本發(fā)明涉及一種益生菌制劑，尤其涉及一種改善上呼吸道微生態(tài)平衡的益生菌制劑及其制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
健康人體的下呼吸道尤其是細小支氣管以下部分，肺內(nèi)和胸腔是完全無菌的，鼻咽部作為呼吸道的起始部分，是連接下呼吸道與外界的通道，任何致病菌進入人體首先需要在鼻咽部定植然后才能進一步引起機體相應(yīng)的病理反應(yīng)。鼻咽在嬰兒出生時是無菌的，通過空氣環(huán)境及周圍人群的密切接觸，在出生后12小時左右就在鼻咽及喉部出現(xiàn)一般的需氧菌如甲型鏈球菌，白色葡萄球菌，在第四天則有76%的嬰兒帶金黃色葡萄球菌，以后逐漸在鼻咽部定居的細菌有奈瑟氏菌屬，大腸桿菌，嗜血桿菌等。健康人體的鼻咽部正常定植菌包括了：甲型鏈球菌，奈瑟氏菌屬，嗜血桿菌，葡萄球菌，棒狀桿菌和某些厭氧菌。而在這一部分定植的正常菌群中甲型鏈球菌占主導(dǎo)地位，比其它菌種有更強的抵抗力。
在我國空氣環(huán)境條件日趨惡化的今天，上呼吸道感染尤其是兒童由于免疫力低下導(dǎo)致的上呼吸道感染發(fā)病率逐年升高。研究表明，急慢性上呼吸道感染疾病的發(fā)生多與上呼吸道微生物群落失調(diào)密切相關(guān)，除分離到治病菌之外，正常定植的微生物群落也發(fā)生顯著變化，甲型鏈球菌比例極度低下，冗余種群（放線菌屬，厭氧菌，藤黃球菌）數(shù)量顯著增多。因此，從2006年即有臨床專家提出維持上呼吸道微生態(tài)平衡對于預(yù)防急慢性上呼吸道感染有重要作用。
微生態(tài)制劑就是利用正常菌群成員聯(lián)合制成的活的微生物制劑，它可以補充生境中缺乏的正常菌群，起到維持或調(diào)整微生態(tài)平衡的作用。目前應(yīng)用于腸道微生態(tài)平衡微生物制劑較為成熟，美國在2003年也有類似的腸道生態(tài)平衡的微生物制劑出現(xiàn)，用于治療因胃腸道異常微生物區(qū)系或微生物區(qū)系的異常分布引起的慢性腸道疾病。Vo rob’ ev等人根據(jù)腸道內(nèi)菌群失調(diào)時可導(dǎo)致嚴重的腹瀉，而雙歧桿菌可以糾正菌群失調(diào)的原理，提出在藥物中加入前生命期的雙歧桿菌，用來治療成人和兒童因菌群失調(diào)而出現(xiàn)的疾病。
《中國微生態(tài)學(xué)雜志》, 2000, 12(4):206-207出版的呼吸道感染與甲型鏈球菌的相關(guān)性研究，肖純凌，李舒音，韓秀珍，張月茹；該研究表明呼吸道感染病者的甲型鏈球菌檢出率明顯低于健康人士，說明呼吸道感染與呼吸道感染與甲型鏈球菌含量密切相關(guān)。但到目前為止，尚無甲型鏈球菌以及其他益生菌在調(diào)整上呼吸道微生態(tài)平衡方面的進一步詳細的介紹。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的之一是提出一種改善上呼吸道微生態(tài)平衡的益生菌制劑，通過甲型鏈球菌、四疊球菌、雙歧桿菌菌粉以及其他益生菌制成益生菌制劑，具有維持人體上呼吸道微生態(tài)平衡，預(yù)防上呼吸道感染性疾病的作用。
為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
