)被擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物通過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳后,使用qiaquickgelextractionkit純化,制備得到5’-h(huán)u終止子-ptb6repunit-spcmr-pucori-h(huán)u啟動(dòng)子-sp7l20-3’載體片段(1)。上述載體直鏈化片段,在序列號(hào)21的第4~第3845的堿基序列中,按照如下所示構(gòu)成。hu終止子:序列號(hào)21的第4~第117的堿基序列雙歧桿菌屬細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)ptb6repunit:序列號(hào)21的第124~第1719的堿基序列壯觀霉素耐性基因spcmr:序列號(hào)21的第1726~第2804的堿基序列大腸菌復(fù)制起點(diǎn)pucori:序列號(hào)21的第2811~第3478的堿基序列hu啟動(dòng)子:序列號(hào)21的第3485~第3845的堿基序列。(in-fusion反應(yīng))除了使用上述制備得到的載體片段與上述抗pd-1-1單鏈抗體插入物之外,按照與上述[質(zhì)粒phusp3l20-scfv-pd-1-1的制作]中的in-fusion反應(yīng)相同的順序制備得到in-fusion反應(yīng)液。(大腸菌的轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒dna的序列確認(rèn))除了使用上述制備得到的in-fusion反應(yīng)液5μl之外,按照與上述[質(zhì)粒phusp3l20-scfv-pd-1-1的制作]中的(大腸菌的轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒dna的序列確認(rèn))中同樣的順序,進(jìn)行大腸菌hst08感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,為了確定提取的質(zhì)粒中的抗pd-1-1單鏈抗體表達(dá)盒(包含從hu啟動(dòng)子到hu終止子)序列,實(shí)施測(cè)序反應(yīng)。將提取的質(zhì)粒命名為phusp7l20-scfv-pd-1-1。(雙歧桿菌屬細(xì)菌的轉(zhuǎn)化)除了使用從上述轉(zhuǎn)化的大腸菌提取的質(zhì)粒phusp7l20-scfv-pd-1-11000ng的dna之外,采用與上述[phusp3l22-scfv-pd-1-1的制作]中的(雙歧桿菌屬細(xì)菌的轉(zhuǎn)化)同樣的方法,進(jìn)行長(zhǎng)雙歧桿菌105-a菌株的轉(zhuǎn)化,得到長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-pd-1-1菌株。[phusp23l27-scfv-pd-1-1的制作]制作質(zhì)粒phusp23l27-scfv-pd-1-1時(shí),首先制作質(zhì)粒phusp23l20-scfv-pd-1-1。[質(zhì)粒phusp23l20-scfv-pd-1-1的制作](抗pd-1-1單鏈抗體插入物的制備)按照與上述[質(zhì)粒phusp3l20-scfv-pd-1-1的制作]中的(抗pd-1-1單鏈抗體插入物的制備)同樣的順序制備抗pd-1-1單鏈抗體插入物。(載體片段的制備)以序列號(hào)22所記載的載體直鏈化片段500pg為模板,使用上述表1和表2中記載的tga_hu_terminator_f引物和vec-sp23l20-pd-1-1_r1引物組成的引物組,按照最終濃度為0.2μm,反應(yīng)體積為30μl,使用primestarhs(premix)試劑盒進(jìn)行pcr擴(kuò)增。作為擴(kuò)增的程序,以98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下5分鐘為1個(gè)循環(huán),進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。對(duì)被擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物通過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳后,使用qiaquickgelextractionkit純化,制備得到5’-h(huán)u終止子-ptb6repunit-spcmr-pucori-h(huán)u啟動(dòng)子-sp23l20-3’載體片段。上述載體直鏈化片段,在序列號(hào)22的第4~第3845的堿基序列中,按照如下所示構(gòu)成。hu終止子:序列號(hào)22的第4~第117的堿基序列雙歧桿菌屬細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)ptb6repunit:序列號(hào)22的第124~第1719的堿基序列壯觀霉素耐性基因spcmr:序列號(hào)22的第1726~第2804的堿基序列大腸菌復(fù)制起點(diǎn)pucori:序列號(hào)22的第2811~第3478的堿基序列hu啟動(dòng)子:序列號(hào)22的第3485~第3845的堿基序列。(in-fusion反應(yīng))除了使用上述制備的載體片段與抗pd-1-1單鏈抗體插入物之外,按照與上述[質(zhì)粒phusp3l20-scfv-pd-1-1的制作]中的in-fusion反應(yīng)同樣的順序制備得到in-fusion反應(yīng)液。(大腸菌的轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒dna的序列確認(rèn))除了使用上述制備的in-fusion反應(yīng)液5μl之外,按照與上述[質(zhì)粒phusp3l20-scfv-pd-1-1的制作]中的(大腸菌的轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒dna的序列確認(rèn))中同樣的順序,進(jìn)行大腸菌hst08感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,為了確定提取的質(zhì)粒中的抗pd-1-1單鏈抗體表達(dá)盒(包含從hu啟動(dòng)子到hu終止子)序列,進(jìn)行測(cè)序反應(yīng),將提取的質(zhì)粒命名為phusp23l20-scfv-pd-1-1。[質(zhì)粒phusp23l27-scfv-pd-1-1的制作](磷酸化引物的制備)對(duì)于表1和表2中記載的ins_pd-1-1_f1引物、sp23l27_r1引物,使用t4多核苷酸激酶,按照產(chǎn)品說明書對(duì)各引物進(jìn)行磷酸化。將ins_pd-1-1_f1磷酸化引物和sp23l27_r1磷酸化引物,分別通過0.1×te緩沖液(1mmtris-h(huán)cl、0.1mmedta、ph7.5)將終濃度調(diào)整為20μm。(phusp23l27-scfv-pd-1-1載體直鏈化片段的制備)以上述質(zhì)粒phusp23l20-scfv-pd-1-1500pg為模板,使用上述ins_pd-1-1_f1磷酸化引物和sp23l27_r1磷酸化引物組成的引物組,按照最終濃度為0.2μm,反應(yīng)體積為30μl,使用primestarhs(premix)試劑盒進(jìn)行pcr擴(kuò)增。作為擴(kuò)增的程序,以98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下5分鐘為1個(gè)循環(huán),進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。對(duì)被擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物通過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳后,使用qiaquickgelextractionkit純化pcr產(chǎn)物,制備得到phusp23l27-scfv-pd-1-1載體直鏈化片段。(連接反應(yīng))按照與上述[質(zhì)粒phusp3l22-scfv-pd-1-1的制作]中的(連接反應(yīng))同樣的順序,對(duì)上述載體片段實(shí)施連接反應(yīng),制備連接反應(yīng)液。(大腸菌的轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒dna的序列確認(rèn))按照與上述[質(zhì)粒phusp3l22-scfv-pd-1-1的制作]中的(大腸菌的轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒dna的序列確認(rèn))同樣的順序,使用上述連接反應(yīng)液10μl,進(jìn)行大腸菌hst08感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,實(shí)施測(cè)序反應(yīng)。將提取的質(zhì)粒命名為phusp23l27-scfv-pd-1-1。(雙歧桿菌屬細(xì)菌的轉(zhuǎn)化)使用從上述轉(zhuǎn)化的大腸菌提取的1000ng的質(zhì)粒phusp23l27-scfv-pd-1-1的dna,按照與上述[質(zhì)粒phusp3l22-scfv-pd-1-1的制作]中的(雙歧桿菌屬細(xì)菌的轉(zhuǎn)化)同樣的順序,進(jìn)行長(zhǎng)雙歧桿菌105-a株的轉(zhuǎn)化,得到長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp23l27-scfv-pd-1-1菌株。實(shí)施例2(重組雙歧桿菌屬細(xì)菌中的單鏈抗體的分泌的有無(wú)的研究1)針對(duì)上述實(shí)施例1中制作的根據(jù)3種抗pd-1-1單鏈抗體分泌質(zhì)粒的3種重組雙歧桿菌屬細(xì)菌(長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp3l22-scfv-pd-1-1菌株、長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-pd-1-1菌株、長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp23l27-scfv-pd-1-1菌株),如下所示,分別通過蛋白質(zhì)印跡分析實(shí)施了抗pd-1-1單鏈抗體的分泌確認(rèn)。將上述各重組雙歧桿菌屬細(xì)菌株的在含有75μg/ml壯觀霉素的bl-bs瓊脂培養(yǎng)基上的劃線培養(yǎng)物,接種至添加了壯觀霉素(終濃度75μg/ml)和維生素c添加液(每100ml中包含35g的抗壞血酸、2g的l-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物和11g的碳酸鈉的溶液)100μl的mrs(becton·dickinson社制造)液體培養(yǎng)基10ml上,在37℃下厭氧培養(yǎng)24小時(shí),得到活性化培養(yǎng)液。然后,在以9:1的比例混合了dmem(catno.11885-084:lifetechnologies社制造):mrs的培養(yǎng)基20ml上,按照維生素c添加液100μl、壯觀霉素75μg/ml添加,接種上述活性化培養(yǎng)液100μl。將其在37℃下厭氧培養(yǎng)18小時(shí)。將該厭氧培養(yǎng)后的活性化培養(yǎng)液離心分離后,回收培養(yǎng)上清。將該培養(yǎng)上清中的蛋白通過三氯乙酸(tca、和光純藥工業(yè)株式會(huì)社制造)沉淀,通過丙酮洗凈后,溶解至sds-page用緩沖液中,在95℃下熱處理3分鐘,得到培養(yǎng)上清濃縮物。針對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/pbe穿梭菌株也進(jìn)行同樣的操作,作為陰性對(duì)照。通過mini-protean(注冊(cè)商標(biāo))tgxtmgels(4~20%)(lifebio-rad社制造)對(duì)上述培養(yǎng)上清濃縮物(相當(dāng)于培養(yǎng)液1ml)進(jìn)行電泳,使用iblot轉(zhuǎn)印設(shè)備(lifetechnologies社制造),將凝膠轉(zhuǎn)印至pvdf膜(iblottransferstacks、lifetechnologies社制造)上。封閉(2%eclprimeblockingagent(gehealthcarejapan株式會(huì)社制造)inttbs)印跡完成后的膜之后,作為一抗使用小鼠組氨酸標(biāo)簽抗體(thehistagantibody、mab、mouse、genscriptjapan株式會(huì)社制造),作為二抗使用ecl-過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠抗體(gehealthcarejapan株式會(huì)社制造)進(jìn)行反應(yīng),使用westernlightningultra(perkinelmer社制造)使其發(fā)光。使用影像分析儀(fluorsmax、lifebio-rad社制造)對(duì)其進(jìn)行解析。結(jié)果如圖4所示。泳道m(xù)表示標(biāo)記,泳道1表示陰性對(duì)照,泳道2表示來(lái)自通過phusp3l22-scfv-pd-1-1被轉(zhuǎn)化的雙歧桿菌屬細(xì)菌的分泌抗體,泳道3表示來(lái)自通過phusp7l20-scfv-pd-1-1被轉(zhuǎn)化的雙歧桿菌屬細(xì)菌的分泌抗體,泳道4表示由通過phusp23l27-scfv-pd-1-1被轉(zhuǎn)化的雙歧桿菌屬細(xì)菌分泌出的抗體。(結(jié)果)由圖4可知,在通過插入有由分泌信號(hào)肽序列sp7和連接在其之后的20個(gè)氨基酸序列組成的、新的分泌信號(hào)肽-接頭連接體sp7l20的phusp7l20-scfv-pd-1-1被轉(zhuǎn)化的雙歧桿菌屬細(xì)菌中,確認(rèn)了抗pd-1-1單鏈抗體的分泌。而通過phusp3l22-scfv-pd-1-1或phusp23l27-scfv-pd-1-1被轉(zhuǎn)化的雙歧桿菌屬細(xì)菌中,未確認(rèn)抗pd-1-1單鏈抗體的分泌。實(shí)施例3[對(duì)33種分泌信號(hào)肽-接頭連接體的研究]對(duì)于上述phusp7l20-scfv-pd-1-1,構(gòu)建將分泌信號(hào)肽-接頭連接體sp7l20分別替換為33種分泌信號(hào)肽-接頭連接體(sp42l20~sp46l20、sp48l20~sp75l20)的33種抗pd-1-1單鏈抗體分泌質(zhì)粒。構(gòu)建方法的概要如圖3所示。使用的引物,具體如下述的表4和表5所示?!颈?】插入物體正向引物反向引物pcrproduet(bp)sp42l20sp42-ins_f1sp42-ins_r1177sp45l20sp45-ins_f1sp45-ins_r1192sp48l20sp48-ins_f1sp48-ins_r1168sp50l20sp50-ins_f1sp50-ins_r1258sp52l20sp52-ins_f1sp52-ins_r1195sp55l20sp55-ins_f1sp55-ins_r1234sp58l20sp58-ins_f1sp58-ins_r1186sp62l20sp62-ins_f1sp62-ins_r1222sp64l20sp64-ins_f1sp64-ins_r1183sp66l20sp65-ins_f1sp66-ins_r1168sp67l20sp67-ins_f1sp67-ins_r1189sp68l20sp68-ins_f1sp68-ins_r1219sp69l20sp69-ins_f1sp69-ins_r1180【表5】引物名序列(5->3)pd-1-scfv_vec_f1caggtccagctggtccagag(序列號(hào)53)hu_vec_r1aaagcatccttcttgggtcagg(序列號(hào)54)sp42-ins_f1caagaaggatgctttgtgcccgtgactacgcg(序列號(hào)55)sp42-ins_r1gaccagctggacctgtgccagcaaggtgcagag(序列號(hào)56)sp45-ins_f1caagaaggatgctttatgaagcacctctcccaccg(序列號(hào)57)sp45-ins_r1gaccagctggacctgatcgccgtcgcttccct(序列號(hào)58)sp48-ins_f1caagaaggatgctttgtgctgattctcatcgttctcg(序列號(hào)59)sp48-ins_r1gaccagctggacctggagcgcgttcaaagtgtcg(序列號(hào)60)sp50-ins_f1caagaaggatgctttatgatcgtggcctacccg(序列號(hào)61)sp50-ins_r1gaccagctggacctgttccatatcgttgtatggaaacgc(序列號(hào)62)sp52-ins_f1caagaaggatgctttatgagtttccatgtatccgcg(序列號(hào)63)sp52-ins_r1gaccagctggacctgcagttcgttatacgcgtgaccg(序列號(hào)64)sp55-ins_f1caagaaggatgctttatggttcgtcgcgccca(序列號(hào)65)sp55-ins_r1gaccagctggacctgccaggtggcgtagtcaacg(序列號(hào)66)sp58-ins_f1caagaaggatgctttatggcaatggcacggc(序列號(hào)67)sp58-ins_r1gaccagctggacctgggtggtttgcccgttgatg(序列號(hào)68)sp62-ins_f1caagaaggatgctttatgactcgttcggacgacgt(序列號(hào)69)sp62-ins_r1gaccagctggacctgcatgttgaacatcgaacgtttgg(序列號(hào)70)sp64-ins_f1caagaaggatgctttatgaagtcactaatcaggaatgtagcg(序列號(hào)71)sp64-ins_r1gaccagctggacctgcttcttgccgttgaacgcg(序列號(hào)72)sp66-ins_f1caagaaggatgctttgtgaagcattggaagaagatggc(序列號(hào)73)sp66-ins_r1gaccagctggacctgcttagtagtctgcactgtcccgg(序列號(hào)74)sp67-ins_f1caagaaggatgctttatgaagataaacaataagggcaagg(序列號(hào)75)sp67-ins_r1gaccagctggacctggggctggaacttggtgtatgtc(序列號(hào)76)sp68-ins_f1caagaaggatgctttatggtttataacattcacatattgcaaac(序列號(hào)77)sp68-ins_r1gaccagctggacctgcttccaaccattaagatcgtcttcg(序列號(hào)78)sp69-ins_f1caagaaggatgctttatgaattatttacgacaaaaaatttcgg(序列號(hào)79)sp69-ins_r1gaccagctggacctgaccgctatcagtcgtggtgtaac(序列號(hào)80)[分泌信號(hào)肽序列、和連接在其之后的連接肽序列的選定]對(duì)已登記在ncbi的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)中的來(lái)源于長(zhǎng)雙歧桿菌ncc2705株的蛋白的全長(zhǎng)氨基酸序列,通過用來(lái)預(yù)測(cè)分泌信號(hào)的有無(wú)的信號(hào)序列預(yù)測(cè)程序signalp4.1server(http://www.cbs.dtu.dk/services/signalp/)進(jìn)行解析。