本發(fā)明涉及植物化學及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及中藥苦參的多種有效單體成分在制備心肌保護藥物中的應用。
背景技術(shù)：
心肌缺血是指心臟的血液灌注減少，導致心臟的供氧減少，心肌能量代謝不正常，不能支持心臟正常工作的一種病理狀態(tài)。持續(xù)性的心肌缺血可導致心肌壞死、心律失常、心力衰竭，是造成患者死亡的直接原因之一。缺血性心臟病具有發(fā)病急、進展快、危害大的特點，因此，尋找防治缺血性心臟病的措施及藥物是心血管領(lǐng)域的研究熱點。
目前保護心臟，減少心肌缺血損傷最有力的方法是缺血預適應，但因倫理道德及使用不便等原因限制其臨床運用。隨著對缺血預適應本質(zhì)、特點和作用機理的不斷認識和研究，人們期望用藥物代替缺血刺激，促使機體釋放生物活性物質(zhì)或直接激活機體保護機制而產(chǎn)生心臟對缺血、缺氧的耐受。隨著人們回歸自然熱潮的興起，從天然植物和中藥中挖掘和開發(fā)低毒高效，治療和保護缺血心肌的藥物已成為研究熱點。
苦參為豆科槐屬植物苦參Sophora flavescens Ait.的干燥根，具有清熱燥濕、殺蟲、利尿等功效?？鄥儆谇鍩崴幹械那鍩嵩餄袼?，用于熱痢，便血，黃疸尿閉，赤白帶下，陰腫陰癢，濕疹，濕瘡，皮膚瘙癢，疥癬麻風；其主要藥理作用有抗心肌纖維化，抗心律失常，抗腫瘤，抗炎，抗病原微生物，抗肝損傷以及對免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用等，已廣泛應用于心血管病的防治。
苦參化學成分主要為生物堿和黃酮類化合物。近年研究證明苦參黃酮類成分具有廣泛的藥理作用，包括抑菌、抗心律失常、抗氧化、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗瘧、降糖、神經(jīng)保護等(中成藥，2016，38(5)：1119-1123；吉林醫(yī)藥學院學報，2013，34(3)：222-224)；此外還發(fā)現(xiàn)苦參總黃酮具有抗心肌纖維化的作用(中草藥，2015，46(20)：3055-3059；中藥藥理與臨床，2013，29(4)：76-78)，是苦參治療心臟相關(guān)疾病的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一。
盡管苦參總黃酮具有心肌保護活性，但苦參酮、降苦參酮、苦參醇A 3種化合物的心肌保護活性至今未見報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供苦參有效成分在制備心肌保護藥物中的應用。
本發(fā)明的技術(shù)方案是，提供一種一類二氫黃酮化合物在制備心肌保護藥物中的應用，其化學結(jié)構(gòu)如下，
其中，R1表示R2表示取代基為任意位置的-OCH3或-OH中的一個或兩個；R3表示取代基為任意位置的一個或兩個-OH。
進一步的，提供一種一類二氫黃酮化合物在制備心肌保護藥物中的應用，其化學結(jié)構(gòu)如下，
其中，R1表示R2表示-OCH3或-OH；R3表示取代基為-H或-OH。
進一步的，本發(fā)明所研究的3種化合物涉及苦參中分離、制備得到的3種二氫黃酮成分，它們的化學結(jié)構(gòu)如下，可從天然藥物中分離制備得到，也可通過化學合成制備得到。
(化合物1)苦參酮：
(化合物2)降苦參酮：
(化合物3)苦參醇A：
本發(fā)明通過考察化合物對缺氧/復氧致?lián)p傷的乳鼠原代心肌細胞存活率的影響，以及對缺血再灌注大鼠心肌梗死面積的影響，首次發(fā)現(xiàn)苦參酮、降苦參酮、苦參醇A具有心肌保護作用。
本發(fā)明通過考察化合物對缺血再灌注大鼠心肌梗死面積的影響，首次發(fā)現(xiàn)苦參酮、降苦參酮、苦參醇A 3個化合物的組合具有心肌保護作用。
本發(fā)明通過藥理實驗發(fā)現(xiàn)苦參中3個單體成分及其組合的心肌保護藥理活性，能用于制備具有相應作用的藥物，有利于進行新型心肌保護藥物的研發(fā)。
具體實施方式
為了更好地解釋本發(fā)明可用于制備鎮(zhèn)痛抗炎藥物的實質(zhì)內(nèi)容，以下通過具體實驗實施例來作進一步的闡釋。以下實施例均為說明性的，并不對本發(fā)明做任何限定。
實施例1：受試單體化合物對缺氧/復氧致?lián)p傷的乳鼠原代心肌細胞存活率的影響
1材料、試劑及儀器
1.1動物
SD乳鼠(<24h)，SPF級，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，質(zhì)量合格證編號：11400700074853。
1.2主要材料與試劑
