本發(fā)明涉及一種多孔支架材料的制備方法，特別涉及一種多肽改性蜂窩狀纖維素支架及其制備方法。

背景技術(shù)：

組織工程是指應(yīng)用生命科學(xué)和工程學(xué)的原理與技術(shù)，在正確認(rèn)識(shí)哺乳動(dòng)物正常及病理兩種狀態(tài)下組織結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，研究、開(kāi)發(fā)用于修復(fù)、維護(hù)和促進(jìn)人體各種組織或器官損傷后功能和形態(tài)生物替代物的學(xué)科[貴浩然,李澎,張衛(wèi)國(guó).制備軟骨組織工程支架的材料和方法.中國(guó)組織工程研究,2013,17:509]。組織工程支架材料是組織工程三大要素之一，理想的組織工程支架材料應(yīng)具有良好的生物相容性、生物可降解性、降解產(chǎn)物無(wú)毒性、良好的機(jī)械強(qiáng)度以及高孔隙率的三維空間結(jié)構(gòu)[MM Stevens.Biomaterials for bone tissue engineering.Materials today,2008,11:18；鄂征,劉流.醫(yī)學(xué)組織工程技術(shù)與臨床應(yīng)用.北京:北京出版社,2003]。天然高分子材料以其良好的生物相容性被廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域。天然高分子材料主要有膠原蛋白、殼聚糖、海藻酸鹽、甲殼素、纖維素、瓊脂糖、多肽、透明質(zhì)酸和絲素蛋白等[U Gburecka,JE Barraletb,K Spatz,et al.Ionic modification of calcium phosphate cement viscosity.Part iv:Hypodermic injection and strength improvement of apatite cement.Biomaterials,2004,25:2187]。由它們制得的多孔支架材料普遍存在力學(xué)性能不足、可塑性差等缺點(diǎn)。木材具有長(zhǎng)期進(jìn)化演變而成的優(yōu)化的多孔結(jié)構(gòu)，且主要成分為纖維，若能通過(guò)技術(shù)處理去除其非纖維素成分并保持其天然結(jié)構(gòu)，將可獲得綜合性能優(yōu)異的多孔纖維素支架材料。

組織工程支架材料需要高孔隙率、高比表面積和適宜的孔徑，這取決于支架制備方法。目前，纖維素支架材料的制備方法是將微晶纖維素或棉纖維素等溶于強(qiáng)堿溶液或離子溶液，再制備成支架材料，但所得支架機(jī)械強(qiáng)度低、孔隙連通性較差、孔隙率與孔分布可控性差，不利于細(xì)胞長(zhǎng)入、血管化、養(yǎng)分傳輸和代謝產(chǎn)物排放。而絕大多數(shù)木材具有天然的蜂窩狀多孔結(jié)構(gòu)，且經(jīng)幾個(gè)至數(shù)十個(gè)微米的微孔連通，力學(xué)性能優(yōu)異。通過(guò)一定技術(shù)手段將木材轉(zhuǎn)變?yōu)榧兝w維素多孔材料，將可保持其優(yōu)異的力學(xué)性能和特殊的蜂窩狀孔結(jié)構(gòu)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有很好的應(yīng)用前景。然而，纖維素為生物惰性材料，生物降解性不夠理想。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種多肽改性蜂窩狀纖維素支架及其制備方法，首先通過(guò)酸/堿處理和漂白過(guò)程將木材轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維素，然后采用真空浸涂工藝將多肽修飾于纖維素支架的孔壁表面，即得到多肽改性蜂窩狀纖維素支架，該支架具有優(yōu)異的生物相容性、突出的機(jī)械性能和特殊的蜂窩狀孔結(jié)構(gòu)，所采用的制備方法原料種類(lèi)多、孔結(jié)構(gòu)類(lèi)型豐富、工藝過(guò)程簡(jiǎn)單、操作方便，所得支架在細(xì)胞3D培養(yǎng)、組織工程、組織修復(fù)等方面具有應(yīng)用潛力。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種多肽改性蜂窩狀纖維素支架的制備方法，包括以下步驟：

1)堿處理：將木材試樣在濃度為1mol/L～6mol/L的堿溶液浸泡6小時(shí)～24小時(shí)后，將試樣轉(zhuǎn)移至質(zhì)量濃度為2.5mol/L～12.5mol/L的堿溶液中，于60℃～100℃加熱攪拌6小時(shí)～16小時(shí)；

2)酸處理：將經(jīng)步驟1)堿處理后的試樣洗滌后放入濃度為1mol/L～5mol/L的鹽酸中，于65℃～100℃加熱攪拌4小時(shí)～12小時(shí)；