通過該解析,對(duì)于被預(yù)測(cè)在蛋白的n末端上有分泌信號(hào)肽序列的蛋白的一部分的氨基酸序列,在推定跨膜區(qū)域(tm)的程序tmhmmserverv.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm-2.0/)上進(jìn)行拓?fù)浣馕觥8鶕?jù)該拓?fù)浣馕鼋Y(jié)果,選定33種被推定在蛋白的n末端上存在tm的蛋白。將這33種蛋白,選定為來(lái)源于被預(yù)測(cè)具有tm的長(zhǎng)雙歧桿菌ncc2705菌株的分泌信號(hào)肽。在對(duì)應(yīng)于選定的33種肽的氨基酸序列的長(zhǎng)雙歧桿菌105a菌株的氨基酸序列中,將從各蛋白的氨基酸序列n末端到通過signalp解析被推定為蛋白酶切斷推定位點(diǎn)的氨基酸序列作為各分泌信號(hào)肽序列。另外,連接肽序列為連接在各信號(hào)序列的c末端后的20個(gè)氨基酸殘基。[質(zhì)粒phuspxl20-scfv-pd-1-1的制作](spxl20插入物的制備)以長(zhǎng)雙歧桿菌105-a株120pg為模板,使用表4和表5中記載的各引物組進(jìn)行pcr擴(kuò)增。各引物序列設(shè)計(jì)為插入物片段與載體片段的末端15bp重疊。按照引物濃度為0.2μm,反應(yīng)體積為20μl,使用primestarhs(premix)試劑盒進(jìn)行pcr擴(kuò)增。作為擴(kuò)增的程序,以98℃下10秒、65℃下5秒、72℃下20秒為1個(gè)循環(huán),進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后,在72℃下進(jìn)行30秒的延伸反應(yīng),上述33種分泌信號(hào)肽-接頭連接體插入物被擴(kuò)增。(載體的制備)以上述phusp7l20-scfv-pd-1-12.5ng為模板,使用上述表4和表5中記載的pd-1-scfv_vec_f1引物和hu_vec_r1引物組成的引物組,按照最終濃度為0.2μm,反應(yīng)體積為50μl,使用primestarhs(premix)試劑盒進(jìn)行pcr擴(kuò)增。作為擴(kuò)增的程序,以98℃下10秒、65℃下5秒、72℃下4分45秒為1個(gè)循環(huán),進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后,在72℃下進(jìn)行30秒的延伸反應(yīng)。通過該處理,制備得到5’-scfv-pd-1-1-h(huán)u終止子-ptb6repunit-spcmr-pucori-h(huán)u啟動(dòng)子-3’的載體片段。(in-fusion反應(yīng))使用in-fusion(注冊(cè)商標(biāo))hdcloningkit連接上述制備的載體片段和33種各分泌信號(hào)肽-接頭連接體插入物。即,將載體與插入物按照1:2的摩爾比添加至微型管中,添加試劑盒內(nèi)的5xin-fusionhdenzymepremix2μl,通過0.1×te緩沖液(1mmtris-h(huán)cl、0.1mmedta、ph7.5)調(diào)整為10μl。將其在37℃下保溫15分鐘后,進(jìn)一步在50℃下保溫15分鐘。其他的順序,遵循試劑盒的產(chǎn)品說明書,制備得到33種in-fusion反應(yīng)液。(大腸菌的轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒dna的序列確認(rèn))使用上述33種in-fusion反應(yīng)液0.8μl分別進(jìn)行大腸菌hst16cr感受態(tài)細(xì)胞(takarabio株式會(huì)社制造)的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的菌懸液,涂布于含有75μg/ml壯觀霉素的lb瓊脂培養(yǎng)基上,在37℃下靜置培養(yǎng)一晚。轉(zhuǎn)化條件參照大腸菌hst16cr感受態(tài)細(xì)胞的產(chǎn)品說明書,其概要如下。將形成于上述瓊脂培養(yǎng)基上的大腸菌菌落在含有75μg/ml壯觀霉素的lb液體培養(yǎng)基上37℃下培養(yǎng)一晩,然后使用qiaprepspinminiprepkit從其中提取質(zhì)粒。為了確定提取的質(zhì)粒的抗pd-1-1單鏈抗體表達(dá)盒(包含從hu啟動(dòng)子到hu終止子)序列,使用bigdye(注冊(cè)商標(biāo))terminatorv3.1cyclesequencingkit實(shí)施測(cè)序反應(yīng)。將提取的質(zhì)粒作為phuspxl20-scfv-pd-1-1(其中,x=42~46、48~75)。(雙歧桿菌屬細(xì)菌的轉(zhuǎn)化)對(duì)于從上述轉(zhuǎn)化的大腸菌提取的質(zhì)粒phuspxl20-scfv-pd-1-1(其中,x=42~46、48~75),分別使用500ng的dna,采用與上述[質(zhì)粒phusp3l22-scfv-pd-1-1的制作]中的(雙歧桿菌屬細(xì)菌的轉(zhuǎn)化)同樣的方法,進(jìn)行長(zhǎng)雙歧桿菌105-a株的轉(zhuǎn)化,得到長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phuspxl20-scfv-pd-1-1(其中,x=42~46、48~75)的各自的菌株。實(shí)施例4(重組雙歧桿菌屬細(xì)菌中的單鏈抗體的分泌的有無(wú)的研究2)對(duì)于上述實(shí)施例3中得到的各個(gè)作為重組雙歧桿菌屬細(xì)菌的長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phuspxl20-scfv-pd-1-1菌株(其中,x=42~46、48~75),采用與上述(重組雙歧桿菌屬細(xì)菌中的單鏈抗體的分泌的有無(wú)的研究1)同樣的方法,通過蛋白質(zhì)印跡分析對(duì)抗pd-1-1單鏈抗體的分泌進(jìn)行確認(rèn),結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,通過插入有下述11種(sp7l20、sp45l20、sp50l20、sp52l20、sp55l20、sp58l20、sp64l20、sp66l20、sp67l20、sp68l20、sp69l20)的各分泌信號(hào)肽-接頭連接體的抗pd-1-1單鏈抗體分泌質(zhì)粒而被轉(zhuǎn)化的長(zhǎng)雙歧桿菌105-a株中確認(rèn)了分泌。而通過插入有sp42、sp48、sp62的分泌信號(hào)肽序列和各自連接在其之后的20個(gè)氨基酸殘基組成的連接肽序列組成的sp42l20、sp48l20、sp62l20的各分泌信號(hào)肽-接頭連接體的質(zhì)粒而被轉(zhuǎn)化的雙歧桿菌屬細(xì)菌中,未確認(rèn)抗pd-1-1單鏈抗體的分泌。通過上述研究可知,能夠分泌單鏈抗體的雙歧桿菌屬細(xì)菌只有使用包含sp45l20、sp50l20、sp52l20、sp55l20、sp58l20、sp64l20、sp66l20、sp67l20、sp68l20、sp69l20的表達(dá)盒而轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。對(duì)于其他的23種序列,確認(rèn)不分泌、或是分泌不充分。作為不分泌、或是分泌不充分的分泌信號(hào)肽-接頭連接體的例子,將sp42l20、sp48l20、sp62l20的序列分別示于序列號(hào)17、18、19上。實(shí)施例5[phusp7l20-scfv-pd-1-2的制作]使用上述抗pd-1-2單鏈抗體作為異源肽,構(gòu)建了包含分泌信號(hào)肽-接頭連接體sp7l20的抗pd-1-2單鏈抗體分泌質(zhì)粒phusp7l20-scfv-pd-1-2。具體如下所示。(抗pd-1-2單鏈抗體插入物的制備)以上述人工合成的質(zhì)粒puc57-scfv-pd-1-2500pg為模板,使用上述表1和表2中所記載的lns_pd-1-2_f1引物和lns_pd-1-2_r1引物組成的引物組進(jìn)行pcr擴(kuò)增。引物序列設(shè)計(jì)為插入物片段與載體片段的末端15bp重疊。pcr反應(yīng)液使用primestarhs(premix)試劑盒,按照引物為0.2μm,反應(yīng)體積為30μl。作為擴(kuò)增的程序,以98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下60秒為1個(gè)循環(huán),進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。對(duì)被擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物,使用2%的瓊脂糖凝膠電泳后,使用qiaquickgelextractionkit純化,制備得到抗pd-1-2單鏈抗體插入物。(載體片段的制備)以序列號(hào)23中記載的載體直鏈化片段500pg為模板,采用上述表1和表2中記載的tga_h(yuǎn)u_terminator_f引物和vec-sp7l20-pd-1-2_r1引物組成的引物組,按照最終濃度為0.2μm,反應(yīng)體積為30μl,使用primestarhs(premix)試劑盒進(jìn)行pcr擴(kuò)增。作為擴(kuò)增的程序,以98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下5分鐘為1個(gè)循環(huán),進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。對(duì)被擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物通過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳后,使用qiaquickgelextractionkit純化,制備得到5’-h(huán)u終止子-ptb6repunit-spcmr-pucori-h(huán)u啟動(dòng)子-sp7l20-3’載體片段(2)。上述載體直鏈化片段,在序列號(hào)23的第4~第3845的堿基序列中,按照如下所示構(gòu)成hu終止子:序列號(hào)23的第4~第117的堿基序列雙歧桿菌屬細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)ptb6repunit:序列號(hào)23的第124~第1719的堿基序列壯觀霉素耐性基因spcmr:序列號(hào)23的第1726~第2804的堿基序列大腸菌復(fù)制起點(diǎn)pucori:序列號(hào)23的第2811~第3478的堿基序列hu啟動(dòng)子:序列號(hào)23的第3485~第3845的堿基序列。(in-fusion反應(yīng))除了使用上述制備的載體片段和抗pd-1-2單鏈抗體插入物之外,按照與上述[質(zhì)粒phusp3l20-scfv-pd-1-1的制作]中的in-fusion反應(yīng)同樣的順序制備得到in-fusion反應(yīng)液。(大腸菌的轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒dna的序列確認(rèn))除了使用上述制備的in-fusion反應(yīng)液5μl之外,按照與上述實(shí)施例1的[質(zhì)粒phusp3l20-scfv-pd-1-1的制作]的(大腸菌的轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒dna的序列確認(rèn))同樣的順序,進(jìn)行大腸菌hst08感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,為了確定提取的質(zhì)粒中的抗pd-1-2單鏈抗體表達(dá)盒(包含從hu啟動(dòng)子到hu終止子)序列,實(shí)施測(cè)序反應(yīng)。將提取的質(zhì)粒命名為phusp7l20-scfv-pd-1-2。(雙歧桿菌屬細(xì)菌的轉(zhuǎn)化)使用從上述轉(zhuǎn)化的大腸菌提取的1000ng的質(zhì)粒phusp7l20-scfv-pd-1-2的dna,按照與上述[質(zhì)粒phusp3l22-scfv-pd-1-1的制作]中的(雙歧桿菌屬細(xì)菌的轉(zhuǎn)化)同樣的順序,進(jìn)行長(zhǎng)雙歧桿菌105-a株的轉(zhuǎn)化,得到長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-pd-1-2菌株。實(shí)施例6[phusp7l20-scfv-pd-1-3的制作]選擇抗pd-1-3單鏈抗體作為異源肽,構(gòu)建了具有分泌信號(hào)肽-接頭連接體(sp7l20)的抗pd-1-3單鏈抗體分泌質(zhì)粒phusp7l20-scfv-pd-1-3。具體如下所示。(抗pd-1-3單鏈抗體插入物的制備)除了以上述人工合成的質(zhì)粒puc57-scfv-pd-1-3500pg為模板,使用上述表1和表2中記載的lns_pd-1-3_f1引物和lns_pd-1-3_r1引物組成的引物組之外,按照與上述[phusp7l20-scfv-pd-1-2的制作]的(抗pd-1-2單鏈抗體插入物的制備)同樣的順序,制備得到抗pd-1-3單鏈抗體插入物。(載體片段的制備)除了以序列號(hào)24中記載的載體直鏈化片段500pg為模板,使用上述表1和表2中記載的tga_h(yuǎn)u_terminator_f引物和vec-sp7l20-pd-1-3_r1引物組成的引物組之外,按照與phusp7l20-scfv-pd-1-2的制作]的(載體片段的制備)同樣的順序,制備得到5’-h(huán)u終止子-ptb6repunit-spcmr-pucori-h(huán)u啟動(dòng)子-sp7l20-3’載體片段(3)。上述載體直鏈化片段,在序列號(hào)24的第4-第3845的堿基序列中,由下述堿基序列構(gòu)成。hu終止子:序列號(hào)24的第4-第117的堿基序列雙歧桿菌屬細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)ptb6repunit:序列號(hào)24的第124-第1719的堿基序列壯觀霉素耐性基因spcmr:序列號(hào)24的第1726-第2804的堿基序列大腸菌復(fù)制起點(diǎn)pucori:序列號(hào)24的第2811-第3478的堿基序列hu啟動(dòng)子:序列號(hào)24的第3485-第3845的堿基序列。(in-fusion反應(yīng))除了使用上述制備的載體片段和抗pd-1-3單鏈抗體插入物之外,按照與上述[質(zhì)粒phusp3l20-scfv-pd-1-1的制作]中的in-fusion反應(yīng)同樣的順序,制備得到in-fusion反應(yīng)液。(大腸菌的轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒dna的序列確認(rèn))除了使用上述制備的in-fusion反應(yīng)液5μl之外,按照與上述實(shí)施例1的[質(zhì)粒phusp3l20-scfv-pd-1-1的制作]的(大腸菌的轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒dna的序列確認(rèn))中同樣的順序,進(jìn)行大腸菌hst08感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,為了確定提取的質(zhì)粒中的抗pd-1-3單鏈抗體表達(dá)盒(包含從hu啟動(dòng)子到hu終止子)序列,實(shí)施測(cè)序反應(yīng),將提取的質(zhì)粒命名為phusp7l20-scfv-pd-1-3。