受試化合物對照品(苦參酮、降苦參酮、苦參醇A、葛根素)購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；WST-8試劑盒(北京鈕因華信科技發(fā)展有限公司)；0.06％胰蛋白酶(美國Gibco公司)；0.06％Ⅰ型膠原酶(美國Sigma公司)；5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu，美國Invitrogen公司)；雙抗(青霉素/鏈霉素，北京鈕因華信科技發(fā)展有限公司)。
1.3主要儀器
5％CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；三氣細胞培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；酶標儀(M5，美國Molecular Devices公司)；96孔細胞培養(yǎng)板(美國Costar公司)。
2.方法
2.1受試樣品溶液配制
取各受試化合物對照品適量溶于DMSO，取DMSO溶解的受試樣品用生理鹽水稀釋到所需要濃度。
2.2乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng)
乳鼠酒精消毒，開胸剪下心室。置于預冷PBS液中洗凈余血。將心肌剪碎成1mm3，置于酶中消化(膠原酶與胰酶1:1，終濃度為0.06％)，放入轉(zhuǎn)子機械攪拌加速消化。
第一次消化約5min，棄去消化液。從第二次消化開始收集消化液，每次5min，取上清至完全培養(yǎng)基中終止消化，共收集7次。800rpm離心3min收集細胞。20％胎牛血清D/F12培養(yǎng)基(終濃度100μM Brdu，100UI雙抗)重懸細胞，過200目篩網(wǎng)至培養(yǎng)皿中，進行差速貼壁生長(成纖維細胞先貼壁，心肌細胞貼壁較慢)。
培養(yǎng)1.5h后收集細胞懸液(未貼壁細胞)，細胞計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為5×104/mL，接種0.2mL/孔于96孔培養(yǎng)板，置5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后倒置顯微鏡下可見孔內(nèi)心肌細胞有規(guī)律的集體跳動即培養(yǎng)成功。每2-3天更換新鮮的20％胎牛血清D/F12培養(yǎng)基(終濃度100μM Brdu，100UI雙抗)，細胞可在14天內(nèi)保持活力用于實驗。
2.3建模及給藥
更換N2飽和的PBS緩沖液，放入三氣細胞培養(yǎng)箱，缺氧2h，更換完全培養(yǎng)基，同時加入樣品，5％CO2培養(yǎng)箱復氧1h。同時設(shè)定正常組(細胞+生理鹽水，5％CO2正常培養(yǎng)3h)，模型組(細胞+生理鹽水，方法同建模)和空白組(無細胞+生理鹽水)。
2.4細胞存活率測定(CCK-8法)
更換100μL/孔無血清培養(yǎng)基，加10μl/孔CCK-8原液，5％CO2培養(yǎng)箱中共孵育2h，450nm處測定吸光度。
2.5計算與統(tǒng)計
細胞存活率(活細胞相對數(shù)量％)＝A(加藥)-A(空白)/A(0加藥)-A(空白)×100；
SPSS17.0軟件計算并統(tǒng)計，ANOVA單因素方差分析顯著性差異(P<0.05)。
3實驗結(jié)果
化合物對缺氧/復氧致?lián)p傷的乳鼠心肌細胞存活率的影響如表1。葛根素(陽性對照)可發(fā)揮心肌細胞保護作用，本研究發(fā)現(xiàn)其可顯著提高缺氧/復氧致?lián)p傷的心肌細胞存活率，說明細胞病理模型可靠；同葛根素一樣，苦參酮、降苦參酮及苦參醇A 3種化合物均可顯著提高缺氧/復氧致?lián)p傷的心肌細胞存活率，表明該3種化合物均有心肌保護活性。
表1受試化合物對缺氧/復氧致?lián)p傷的乳鼠心肌細胞存活率的影響(n＝3，)
與模型組比較，*P<0.05。
實施例2：受試單體化合物對缺血再灌注大鼠心肌梗死面積的影響
1材料、試劑及儀器
1.1動物
健康雄性Wistar大鼠48只，體重200±20g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。實驗前，所用動物均進行一周的適應性飼養(yǎng)。在適應性飼養(yǎng)期間，動物自由取食，自由飲水。飼養(yǎng)室內(nèi)保持安靜，室內(nèi)溫度維持在23–25℃，濕度55％～75％，日光燈照明，每天24h中保持12h照明12h黑暗。
1.2主要材料與試劑
受試化合物對照品(苦參酮、降苦參酮、苦參醇A)購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；地奧心血康軟膠囊購自成都地奧制藥集團有限公司；伊文思藍(Evans blue)和氯化三苯基四氮唑(TTC)購自Sigma公司。
1.3主要儀器