3)漂白：將經(jīng)步驟2)酸處理后的試樣進(jìn)行漂白；

4)多肽涂覆：將經(jīng)步驟3)漂白的試樣置于多肽溶液中，采用真空浸涂工藝將多肽浸涂于孔壁上，干燥后得到多肽改性蜂窩狀纖維素支架；其中，所述的多肽溶液是將多肽溶于溶劑中制備的，每100mL溶劑中加入多肽的質(zhì)量為0.1g～5g。

本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，所述木材試樣是通過(guò)將木材加工成厚度1mm～10mm、直徑0.5cm～2cm的圓片，或者各維度長(zhǎng)度均不超過(guò)2cm的規(guī)則塊體或異形塊體。

本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，所述的木材為爬山虎藤、泡桐、沙比利或橡木。

本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，所述堿溶液為氫氧化鈉溶液或氫氧化鉀溶液。

本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，漂白具體過(guò)程為：將經(jīng)步驟3)酸處理后的試樣置于濃度為1mol/L～2mol/L的次氯酸鈉溶液中，室溫?cái)嚢?小時(shí)～12小時(shí)后取出，用水和乙醇反復(fù)漂洗至pH呈中性后進(jìn)行干燥。

本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，所述的多肽溶液是將多肽溶于溶劑中制備的，其中，溶劑為水、二氯甲烷、氯仿、二甲基甲酰胺、甲酸或三氟乙酸。

本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，所述的多肽為L(zhǎng)-谷氨酸-γ-芐酯、L-賴(lài)氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸的均聚物或幾種的共聚物。

本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，所述的真空浸涂工藝具體過(guò)程為：先在負(fù)壓為0.02MPa下保持10分鐘～30分鐘、再于負(fù)壓為0.04MPa保持1小時(shí)～3小時(shí)，最后在負(fù)壓為0.06MPa保持1小時(shí)～4小時(shí)。

一種多肽改性蜂窩狀纖維素支架，該支架呈蜂窩狀結(jié)構(gòu)，孔隙率為80％～95％，蜂窩狀孔壁為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，蜂窩狀孔的孔徑為90μm～200μm。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

1.本發(fā)明中通過(guò)兩次堿處理，第一次室溫的堿處理是一個(gè)預(yù)反應(yīng)的過(guò)程，使纖維中酚類(lèi)等偏酸性物質(zhì)充分與堿接觸，第二次加熱堿處理是除去纖維中的酚類(lèi)等物質(zhì)，堿處理后采用酸處理，酸處理有兩個(gè)目的，一是除去金屬離子與堿生成的沉淀，二是中和堿。本發(fā)明的支架材料保留了模板的特殊的蜂窩狀孔結(jié)構(gòu)，孔隙率為80％～95％，蜂窩狀孔的孔徑范圍為90μm～200μm，蜂窩狀孔通過(guò)幾個(gè)至幾十個(gè)微米的微孔連通，連通性好。

2.本發(fā)明的支架材料沒(méi)有破壞模板固有的組織結(jié)構(gòu)，因而具有突出的機(jī)械強(qiáng)度，其壓縮模量高達(dá)50MPa，遠(yuǎn)高于現(xiàn)有纖維素及其復(fù)合材料支架的壓縮模量。

3.本發(fā)明的支架材料的孔壁上涂覆有多肽涂層，該多肽涂層賦予其優(yōu)異的生物相容性，且其效果好于現(xiàn)有的生物聚酯等材料。

4.本發(fā)明的制備方法具有原料來(lái)源廣、孔結(jié)構(gòu)多樣性好、工藝過(guò)程簡(jiǎn)單，所得支架材料適用多種生物醫(yī)學(xué)用途，如細(xì)胞三維培養(yǎng)、組織工程、缺損組織修復(fù)和重建等。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例1得到的蜂窩孔狀纖維素的SEM照片，其中，圖1(a)為橫截面，圖1(b)為縱截面。

圖2是實(shí)施例1得到的聚(L-谷氨酸-γ-芐酯)改性蜂窩孔狀纖維素支架的SEM照片，其中，圖2(a)為橫截面，圖2(b)為縱截面。

圖3是實(shí)施例1得到的聚(L-谷氨酸-γ-芐酯)改性蜂窩孔狀纖維素支架的圧縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但本發(fā)明并不限于此。

實(shí)施例1

聚(L-谷氨酸-γ-芐酯)改性蜂窩狀纖維素支架的制備

1)加工成型：將爬山虎藤加工成厚度為4mm、直徑為6mm的圓片，得到試樣；

2)堿處理：將步驟1)獲得的試樣在濃度為4mol/L的氫氧化鈉溶液浸泡12小時(shí)后，將試樣轉(zhuǎn)移至2.5mol/L氫氧化鈉水溶液中，于100℃加熱攪拌10小時(shí)；