一種改善上呼吸道微生態(tài)平衡的益生菌制劑，其特征在于：包括甲型鏈球菌菌粉、四疊球菌菌粉、雙歧桿菌菌粉和嗜酸乳桿菌菌粉，所述甲型鏈球菌菌粉占益生菌制劑的重量百分比為30～60%；所述益生菌制劑中活菌數(shù)為 1010～1015。
本發(fā)明的益生菌制劑可通過上述益生菌混合發(fā)酵制得，也可以分別單獨發(fā)酵后再混合制得，也可先單獨發(fā)酵甲型鏈球菌菌粉制得菌粉后，再將其他益生菌混合發(fā)酵制成混合菌種，最后將多次發(fā)酵得到的菌粉進行混合。
為了更好地實現(xiàn)本發(fā)明，所述雙歧桿菌菌粉為嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌和短雙歧桿菌中至少一種。
本發(fā)明的另一個目的是提供益生菌制劑的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：
A. 甲型鏈球菌菌粉制備
在液體培養(yǎng)基中加入乳清蛋白、低聚果糖后，121℃下高壓滅菌20min，冷卻至37℃后，接種甲型鏈球菌，于 37℃下連續(xù)培養(yǎng)至含菌量達到105～109/ml后，用低溫高速離心機進行離心，得到濕菌體；
將所述濕菌體懸于pH為4.8～7.2，質(zhì)量濃度為20%的脫脂奶粉液中，混合均勻后冷凍干燥即得到甲型鏈球菌菌粉；
B. 混合菌粉的制備
在液體培養(yǎng)基中加入乳清蛋白、低聚果糖后，121℃下高壓滅菌30min，冷卻至37℃后，接種四疊球菌菌粉、雙歧桿菌菌粉和嗜酸乳桿菌，于 37℃下連續(xù)培養(yǎng)至含菌量達到105～109/ml后，用低溫高速離心機進行離心，得到濕菌體；
將所述濕菌體懸于pH為4.8～7.2，質(zhì)量濃度為20%的脫脂奶粉液中，混合均勻后冷凍干燥即得到混合菌粉；
C.益生菌噴霧劑制備
將步驟A得到的甲型鏈球菌菌粉和步驟B得到的混合菌粉按3:1的重量比進行混合，然后加入重量百分比為1～5%的殼聚糖，0.5～1.5%的木糖醇，混勻后包裝即得到所述益生菌制劑。
上述制備方法中，所述液體培養(yǎng)基為TSB培養(yǎng)基。
步驟A中，所述連續(xù)培養(yǎng)的時間為20～48h。
步驟A中，所述乳清蛋白的添加量為發(fā)酵體積的1～6%，低聚果糖的添加量為發(fā)酵體積的1～5%。
步驟A中，所述甲型鏈球菌菌粉中活菌數(shù)為5×109/g。
步驟B中，所述連續(xù)培養(yǎng)的時間為18～36h。
步驟B中，所述四疊球菌菌粉、雙歧桿菌菌粉和嗜酸乳桿菌的接種比例為1:1:1。
步驟B中，所述乳清蛋白的添加量為發(fā)酵體積的1～5%，低聚果糖的添加量為發(fā)酵體積的1～5%。
步驟B中，所述混合菌粉中活菌數(shù)為5×1010/g。
本發(fā)明的有益效果:
（1）本發(fā)明通過添加人體呼吸道正常寄生的益生菌：甲型鏈球菌和四疊球菌，起到維持呼吸道的微生態(tài)平衡的作用；益生菌制劑中還添加了雙歧桿菌菌粉，可維持甲型鏈球菌和四疊球菌初始含量狀態(tài)，使其含量保持相對平衡的狀態(tài)，以保證益生菌制劑預(yù)防呼吸道疾病的作用達到最佳；另外，益生菌制劑中添加有嗜酸乳桿菌菌粉，該益生菌除了調(diào)節(jié)胃、腸微生態(tài)平衡，還可與雙歧桿菌在腸道內(nèi)發(fā)酵后，產(chǎn)生乳酸和醋酸，可提高鈣、磷、鐵的利用率，促進鐵和維生素D的吸收，產(chǎn)生維生素K及維生素B，起到促進人整個機體健康的作用。