(雙歧桿菌屬細(xì)菌的轉(zhuǎn)化)使用從上述轉(zhuǎn)化的大腸菌提取的1000ng的質(zhì)粒phusp7l20-scfv-pd-1-3的dna,按照與上述[質(zhì)粒phusp3l22-scfv-pd-1-1的制作]中的(雙歧桿菌屬細(xì)菌的轉(zhuǎn)化)同樣的順序,進(jìn)行長(zhǎng)雙歧桿菌105-a株的轉(zhuǎn)化,得到長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-pd-1-3菌株。實(shí)施例7[phusp7l20-scfv-ctla-4-1的制作]構(gòu)建了具有分泌信號(hào)肽-接頭連接體sp7l20的抗ctla-4-1單鏈抗體分泌質(zhì)粒phusp7l20-scfv-ctla-4-1。抗ctla-4單鏈抗體分泌質(zhì)粒的制作概要如圖2所示。在圖2左側(cè)上,scfv-gene是ctla-4,在phusp7l20-scfv-ctla-4-1的制作中,x=7、m=1,在phusp7l20-scfv-ctla-4-2的制作中,x=7、m=2。具體如下。[抗ctla-4單鏈抗體的表達(dá)盒]抗ctla-4單鏈抗體的表達(dá)盒如圖1(b)所示,由hu啟動(dòng)子dna(來(lái)源于長(zhǎng)雙歧桿菌)、編碼分泌信號(hào)肽的dna和編碼連接在所述分泌信號(hào)肽之后的連接肽的dna、編碼抗ctla-4單鏈抗體(包含重鏈序列、接頭((ggggs)3)、輕鏈序列)的dna、his標(biāo)簽序列、和hu終止子(來(lái)源于長(zhǎng)雙歧桿菌)構(gòu)成。各表達(dá)盒中的抗ctla-4單鏈抗體(包含含有重鏈序列、接頭((ggggs)3)、輕鏈序列的堿基序列)如下所示,參照下述表6所示的文獻(xiàn),使用了2種抗人ctla-4單鏈抗體【表6】對(duì)于序列號(hào)4所示的scfv-ctla-4-1和序列號(hào)5所示的scfv-ctla-4-2的各單鏈抗體基因,在genscriptjapan株式會(huì)社被亞克隆至大腸菌用質(zhì)粒puc57上,人工基因合成為質(zhì)粒puc57-scfv-ctla-4-1和puc57-scfv-ctla-4-2。(抗ctla-4-1單鏈抗體插入物的制備)以質(zhì)粒puc57-scfv-ctla-4-1500pg為模板,使用上述表1和表2中記載的lns_ctla-4-1_f1引物和lns_ctla-4-1_r1引物組成的引物組進(jìn)行pcr擴(kuò)增。引物序列設(shè)計(jì)為插入物片段和載體片段的末端15bp重疊。pcr反應(yīng)液,按照引物為0.2μm,反應(yīng)體積為30μl,使用primestarhs(premix)(takarabio株式會(huì)社)試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。作為擴(kuò)增的程序,以98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下60秒為1個(gè)循環(huán),進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。對(duì)被擴(kuò)增的插入物pcr產(chǎn)物,通過2%的瓊脂糖凝膠電泳后,使用qiaquickgelextractionkit純化,制備得到抗ctla-4-1單鏈抗體插入物。(載體片段的制備)按照與所述[phusp7l20-scfv-pd-1-1的制作]的(載體片段的制備)同樣的順序,制備得到5’-h(huán)u終止子-ptb6repunit-spcmr-pucori-h(huán)u啟動(dòng)子-sp7l20-3’載體片段(1)。(in-fusion反應(yīng))除了使用上述制備的載體片段與上述抗ctla-4-1單鏈抗體插入物之外,采用與上述[質(zhì)粒phusp3l20-scfv-pd-1-1的制作]中的in-fusion反應(yīng)同樣的順序制備得到in-fusion反應(yīng)液。(大腸菌的轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒dna的序列確認(rèn))除了使用上述制備的in-fusion反應(yīng)液5μl之外,按照與上述[質(zhì)粒phusp3l20-scfv-pd-1-1的制作]的(大腸菌的轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒dna的序列確認(rèn))同樣的順序,進(jìn)行大腸菌hst08感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,為了確定提取的質(zhì)粒中的抗ctla-4-1單鏈抗體表達(dá)盒(包含從hu啟動(dòng)子到hu終止子)序列,實(shí)施測(cè)序反應(yīng),將提取的質(zhì)粒命名為phusp7l20-scfv-ctla-4-1。(雙歧桿菌屬細(xì)菌的轉(zhuǎn)化)除了使用從上述轉(zhuǎn)化的大腸菌提取的質(zhì)粒phusp7l20-scfv-ctla-4-11000ng的dna之外,采用與上述[phusp3l22-scfv-pd-1-1的制作]中的(雙歧桿菌屬細(xì)菌的轉(zhuǎn)化)同樣的方法,進(jìn)行長(zhǎng)雙歧桿菌105-a株的轉(zhuǎn)化,得到長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-ctla-4-1菌株。實(shí)施例8[phusp7l20-scfv-ctla-4-2的制作]構(gòu)建具有分泌信號(hào)肽-接頭連接體(sp7l20)的抗ctla-4-2單鏈抗體分泌質(zhì)粒phusp7l20-scfv-ctla-4-2。具體如下。(抗ctla-4-2單鏈抗體插入物的制備)除了以上述質(zhì)粒puc57-scfv-ctla-4-2為模板,使用上述表1和表2中記載的lns_ctla-4-1_f1引物和lns_ctla-4-2_r1引物組組成的引物組之外,按照與上述(抗ctla-4-1單鏈抗體插入物的制備)同樣的順序,純化抗ctla-4-2單鏈抗體插入物。(載體的制備)按照與所述[phusp7l20-scfv-pd-1-1的制作]的(載體片段的制備)同樣的順序制備得到5’-h(huán)u終止子-ptb6repunit-spcmr-pucori-h(huán)u啟動(dòng)子-sp7l20-3’載體片段(1)。(in-fusion反應(yīng))除了使用上述制備的載體片段和上述抗ctla-4-2單鏈抗體插入物之外,按照與上述[質(zhì)粒phusp3l20-scfv-pd-1-1的制作]中的in-fusion反應(yīng)同樣的順序制備得到in-fusion反應(yīng)液。(大腸菌的轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒dna的序列確認(rèn))除了使用上述制備的in-fusion反應(yīng)液5μl之外,按照與所述實(shí)施例1的[質(zhì)粒phusp3l20-scfv-pd-1-1的制作]的(大腸菌的轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒dna的序列確認(rèn))同樣的順序,進(jìn)行大腸菌hst08感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,為了確定提取的質(zhì)粒中的抗ctla-4-2單鏈抗體表達(dá)盒(包含從hu啟動(dòng)子到hu終止子)序列,實(shí)施測(cè)序反應(yīng),將提取的質(zhì)粒命名為phusp7l20-scfv-ctla-4-2。(雙歧桿菌屬細(xì)菌的轉(zhuǎn)化)除了使用從上述轉(zhuǎn)化的大腸菌提取的1000ng的質(zhì)粒phusp7l20-scfv-ctla-4-2之外,采用與上述[phusp3l22-scfv-pd-1-1的制作]中的(雙歧桿菌屬細(xì)菌的轉(zhuǎn)化)同樣的方法,進(jìn)行長(zhǎng)雙歧桿菌105-a株的轉(zhuǎn)化,得到長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-ctla-4-2菌株。實(shí)施例9(重組雙歧桿菌屬細(xì)菌中的單鏈抗體的分泌的有無(wú)的研究3)對(duì)于作為根據(jù)抗pd-1單鏈抗體分泌質(zhì)粒和抗ctla-4單鏈抗體分泌質(zhì)粒的重組雙歧桿菌屬細(xì)菌的、長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-pd-1-1菌株、長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-pd-1-2菌株、長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-pd-1-3菌株、長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-ctla-4-1菌株和長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-ctla-4-2菌株,采用與上述(重組雙歧桿菌屬細(xì)菌中的單鏈抗體的分泌的有無(wú)的研究1)同樣的方法,通過蛋白質(zhì)印跡分析實(shí)施抗pd-1單鏈抗體和抗ctla-4單鏈抗體的分泌確認(rèn)。其中,培養(yǎng)時(shí)間設(shè)為15小時(shí)。結(jié)果如圖6所示。(結(jié)果)由圖6可知,長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-pd-1-1菌株的培養(yǎng)上清中確認(rèn)了抗pd-1-1單鏈抗體的分泌,長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-pd-1-2菌株的培養(yǎng)上清中確認(rèn)了抗pd-1-2單鏈抗體的分泌,長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-pd-1-3菌株的培養(yǎng)上清中確認(rèn)了抗pd-1-3單鏈抗體的分泌,長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-ctla-4-1菌株的培養(yǎng)上清中確認(rèn)了抗ctla-4-1單鏈抗體的分泌,長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-ctla-4-2菌株的培養(yǎng)上清中確認(rèn)了抗ctla-4-2單鏈抗體的分泌。實(shí)施例10[來(lái)自重組雙歧桿菌屬細(xì)菌株的抗pd-1及抗ctla-4單鏈抗體的純化]針對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-pd-1-1菌株、長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-pd-1-2菌株、長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-pd-1-3菌株、長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-ctla-4-1菌株和長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-ctla-4-2菌株,按照如下所示的方法進(jìn)行單鏈抗體的純化。將上述各重組雙歧桿菌屬細(xì)菌株接種至添加了壯觀霉素(終濃度75μg/ml)和維生素c添加液100μl的mrs培養(yǎng)基10ml中,在37℃下厭氧培養(yǎng)24小時(shí)。向dmem:mrs(9:1)培養(yǎng)基上添加壯觀霉素(終濃度75μg/ml)、維生素c添加液(每100ml培養(yǎng)基中500μl)進(jìn)行調(diào)整,按照培養(yǎng)基量的0.5%的量向其接種上述培養(yǎng)液,在37℃下厭氧培養(yǎng)18小時(shí)。一邊攪拌將上述厭氧培養(yǎng)后的培養(yǎng)液離心分離得到的培養(yǎng)上清,一遍慢慢添加硫酸銨至80%飽和,在4℃下攪拌一晚進(jìn)行鹽析。將其離心分離后,回收沉淀,通過帶組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的純化試劑盒(talonresin、takarabio株式會(huì)社制造)純化組氨酸標(biāo)簽融合蛋白。通過超濾(amiconultra0.5、merckmillipore社制造)對(duì)該純化溶液進(jìn)行濃縮。采用bradford法測(cè)量純化蛋白質(zhì)的濃度(coomassieplusproteinassay、thermoscientific社制造)。使用部分上述純化單鏈抗體sds-page后,進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色(simplyblue(注冊(cè)商標(biāo))safestain、lifetechnologies社制造),確認(rèn)了scfv-pd-1-1、scfv-pd-1-2、scfv-pd-1-3、scfv-ctla4-1、和scfv-ctla4-2的各單鏈抗體被純化為了約9成的純度。實(shí)施例11[人pd-1與抗pd-1單鏈抗體或抗ctla-4單鏈抗體的結(jié)合的有無(wú)的確認(rèn)]針對(duì)由長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-pd-1-2菌株的培養(yǎng)上清純化的抗pd-1-2單鏈抗體,采用elisa法,進(jìn)行了與人pd-1(hpd-1)的結(jié)合的有無(wú)的確認(rèn)。向96孔板中,按照每次100μl,分別注入通過1×pbs調(diào)整為1μg/ml的hpd-1(recombinanthumanpd-1fcchimera、r&dsystems社制造),通過在4℃下靜置一晚固相化。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。通過向上述板中按照每次350μl分別注入1%的bsa溶液,在室溫下靜置2小時(shí),實(shí)施封閉。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。通過信號(hào)增強(qiáng)試劑(signalenhancerhikari、nacalaitesque社制造)將抗pd-1-2單鏈抗體調(diào)整為1000ng/ml、100ng/ml、10ng/ml和1ng/ml,按照每次100μl,分別注入至上述封閉完畢后的板中。作為陰性對(duì)照,對(duì)由雙歧桿菌屬細(xì)菌純化的抗ctla-4-1單鏈抗體、抗ctla-4-2單鏈抗體,也進(jìn)行了與上述一樣的調(diào)整。向空白的孔中僅注入100μl信號(hào)增強(qiáng)試劑。將板貼上密封,室溫下靜置2小時(shí)后,使固相化的hpd-1與各單鏈抗體反應(yīng)。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。通過信號(hào)增強(qiáng)試劑將二抗(thehis-tagantibody、genscript社制造)稀釋至2500倍,將其按照每次100μl分別注入。將板貼上密封,室溫下靜置2小時(shí)。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。通過信號(hào)增強(qiáng)試劑將三抗(biotinanti-mouseigg、biolegend社制造)稀釋至20,000倍,將其按照每次100μl分別注入。將板貼上密封,室溫下靜置30分鐘。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。作為抗生物素蛋白-生物素標(biāo)記酶復(fù)合物(vectastainabckit,vector社制造),將a液和b液各滴入3滴至信號(hào)增強(qiáng)試劑7.5ml中。將其按照每次100μl分別注入后,將板貼上密封,室溫下靜置30分鐘。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。將colorsolutiona和colorsolutionb(r&dsystems社制造)等量混合作為檢測(cè)試劑,按照每次200μl分別注入,遮光,在室溫下靜置20分鐘。準(zhǔn)確經(jīng)過20分鐘后,按照每次50μl添加終止液(r&dsystems社制造),使顯色反應(yīng)停止。測(cè)量的是450nm處的吸光度,并將570nm處作為對(duì)照。對(duì)于使用elisa法的抗pd-1-2單鏈抗體、抗ctla-4-1單鏈抗體、抗ctla-4-2單鏈抗體與人pd-1固相板的結(jié)合的有無(wú)的結(jié)果,如下表7和圖7所示。【表7】(結(jié)果)由表7和圖7清楚可知,由雙歧桿菌屬細(xì)菌純化的抗pd-1-2單鏈抗體表現(xiàn)出了濃度依賴性地與hpd-1結(jié)合。而同樣由雙歧桿菌屬細(xì)菌純化的抗ctla-4-1單鏈抗體和抗ctla-4-2單鏈抗體沒有與hpd-1結(jié)合。根據(jù)該結(jié)果,確認(rèn)了雙歧桿菌屬細(xì)菌分泌的抗pd-1-2單鏈抗體(抗人pd-1抗體)特異性地與hpd-1結(jié)合。實(shí)施例12[人ctla-4與抗pd-1單鏈抗體或抗ctla-4單鏈抗體的結(jié)合的有無(wú)的確認(rèn)]使用由上述培養(yǎng)上清純化的抗pd-1-2單鏈抗體、和抗ctla-4-1單鏈抗體及抗ctla-4-2單鏈抗體,按照與上述[人pd-1與抗pd-1單鏈抗體或抗ctla-4單鏈抗體的結(jié)合的有無(wú)的確認(rèn)]同樣的順序進(jìn)行了與人ctla-4(hctla-4)(recombinanthumanctla-4-fcchimera、carrier-freebiolegend社制造)的結(jié)合的有無(wú)的確認(rèn)。對(duì)于抗pd-1-2單鏈抗體、和抗ctla-4-1單鏈抗體及抗ctla-4-2單鏈抗體與人ctla-4固相板的結(jié)合的有無(wú)的結(jié)果,示于下述表8和圖8中?!