3)酸處理：將經(jīng)步驟2)堿處理后的試樣用蒸餾水充分洗滌后放入濃度為2mol/L的鹽酸中，于100℃加熱攪拌4小時(shí)；

4)漂白：將經(jīng)步驟3)酸處理后的試樣置于濃度為2mol/L的次氯酸鈉溶液中，室溫?cái)嚢?小時(shí)后取出，用水和乙醇反復(fù)漂洗至pH呈中性后進(jìn)行干燥；

5)多肽涂覆：將經(jīng)步驟4)漂白的試樣置于多肽溶液中，采用真空浸涂工藝將多肽浸涂于孔壁上，具體為負(fù)壓0.02MPa下保持10分鐘、負(fù)壓0.04MPa保持1小時(shí)、負(fù)壓0.06MPa保持1小時(shí)，最后干燥試樣，即得到聚(L-谷氨酸-γ-芐酯)改性蜂窩狀纖維素支架。其中，多肽溶液是通過(guò)將0.2g L-谷氨酸-γ-芐酯的均聚物溶于100mL氯仿中制得。

經(jīng)過(guò)酸/堿處理和漂白后纖維素的SEM照片見(jiàn)圖1，最后得到的聚(L-谷氨酸-γ-芐酯)改性蜂窩狀纖維素的SEM照片和壓縮應(yīng)力應(yīng)-變曲線分別見(jiàn)圖2和圖3。

由圖1可以看出，處理后的纖維素呈蜂窩狀，蜂窩狀孔孔壁呈現(xiàn)網(wǎng)狀，連通性高。

由圖2可以看出，經(jīng)聚(L-谷氨酸-γ-芐酯)涂覆改性后，仍然呈現(xiàn)典型的蜂窩狀結(jié)構(gòu)，蜂窩狀孔壁仍為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔隙率為80％～95％，蜂窩狀孔的孔徑范圍為90μm～200μm，蜂窩狀孔通過(guò)幾個(gè)至幾十個(gè)微米的微孔連通，連通性好，孔徑大小基本不變。

由圖3可以看出，聚(L-谷氨酸-γ-芐酯)改性蜂窩狀纖維素的壓縮模量高達(dá)50.1MPa±2.4MPa。

實(shí)施例2

1)加工成型：將爬山虎藤加工成厚度1mm、直徑0.5cm的圓片，得到木材試樣。

2)堿處理：將步驟1)中的木材試樣在濃度為1mol/L的氫氧化鈉溶液浸泡24小時(shí)后，將試樣轉(zhuǎn)移至質(zhì)量濃度為12.5mol/L的氫氧化鈉水溶液中，于60℃加熱攪拌16小時(shí)。

3)酸處理：將經(jīng)步驟2)堿處理后的試樣洗滌后放入濃度為1mol/L的鹽酸中，于65℃加熱攪拌12小時(shí)。

4)漂白：將經(jīng)步驟3)酸處理后的試樣置于濃度為1mol/L的次氯酸鈉溶液中，室溫?cái)嚢?小時(shí)后取出，用水和乙醇反復(fù)漂洗至pH呈中性后進(jìn)行干燥。

5)多肽涂覆：將經(jīng)步驟4)漂白的試樣置于多肽溶液中，采用真空浸涂工藝將多肽浸涂于孔壁上，干燥后得到多肽改性蜂窩狀纖維素支架；其中，所述的多肽溶液是通過(guò)將0.1g L-賴(lài)氨酸的均聚物溶于100mL二氯甲烷中制備的。其中，所述的真空浸涂工藝具體過(guò)程為：先在負(fù)壓為0.02MPa下保持30分鐘、再于負(fù)壓為0.04MPa保持1.5小時(shí)，最后在負(fù)壓為0.06MPa保持4小時(shí)。

實(shí)施例3

1)加工成型：將泡桐加工成厚度10mm、直徑2cm的圓片，得到木材試樣。

2)堿處理：將步驟1)中的木材試樣在濃度為3mol/L的氫氧化鈉溶液浸泡18小時(shí)后，將試樣轉(zhuǎn)移至質(zhì)量濃度為5mol/L的氫氧化鈉水溶液中，于100℃加熱攪拌6小時(shí)。

3)酸處理：將經(jīng)步驟2)堿處理后的試樣洗滌后放入濃度為4mol/L的鹽酸中，于70℃加熱攪拌10小時(shí)。

4)漂白：將經(jīng)步驟3)酸處理后的試樣置于濃度為1.5mol/L的次氯酸鈉溶液中，室溫?cái)嚢?0小時(shí)后取出，用水和乙醇反復(fù)漂洗至pH呈中性后進(jìn)行干燥。