（2）本發(fā)明的雙歧桿菌菌粉為嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌和短雙歧桿菌中的一種，以穩(wěn)定微生物種群，調(diào)節(jié)宿主環(huán)境和微生物群落的穩(wěn)定。
（3）本發(fā)明通過菌粉制備后，將多種益生菌菌粉混合制成噴霧劑，將制劑中的益生菌群直接補充到人體咽部，不僅有利于呼吸道微生物菌群穩(wěn)定，能夠有效預(yù)防上呼吸道感染，避免上呼吸道疾病的發(fā)生，而且在益生菌粉隨唾液吞咽進入胃腸道后，仍然能夠發(fā)揮益生菌作用，調(diào)節(jié)胃腸道菌群平衡，增強人體對外來致病菌的抵抗力，噴劑使用起來也方便、快捷，尤其適合兒童和其他吞咽能力不足的人群使用。
具體實施方式
實施例1
一種改善上呼吸道微生態(tài)平衡的益生菌制劑，由甲型鏈球菌菌粉、四疊球菌菌粉、嬰兒雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌組成，所述甲型鏈球菌菌粉占益生菌制劑的重量百分比為30%；所述益生菌制劑中活菌數(shù)為 1010。
實施例2
一種改善上呼吸道微生態(tài)平衡的益生菌制劑，由甲型鏈球菌菌粉、四疊球菌菌粉、長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌組成，所述甲型鏈球菌菌粉占益生菌制劑的重量百分比為60%；所述益生菌制劑中活菌數(shù)為 1015。
實施例3
一種改善上呼吸道微生態(tài)平衡的益生菌制劑，由甲型鏈球菌菌粉、四疊球菌菌粉、短雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌組成，所述甲型鏈球菌菌粉占益生菌制劑的重量百分比為50%；所述益生菌制劑中活菌數(shù)為 1012。
本實施例中的益生菌制劑的制備方法如下：
A. 甲型鏈球菌菌粉制備
在液體培養(yǎng)基中加入乳清蛋白、低聚果糖后，121℃下高壓滅菌20min，冷卻至37℃后，接種甲型鏈球菌，于 37℃下連續(xù)培養(yǎng)至含菌量達到1×105/ml后，用低溫高速離心機進行離心，得到濕菌體；
將所述濕菌體懸于pH為4.8，質(zhì)量濃度為20%的脫脂奶粉液中，混合均勻后冷凍干燥即得到甲型鏈球菌菌粉；
B. 混合菌粉的制備
在液體培養(yǎng)基中加入乳清蛋白、低聚果糖后，121℃下高壓滅菌30min，冷卻至37℃后，接種四疊球菌菌粉、雙歧桿菌菌粉和嗜酸乳桿菌，于 37℃下連續(xù)培養(yǎng)至含菌量達到1×105/ml后，用低溫高速離心機進行離心，得到濕菌體；
將所述濕菌體懸于pH為4.8，質(zhì)量濃度為20%的脫脂奶粉液中，混合均勻后冷凍干燥即得到混合菌粉；
C.益生菌噴霧劑制備
將步驟A得到的甲型鏈球菌菌粉和步驟B得到的混合菌粉按3:1的重量比進行混合，然后加入重量百分比為1%的殼聚糖，0.5%的木糖醇，混勻后包裝即得到所述益生菌制劑。
實施例4
一種改善上呼吸道微生態(tài)平衡的益生菌制劑，由甲型鏈球菌菌粉、四疊球菌菌粉、短雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌組成，所述甲型鏈球菌菌粉占益生菌制劑的重量百分比為55%；所述益生菌制劑中活菌數(shù)為 6*1010。