HX–200動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司)，BL–420F生物機能實驗系統(tǒng)、YPJO1型壓力換能器(成都醫(yī)療儀器廠)，image–pro plus 7.0圖像分析軟件(太原塞恩思科技發(fā)展有限公司)。
2.方法
2.1分組與給藥方法Wistar大鼠，隨機分成6組，每組6只，即假手術(shù)組(生理鹽水)、缺血再灌注損傷組(生理鹽水)、地奧心血康組(70mL/kg)、苦參酮組(50mg/kg)、降苦參酮組(50mg/kg)、苦參醇A組(50mg/kg)；各組大鼠均以10mL/kg的劑量灌胃給藥，連續(xù)7d，每天1次，于末次給藥1h后開始造模。
2.2建立缺血再灌注損傷模型各組大鼠以20％烏拉坦腹腔注射麻醉，仰臥位固定。用針形電極刺入四肢皮下，以標準Ⅱ?qū)?lián)監(jiān)測心電圖。頸部備皮，作縱向正中切口，分離氣管、右側(cè)頸總動脈，行氣管插管、右頸總動脈插管，接人工呼吸機通氣，頻率為60次/min，呼吸比率為2︰1，潮氣量8mL/kg(隨大鼠體重調(diào)節(jié))。于胸骨左側(cè)第三、四肋間打開胸腔暴露心臟，在肺動脈圓錐左緣與左心耳右緣之間，用6/0無損傷縫合線平左心耳下緣2mm處進針，進針深度1～2mm，寬度2～3mm，然后將縫合線穿于自制的冠脈阻斷塑料管。除假手術(shù)組不結(jié)扎外，其他組均結(jié)扎冠狀動脈左前降支30min后，松開結(jié)扎線再灌注60min。實驗中以心電圖ST段明顯抬高并與T波融合、心肌顏色變淺紅色為結(jié)扎成功的標志；放松結(jié)扎線后ST段降低1/2以上及心肌逐漸紅潤為再灌注成功的標志。
2.3心肌梗死面積測定將冠狀動脈左前降支原位重新結(jié)扎，于頸總動脈注入2％的伊文思藍1.5mL，待大鼠鞏膜藍染后迅速取下心臟，置于4℃生理鹽水中洗凈心腔殘余染液，剪去心底組織、心耳及右心室，錫箔紙包裹，置于–80℃保存。
將各實驗組大鼠心臟自心尖向心底平行于房室溝方向切成6片(1～1.5mm厚)。在1％TTC(37℃，pH7.4)中避光孵育15min后，用10％甲醛溶液固定48h。染成藍色的區(qū)域代表非缺血區(qū)，紅色區(qū)域代表危險區(qū)(AAR)，白色區(qū)域為梗死區(qū)(An)。拍照后利用圖像分析軟件image–pro plus 7.0分析、計算心肌梗死面積。
危險區(qū)面積百分比(AAR/LV，％)＝(危險區(qū)總面積/左心室區(qū)面積)100％
心肌梗死面積百分比(An/AAR，％)＝(梗死區(qū)面積/危險區(qū)總面積)100％
2.4統(tǒng)計學處理各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析進行組間比較，P<0.05認為有統(tǒng)計學差異。
3實驗結(jié)果
結(jié)果見表2，AAR/LV代表各組間冠脈結(jié)扎所致的缺血損傷程度；An/AAR表示心肌梗死面積大小。各組間AAR差異無顯著性，表明各組動物的缺血程度大體相當，具有可比性。地奧心血康(陽性對照)可保護缺血再灌注損傷心肌，本研究發(fā)現(xiàn)其可顯著減小大鼠心肌梗死面積(與模型組比較，An/AAR顯著降低)，說明動物模型可靠；同地奧心血康一樣，苦參酮、降苦參酮及苦參醇A 3種化合物均可顯著減小缺血再灌注所致心肌梗死面積，說明3種化合物具有心肌保護作用。
表2受試單體化合物對心肌缺血再灌注大鼠梗死范圍的影響(n＝6)
與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。
實施例3：受試化合物組合對缺血再灌注大鼠心肌梗死面積的影響
1材料、試劑及儀器
材料、試劑及儀器均同實施例2。
2.方法
Wistar大鼠，隨機分成6組，每組6只，即假手術(shù)組(生理鹽水)、缺血再灌注損傷組(生理鹽水)、地奧心血康組(70mL/kg)、受試化合物組合(苦參酮︰降苦參酮︰苦參醇A＝3︰2︰1)低、中、高劑量組(15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg)；各組大鼠均以10mL/kg的劑量灌胃給藥，連續(xù)7d，每天1次，于末次給藥1h后開始造模。其余方法同實施例2。
3實驗結(jié)果
結(jié)果見表3，AAR/LV代表各組間冠脈結(jié)扎所致的缺血損傷程度；An/AAR表示心肌梗死面積大小。各組間AAR差異無顯著性，表明各組動物的缺血程度大體相當，具有可比性。地奧心血康(陽性對照)可保護缺血再灌注損傷心肌，本研究發(fā)現(xiàn)其可顯著減小大鼠心肌梗死面積(與模型組比較，An/AAR顯著降低)，說明動物模型可靠；同地奧心血康一樣，受試化合物組合中、高劑量組均可顯著減小缺血再灌注所致心肌梗死面積，說明該化合物組合具有心肌保護作用。
表3受試化合物組合對心肌缺血再灌注大鼠梗死范圍的影響(n＝6)
與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。