颈?】(結(jié)果)由表8和圖8清楚可知,抗ctla-4-1單鏈抗體和抗ctla-4-2單鏈抗體表現(xiàn)出了濃度依賴性地與hctla-4結(jié)合。而同樣由雙歧桿菌屬細(xì)菌純化的抗pd-1-2單鏈抗體沒有與hctla-4結(jié)合。根據(jù)該結(jié)果,確認(rèn)了雙歧桿菌屬細(xì)菌分泌的抗ctla-4-1單鏈抗體和抗ctla-4-2單鏈抗體(均為抗人ctla-4抗體)特異性地與hctla-4結(jié)合。實(shí)施例13(小鼠pd-1和抗pd-1-3單鏈抗體的結(jié)合的有無(wú)的確認(rèn)1)針對(duì)由上述長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-pd-1-3菌株的培養(yǎng)上清純化的抗pd-1-3單鏈抗體和小鼠pd-1(mpd-1)的結(jié)合的有無(wú),通過下述的elisa法進(jìn)行了確認(rèn)。向96孔板中,按照每次100μl分別注入通過1×pbs調(diào)整為了1μg/ml的mpd-1(recombinantmousepd-1fcchimera、r&dsystems社制造),通過在4℃下靜置一晚固相化。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。向上述板中按照每次350μl分別注入1%bsa溶液,在室溫下靜置2小時(shí),進(jìn)行封閉。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。通過信號(hào)增強(qiáng)試劑(signalenhancerhikari、nacalaitesque社制造)對(duì)由雙歧桿菌屬細(xì)菌純化的抗pd-1-3單鏈抗體進(jìn)行調(diào)整,調(diào)整為1000ng/ml、100ng/ml及10ng/ml,按照每次100μl分別注入至上述封閉完畢后的板中。作為對(duì)照,針對(duì)由雙歧桿菌屬細(xì)菌純化的抗pd-1-2單鏈抗體和由雙歧桿菌屬細(xì)菌純化的抗ctla-4-2單鏈抗體,也進(jìn)行與上述同樣的調(diào)整。向空白的孔中僅注入100μl信號(hào)增強(qiáng)試劑。將板貼上密封,室溫下靜置2小時(shí)后,使固相化的mpd-1與抗pd-1-3單鏈抗體反應(yīng)。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。通過信號(hào)增強(qiáng)試劑將二抗(anti-h(huán)is-tagmab-biotin、mbl)稀釋至2000倍,將其按照每次100μl分別注入。將板貼上密封,室溫下靜置2小時(shí)。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。使用所述抗生物素蛋白-生物素標(biāo)記酶復(fù)合物,將試劑盒的a液和b液各滴入3滴至信號(hào)增強(qiáng)試劑7.5ml中。將其按照每次100μl分別注入后,將板貼上密封,室溫下靜置30分鐘。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。將colorsolutiona和colorsolutionb(r&dsystems社制造)等量混合作為檢測(cè)試劑,按照各200μl分別注入后,遮光,在室溫下靜置20分鐘。準(zhǔn)確經(jīng)過20分鐘后,按照每次50μl添加終止液(r&dsystems社制造),使顯色反應(yīng)停止。測(cè)量的是450nm處的吸光度,并將570nm處作為對(duì)照。對(duì)于抗pd-1-2單鏈抗體、抗pd-1-3單鏈抗體、抗ctla-4-2單鏈抗體與小鼠pd-1固相板的結(jié)合的有無(wú)的結(jié)果,如下表9和圖9所示?!颈?】(結(jié)果)抗pd-1-3單鏈抗體表現(xiàn)出了濃度依賴性地與mpd-1結(jié)合。而同樣純化的抗pd-1-2單鏈抗體和抗ctla-4-2單鏈抗體則沒有與mpd-1結(jié)合。由此表明,雙歧桿菌屬細(xì)菌分泌的抗pd-1-3單鏈抗體(抗小鼠pd-1抗體)與mpd-1特異性地結(jié)合。實(shí)施例14(小鼠pd-1與抗pd-1-3單鏈抗體的結(jié)合的有無(wú)的確認(rèn)2)針對(duì)由長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-pd-1-3菌株的培養(yǎng)上清純化的抗pd-1-3單鏈抗體,確認(rèn)了其與小鼠pd-1(mpd-1)的結(jié)合的特異性。將在板上固相化的蛋白設(shè)為hctla-4(recombinanthumanctla-4-fcchimeracarrier-free、biolegend社制造),實(shí)施與上述[實(shí)施例13]相同的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表10和圖10所示。(結(jié)果)由表10和圖10清楚可知,陽(yáng)性對(duì)照的抗ctla-4-2單鏈抗體表現(xiàn)出濃度依賴性地與hctla-4結(jié)合,但是抗pd-1-3單鏈抗體沒有結(jié)合。此外,作為抗人pd-1抗體的抗pd-1-2單鏈抗體也沒有結(jié)合。這些結(jié)果也表明,上述[實(shí)施例13]中的mpd-1和抗pd-1-3單鏈抗體的結(jié)合是特異的?!颈?0】實(shí)施例15(抗pd-1-2單鏈抗體與人pd-1的根據(jù)流式細(xì)胞儀解析的結(jié)合的有無(wú)的確認(rèn))抗pd-1-2單鏈抗體與人pd-1過量表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合使用過量表達(dá)人pd-1的jurkat細(xì)胞(信州大學(xué)分子腫瘤學(xué)講座谷口俊一郎教授提供)、和過量表達(dá)人pd-1的hek293t細(xì)胞(信州大學(xué)分子腫瘤學(xué)講座谷口俊一郎教授提供)進(jìn)行了研究。將人pd-1過量表達(dá)jurkat細(xì)胞按照5×106cells/10ml培養(yǎng)基(包含滅活后的10%的胎牛血清、50μm的2-巰基乙醇和8mmhepes的rpmi1640培養(yǎng)基)/dish播種至100mm皮氏培養(yǎng)皿(ina·optika社)上,人pd-1過量表達(dá)hek293t細(xì)胞按照2×106cells/10ml培養(yǎng)基(包含滅活后的10%的胎牛血清的dmem培養(yǎng)基)播種至100mm培養(yǎng)皿(greiner·japan社制造)上。第二天,將人pd-1過量表達(dá)jurkat細(xì)胞回收至15ml的falcon管(becton·dickinson社制造)中后,通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算細(xì)胞數(shù)量,按照1×105cells/ml/tube分別注入至1.5ml的管(ina·optika社制造)中。人pd-1過量表達(dá)hek293t細(xì)胞,除去培養(yǎng)上清,通過pbs(無(wú)ca2+、mg2+的磷酸緩沖液)洗凈2次,加入通過pbs稀釋至10倍的胰蛋白酶·edta溶液(wako社制造)1ml,室溫下靜置1分鐘后,加入包含10ml的滅活后的10%的胎牛血清的dmem培養(yǎng)基,移至15ml的falcon管中。通過低速離心機(jī)(tomy精工社制造)在1000rpm下,離心5分鐘后,除去上清,加入包含1ml的滅活后的10%的胎牛血清的dmem培養(yǎng)基,計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。進(jìn)一步添加dmem培養(yǎng)基,按照1×105cells/ml制備細(xì)胞懸液,然后按照1×105cells/ml/tube,分別注入至1.5ml管(ina·optika社)中。將分別注入至1.5ml管的pd-1過量表達(dá)jurkat細(xì)胞和hek293t細(xì)胞通過微量冷卻離心機(jī)(tomy精工社制造)在5000rpm、4℃下離心1分鐘,離心后除去上清。通過0.5ml的pbs對(duì)殘留在管中的細(xì)胞的顆粒洗凈2次后,將抗pd-1-2單鏈抗體和作為陽(yáng)性對(duì)照的leafpurifiedanti-h(huán)umanpd-1抗體(克?。篹h12.2h7)(biolegend社制造)按照10μg/ml的濃度添加50μl,在冰上靜置30分鐘。將facs緩沖液(包含1%bsa、0.1%nan3的pbs)加入至500μl的管中,通過上述微量冷卻離心機(jī),在5000rpm、4℃下離心1分鐘,離心后除去上清。將通過滅菌超純水稀釋為1μg/ml的生物素化蛋白l(pierce社制造)50μl加入至1.5ml的管中,通過移液充分混合,在冰上靜置30分鐘。30分鐘后,將facs緩沖液(包含1%的bsa、0.1%的nan3的pbs)500μl加入至管中,通過微量冷卻離心機(jī)在5000rpm、4℃下離心1分鐘,除去離心后上清。將通過facs緩沖液稀釋至5μg/ml的brilliantviolet421streptavidin(biolegend社制造)50μl添加至1.5ml的管中后,通過移液充分混合,在冰上靜置15分鐘。15分鐘后,通過微量冷卻離心機(jī)在5000rpm、4℃下離心1分鐘后除去上清,添加500μl的facs緩沖液后,將通過facs緩沖液懸浮的細(xì)胞移至5ml的聚苯乙烯圓底管(becton·dickinson社制造)中。添加通過facs緩沖液稀釋至5μg/ml的碘化丙啶溶液5μl,通過bdfacscantoii流式細(xì)胞儀(becton·dickinson社制造)和流式細(xì)胞儀解析軟件kaluzaver1.2(beckmancoulter社制造)進(jìn)行解析。結(jié)果如圖11和圖12所示。(結(jié)果)由圖11清楚可知,確認(rèn)了過量表達(dá)pd-1的jurkat細(xì)胞上有抗pd-1-2單鏈抗體結(jié)合。而未表達(dá)pd-1的jurkat-mock細(xì)胞上,未確認(rèn)抗pd-1-2單鏈抗體的結(jié)合。另外,由圖12清楚可知,確認(rèn)了抗pd-1-2單鏈抗體和抗人pd-1抗體(克隆:eh12.2h7)與過量表達(dá)人pd-1的hek293t-pd-1細(xì)胞的結(jié)合。但是,未確認(rèn)抗pd-1-2單鏈抗體和抗人pd-1抗體(克隆:eh12.2h7)與未表達(dá)pd-1的hek293t-mock細(xì)胞的結(jié)合。實(shí)施例16(使用elisa法的抗ctla-4單鏈抗體對(duì)于人ctla-4與cd80和cd86的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制活性的確認(rèn))使用上述實(shí)施例7和8中制作的重組雙歧桿菌屬細(xì)菌分泌的抗ctla-4-1單鏈抗體和抗ctla-4-2單鏈抗體,來(lái)確認(rèn)對(duì)于人ctla-4(hctla-4)與人cd80(hcd80)或人cd86(hcd86)的結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制活性。使用抗pd-1-2單鏈抗體作為陰性對(duì)照。向96孔板中,按照每次100μl分別注入通過1×pbs調(diào)整為1μg/ml的hctla-4(recombinanthumanctla-4-fcchimera、carrier-free、biolegend社制造),通過在4℃下靜置一晚固相化。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。向上述板中按照每次350μl分別注入1%的bsa溶液,在室溫下靜置2小時(shí),進(jìn)行封閉。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。將hcd80(recombinanthumanb7-1/cd80fcchimera、r&dsystems社制造)和hcd86(recombinanthumanb7-2/cd86fcchimera、r&dsystems社制造)通過信號(hào)增強(qiáng)試劑(signalenhancerhikari,nacalaitesque社制造)調(diào)整為2000ng/ml。將由雙歧桿菌屬細(xì)菌純化的抗ctla-4-1抗體和抗ctla-4-2單鏈抗體通過信號(hào)增強(qiáng)試劑調(diào)整為20000ng/ml、2000ng/ml、200ng/ml、20ng/ml和2ng/ml,按照每次110μl與調(diào)整后的hcd80和hcd86等量混合后,按照每次100μl分別注入至上述封閉完畢后的板中。作為陰性對(duì)照,對(duì)由雙歧桿菌屬細(xì)菌純化的抗pd-1-2單鏈抗體也與上述一樣進(jìn)行調(diào)整。向空白的孔中僅注入100μl信號(hào)增強(qiáng)劑。將板貼上密封,在室溫下靜置2小時(shí)后,使固相化的hctla-4與和抗ctla-4單鏈抗體、抗ctla-4-2單鏈抗體混合的hcd80和hcd86反應(yīng)。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。將相對(duì)于hcd80的二抗(humanb7-1/cd80biotinylatedantibody、r&dsystems社制造)和相對(duì)于hcd86的二抗(biotinylatedanti-humanb7-2antibody、r&dsystems社制造)通過信號(hào)增強(qiáng)試劑調(diào)整為2.5μg/ml和0.5μg/ml,按照每次100μl分別注入。將板貼上密封,室溫下靜置30分鐘。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。作為所述抗生物素蛋白-生物素標(biāo)記酶復(fù)合物,將a液和b液各滴入3滴至信號(hào)增強(qiáng)試劑7.5ml中。將其按照每次100μl分別注入,將板貼上密封,在室溫下靜置30分鐘。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。將colorsolutiona和colorsolutionb(r&dsystems社制造)等量混合作為檢測(cè)試劑,按照每次200μl分別注入后,遮光,在室溫下靜置20分鐘。準(zhǔn)確經(jīng)過20分鐘后,按照每次50μl添加終止液(r&dsystems社制造),使顯色反應(yīng)停止。測(cè)量的是450nm處的吸光度,并將570nm處作為對(duì)照。測(cè)量結(jié)果如表11和表12所示,抑制率如圖13和圖14所示?!颈?1】使用elisa法的抗ctla-4-1單鏈抗體和抗ctla-4-2單鏈抗體的相對(duì)于人ctla-4(固相)的與hcd80的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合(拮抗抑制率)【表12】使用elisa法的抗ctla-4-1單鏈抗體和抗ctla-4-2單鏈抗體對(duì)于人ctla-4(固相)與hcd86的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合(拮抗抑制率)(結(jié)果)針對(duì)hcd80與hctla-4的結(jié)合的抑制率,在1μg/ml的抗ctla-4-1單鏈抗體和抗ctla-4-2單鏈抗體中分別是61.7%和73.1%,在10μg/ml中分別是94.1%和99.3%。另外,針對(duì)hcd86與hctla-4的結(jié)合的抑制率,在1μg/ml的抗ctla-4-1單鏈抗體和抗ctla-4-2單鏈抗體中分別是83.7%和90.9%,在10μg/ml中分別是96.0%和97.7%。由以上結(jié)果可知,針對(duì)1μg/ml的hcd80和hcd86與hctla-4的結(jié)合,抗ctla-4-1單鏈抗體和抗ctla-4-2單鏈抗體均顯示出在1μg/ml以上的濃度下競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合抑制。實(shí)施例17[相對(duì)于小鼠pd-1與小鼠pd-l1的結(jié)合反應(yīng)的抗小鼠pd-1單鏈抗體的競(jìng)爭(zhēng)性抑制活性]使用實(shí)施例6中制作的長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-pd-1-3菌株分泌的抗小鼠pd-1單鏈抗體,通過elisa法,針對(duì)小鼠pd-1(mpd-1)與小鼠pd-l1(mpd-l1)的結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制活性進(jìn)行了確認(rèn)。使用抗人ctla-4-2單鏈抗體作為陰性對(duì)照。向96孔板中,按照每次100μl,分別注入通過1×pbs調(diào)整為1μg/ml的所述mpd-1,通過在4℃下靜置一晚固相化。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。向上述板中按照每次350μl分別注入1%的bsa溶液,在室溫下靜置2小時(shí)進(jìn)行封閉。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。將mpd-l1(recombinantmouseb7-h1/pd-l1fcchimera、r&dsystems社制造)通過信號(hào)增強(qiáng)試劑(signalenhancerhikari、nacalaitesque社制造)調(diào)整為2000ng/ml。將由長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-pd-1-3菌株純化的抗小鼠pd-1單鏈抗體通過信號(hào)增強(qiáng)試劑調(diào)整為20000ng/ml、2000ng/ml、200ng/ml和20ng/ml,與mpd-l1等量混合,按照每次100μl,分別注入至上述封閉完畢后的板中。作為陰性對(duì)照,對(duì)由雙歧桿菌屬細(xì)菌純化的抗人ctla-4-2單鏈抗體也進(jìn)行與上述同樣的調(diào)整。