本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及天冬氨酸作為抗菌藥物硫酸新霉素增效劑的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

嗜水氣單胞菌在河流、湖泊、池塘、食物、動(dòng)物及人體等自然環(huán)境中廣泛存在。嗜水氣單胞菌屬于條件性致病菌，可引起多種水生動(dòng)物和陸生動(dòng)物患病，是一種典型的人-畜-魚共患病病原菌，當(dāng)環(huán)境條件惡劣，機(jī)體抵抗力下降可導(dǎo)致魚類、兩棲類、爬行類等冷血?jiǎng)游锖筒溉閯?dòng)物發(fā)病，引發(fā)水生動(dòng)物細(xì)菌性出血病、體表潰瘍癥以及哺乳動(dòng)物腹瀉等，是魚類、爬行類和人類的一種致命傳染源。為了預(yù)防和治療病原菌引起的疾病，多采用抗生素的方法，而長(zhǎng)期濫用抗生素導(dǎo)致抗菌藥物出現(xiàn)多重耐藥、交叉耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，給水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治帶來極大的困難。因此，針對(duì)當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中嗜水氣單胞菌感染引起的問題，開發(fā)一種防治水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物嗜水氣單胞菌的藥物防治策略，以提高防治效果、降低嗜水氣單胞菌耐藥性和避免抗菌藥物的殘留問題，促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康和可持續(xù)發(fā)展。

硫酸新霉素為氨基糖苷類抗生素，可抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，對(duì)葡萄球菌屬、需氧革蘭氏陰性桿菌、部分結(jié)核分支桿菌有較好的抗菌活性，常用于畜禽、養(yǎng)殖魚類細(xì)菌性病害的防治。由于該藥物具有較強(qiáng)的耳毒性和腎毒性，殘留在食品中的硫酸新霉素是潛在的安全隱患。因此，在具有相同殺菌效果的情況下，大幅降低或控制該藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的使用量，對(duì)于水產(chǎn)品安全和生態(tài)環(huán)境保護(hù)具有重要的意義。

天冬氨酸又稱天門冬氨酸，是一種α-氨基酸，分子式為C₄H₇NO₄，分子量為133.1，具有旋光性，是構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸之一。天冬氨酸普遍存在于生物合成作用中，是生物體內(nèi)賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸等氨基酸及嘌呤、嘧啶堿基的合成前體?，F(xiàn)有技術(shù)中已公開的天冬氨酸的作用有：L-天冬氨酸廣泛用作氨解毒劑、肝機(jī)能促進(jìn)劑、疲勞恢復(fù)劑等醫(yī)藥用品和各種清涼飲料的添加劑；DL-天冬氨酸可用于合成DL-天冬氨酸鉀鎂鹽，用于治療心律失常、心動(dòng)過速、心力衰竭、心肌梗塞、心絞痛、肝炎和肝硬化等疾??；DL-天冬氨酸還可作為合成多肽的原料。綜上所述，天冬氨酸的食品、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有較大的市場(chǎng)開發(fā)潛力，但其作為抗菌藥物增效劑的研究尚未見報(bào)道。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，天冬氨酸是一種非必需氨基酸，雖然魚體可以自行合成天冬氨酸，但天冬氨酸的缺乏會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)絕大多數(shù)蛋白質(zhì)都無法正常形成，同時(shí)造成機(jī)體營(yíng)養(yǎng)不良、代謝紊亂等癥狀。有研究表明，天冬氨酸對(duì)牙鯛等魚類有誘食效果。因此，天冬氨酸作為一種常見的氨基酸代謝物，當(dāng)其用作藥物或飼料添加劑時(shí)，應(yīng)當(dāng)與藥物或飼料具有同等的安全性。本發(fā)明提供的一種聯(lián)合用藥方式，用于防治水產(chǎn)養(yǎng)殖中容易出現(xiàn)的病害，既可提高抗菌藥物藥效，又可大幅減少藥物的使用量，進(jìn)而減少藥物的毒副作用和藥物殘留，完全符合無公害水產(chǎn)業(yè)、生產(chǎn)綠色水產(chǎn)品的疾病防治準(zhǔn)則，尤其適用于當(dāng)前水產(chǎn)業(yè)集約化、規(guī)模化生產(chǎn)的需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供了天冬氨酸作為硫酸新霉素增效劑的應(yīng)用，天冬氨酸與硫酸新霉素聯(lián)合使用能夠大幅增強(qiáng)硫酸新霉素的殺菌效果，提高魚體感染細(xì)菌后的存活率，為硫酸新霉素的使用提供了一種新方法，天冬氨酸與硫酸新霉素的聯(lián)合使用能夠大幅度降低抗生素的使用量，同時(shí)提高魚體對(duì)細(xì)菌感染的防治水平。