5)多肽涂覆：將經(jīng)步驟4)漂白的試樣置于多肽溶液中，采用真空浸涂工藝將多肽浸涂于孔壁上，干燥后得到多肽改性蜂窩狀纖維素支架；其中，所述的多肽溶液是通過(guò)將3g L-苯丙氨酸與L-丙氨酸的共聚物溶于100mL二甲基甲酰胺中制備的。其中，所述的真空浸涂工藝具體過(guò)程為：先在負(fù)壓為0.02MPa下保持20分鐘、再于負(fù)壓為0.04MPa保持2.5小時(shí)，最后在負(fù)壓為0.06MPa保持3小時(shí)。

實(shí)施例4

1)加工成型：將沙比利加工成最大維度長(zhǎng)度不超過(guò)2cm的規(guī)則塊體，得到木材試樣。

2)堿處理：將步驟1)中的木材試樣在濃度為5mol/L的氫氧化鉀溶液浸泡10小時(shí)后，將試樣轉(zhuǎn)移至質(zhì)量濃度為8mol/L的氫氧化鈉水溶液中，于80℃加熱攪拌12小時(shí)。

3)酸處理：將經(jīng)步驟2)堿處理后的試樣洗滌后放入濃度為3mol/L的鹽酸中，于80℃加熱攪拌8小時(shí)。

4)漂白：將經(jīng)步驟3)酸處理后的試樣置于濃度為2mol/L的次氯酸鈉溶液中，室溫?cái)嚢?2小時(shí)后取出，用水和乙醇反復(fù)漂洗至pH呈中性后進(jìn)行干燥。

5)多肽涂覆：將經(jīng)步驟4)漂白的試樣置于多肽溶液中，采用真空浸涂工藝將多肽浸涂于孔壁上，干燥后得到多肽改性蜂窩狀纖維素支架；其中，所述的多肽溶液是通過(guò)將1g L-賴(lài)氨酸、L-苯丙氨酸與L-丙氨酸的共聚物溶于100mL水中制備的。其中，所述的真空浸涂工藝具體過(guò)程為：先在負(fù)壓為0.02MPa下保持30分鐘、再于負(fù)壓為0.04MPa保持2小時(shí)，最后在負(fù)壓為0.06MPa保持2小時(shí)。

實(shí)施例5

1)加工成型：將橡木加工成最大維度長(zhǎng)度不超過(guò)2cm的異形塊體，得到木材試樣。

2)堿處理：將步驟1)中的木材試樣在濃度為6mol/L的氫氧化鉀溶液浸泡6小時(shí)后，將試樣轉(zhuǎn)移至質(zhì)量濃度為10mol/L的氫氧化鈉水溶液中，于90℃加熱攪拌11小時(shí)。

3)酸處理：將經(jīng)步驟2)堿處理后的試樣洗滌后放入濃度為5mol/L的鹽酸中，于90℃加熱攪拌7小時(shí)。

4)漂白：將經(jīng)步驟3)酸處理后的試樣置于濃度為1mol/L的次氯酸鈉溶液中，室溫?cái)嚢?小時(shí)后取出，用水和乙醇反復(fù)漂洗至pH呈中性后進(jìn)行干燥。

5)多肽涂覆：將經(jīng)步驟4)漂白的試樣置于多肽溶液中，采用真空浸涂工藝將多肽浸涂于孔壁上，干燥后得到多肽改性蜂窩狀纖維素支架；其中，所述的多肽溶液是通過(guò)將3gL-賴(lài)氨酸的均聚物溶于100mL三氟乙酸中制備的。其中，所述的真空浸涂工藝具體過(guò)程為：先在負(fù)壓為0.02MPa下保持15分鐘、再于負(fù)壓為0.04MPa保持3小時(shí)，最后在負(fù)壓為0.06MPa保持1小時(shí)。

本發(fā)明中在制備多肽溶液時(shí)，溶劑還可以采用甲酸；L-谷氨酸-γ-芐酯、L-賴(lài)氨酸、L-苯丙氨酸、L-丙氨酸的均聚物或幾種的共聚物的制備方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。

近年來(lái)頗受重視的人工合成的多肽材料，具有優(yōu)異的生物相容性，已廣泛用于制備藥物載體。將這種多肽材料與纖維素復(fù)合，將可兼具多肽優(yōu)異的生物相容性和木材衍生纖維素的特殊多孔結(jié)構(gòu)和高強(qiáng)度。為此，本發(fā)明提出一種技術(shù)，在去除木材中非纖維素成分的同時(shí)保持木材多孔結(jié)構(gòu)，再在其孔壁表面涂覆一層多肽材料，獲得一種理想的組織工程多孔支架材料。該支架以II型纖維素為蜂窩狀孔骨架，孔壁涂覆有多肽涂層，具有優(yōu)異的力學(xué)性能和生物相容性，孔隙率為80％～95％，蜂窩狀孔的孔徑范圍為90μm～200μm，蜂窩狀孔通過(guò)幾個(gè)至幾十個(gè)微米的微孔連通，壓縮模量高達(dá)50MPa。