向空白的孔中僅注入100μl信號(hào)增強(qiáng)劑。將板貼上密封,在室溫下靜置2小時(shí),使固相化的mpd-1與和抗小鼠pd-1單鏈抗體混合的mpd-l1反應(yīng)。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。通過信號(hào)增強(qiáng)試劑將相對(duì)于mpd-l1的二抗(biotinanti-mousecd274,biolegend社制造)調(diào)整為10ng/ml,將其按照每次100μl分別注入。將板貼上密封,在室溫下靜置30分鐘。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。作為所述抗生物素蛋白-生物素標(biāo)記酶復(fù)合物(vectastainabckit,vector社制造),將a液和b液各滴入1滴至信號(hào)增強(qiáng)試劑2.5ml中。將其按照每次100μl分別注入,將板貼上密封,在室溫下靜置30分鐘。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。將colorsolutiona和colorsolutionb(r&dsystems社制造)等量混合作為檢測(cè)試劑,按照每次200μl分別注入后,遮光,在室溫下靜置20分鐘。準(zhǔn)確經(jīng)過20分鐘后,將終止液(r&dsystems社制造)按照每次50μl添加,使顯色反應(yīng)停止,測(cè)量的是450nm處的吸光度,并將570nm處作為對(duì)照。測(cè)量結(jié)果如下述表13和圖15所示?!颈?3】抗小鼠pd-1單鏈抗體對(duì)于小鼠pd-1與小鼠pd-l1的結(jié)合反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制活性(結(jié)果)由表13和圖15清楚可知,向固相化的mpd-1添加1μg/ml的mpd-l1時(shí),針對(duì)單鏈抗體對(duì)于其結(jié)合反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制率,在10μg/ml的抗小鼠pd-1單鏈抗體中為51.4%。作為対照的抗人ctla-4-2單鏈抗體中未確認(rèn)競(jìng)爭(zhēng)性抑制(-6.4%)。根據(jù)以上結(jié)果,確認(rèn)相對(duì)于1μg/ml的mpd-l1,10μg/ml以上的抗小鼠pd-1單鏈抗體顯示競(jìng)爭(zhēng)性抑制活性。實(shí)施例18[抗小鼠pd-1單鏈抗體與小鼠t-細(xì)胞(cd3/cd28刺激cd4陽(yáng)性細(xì)胞)的結(jié)合的有無(wú)的確認(rèn)]對(duì)于由抗小鼠pd-1單鏈抗體分泌雙歧桿菌屬細(xì)菌的培養(yǎng)上清純化的抗小鼠pd-1單鏈抗體與mpd-1表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合的有無(wú),使用由于cd3和cd28刺激而誘導(dǎo)表達(dá)mpd-1的cd4陽(yáng)性細(xì)胞(以下,也稱為“cd3/cd28刺激cd4陽(yáng)性細(xì)胞”),通過流式細(xì)胞儀解析進(jìn)行研究。(cd3/cd28刺激cd4陽(yáng)性細(xì)胞的制備)從balb/c小鼠中摘除脾臟,回收脾細(xì)胞后,通過biotinanti-mousecd4antibody(biolegend社)對(duì)cd4陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。通過洗凈除去剩余的抗體后,加入streptavidinparticlesplus-dm(日本becton·dickinson社制造),將磁微珠結(jié)合至cd4陽(yáng)性細(xì)胞上。通過磁體將其分離,將被吸至磁體上的細(xì)胞作為cd4陽(yáng)性細(xì)胞回收,在包含10%胎牛血清、8mmhepes、50μm2-巰基乙醇的rpmi-1640培養(yǎng)基上懸浮,制備2×106cells/ml的cd4陽(yáng)性細(xì)胞。將調(diào)整為2μg/ml的purifiedanti-mousecd3ε抗體(biolegend社制造、以下也稱為“抗cd3抗體”),按照110μl/孔分別注入至48孔板中,在4℃下靜置一晚固相化。將上述cd4陽(yáng)性細(xì)胞按照500μl/孔分別注入至固相板中。然后,將調(diào)整為1mg/ml的functionalgradeanti-mousecd28(ebioscience社制造、以下也稱為“抗cd28抗體”)按照1μl/孔分別添加,作為cd3/cd28刺激cd4陽(yáng)性細(xì)胞。同樣地,向未固相化抗cd3抗體的孔中也注入cd4陽(yáng)性細(xì)胞,作為未刺激cd4陽(yáng)性細(xì)胞。將該板在37℃、co25%的條件下培養(yǎng)2天。將上述培養(yǎng)了2天的細(xì)胞通過移液剝離,移至1.5ml的管中,在4℃、5000rpm下離心分離1分鐘后除去上清。添加1ml的pbs后,離心分離,重復(fù)2次除去上清的操作洗凈后,加入facs緩沖液(包含1%bsa的pbs)0.9ml,同樣地離心分離,除去上清。加入通過sorting緩沖液(包含0.5%bsa的pbs)稀釋50倍的trustainfcx(biolegend社制造)20μl,攪拌后,在冰上靜置10分鐘。向其中加入通過facs緩沖液稀釋200倍的alexafluor647anti-mousecd4antibody(biolegend社制造)20μl,攪拌后,在冰上靜置20分鐘。加入facs緩沖液1ml,離心分離,重復(fù)2次除去上清的操作洗凈。然后,添加通過facs緩沖液稀釋200倍的peanti-mousecd69antibody(biolegend社制造)20μl,攪拌后在冰上靜置20分鐘。加入facs緩沖液1ml,離心分離,重復(fù)2次除去上清的操作洗凈,得到cd3/cd28刺激cd4陽(yáng)性細(xì)胞。將該細(xì)胞分為2部分,一部分用于抗小鼠pd-1單鏈抗體的結(jié)合確認(rèn),另外一部分用于pd-1表達(dá)確認(rèn)。(細(xì)胞與抗小鼠pd-1單鏈抗體的結(jié)合確認(rèn))關(guān)于細(xì)胞與抗小鼠pd-1單鏈抗體的結(jié)合確認(rèn),使用了從小鼠脾細(xì)胞得到的未刺激cd4陽(yáng)性細(xì)胞和cd3/cd28刺激cd4陽(yáng)性細(xì)胞。回收該細(xì)胞后,重復(fù)2次通過1ml的1×pbs緩沖液離心分離而除去上清的操作,以洗凈培養(yǎng)基成分。進(jìn)一步加入facs緩沖液離心分離,除去上清。在其中加入通過facs緩沖液稀釋50倍的trustainfcx(biolegend社制造)20μl,充分?jǐn)嚢韬?,在冰上靜置10分鐘。接下來(lái),添加通過facs緩沖液稀釋200倍的alexafluor647anti-mousecd4antibody(biolegend社制造)20μl,充分?jǐn)嚢韬螅诒响o置20分鐘。反應(yīng)后,重復(fù)2次通過1ml的facs緩沖液離心分離而除去上清的操作。然后,添加通過facs緩沖液稀釋200倍的peanti-mousecd69antibody(biolegend社制造)20μl,充分?jǐn)嚢韬螅诒响o置20分鐘。反應(yīng)后,重復(fù)2次通過1ml的facs緩沖液離心分離而除去上清的操作。添加通過facs緩沖液調(diào)整為10μg/ml的抗小鼠pd-1單鏈抗體20μl,攪拌后在冰上靜置20分鐘。加入facs緩沖液1ml離心分離后,除去上清,重復(fù)該操作2次,進(jìn)行洗凈。然后,添加通過facs緩沖液稀釋1000倍的anti-h(huán)is-tagalexafluor488antibody(mbl社)20μl,攪拌后在冰上靜置20分鐘。重復(fù)2次加入facs緩沖液1ml離心分離,除去上清的操作,進(jìn)行洗凈。添加1ml的facs緩沖液后,將通過facs緩沖液懸浮的細(xì)胞移至5ml聚苯乙烯圓底管(becton·dickinson社制造)中。(細(xì)胞的pd-1表達(dá)確認(rèn))對(duì)于所使用的細(xì)胞中是否有pd-1的表達(dá)的確認(rèn),將從小鼠脾細(xì)胞得到的未刺激cd4陽(yáng)性細(xì)胞和cd3/cd28刺激cd4陽(yáng)性細(xì)胞,通過抗體對(duì)cd4和cd69進(jìn)行了熒光標(biāo)記后使用該細(xì)胞。向該細(xì)胞中添加通過facs緩沖液稀釋100倍的fitcanti-mousecd279(pd-1)抗體(biolegend社制造)20μl,攪拌后,在冰上靜置20分鐘。然后向其中加入facs緩沖液1ml,離心分離,除去上清,重復(fù)該操作2次進(jìn)行洗凈。添加1ml的facs緩沖液后,將通過facs緩沖液懸浮的細(xì)胞移至5ml的聚苯乙烯圓底管(becton·dickinson社制造)中。向上述進(jìn)行了熒光標(biāo)記的細(xì)胞懸液中,添加通過facs緩沖液稀釋至5μg/ml的碘化丙啶溶液5μl,通過bdfacscantoii流式細(xì)胞儀(becton·dickinson社)和流式細(xì)胞儀解析軟件kaluzaver1.2(beckmancoulter社制造)進(jìn)行解析。針對(duì)細(xì)胞懸液,通過流式細(xì)胞儀,調(diào)查前散射(fsc)和(側(cè)散射)ssc,根據(jù)細(xì)胞的大小和細(xì)胞的形態(tài)對(duì)細(xì)胞群進(jìn)行選通。然后,對(duì)該細(xì)胞群進(jìn)行根據(jù)pi的選通,作為去除了死細(xì)胞的細(xì)胞群。進(jìn)一步地,在波長(zhǎng)647nm下,對(duì)cd4陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行選通,通過pe確認(rèn)該細(xì)胞是否處于表達(dá)cd69,通過cd3/cd28刺激的狀態(tài)。mpd-1的表達(dá)確認(rèn)和抗小鼠pd-1單鏈抗體與mpd-1的結(jié)合,以cd4陽(yáng)性細(xì)胞的群中,fitc陽(yáng)性(=mpd-1表達(dá)或結(jié)合有抗小鼠pd-1單鏈抗體)的細(xì)胞的增加的形式來(lái)確認(rèn)。由抗小鼠pd-1單鏈抗體分泌雙歧桿菌屬細(xì)菌純化的抗小鼠pd-1單鏈抗體與cd3/cd28刺激cd4陽(yáng)性細(xì)胞的結(jié)合結(jié)果如圖16c和圖16d所示,細(xì)胞的mpd-1表達(dá)如圖16a和圖16b所示。(結(jié)果)由圖16a和圖16b清楚可知,抗mpd-1抗體特異性地結(jié)合在cd3/cd28刺激cd陽(yáng)性細(xì)胞上,確認(rèn)了細(xì)胞表面上的pd-1表達(dá)。另外,如圖16c和圖16d所示,確認(rèn)了由抗小鼠pd-1單鏈抗體分泌雙歧桿菌屬細(xì)菌純化的抗小鼠pd-1單鏈抗體與mpd-1表達(dá)細(xì)胞(cd3/cd28刺激cd4陽(yáng)性細(xì)胞)特異性結(jié)合。實(shí)施例19[抗小鼠pd-1單鏈抗體分泌雙歧桿菌屬細(xì)菌在荷瘤小鼠的腫瘤內(nèi)的定植和抗小鼠pd-1單鏈抗體的分泌]使用小鼠大腸癌細(xì)胞株ct26的荷瘤小鼠,將長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-pd-1-3菌株靜脈給藥,確認(rèn)菌在腫瘤內(nèi)的定植,并通過免疫組織染色確認(rèn)對(duì)抗小鼠pd單鏈抗體的定位(分泌)。將小鼠大腸癌細(xì)胞株ct-26(atcc)在包含10%的fbs(equitech-bio,inc.社制造)的rpmi1640培養(yǎng)基(和光純藥工業(yè)社制造)上培養(yǎng),移植至6周齡的母balb/c小鼠(日本slc社制造)上制作荷瘤小鼠。將腫瘤大小為30.18~138.16mm3的荷瘤小鼠按照下表所示分成3組(每組3只)(day1)。第1組和第2組用于確認(rèn)腫瘤組織中的來(lái)自重組雙歧桿菌屬細(xì)菌的抗小鼠pd-1單鏈抗體分泌,第3組用于確認(rèn)腫瘤組織中的重組雙歧桿菌屬細(xì)菌的定植。向第2組和第3組,按照1.0×109cfu的用量從尾靜脈施用作為抗小鼠pd-1單鏈抗體分泌雙歧桿菌屬細(xì)菌的長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-pd-1-3菌株的簡(jiǎn)易冷凍制劑。另外,將10%麥芽糖溶液按照每次1ml,1天2次的頻率給藥5天。雙歧桿菌屬細(xì)菌給藥7天后,摘除腫瘤。對(duì)于第3組的腫瘤在冷凍保存后,測(cè)量活菌數(shù)。對(duì)于第1組和第2組的腫瘤,用o.c.t.復(fù)合物(sakurafinetek社制造)冷凍包埋。然后,使用冷凍切片機(jī)leicacm1900(leica社制造)制作切片標(biāo)本,用于組織染色。(活菌數(shù)測(cè)量)向冷凍的腫瘤組織中添加厭氧性稀釋液,進(jìn)行均質(zhì)化處理。使用厭氧性稀釋液對(duì)該勻漿適當(dāng)稀釋后,涂布至blfs瓊脂培養(yǎng)基(含有250μg/ml5-氟尿嘧啶、30μg/ml壯觀霉素的bl瓊脂培養(yǎng)基)上,在厭氧條件、37℃下培養(yǎng)3天。數(shù)出形成在blfs瓊脂培養(yǎng)基上的菌落數(shù),算出腫瘤中的重組雙歧桿菌屬細(xì)菌的活菌數(shù)。結(jié)果如下述表14所示?!颈?4】(結(jié)果)由表14可知,確認(rèn)每1g腫瘤上有2.7x106cfu的活菌。(免疫組織染色)風(fēng)干切成薄片的切片,在4%pfa(和光純藥工業(yè)社制造)中浸漬10分鐘固定。固定后,通過純水清洗1分鐘,通過1×pbs(-)實(shí)施3次各5分鐘的清洗。擦掉組織的周邊的水分,用dakopen(dako社制造)包圍組織的周圍,將3%的bsa-pbs滴落至組織上,使其反應(yīng)60分鐘,實(shí)施非特異性結(jié)合的抑制。將anti-h(huán)is-tagmab-alexafluor(注冊(cè)商標(biāo))488(mbl社制造)抗體反應(yīng)液通過3%bsa-pbs稀釋1000倍,將得到的溶液滴落至組織上。將其在4℃下反應(yīng)一晚??贵w反應(yīng)后,通過1×pbs(-)實(shí)施3次各5分鐘的清洗,通過vectashield(r)mountingmediumwithdapi封裝。將上述染色的切片通過顯微鏡dm5000b(leica社制造)鏡檢,拍攝圖像。結(jié)果如圖17所示。(結(jié)果)由圖17清楚可知,在施用了抗小鼠pd-1單鏈抗體分泌雙歧桿菌屬細(xì)菌的小鼠(圖17a)中,抗小鼠pd-1單鏈抗體(染色為綠色)在腫瘤組織內(nèi)呈彌漫性陽(yáng)性。實(shí)施例20[抗小鼠pd-1單鏈抗體分泌雙歧桿菌屬細(xì)菌對(duì)于ct26荷瘤模型小鼠的藥理(抗腫瘤)效果的研究]按照與實(shí)施例19相同的方法制作ct26荷瘤模型小鼠。將腫瘤大小為40.51至88.03mm3的荷瘤小鼠按照下述表15分為5組(每組7只)(day0)。將第1組作為未處理對(duì)照組,第2組作為抗小鼠pd-1單鏈抗體分泌株(長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp7l20-scfv-pd-1-3菌株)單劑(i.v.)給藥組,第3組作為抗mpd-1抗體(bioxcell社制造、clone:rpm1-14)單劑給藥(i.t.)組,第4組作為抗mctla-4抗體(bioxcell社制造、clone:9d9)單劑(i.t.)給藥組,第5組作為抗小鼠pd-1單鏈抗體分泌雙歧桿菌屬細(xì)菌(i.v.)和抗mctla-4抗體(i.t.)的雙劑合用給藥組。藥劑的給藥日、給藥量和給藥路徑如下述表15所示。另外,對(duì)于第2組和第5組,將10%麥芽糖溶液按照每次1ml,1天2次的頻率,從day1至day5,以及day8至day12,進(jìn)行腹腔內(nèi)給藥。各組均定期測(cè)量腫瘤徑(day0,3,7,10,14,17,22),并在day22摘除腫瘤,測(cè)量腫瘤重量。腫瘤體積的變化如表16所示,ct26荷瘤小鼠中的腫瘤體積的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)如表17所示,單劑給藥組與未處理組的ct26腫瘤體積變化如圖18所示。【表15】i.v.:靜脈給藥;i.t.:腫瘤局部給藥【表16】【表17】【表18】單劑和雙劑合用給藥的ct26荷瘤小鼠的平均腫瘤體積的t/c(結(jié)果)由表17、圖18清楚可知,抗小鼠pd-1單鏈抗體分泌雙歧桿菌屬細(xì)菌給藥組(第2組)中,與未處理組(第1組)相比,在所有的時(shí)間點(diǎn)都顯示出了低的腫瘤體積變化,發(fā)現(xiàn)在所有的時(shí)間點(diǎn)都有具有顯著差異的增殖抑制效果(表17)。另外,該腫瘤增殖抑制,從處理組與未處理對(duì)照的比(t/c)來(lái)看,day10之后為0.34以下。抗mpd-1抗體單劑給藥組(第3組)中,與未處理組(第1組)相比,發(fā)現(xiàn)在腫瘤體積上,在所有的時(shí)間點(diǎn)都有具有顯著差異的抑制作用,t/c在day10之后為0.15以下。另外,腫瘤內(nèi)給藥的抗mctla-4抗體單劑給藥組(第4組)與未處理組相比,發(fā)現(xiàn)在腫瘤體積上,在所有的時(shí)間點(diǎn)上都有具有顯著差異的抑制作用,t/c在day10之后為0.22以下。而抗小鼠pd-1單鏈抗體分泌雙歧桿菌屬細(xì)菌與抗mctla-4抗體的雙劑合用組(第5組)中,與未處理組相比,發(fā)現(xiàn)在腫瘤體積上,在所有的時(shí)間點(diǎn)上都具有顯著差異,t/c在day10之后為0.10以下,顯示了最強(qiáng)的抗腫瘤作用。比較雙劑合用組與單劑組可知,相對(duì)于day10時(shí)的各單劑給藥組,或day14之后的抗小鼠pd-1單鏈抗體分泌雙歧桿菌屬細(xì)菌給藥組,確認(rèn)了具有顯著差異的強(qiáng)的抑制作用(參照表16、表17、表18、圖19、圖20)。另外,在抗mctla-4抗體給藥組與雙劑合用組中,各有1例的小鼠上確認(rèn)了腫瘤的完全消退。