本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的采用如下技術(shù)方案：

天冬氨酸作為硫酸新霉素增效劑的應(yīng)用，其特征在于：通過天冬氨酸與硫酸新霉素的聯(lián)合使用以增強(qiáng)抗菌藥物硫酸新霉素的藥效，進(jìn)而減少硫酸新霉素的用藥量。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述的天冬氨酸與硫酸新霉素的重量比為0.26-332.8:1。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述的天冬氨酸作為增效劑用于增加硫酸新霉素在體外殺滅細(xì)菌的能力。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述的天冬氨酸作為增效劑用于增加硫酸新霉素在體內(nèi)清除細(xì)菌的能力。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述的天冬氨酸作為增效劑用于與硫酸新霉素聯(lián)合使用以提高魚體感染細(xì)菌的存活率。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述的細(xì)菌為嗜水氣單胞菌。

本發(fā)明經(jīng)體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，天冬氨酸能夠增強(qiáng)硫酸新霉素的殺菌效果；其聯(lián)合運(yùn)用能提高魚體嗜水氣單胞菌感染的治療效果，大幅增加魚體存活率。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)病原菌耐藥性日趨普遍、耐藥程度日趨嚴(yán)重的情況下，大幅降低抗菌藥物硫酸新霉素的使用量，同時(shí)提高抗菌藥物硫酸新霉素的防治效果，有助于無公害水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)的推廣。

附圖說明

圖1是10mM天冬氨酸添加前后不同硫酸新霉素作用后的細(xì)菌存活率圖；

圖2是不同劑量天冬氨酸聯(lián)合硫酸新霉素作用后的細(xì)菌存活率圖；

圖3是10mM天冬氨酸添加前后硫酸新霉素殺菌的時(shí)間依賴關(guān)系圖；

圖4是天冬氨酸聯(lián)合硫酸新霉素作用后淇河鯽肝臟、脾和腎臟中細(xì)菌含量圖；

圖5是細(xì)菌攻毒后注射天冬氨酸或/和硫酸新霉素對(duì)魚體的保護(hù)作用對(duì)比圖；

圖6是細(xì)菌攻毒后口服天冬氨酸或/和硫酸新霉素對(duì)魚體的保護(hù)作用對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

天冬氨酸增加硫酸新霉素在體外殺滅細(xì)菌的能力

1、細(xì)菌培養(yǎng)與生存率體外實(shí)驗(yàn)方法

（1）挑取嗜水氣單胞菌單菌落接種于100mL LB培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)過夜；

（2）取適量的菌液于12000rpm、5min離心收集菌體，用質(zhì)量濃度為0.85%的生理鹽水洗滌菌體2次，懸浮于含10mM 乙酸鈉的M9培養(yǎng)基中，調(diào)OD600值至0.6；

（3）加入相應(yīng)的代謝物和適量的抗生素于試管中，加M9培養(yǎng)基至5mL體系，28℃培養(yǎng)6h；

（4）在特定的時(shí)間點(diǎn)，取100uL樣品，采用系列稀釋法，取10uL進(jìn)行點(diǎn)板計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)菌cfu/mL（菌落形成單位/毫升）。不經(jīng)過抗生素和代謝物處理的樣品作為起始細(xì)菌數(shù)，細(xì)菌菌落數(shù)在20-200的數(shù)據(jù)可用于統(tǒng)計(jì)分析。細(xì)菌存活率（percent survival）是抗生素和代謝物處理后的細(xì)菌cfu與起始細(xì)菌cfu的百分比。

2、天冬氨酸在提高硫酸新霉素殺菌效果方面具有抗生素濃度依賴效應(yīng)

10mM天冬氨酸能顯著提高硫酸新霉素的殺菌作用，隨著抗生素濃度的增加其增效作用也越來越明顯。天冬氨酸提高硫酸新霉素對(duì)嗜水氣單胞菌的殺菌倍數(shù)，分別增加1.8、22、157.5、428、813.8和1976倍（圖1）。從圖中虛線標(biāo)識(shí)可以看出，單獨(dú)使用40μg/mL硫酸新霉素，與天冬氨酸聯(lián)合8μg/mL硫酸新霉素的殺菌效果相似，即使用天冬氨酸后，可降低5倍硫酸新霉素使用量。

3、天冬氨酸在提高硫酸新霉素殺菌效果方面具有物質(zhì)劑量依賴效應(yīng)

選擇細(xì)菌存活率在50%左右的抗生素濃度，進(jìn)一步探討天冬氨酸物質(zhì)梯度的作用效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.078mM的天冬氨酸也明顯提高硫酸新霉素的殺菌作用。對(duì)嗜水氣單胞菌來說，在8μg/mL硫酸新霉素條件下，0.078-10mM天冬氨酸的增效作用達(dá)5.8、7.7、9.5、12.2、52.7、77.3、213.6和651.1倍（圖2）。

