(本申請是申請日為2009年9月3日、申請?zhí)枮?00980134370.1(國際申請?zhí)枮閜ct/ep2009/061402)的發(fā)明申請的分案申請。)
本發(fā)明涉及具有保護高純度重組制備的因子viii(r-因子viii)能力的冷凍干燥的制劑。本發(fā)明還涉及在冷凍干燥之前的以及在將冷凍干燥的固體制劑復溶(reconstitution)至可注射液體之后的r-因子viii的液體制劑。
背景技術：
因子viii是與血液凝固過程有關的重要血漿蛋白質(zhì)。這一凝固因子的缺乏導致血友病a，血友病a是一種必須通過因子viii替代療法來治療的威脅生命的疾病。通常，提純的血漿源性因子viii(p-因子viii)的濃縮物已經(jīng)被用于替代療法。最近，已經(jīng)可以獲得重組制備的因子viii(r-因子viii)，其提供不依賴血漿捐獻的補充，降低了病毒傳播性疾病的風險。
因子viii是復雜的分子，并且是與活性隨時間降低有關的非常敏感的蛋白質(zhì)。在血液中，其他血液蛋白質(zhì)如人類血清白蛋白(hsa)和馮維勒布蘭德因子(vonwillebrandfactor，vwf)協(xié)助維持因子viii的凝固活性。然而，由于病毒傳播風險的原因，期望避免在r-因子viii的藥物制劑中存在通過血漿提純獲得的蛋白質(zhì)。因此，提供其他藥學可接受賦形劑的組合物以保護r-因子viii防止引起活性降低的物理和化學降解以及聚集是必要的。為防止在長期存儲期間蛋白質(zhì)活性降低所通常采用的技術是通過凍干法(冷凍干燥)制備干燥的固體藥物制劑。在制藥工藝期間、在長期存儲期間以及在冷凍干燥的制劑被復溶至施用的溶液之后，藥物賦形劑也必須保護因子viii。
因子viii的dna序列被分為6個結(jié)構(gòu)域；3個a結(jié)構(gòu)域、2個c結(jié)構(gòu)域和1個b結(jié)構(gòu)域，并且這種蛋白質(zhì)含有針對其他凝血因子、vwf、磷脂和金屬離子的相互作用位點。因子viii蛋白質(zhì)的最小活性形式缺少b結(jié)構(gòu)域并且由與90kda的重鏈結(jié)合的80kda的輕鏈構(gòu)成(wangw.等,2003)。目前市場上有全長r-因子viii藥物產(chǎn)品(bayer公司的
在因子viii的藥物制劑中，所有組分都需要仔細地選擇。每種賦形劑都提供保護功能從而在制藥工藝、長期存儲以及最終復溶和對患者施用過程中保持因子viii的高收率。另外，考慮所有賦形劑的臨床安全。
凍干法的目的(manning,m.c.等,1989,tang,x.等,2004,schwegman,j.j.等,2005)在于將水從制劑中去除，因為在水相中經(jīng)常發(fā)生不利的物理和化學反應。
在冷凍干燥過程中以及在存儲期間需要冷凍/凍干保護劑從而通過在蛋白質(zhì)周圍形成無定形基體來保護蛋白質(zhì)。
加入膨脹劑(bulkingagent)作為塊體形成劑(cakeformer)從而在冷凍干燥期間提供機械支撐并且增加藥物產(chǎn)品的干重量。因此膨脹劑有助于提供冷凍干燥產(chǎn)品的均勻質(zhì)量和外觀。
可以加入緩沖劑以將ph保持在對于蛋白質(zhì)而言以及對于產(chǎn)品的治療用途而言合適的值。
由于因子viii的高效力的原因，因子viii在治療溶液中的濃度低。另外，因子viii易于吸附到表面，這使得表面吸附成為在制造期間以及在產(chǎn)品復溶之后活性降低的主要原因。對于目前市售的因子viii產(chǎn)品而言，通常要求在其臨界膠束濃度(cmc)以上使用表面活性劑，所述臨界膠束濃度是表面活性劑形成膠束聚集體的溶液濃度。含有聚氧乙烯的非離子洗滌劑(detergent)的cmc值是溫度依賴性的，因為在較低的溫度下cmc值變得更高(alexandridis,p.等,1994,nilsson,m.等,2007)。泊洛沙姆188(poloxamer188)的cmc在37℃下為至少20-30mg/ml(kabanov,a.v.等,1995,alexandridis,p.等,1994,moghimi,s.m.等,2004)并且在20℃下升高至100mg/ml(nakashima,k.等,1994)。因此，根據(jù)這些報道，在25℃下泊洛沙姆188的cmc在20-100mg/ml的范圍內(nèi)。