腫瘤重量方面也是與腫瘤體積相同的結(jié)果,與未處理組相比,所有的組中都確認(rèn)了顯著差異,t/c在抗小鼠pd-1單鏈抗體分泌雙歧桿菌屬細(xì)菌給藥組、抗mpd-1抗體給藥組、抗mctla-4抗體給藥組和雙劑合用組中分別為0.31、0.12、0.10和0.04,雙劑合用組在腫瘤重量方面的值最低(參照表19、表20)?!颈?9】單劑和雙劑合用給藥對(duì)于ct26荷瘤小鼠的抗腫瘤效果(平均腫瘤重量和t/c比)七只動(dòng)物的平均值±s.d*:六只動(dòng)物的平均值±s.d.t/cratios=藥劑給藥組的平均腫瘤重量/未處理組的平均腫瘤重量-:不確定#:長(zhǎng)雙歧桿菌105a/phusp7l20-mpd-1scfv【表20】ct26荷瘤小鼠中的腫瘤體積的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)(結(jié)果)根據(jù)上述結(jié)果可知,抗小鼠pd-1單鏈抗體分泌雙歧桿菌屬細(xì)菌通過靜脈內(nèi)給藥,移植至ct-26荷瘤小鼠的腫瘤內(nèi)(實(shí)施例19),分泌抗小鼠pd-1單鏈抗體,發(fā)揮腫瘤增殖抑制效果,其效果與將作為試劑抗體的抗mpd-1抗體直接給藥至腫瘤內(nèi)的基本同等。推測(cè)由雙歧桿菌屬細(xì)菌分泌的抗小鼠pd-1單鏈抗體在invitro的試驗(yàn)中,具有競(jìng)爭(zhēng)性地抑制mpd-1和mpd-l1的結(jié)合的活性(實(shí)施例17),在腫瘤內(nèi)也根據(jù)同樣的機(jī)理,通過封閉t細(xì)胞上的pd-1與腫瘤細(xì)胞上的pd-l1間的負(fù)的信號(hào)傳輸,從而使t細(xì)胞活性化的結(jié)果,從而發(fā)揮了抗腫瘤效果。另外,確認(rèn)了抗小鼠pd-1單鏈抗體分泌雙歧桿菌屬細(xì)菌與抗mctla-4抗體的合用效果,因此啟示了同時(shí)分泌抑制ctla-4的單鏈抗體和抑制pd-1的單鏈抗體的共表達(dá)雙歧桿菌屬細(xì)菌的有用性。實(shí)施例21[各種接頭長(zhǎng)度的抗人pd-1scfv03單鏈抗體分泌雙歧桿菌屬細(xì)菌的制作](概要)構(gòu)建了分泌信號(hào)為sp7,連接在分泌信號(hào)之后的接頭長(zhǎng)度為20個(gè)氨基酸殘基的抗人pd-1scfv03分泌質(zhì)粒phusp7l20-hpd-1scfv03。構(gòu)建了將該質(zhì)粒的分泌信號(hào)和連接在分泌信號(hào)之后的接頭替換為sp69和對(duì)應(yīng)于sp69的接頭(20個(gè)氨基酸殘基)的抗人pd-1scfv03分泌質(zhì)粒phusp69l20-hpd-1scfv03。進(jìn)一步地,還構(gòu)建了將接頭的長(zhǎng)度由20變更為l0~10、15(l0、l1、l2、l3、l4、l5、l6、l7、l8、l9、l10和l15)的質(zhì)粒。[質(zhì)粒phusp7l20-hpd-1scfv03的制作](概要)制作包含分泌抗hpd-1scfv03的表達(dá)盒(抗人pd-1scfv03分泌表達(dá)盒)的,作為大腸菌-雙歧桿菌屬細(xì)菌穿梭載體的質(zhì)粒phusp7l20-hpd-1scfv03。所使用的引物如下述表21所示?!颈?1】引物名dna序列(5’→3’)序列號(hào)ins-hpd-1scfv03-f1caggtccagctggtcgaatcgggcggcggc序列號(hào)82ins-hpd-1scfv03-r1acgagcagaaggtcagtggtggtgatgatggtgctt序列號(hào)83tga-hu-terminator-ftgaccttctgctcgtagcgattac序列號(hào)84vec-sp7l20-r1gaccagctggacctgcaccgaactcgccttcgggaa序列號(hào)85(抗人pd-1scfv03分泌表達(dá)盒的構(gòu)成)編碼作為抗人pd-1scfv03分泌表達(dá)盒的,依次包含(1)hu啟動(dòng)子dna、(2)編碼信號(hào)肽-接頭連接體sp7l20的dna、(3)編碼抗hpd-1scfv03的氨基酸序列(包含重鏈序列、接頭(ggggs)3、輕鏈序列)的dna、和(4)編碼his標(biāo)簽序列的dna、(5)hu終止子dna的(1)~(5)的dna,使(1)為上游(5’末端)側(cè),(5)為下游(3’末端)側(cè)的盒(包含上述抗hpd-1scfv03的氨基酸序列中的重鏈序列、接頭(ggggs)3、輕鏈序列)的dna的堿基序列,參考了下述表22所示的文獻(xiàn)。(抗hpd-1scfv03的人工dna合成)對(duì)于序列號(hào)86所示的抗hpd-1scfv03,在genscriptjapan株式會(huì)社被亞克隆至大腸菌用質(zhì)粒puc57上,人工基因合成為質(zhì)粒puc57-h(huán)pd-1scfv03?!颈?2】關(guān)于抗hpd-1scfv03的文獻(xiàn)(抗hpd-1scfv03插入物片段的制備1)以上述質(zhì)粒puc57-h(huán)pd-1scfv03(500pg)為模板,使用上述表21中所述的ins-h(huán)pd-1scfv03-f1引物(正向)和ins-h(huán)pd-1scfv03-r1引物(反向)的引物組,進(jìn)行pcr擴(kuò)增。引物序列設(shè)計(jì)為插入物片段與載體片段的末端15bp重疊。按照各引物濃度為0.2μm,反應(yīng)體積為30μl,使用所述primestarhs(premix)試劑盒(takarabio社制造)進(jìn)行pcr擴(kuò)增。作為擴(kuò)增的程序,以98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下60秒為1個(gè)循環(huán),進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。對(duì)被擴(kuò)增的插入物pcr產(chǎn)物使用2%的瓊脂糖凝膠電泳后,使用qiaquickgelextraction試劑盒(qiagen公司制造)純化,制備得到約0.7kbp的抗hpd-1scfv03插入物片段(1)。(包含編碼sp7l20的氨基酸序列的dna的載體片段(1)的制備)以序列號(hào)87所述的載體直鏈化片段(500pg)為模板,使用上述表21所述的tga-h(huán)u-terminator-f引物(正向)和vec-sp7l20-r1引物(反向)的引物組進(jìn)行pcr擴(kuò)增。按照各引物濃度為0.2μm,反應(yīng)體積為30μl,使用primestarhs(premix)試劑盒進(jìn)行pcr擴(kuò)增。作為擴(kuò)增的程序,以98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下5分鐘為1個(gè)循環(huán),進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。對(duì)被擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物通過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳后,使用qiaquickgelextraction試劑盒純化,制備得到約4.0kbp的5’-h(huán)u終止子-ptb6repunit-spcmr-pucori-h(huán)u啟動(dòng)子-sp7l20-3’載體片段(1)。(in-fusion反應(yīng))使用in-fusion(注冊(cè)商標(biāo))hdcloning試劑盒(takarabio社制造)連接上述制備的載體片段(1)與上述抗hpd-1scfv03插入物片段(1)。即,將試劑盒內(nèi)的上述載體與插入物按照1:5的摩爾比添加至微型管中后,添加2μl的5×in-fusion(注冊(cè)商標(biāo))hdenzymepremix(takarabio社制造),將反應(yīng)液體積調(diào)整為10μl。將其在50℃下保溫15分鐘。其他的順序遵循試劑盒的產(chǎn)品說明書,制備in-fusion反應(yīng)液1。(大腸菌的轉(zhuǎn)化和phusp7l20-h(huán)pd-1scfv03的dna序列確認(rèn))按照產(chǎn)品說明書,使用上述in-fusion反應(yīng)液5μl,實(shí)施大腸菌hst16cr感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的菌懸液,涂布于含有75μg/ml壯觀霉素的lb瓊脂培養(yǎng)基上,在37℃下靜置培養(yǎng)一晚。將形成于瓊脂培養(yǎng)基上的菌落,在含有75μg/ml壯觀霉素的lb液體培養(yǎng)基中,30℃下振蕩培養(yǎng)一晚,然后使用qiaprepspinminiprepkit(qiagen公司制造)從其中提取質(zhì)粒。為了確定提取的質(zhì)粒中的抗人pd-1scfv03分泌表達(dá)盒(5’-h(huán)u啟動(dòng)子-sp7l20-抗hpd-1scfv03-h(huán)is標(biāo)簽-h(huán)u終止子-3’)的序列,使用bigdye(注冊(cè)商標(biāo))terminatorv3.1cyclesequencingkit(appliedbiosystems社制造),實(shí)施測(cè)序反應(yīng)。將確認(rèn)了序列的質(zhì)粒命名為phusp7l20-h(huán)pd-1scfv03。phusp7l20-h(huán)pd-1scfv03的序列如序列號(hào)88所示。[質(zhì)粒phusp69l20-h(huán)pd-1scfv03的制作]按照如下所述構(gòu)建將上述抗人pd-1scfv03分泌質(zhì)粒phusp7l20-h(huán)pd-1scfv03的信號(hào)肽序列和連接在信號(hào)肽序列之后的連接肽序列替換為sp7l20~sp69l20的質(zhì)粒phusp69l20-h(huán)pd-1scfv03。(載體片段與插入物片段的制備)載體片段的制備,以質(zhì)粒phusp7l20-h(huán)pd-1scfv03為模板,使用下述表23(v1)和表24中所述的hpd-1scfv03_vec_f1引物和hu-mccl21_vec_r1引物組成的引物組,按照引物濃度為0.2μm,反應(yīng)體積為50μl,使用primestarhs(premix)試劑盒進(jìn)行pcr擴(kuò)增。作為擴(kuò)增程序,以98℃下10秒、65℃下5秒、72℃下4分45秒為1個(gè)循環(huán),進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后,72℃下進(jìn)行30秒。將擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物作為載體片段v1。以長(zhǎng)雙歧桿菌105-a基因組dna800pg為模板,使用下述表23(ins-1)和表24中所述的sp69-ins_f1引物和sp69-ins_r1_h(yuǎn)pd1_03引物組成的引物組進(jìn)行pcr擴(kuò)增。引物序列設(shè)計(jì)為插入物片段與載體片段的末端15bp重疊。與上述載體同樣地進(jìn)行pcr擴(kuò)增。其中,72℃下的延伸反應(yīng)時(shí)間為20秒。將擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物作為插入物片段ins-1?!颈?3】pcr擴(kuò)增時(shí)的模板和引物【表24】pcr擴(kuò)增時(shí)的引物序列引物名序列(5’→3’)序列號(hào)hu-mccl21_vec_r1aaagcatccttcttgggtcagg序列號(hào)89hpd-1scfv03_vec_f1caggtccagctggtcgaatc序列號(hào)90sp69-ins_f1caagaaggatgctttatgaattatttacgacaaaaaatttcgg序列號(hào)91sp69-ins_r1_hpd1_03gaccagctggacctgaccgctatcagtcgtggtgtaac序列號(hào)92sp69l5-ins_r1_hpd1_03gaccagctggacctgtggcgttgaatcatccgc序列號(hào)93sp69l10-ins_r1_hpd1_03gaccagctggacctgcgatggcgttgaagatgg序列號(hào)94sp69l15-ins_r1_hpd1_03gaccagctggacctgggtgtaactgccatccgatg序列號(hào)95sp69l0-ins_r1_hpd1_03gaccagctggacctgcgcaaagaccggcattg序列號(hào)96sp69l1-ins_r1_hpd1_03gaccagctggacctgatccgcaaagaccggcat序列號(hào)97sp69l2-ins_r1_hpd1_03gaccagctggacctgatcatccgcaaagaccgg序列號(hào)98sp69l3-ins_r1_hpd1_03gaccagctggacctgtgaatcatccgcaaagaccg序列號(hào)99sp69l4-ins_r1_hpd1_03gaccagctggacctgcgttgaatcatccgcaaagac序列號(hào)100sp69l6-ins_r1_hpd1_03gaccagctggacctgagatggcgttgaatcatccg序列號(hào)101sp69l7-ins_r1_hpd1_03gaccagctggacctgtgaagatggcgttgaatcatcc序列號(hào)102sp69l8-ins_r1_hpd1_03gaccagctggacctgcgttgaagatggcgttgaatc序列號(hào)103sp69l9-ins_r1_hpd1_03gaccagctggacctgtggcgttgaagatggcg序列號(hào)104(in-fusion反應(yīng))使用in-fusionhdcloningkit連接上述制備的載體片段v1與插入物片段ins-1。即,將上述載體片段與插入物片段按照1∶2的摩爾比添加至微型管中后,添加5xin-fusion(注冊(cè)商標(biāo))hdenzymepremix2μl、cloningenhancer1μl,將反應(yīng)體積調(diào)整為10μl。將其在37℃下保溫15分鐘后,在50℃下保溫15分鐘。其他的順序遵循試劑盒的產(chǎn)品說明書,制備in-fusion反應(yīng)液。(大腸菌的轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒dna的序列確認(rèn))按照產(chǎn)品說明書,使用上述in-fusion反應(yīng)液1μl,實(shí)施大腸菌hst16cr感受態(tài)細(xì)胞(takarabio社制造)的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的菌懸液涂布于含有75μg/ml壯觀霉素的lb瓊脂培養(yǎng)基上,在37℃下靜置培養(yǎng)一晚。將形成于瓊脂培養(yǎng)基上的菌落,在含有75μg/ml壯觀霉素的lb液體培養(yǎng)基中于37℃下振蕩培養(yǎng)一晚,然后使用qiaprepspinminiprepkit(qiagen公司制造)從其中提取質(zhì)粒。為了確定提取的質(zhì)粒中的抗人pd-1scfv03表達(dá)盒(包含從hu啟動(dòng)子到hu終止子)序列,使用bigdye(注冊(cè)商標(biāo))terminatorv3.1cyclesequencingkit(appliedbiosystems公司制造),實(shí)施測(cè)序反應(yīng)。將確認(rèn)了序列的質(zhì)粒命名為phusp69l20-hpd-1scfv03。[phusp69ly-h(huán)pd-1scfv03(y=0~10,15)的制作]對(duì)于編碼使上述phusp69l20-h(huán)pd-1scfv03的接頭從3’末端縮短的0~10和15個(gè)氨基酸的dna的質(zhì)粒、phusp69ly-h(huán)pd-1scfv03(y=0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15),按照如下制作。(載體片段與插入物片段的制備)載體片段使用上述載體片段v1。插入物片段的制備,以質(zhì)粒phusp69l20-h(huán)pd-1scfv03為模板,使用表23(ins-l0~10、ins-l15)中所述的引物組,按照與上述插入物片段ins-1的制備同樣的方法制備。將擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物作為插入物片段ins-l0、ins-l1、ins-l2、ins-l3、ins-l4、ins-l5、ins-l6、ins-l7、ins-l8、ins-l9、ins-l10和ins-l15。(in-fusion反應(yīng))對(duì)上述制備載體片段v1和各插入物片段ins-ly(y=0~10,15),采用與上述phusp69l20-h(huán)pd-1scfv03制作時(shí)相同的方法,通過in-fusion反應(yīng)連接。(大腸菌的轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒dna的序列確認(rèn))使用上述in-fusion反應(yīng)液,按照與phusp69l20-h(huán)pd-1scfv03制作時(shí)相同的方法,進(jìn)行大腸菌的轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒dna的序列確認(rèn)。[雙歧桿菌屬細(xì)菌的轉(zhuǎn)化]使用上述制作的13種質(zhì)粒phusp69ly-h(huán)pd-1scfv03(l0、l1、l2、l3、l4、l5、l6、l7、l8、l9、l10、l15、和l20),通過電穿孔系統(tǒng)(genepulserii、bio-radlaboratories社制造),實(shí)施長(zhǎng)雙歧桿菌105-a株的轉(zhuǎn)化。電沖擊(2kv、25μf、200ω)后,立即向反應(yīng)杯(2mm間隙)中添加800μl的imr液體培養(yǎng)基與50μl的維生素c添加液的混合液,將其回收至滅菌完畢的2ml微型管中。