4、天冬氨酸在提高硫酸新霉素殺菌效果方面具有作用時(shí)間依賴效應(yīng)

進(jìn)一步研究了天冬氨酸協(xié)同硫酸新霉素殺菌作用與時(shí)間的關(guān)系。對(duì)于嗜水氣單胞菌，采用10mM天冬氨酸分別與8μg/mL硫酸新霉素協(xié)同殺菌；對(duì)于嗜水氣單胞菌，10mM天冬氨酸分別與16μg/mL硫酸新霉素協(xié)同殺菌。在0、2、4、6、8、10h取樣，并點(diǎn)板計(jì)數(shù)，結(jié)果可以看到，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，同時(shí)添加硫酸新霉素和天冬氨酸的試驗(yàn)組生存率下降越來越顯著，在10h分別提高硫酸新霉素對(duì)該種細(xì)菌的殺菌作用為638.2倍（圖3）。

實(shí)施例2

天冬氨酸增加硫酸新霉素在體內(nèi)清除細(xì)菌的能力

1、魚體感染與細(xì)菌清除實(shí)驗(yàn)：嗜水氣單胞菌Ah-479為高毒力菌株，淇河鯽腹腔注射100μL 1.0×10⁷cfu/mL的細(xì)菌懸液，24h后，淇河鯽隨機(jī)分為4組，每組6尾，分別為：生理鹽水對(duì)照組、代謝物組、抗生素組和相應(yīng)濃度的抗生素與代謝物組。天冬氨酸的劑量為50mg/kg，硫酸新霉素的使用劑量為40mg/kg。治療24h后，取魚體肝臟、腎臟、脾等組織并稱重，加入1mL生理鹽水充分研磨勻漿，進(jìn)行梯度稀釋并平板計(jì)數(shù)檢測(cè)組織中的細(xì)菌含量（cfu/g）。

2、天冬氨酸聯(lián)合硫酸新霉素能顯著清除魚體組織中的嗜水氣單胞菌

細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果表明，單獨(dú)天冬氨酸治療能促進(jìn)魚體對(duì)病原菌的清除，特別是肝臟組織中，與對(duì)照組相比，細(xì)菌數(shù)下降約10倍。天冬氨酸協(xié)同硫酸新霉素組具有最為明顯的作用，在三個(gè)組織中，細(xì)菌數(shù)下降分別為23、7.5、20倍（圖4）。

實(shí)施例3

天冬氨酸聯(lián)合硫酸新霉素提高魚體感染細(xì)菌的存活率

天冬氨酸聯(lián)合硫酸新霉素提高魚體治療效果

Ah-479的半數(shù)致死劑量（LD₅₀）為1.55×10⁶cfu/g，當(dāng)注射劑量為100μL 5.0×10⁷cfu/mL劑量時(shí)，在攻毒1h后，用注射或口服兩種給藥方式進(jìn)行治療。每種給藥方式分為4個(gè)組：對(duì)照組為生理鹽水、天冬氨酸組使用量為50mg/kg、硫酸新霉素組使用量為40mg/kg和50mg/kg天冬氨酸+40mg/kg硫酸新霉素組同時(shí)使用，所有注射注射或口服用藥均為100μL/尾，每組20尾淇河鯽。細(xì)菌感染后，每12h觀察一次魚的發(fā)病和死亡情況，持續(xù)7d。藥物保護(hù)率=[1-(給藥組死亡率/對(duì)照組死亡率)]×100%。

注射實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)注射劑量為100μL 5.0×10⁷cfu/mL細(xì)菌時(shí)，48h時(shí)以后魚體的死亡情況穩(wěn)定，不會(huì)再有死亡情況發(fā)生。對(duì)照組48h時(shí)魚存活率10%；單獨(dú)的抗生素治療效果并不明顯，48h時(shí)魚存活率為30%；天冬氨酸組的保護(hù)作用明顯，48h時(shí)魚存活率為60%左右；天冬氨酸+硫酸新霉素組，48h時(shí)魚存活率為100%，即注射聯(lián)合用藥對(duì)魚體的保護(hù)率達(dá)100%（圖5）。

口服實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組48h時(shí)魚存活率10%；單獨(dú)的口服抗生素效果并不明顯，48h時(shí)魚存活率為25%；天冬氨酸組的保護(hù)作用明顯，48h時(shí)魚存活率為60%左右；天冬氨酸+硫酸新霉素組，48h時(shí)魚存活率為90%，即口服聯(lián)合用藥對(duì)魚體的保護(hù)率達(dá)88.9%（圖6）。

以上實(shí)施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點(diǎn)，本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)均落入本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。