本實施例的益生菌制劑制備方法同實施例3。
本實施例的制備方法中，液體培養(yǎng)基為TSB培養(yǎng)基。
實施例5
一種改善上呼吸道微生態(tài)平衡的益生菌制劑，由甲型鏈球菌菌粉、四疊球菌菌粉、短雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌組成，所述甲型鏈球菌菌粉占益生菌制劑的重量百分比為55%；所述益生菌制劑中活菌數(shù)為 6*1010。
制備方法如下：
A. 甲型鏈球菌菌粉制備
在液體培養(yǎng)基中加入乳清蛋白、低聚果糖后，121℃下高壓滅菌20min，冷卻至37℃后，接種甲型鏈球菌，于 37℃下連續(xù)培養(yǎng)至含菌量達到1×109/ml后，用低溫高速離心機進行離心，得到濕菌體；
將所述濕菌體懸于pH為7.2，質(zhì)量濃度為20%的脫脂奶粉液中，混合均勻后冷凍干燥即得到甲型鏈球菌菌粉；
B. 混合菌粉的制備
在液體培養(yǎng)基中加入乳清蛋白、低聚果糖后，121℃下高壓滅菌30min，冷卻至37℃后，接種四疊球菌菌粉、雙歧桿菌菌粉和嗜酸乳桿菌，于 37℃下連續(xù)培養(yǎng)至含菌量達到1×109/ml后，用低溫高速離心機進行離心，得到濕菌體；
將所述濕菌體懸于pH為6.5，質(zhì)量濃度為20%的脫脂奶粉液中，混合均勻后冷凍干燥即得到混合菌粉；
C.益生菌噴霧劑制備
將步驟A得到的甲型鏈球菌菌粉和步驟B得到的混合菌粉按3:1的重量比進行混合，然后加入重量百分比為5%的殼聚糖，1.5%的木糖醇，混勻后包裝即得到所述益生菌制劑。
進一步地，本實施例的制備方法中，液體培養(yǎng)基為TSB培養(yǎng)基。
步驟A中，所述連續(xù)培養(yǎng)的時間為20h。
步驟A中和步驟B中，所述乳清蛋白的添加量為發(fā)酵體積的1%，低聚果糖的添加量為發(fā)酵體積的1%。
步驟A中，所述甲型鏈球菌菌粉中活菌數(shù)為5×1010/g。
實施例6
一種改善上呼吸道微生態(tài)平衡的益生菌制劑，由甲型鏈球菌菌粉、四疊球菌菌粉、短雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌組成，所述甲型鏈球菌菌粉占益生菌制劑的重量百分比為45%；所述益生菌制劑中活菌數(shù)為 1011。
本實施例的益生菌制劑的制備方法與實施例5的區(qū)別在于：
步驟A中，所述連續(xù)培養(yǎng)的時間為48h。
步驟A中，所述乳清蛋白的添加量為發(fā)酵體積的6%，低聚果糖的添加量為發(fā)酵體積的5%。
步驟B中，脫脂奶粉液的pH值為7.2。
步驟B中，所述四疊球菌菌粉、雙歧桿菌菌粉和嗜酸乳桿菌的接種比例為1:1:1。
步驟B中，所述連續(xù)培養(yǎng)的時間為18h。
步驟B中，所述乳清蛋白的添加量為發(fā)酵體積的5%，低聚果糖的添加量為發(fā)酵體積的5%。
實施例7
本實施例與實施例6的區(qū)別在于，步驟A中，所述連續(xù)培養(yǎng)的時間為36h；步驟A中，所述乳清蛋白的添加量為發(fā)酵體積的2%，低聚果糖的添加量為發(fā)酵體積的3%；步驟B中，所述連續(xù)培養(yǎng)的時間為36h；所述乳清蛋白的添加量為發(fā)酵體積的2.5%，低聚果糖的添加量為發(fā)酵體積的4%；步驟B得到的混合菌粉中活菌數(shù)為5×1010/g。