針對(duì)各個(gè)管進(jìn)行同樣的操作,然后擰松這些2ml管的蓋子,與脫氧·二氧化碳發(fā)生劑(anaeropack(注冊(cè)商標(biāo))·厭氧、三菱瓦斯化學(xué)社制造)一起加入至密閉容器中,在設(shè)定為37℃的培養(yǎng)器中保溫3小時(shí)。將保溫后的各菌懸液涂布至含有75μg/ml壯觀霉素的imr瓊脂培養(yǎng)基中。將這些板與上述脫氧·二氧化碳發(fā)生劑一起加入至密閉容器中,在設(shè)定為37℃的培養(yǎng)器中培養(yǎng)2天。對(duì)形成于上述含有壯觀霉素的imr瓊脂培養(yǎng)基上的菌落進(jìn)行釣菌,在含有75μg/ml壯觀霉素的bl-bs瓊脂培養(yǎng)基(不包含馬脫纖維血的bl瓊脂培養(yǎng)基)上劃線后,與脫氧·二氧化碳發(fā)生劑一起加入至密閉容器,在設(shè)定為37℃的培養(yǎng)器中培養(yǎng)1天,得到長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp69ly-h(huán)pd-1scfv03菌株(y=0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15和20)。實(shí)施例22[各種接頭長(zhǎng)度的抗人pd-1scfv03分泌雙歧桿菌屬細(xì)菌的scfv表達(dá)解析]由于實(shí)施例21中制作的長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp69ly-h(huán)pd-1scfv03菌株(y=0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15和20)分泌的抗hpd-1scfv03在c末端上融合了組氨酸標(biāo)簽,故而通過使用了抗組氨酸標(biāo)簽抗體的蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行單鏈抗體分泌的解析。(雙歧桿菌屬細(xì)菌的培養(yǎng))將上述各重組雙歧桿菌屬細(xì)菌株在含有75μg/ml壯觀霉素的bl-bs瓊脂培養(yǎng)基上的劃線培養(yǎng)物,接種至添加了壯觀霉素(終濃度75μg/ml)和維生素c添加液(每100ml中包含35g的抗壞血酸、2g的l-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物和11g的碳酸鈉的溶液)100μl的mrs(becton·dickinson社制造)液體培養(yǎng)基10ml中,在37℃下厭氧培養(yǎng)24小時(shí),作為活性化培養(yǎng)液。然后,向按照9:1的比例混合了dmem(catno.12320-032:lifetechnologies社制造):mrs的培養(yǎng)基20ml上,按照維生素c添加液100μl、壯觀霉素75μg/ml添加,接種上述活性化培養(yǎng)液100μl。將其在37℃下厭氧培養(yǎng)18小時(shí)。將該厭氧培養(yǎng)后的培養(yǎng)液離心分離后,回收培養(yǎng)上清。將該培養(yǎng)上清中的蛋白通過三氯乙酸(tca、和光純藥工業(yè)社制造)沉淀,通過丙酮洗凈后,溶解至sds-page用緩沖液中,在95℃下熱處理3分鐘,作為培養(yǎng)上清濃縮物。將上述培養(yǎng)上清濃縮物(相當(dāng)于培養(yǎng)液1ml)通過mini-protean(注冊(cè)商標(biāo))tgxtmgels(lifebio-rad社制造)電泳,使用trans-blotturbo(lifebio-rad社制造)將凝膠轉(zhuǎn)印至pvdf膜(iblottransferstacks、lifetechnologies社制造)中。封閉印跡完成后的膜(2%eclprimeblockingagent(gehealthcarejapan社制造)inttbs)之后,作為一抗使用小鼠組氨酸標(biāo)簽抗體(thehistagantibody、mab、mouse、genscriptjapan社制造),作為二抗使用ecl-過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠抗體(gehealthcarejapan社制造)進(jìn)行反應(yīng),使用westernlightningultra(perkinelmer公司制造)使其發(fā)光。將其通過影像分析儀(myeclimager,thermoscientific社制造或fluorsmax、lifebio-rad社制造)進(jìn)行解析。結(jié)果如圖21所示。(結(jié)果)由圖21清楚可知,除了接頭為l0的長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp69l0-h(huán)pd-1scfv03菌株之外,所有的菌株上均檢測(cè)出了抗hpd-1scfv03。另外,抗hpd-1scfv03分泌量呈現(xiàn)接頭長(zhǎng)度越短則越少的傾向。實(shí)施例23[接頭長(zhǎng)度不同的抗hpd-1scfv03與人pd-l1的根據(jù)elisa的結(jié)合的確認(rèn)](抗hpd-1scfv03的純化)按照與上述實(shí)施例22相同的方法,培養(yǎng)接頭長(zhǎng)度不同的2種雙歧桿菌屬細(xì)菌、長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp69l20-h(huán)pd-1scfv03菌株和長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp69l5-h(huán)pd-1scfv03。其中,培養(yǎng)放大至200ml。一邊攪拌離心分離上述厭氧培養(yǎng)后的培養(yǎng)液得到的培養(yǎng)上清,一邊慢慢添加硫酸銨,使其達(dá)到80%飽和,在4℃下攪拌一晚,進(jìn)行鹽析。將其離心分離后,回收沉淀,通過帶組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的純化試劑盒(talonresin、takarabio社制造)純化組氨酸標(biāo)簽融合蛋白。將該純化溶液通過超濾(amiconultra0.5、nmwl:10,000、merckmillipore社制造)進(jìn)行濃縮。純化蛋白質(zhì)的濃度通過bradford法測(cè)量(coomassieplusproteinassay、thermoscientific社制造)。濃度標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為白蛋白。使用部分上述純化單鏈抗體sds-page后,進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色(ライフテクノロジーズ、simplybluetmsafestain),確認(rèn)抗hpd-1scfv03的各單鏈抗體被純化為了約9成的純度。(抗hpd-1scfv03與人pd-1的結(jié)合確認(rèn))對(duì)于上述純化的來(lái)源于長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp69l20-h(huán)pd-1scfv03菌株和長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phusp69l5-h(huán)pd-1scfv03的抗hpd-1scfv03,通過elisa法,對(duì)其與人pd-1(hpd-1)的結(jié)合進(jìn)行確認(rèn)。向96孔板中,按照每次100μl分別注入通過1×pbs調(diào)整為1μg/ml的hpd-1(recombinanthumanpd-1fcchimera、r&dsystems社制造),通過在4℃下靜置一晚固相化。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。將1%的bsa溶液按照每次350μl分別注入至上述板中,通過在室溫下靜置2小時(shí)進(jìn)行封閉。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。通過信號(hào)增強(qiáng)試劑(signalenhancerhikari、nacalaitesque社制造)將抗hpd-1scfv03調(diào)整為5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml和40ng/ml,按照每次100μl分別注入至上述封閉完畢后的板中。向空白的孔中僅注入100μl信號(hào)增強(qiáng)試劑。將板貼上密封,在室溫下靜置2小時(shí)后,使固相化的hpd-1與各單鏈抗體反應(yīng)。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。通過信號(hào)增強(qiáng)試劑將二抗(anti-h(huán)is-tag-biotin、mbl社制造)稀釋至2000倍,將其按照每次100μl分別注入。將板貼上密封,在室溫下靜置30分鐘。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。作為抗生物素蛋白-生物素標(biāo)記酶復(fù)合物(vectastainabckit,vector社制造),將a液和b液各滴入3滴至信號(hào)增強(qiáng)試劑7.5ml中。將其按照每次100μl分別注入后,將板貼上密封,在室溫下靜置30分鐘。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。將colorsolutiona和colorsolutionb(r&dsystems社制造)等量混合作為檢測(cè)試劑,按照每次200μl分別注入,遮光,在室溫下靜置20分鐘。準(zhǔn)確經(jīng)過20分鐘后,按照每次50μl添加終止液(r&dsystems社制造),使顯色反應(yīng)停止。測(cè)量的是450nm處的吸光度,并將570nm處作為對(duì)照。(結(jié)果)抗hpd-1scfv03的結(jié)合elisa的結(jié)果如圖22所示。抗hpd-1scfv03,無(wú)論l5、l20的接頭長(zhǎng)度如何均與人pd-1結(jié)合,結(jié)合量依賴于scfv濃度。實(shí)施例24[接頭長(zhǎng)度不同的抗hpd-1scfv03對(duì)于人pd-1與pd-l1的結(jié)合反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制活性的確認(rèn)]使用上述實(shí)施例23中純化的接頭長(zhǎng)度不同的抗hpd-1scfv03,通過elisa法對(duì)于人pd-1與人pd-l1的結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制活性進(jìn)行確認(rèn)。使用抗人ctla-4-2單鏈抗體作為陰性對(duì)照。向96孔板中,按照每次100μl,分別注入通過1×pbs調(diào)整為1μg/ml的hpd-1(recombinanthumanpd-1fcchimera、r&dsystems社制造),通過在4℃下靜置一晚固相化。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。將1%bsa溶液按照每次350μl分別注入至上述板中,通過在室溫下靜置2小時(shí)進(jìn)行封閉。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。通過信號(hào)增強(qiáng)試劑(signalenhancerhikari、nacalaitesque社制造)將hpd-l1(r&dsystems社制造、recombinanthumanb7-h1、hpdl1)調(diào)整至40nm。通過信號(hào)增強(qiáng)試劑將由各雙歧桿菌屬細(xì)菌純化的抗人pd-1單鏈抗體調(diào)整為1280nm、640nm、320nm、160nm、80nm、40nm、20nm和10nm,與40nm的hpd-l1等量混合。將該scfv/hpd-l1混合液按照每次100μl分別注入至上述封閉完畢后的板中。作為陰性對(duì)照,對(duì)由雙歧桿菌屬細(xì)菌純化的抗人ctla-4-2單鏈抗體也進(jìn)行與上述同樣的操作。另外,作為未添加scfv(無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性抑制)的孔,將通過信號(hào)增強(qiáng)試劑調(diào)整為20nm的hpd-l1溶液注入100μl。向空白的孔中僅注入100μl信號(hào)增強(qiáng)試劑。將板貼上密封,在室溫下靜置2小時(shí),使與抗hpd-1scfv混合的hpd-l1與固相化的hpd-1反應(yīng)。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。通過信號(hào)增強(qiáng)試劑將相對(duì)于hpd-l1的二抗(biotin-anti-humancd274、pd-l1、biolegend社制造)調(diào)整為200ng/ml,將其按照每次100μl分別注入。將板貼上密封,在室溫下靜置30分鐘。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。作為抗生物素蛋白-生物素標(biāo)記酶復(fù)合物(vectastainabckit,vector社制造),將a液和b液各滴入4滴至信號(hào)增強(qiáng)試劑10ml中。將其按照每次100μl分別注入,將板貼上密封,在室溫下靜置30分鐘。除去液體后,將1×pbs按照每次350μl分別注入,除去液體。重復(fù)3次該操作,洗凈。將colorsolutiona和colorsolutionb(r&dsystems社制造)等量混合作為檢測(cè)試劑,按照每次200μl分別注入,遮光,在室溫下靜置20分鐘。準(zhǔn)確經(jīng)過20分鐘后,按照每次50μl添加終止液(r&dsystems社制造),使顯色反應(yīng)停止。測(cè)量的是450nm處的吸光度,并將570nm處作為對(duì)照。對(duì)于測(cè)量值,使用免費(fèi)軟件imagej求出回歸方程式,計(jì)算出50%抑制pd-1與pd-l1的結(jié)合的抗體濃度(ic50)。測(cè)量和解析結(jié)果如下述的表25和圖23所示。【表25】接頭長(zhǎng)度不同的各種抗hpd-1單鏈抗體對(duì)于hpd-1與hpd-l1的結(jié)合反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制活性(結(jié)果)由表25和圖23清楚可知,抗hpd-1scfv03,無(wú)論l5、l20的接頭長(zhǎng)度如何,均顯示出了對(duì)于人pd-l1與人pd-1的結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制活性。sp69l5和sp69l20的抗hpd-1scfv03的ic50分別為18.7nm和51.7nm,接頭長(zhǎng)度短的sp69l5在更低的濃度下顯示出了競(jìng)爭(zhēng)性抑制活性。而陰性對(duì)照的抗人ctla-4-2單鏈抗體中未確認(rèn)競(jìng)爭(zhēng)性抑制。實(shí)施例25[重組有各種信號(hào)肽的抗人pd-1scfv03分泌雙歧桿菌屬細(xì)菌的scfv表達(dá)解析]按照與實(shí)施例21的“質(zhì)粒phusp7l20-hpd-1scfv03的制作”相同的方法,對(duì)于長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phuspxl20-h(huán)pd-1-scfv03菌株(其中,x=7、45、50、52、55、58、64、66、67、68、69),由于被分泌的抗hpd-1scfv03在c末端上融合了組氨酸標(biāo)簽,因此通過使用了抗組氨酸標(biāo)簽抗體的蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行單鏈抗體分泌的解析。結(jié)果如圖24(a)和(b)所示。由圖24(a)和(b)清楚可知,通過包含在下述11種(sp7l20、sp45l20、sp50l20、sp52l20、sp55l20、sp58l20、sp64l20、sp66l20、sp67l20、sp68l20、sp69l20)的各分泌信號(hào)肽-接頭連接體的下游重組有抗hpd-1scfv03的表達(dá)盒的載體被轉(zhuǎn)化的長(zhǎng)雙歧桿菌105-a株中,確認(rèn)了抗hpd-1scfv03的分泌。其中,插入了sp50l20、sp64l20、sp68l20、sp69l20的各分泌信號(hào)肽-接頭連接體的上述長(zhǎng)雙歧桿菌105-a株中,分泌量較多。實(shí)施例26[抗hpd-1scfv03與人pd-1的根據(jù)elisa的結(jié)合的確認(rèn)]使用由長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phuspxl20-h(huán)pd-1-scfv03菌株的各培養(yǎng)上清純化的上述各種抗hpd-1-scfv03,對(duì)與人pd-1的結(jié)合進(jìn)行確認(rèn)。測(cè)量的是450nm處的吸光度,并將570nm處作為對(duì)照??筯pd-1scfv03的結(jié)合elisa的結(jié)果如下述表26所示?!颈?6】(結(jié)果)由上述表26清楚可知,各抗hpd-1scfv03,無(wú)論信號(hào)肽的種類如何,均與人pd-1結(jié)合了,其中,sp7、sp50、sp64、sp67的情況下,結(jié)合量多。實(shí)施例27[抗hpd-1scfv03對(duì)于人pd-1與pd-l1的結(jié)合反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制活性的確認(rèn)]使用由上述長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phuspxl20-h(huán)pd-1-scfv03菌株純化的各種抗hpd-1scfv03,向固相化了人pd-1的微孔板中添加各種抗hpd-1scfv03(10μg/ml)與人pd-l1(1μg/ml)的混合物,測(cè)量結(jié)合在人pd-1上的pd-l1量。將未添加抗hpd-1scfv03時(shí)的pd-l1結(jié)合抑制率設(shè)為0%,計(jì)算出使抗hpd-1scfv03共存時(shí)對(duì)于pd-1/pd-l1結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制率(%)。結(jié)果如下述表27所示?!颈?7】(結(jié)果)由表27清楚可知,根據(jù)信號(hào)肽的種類的不同,競(jìng)爭(zhēng)性抑制率的值并沒有大的差異,但是使用sp55l20時(shí),競(jìng)爭(zhēng)性抑制率稍低。實(shí)施例28[接頭長(zhǎng)度的研究]針對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phuspxly-h(huán)pd-1-scfv03菌株(其中,x=7、45、50、52、55、58、64、66、67、68、69),分別在不同的接頭長(zhǎng)度(ly)下進(jìn)行研究。對(duì)于抗hpd-1-scfv03抗體,針對(duì)11種(sp7、sp45、sp50、sp52、sp55、sp58、sp64、sp66、sp67、sp68、sp69)的各分泌信號(hào)肽,構(gòu)建了插入有具有不同的接頭長(zhǎng)度的各分泌信號(hào)肽-接頭連接體的抗hpd-1scfv03分泌質(zhì)粒,制作通過該質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化的各種長(zhǎng)雙歧桿菌105-a株。對(duì)于上述研究用各種長(zhǎng)雙歧桿菌105-a株,針對(duì)抗hpd-1-scfv03抗體的分泌確認(rèn),分別通過使用了抗組氨酸標(biāo)簽抗體的蛋白質(zhì)印跡法,進(jìn)行單鏈抗體分泌的解析。結(jié)果如圖25(a)~(d)所示。(結(jié)果)由圖25(a)~(d)清楚可知,除去sp58l5,sp58l10之外,從通過插入有sp7l5、sp7l10、sp7l15,sp7l20、sp45l5、sp45l10、sp45l15,sp45l20、sp50l5、sp50l10、sp50l15,sp50l20、sp52l5、sp52l10、sp52l15,sp52l20、sp55l5、sp55l10、sp55l15,sp55l20、sp58l15,sp58l20、sp64l5、sp64l10、sp64l15,sp64l20、sp66l5、sp66l10、sp66l15,sp66l20、sp67l5、sp67l10、sp67l15,sp67l20、sp68l5、sp68l10、sp68l15,sp68l20、sp69l5、sp69l10、sp69l15,sp69l20的各分泌信號(hào)肽-接頭連接體的抗hpd-1scfv03分泌質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化的各種長(zhǎng)雙歧桿菌105-a株中分泌出了單鏈抗體。另外,sp7無(wú)論設(shè)計(jì)的接頭長(zhǎng)度如何,均檢測(cè)出了相同分子大小的分泌物。sp45檢測(cè)出了與設(shè)計(jì)的接頭長(zhǎng)度相應(yīng)的分子大小的分泌物。sp50確認(rèn)到了與設(shè)計(jì)的接頭長(zhǎng)度相應(yīng)的分子大小的分泌物。sp58的話,雖然設(shè)計(jì)的接頭長(zhǎng)度為l20,但分泌物的分子大小較小,并且縮短接頭(l10,l5)的話,則變得不分泌(參照?qǐng)D25(c))。單鏈抗體的蛋白質(zhì)印跡分析下的分子大小與設(shè)計(jì)的接頭長(zhǎng)度并非完全一致。實(shí)施例29[抗hpd-1scfv03與人pd-1的根據(jù)elisa的結(jié)合的確認(rèn)]添加1μg/ml的由長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/phuspxly-h(huán)pd-1-scfv03菌株(其中,x=7、68、69)各培養(yǎng)上清純化的抗hpd-1scfv03抗體,通過elisa法對(duì)與人pd-1(hpd-1)的結(jié)合量進(jìn)行確認(rèn)。測(cè)量的是450nm處的吸光度,并將570nm處作為對(duì)照。使用elisa法的與人pd-1固相板的抗hpd-1scfv03抗體的結(jié)合量如下述表28所示?!颈?8】(結(jié)果)由表28清楚可知,sp7、sp68、sp69三者,與接頭長(zhǎng)度20(l20)相比,均在接頭長(zhǎng)度5(l5)時(shí),抗hpd-1scfv03抗體與人pd-1固相板的結(jié)合量更多。因此,表明存在通過接頭長(zhǎng)度的最優(yōu)化,可以提高抗hpd-1scfv03抗體與pd-1的結(jié)合量的可能性。實(shí)施例30(接頭長(zhǎng)度的研究l=0~10)對(duì)于sp45、sp50、sp64、sp68、sp69這5種信號(hào)肽,針對(duì)接頭長(zhǎng)度進(jìn)行研究。制作通過插入有spxly(其中,x=45時(shí),y=0、1、2、3、5;x=50、64、68時(shí),y=0、1、2、3、4、5;x=69時(shí),y=0、1、2、3、4、5,6,7,8,9,10)的各分泌信號(hào)肽-接頭連接體的抗hpd-1scfv03分泌質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化的長(zhǎng)雙歧桿菌105-a株,通過使用了抗組氨酸標(biāo)簽抗體的蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行單鏈抗體分泌的解析。結(jié)果如圖26所示。(結(jié)果)由圖26清楚可知,除了通過插入有sp69l0的分泌信號(hào)肽-接頭連接體的抗hpd-1scfv03分泌質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化的長(zhǎng)雙歧桿菌105-a株中未確認(rèn)分泌外(參照?qǐng)D26(c)),通過插入有sp45l0、sp45l1、sp45l2、sp45l3、sp45l5、sp50l0、sp50l1、sp50l2、sp50l3、sp50l4、sp50l5、sp64l0、sp64l1、sp64l2、sp64l3、sp64l4、sp64l5、sp68l0、sp68l1、sp68l2、sp68l3、sp68l4、sp68l5、sp69l1、sp69l2、sp69l3、sp69l4、sp69l5、sp69l6、sp69l7、sp69l8、sp69l9、sp69l10的各分泌信號(hào)肽-接頭連接體的抗hpd-1scfv03分泌質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化的長(zhǎng)雙歧桿菌105-a株中都確認(rèn)了分泌。sp68l0、sp68l1作為分泌信號(hào)肽-接頭連接體使用時(shí),分泌量少(參照?qǐng)D26(b))。實(shí)施例31制作通過插入有sp50ly(其中,y=0、1、5)、sp64ly(其中,y=0、5)、sp67ly(其中,y=10)、sp68ly(其中,y=1、5)、sp69ly(其中,y=1、7)的各分泌信號(hào)肽-接頭連接體的抗hpd-1scfv03分泌質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化的長(zhǎng)雙歧桿菌105-a株,通過使用了抗組氨酸標(biāo)簽抗體的蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行單鏈抗體分泌的解析。結(jié)果如圖27所示。(結(jié)果)由圖27清楚可知,通過插入有sp50l0、sp50l1、sp50l5、sp64l0、sp64l5、sp67l10、sp68l1、sp68l5、sp69l1、sp69l7的任意一個(gè)的分泌信號(hào)肽-接頭連接體的抗hpd-1scfv03分泌質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化的菌株中,都確認(rèn)了抗hpd-1-scfv03抗體的分泌。實(shí)施例32(抗hpd-1scfv03對(duì)人pd-1與pd-l1的結(jié)合反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制活性的確認(rèn))按照與實(shí)施例24的順序同樣地,對(duì)于由hpd-1scfv03分泌各雙歧桿菌屬細(xì)菌純化的scfv對(duì)pd-1/pd-l1結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制活性進(jìn)行確認(rèn)。測(cè)量的是450nm處的吸光度,并將570nm處作為對(duì)照。將未添加scfv時(shí)的pd-l1的結(jié)合量設(shè)為100%,計(jì)算出50%抑制pd-1與pd-l1的結(jié)合的scfv濃度(ic50)。測(cè)量結(jié)果如下述表29所示?!颈?9】sp/接頭ic50*(nm)sp50l510.9sp64l523.4sp67l1026.9sp68l121.7sp68l541.1sp69l121.8sp69l728.8(結(jié)果)由表29清楚可知,sp50l5以最低濃度抑制了pd-1與pd-l1的結(jié)合。比較同一sp下接頭長(zhǎng)度不同的sp68l1與sp68l5、以及sp69l1與sp69l7可知,均是接頭長(zhǎng)度短的一方(l1)在更低的濃度下也抑制了pd-1與pd-l1的結(jié)合。實(shí)施例33(結(jié)合親和力)對(duì)于抗pd-1抗體,通過biacore分析(biacoreab、uppsala、sweden),分別使下述表30所示的no1~no7的7個(gè)樣品n=5,對(duì)結(jié)合親和力進(jìn)行解析。作為配體,將人pd-1fc嵌合(r&d社制造)通過acetateph4.5(gehealthcare社制造)制備為5μg/ml。將該液體,在將導(dǎo)入了cm基的葡聚糖涂布于金膜表面的傳感芯片上通過標(biāo)準(zhǔn)的蛋白固定化法(氨基偶聯(lián)法)進(jìn)行固定。作為分析物的抗人pd-1單鏈抗體,通過hbs-ep緩沖液(gehealthcare社制造)制備為12.5、25、50、100和200nm。關(guān)于動(dòng)力學(xué)測(cè)量,將各分析物從低濃度開始,在添加時(shí)間60秒、解離時(shí)間60秒、流速30μl/分的條件下,通過單循環(huán)法實(shí)施。關(guān)于測(cè)量后的試樣的解離條件,將glycin1.5(gehealthcare社制造)設(shè)為添加時(shí)間60秒、流速30μl/分。本實(shí)驗(yàn)的運(yùn)行緩沖液為hbs-ep緩沖液。結(jié)果如下述表30所示?!颈?0】樣品名稱ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)no1sp50l5pd-1scfv417037.20.0026666.39e-09no2sp64l5pd-1scfv274449.60.0039601.44e-08no3sp67l10pd-1scfv359502.60.0031868.86e-09no4sp68l1pd-1scfv398089.30.0033888.51e-09no5sp68l5pd-1scfv291332.50.0054571.87e-08no6sp69l1pd-1scfv393708.80.0033798.58e-09no7sp69l7pd-1scfv238025.40.0036521.53e-08(結(jié)果)由表30清楚可知,作為抗體的功能,結(jié)合強(qiáng)(kd值小)、解離慢(kd值低)的sp50l5最優(yōu)。其次是no3、4、6的sp67l10、sp68l1、sp69l1。實(shí)施例34[重組有各種信號(hào)肽的抗hctla-4scfv02-flag分泌雙歧桿菌屬細(xì)菌的scfv表達(dá)解析]對(duì)于長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/pp30spxl20-hctla-4scfv02菌株(其中,x=7、45、50、52、55、58、64、66、67、68、69),分別從18小時(shí)培養(yǎng)的培養(yǎng)液中制備樣品,使用培養(yǎng)上清80μl,通過使用了抗flag標(biāo)簽抗體的蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行單鏈抗體分泌的解析。結(jié)果如圖28所示。由圖28清楚可知,通過插入有下述11種(sp7l20、sp45l20、sp50l20、sp52l20、sp55l20、sp58l20、sp64l20、sp66l20、sp67l20、sp68l20、sp69l20)的各分泌信號(hào)肽-接頭連接體的抗hctla-4scfv02分泌質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化的長(zhǎng)雙歧桿菌105-a株中,確認(rèn)了抗體分泌。其中,通過插入有sp50l20、sp52l20、sp64l20、sp67l20、sp68l20、sp69l20的各分泌信號(hào)肽-接頭連接體的抗hctla-4scfv02分泌質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化的長(zhǎng)雙歧桿菌105-a株中,分泌量較多。實(shí)施例35[抗hctla-4scfv02與人ctla-4的根據(jù)elisa的結(jié)合的確認(rèn)]使用由長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/pp30spxl20-h(huán)ctla-4scfv02菌株的各培養(yǎng)上清純化的各種抗hctla-4scfv02,對(duì)與人ctla-4的結(jié)合進(jìn)行確認(rèn)。測(cè)量的是450nm處的吸光度,并將570nm處作為對(duì)照。與人ctla-4的結(jié)合elisa的結(jié)果如下述表31所示。【表31】(結(jié)果)由表31清楚可知,根據(jù)sp/linker的種類的不同,scfv的結(jié)合量不同。sp7l20和sp67l20的值較高。實(shí)施例36[抗hctla-4scfv02對(duì)人ctla-4/人cd80的結(jié)合反應(yīng)或人ctla-4/人cd86的結(jié)合反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制活性的確認(rèn)]使用由長(zhǎng)雙歧桿菌105-a/pp30spxl20-h(huán)ctla-4scfv02菌株得到的抗hctla-4scfv02,向固相化了人ctla-4的微孔板中,添加純化scfv(10μg/ml)與人cd80或人cd86(1μg/ml)的混合物,測(cè)量與人ctla-4結(jié)合的人cd80或人cd86的量。將未添加抗hctla-4scfv02時(shí)的人cd80或人cd86結(jié)合抑制率作為0%,計(jì)算出使抗hctla-4scfv02共存時(shí)的對(duì)于人ctla-4/人cd80結(jié)合或人ctla-4/人cd86結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制率(%)。結(jié)果如下述表32所示。【表32】(結(jié)果)接頭長(zhǎng)度為20時(shí),信號(hào)肽并沒有帶來(lái)大的差異。實(shí)施例37對(duì)于抗hctla-4scfv02抗體,針對(duì)sp45、sp50、sp64、sp68、sp69的信號(hào)肽,對(duì)接頭長(zhǎng)度進(jìn)行研究。制作通過插入有spxly(其中,x=45、50、64、68時(shí),y=0、1、2、3、4、5;x=69時(shí),y=0、1、2、3、4、5,6,7,8,9,10)的各分泌信號(hào)肽-接頭連接體的抗hctla-4scfv02分泌質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化的長(zhǎng)雙歧桿菌105-a株,從18小時(shí)培養(yǎng)的培養(yǎng)液中制備樣品,使用培養(yǎng)上清100μl,通過使用了抗flag標(biāo)簽抗體的蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行單鏈抗體分泌的解析。結(jié)果如圖29(a)~(c)所示。(結(jié)果)由圖29清楚可知,在通過包含除了s68l0之外的sp45l0、sp45l1、sp45l2、sp45l3、sp45l4、sp45l5、sp50l0、sp50l1、sp50l2、sp50l3、sp50l4、sp50l5、sp64l0、sp64l1、sp64l2、sp64l3、sp64l4、sp64l5、sp68l1、sp68l2、sp68l3、sp68l4、sp68l5、sp69l0、sp69l1、sp69l2、sp69l3、sp69l4、sp69l5、sp69l6、sp69l7、sp69l8、sp69l9、sp69l10的分泌信號(hào)肽、分泌信號(hào)肽-接頭連接體的下游重組有抗hctla-4scfv02的表達(dá)盒的載體被轉(zhuǎn)化的長(zhǎng)雙歧桿菌105-a株中,確認(rèn)了抗hctla-4scfv02的分泌。產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明的雙歧桿菌屬細(xì)菌、藥物組合物在醫(yī)療領(lǐng)域是有用的。當(dāng)前第1頁(yè)12