已經(jīng)表明金屬離子與因子viii的輕鏈和重鏈的結(jié)合有關(wangw等,2003)，因此在因子viii的制劑中通常存在鈣離子(ca2+)以保持80kda鏈和90kda鏈的復合體的結(jié)合。
已經(jīng)做出了大量的努力來尋找因子viii的合適的制劑，例如：
us-b-7247707(besman等)公開了無白蛋白的制劑，其包含300至500mm氯化鈉、1％至4％的選自蔗糖、海藻糖、棉子糖和精氨酸的穩(wěn)定劑、1至5mmcacl2以及緩沖劑，所述緩沖劑優(yōu)選為組氨酸。在組合物中還包括最多0.1％濃度的表面活性劑。
us-a-5874408(nayar)描述了重組因子viii的制劑，其包含甘氨酸、組氨酸、蔗糖、cacl2和少量的氯化鈉。nayar發(fā)現(xiàn)組氨酸在冷凍干燥的因子viii制劑中具有去穩(wěn)作用，目前在所有市售的r-因子viii制劑中加入組氨酸作為緩沖劑。然而，通過加入鹽、甘氨酸和蔗糖克服了這種效應。
us-a-4877608(lee等)描述了在水溶液中的高純因子viii蛋白質(zhì)制劑的用途，所述制劑主要含有具有至少130iu/mg的活性的治療活性因子viii；0.4至1.2m氯化鈉、氯化鉀或其混合物；1.5至40mm氯化鈣和1至50mm組氨酸以及任選地最多10％的選自甘露醇、蔗糖和麥芽糖的糖。
us-a-2005/0256038(white等)教導了冷凍干燥的因子viii組合物，其包含表面活性劑、氯化鈣、蔗糖、氯化鈉、檸檬酸三鈉和沒有氨基酸的緩沖劑。
wo-a-99/10011(kanellos等)公開了具有高純度血漿因子viii的熱處理的制劑。所述制劑包含穩(wěn)定有效量的蔗糖、海藻糖和至少一種氨基酸。所述氨基酸優(yōu)選賴氨酸，但是其他可以使用的氨基酸為異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、丙氨酸、精氨酸、組氨酸、脯氨酸、絲氨酸和甘氨酸。
ep-a-1016673(
us-b-6887852(paik等)描述了冷凍干燥的因子viii制劑，其包含用作穩(wěn)定劑的l-精氨酸、l-異亮氨酸和l-谷氨酸的混合物?；局苿┌倭康穆然c、氯化鈣和組氨酸。不向組合物中加入表面活性劑，因為所述制劑顯示出比包含表面活性劑的制劑更好的穩(wěn)定性。
us-a-5565427(freudenberg)教導了因子viii的穩(wěn)定溶液的用途，其包含洗滌劑和氨基酸或其一種鹽。蛋白質(zhì)的比活性為至少2000iu/mg。
us-a-5328694(schwinn)公開了穩(wěn)定的可注射溶液，其包含從血漿中提純的因子viii以及二糖和一種或多種氨基酸的組合。優(yōu)選地，所述氨基酸為賴氨酸或甘氨酸。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明涉及高純度的重組制備的因子viii(r-因子viii)的組合物。所述組合物無組氨酸。為了發(fā)揮最大的保護作用，本發(fā)明的組合物基于有目的地選擇賦形劑，如冷凍/凍干保護劑、膨脹劑和表面活性劑。每種加入的賦形劑可以在所有階段即在制藥過程、長期存儲期間以及在復溶和施用期間都不發(fā)揮其保護作用。
本發(fā)明的冷凍干燥的制劑不限于具有相同的充裝體積和復溶體積。對于本領域技術人員來說明顯的是，配制的產(chǎn)品也可以復溶為更加稀釋的形式。
本發(fā)明涉及根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其具有保護重組制備的因子viii的能力。
根據(jù)本發(fā)明的無組氨酸的r-因子viii組合物通常包含冷凍/凍干保護劑，所述冷凍/凍干保護劑為精氨酸或蔗糖，或者精氨酸和蔗糖的組合；膨脹劑，所述膨脹劑為氯化鈉或精氨酸；表面活性劑；以及任選地ph緩沖劑。當術語“無組氨酸”在本文中出現(xiàn)時，并不意味著組合物“沒有組氨酸”，而是指在制藥過程中沒有添加組氨酸，因為少量可來自此前制備步驟的原料藥物。組氨酸經(jīng)常在因子viii組合物中用作緩沖劑，而一些消息報道了對因子viii的穩(wěn)定作用(ep-a-1016673,
所述組合物還可以包含約0.5至10mm的量的氯化鈣以提高因子viii分子的特定穩(wěn)定性。所述組合物還可以包含其他化合物，如抗氧化劑，如谷胱甘肽或甲硫氨酸。
膨脹劑是指存在于制劑中的賦形劑以對冷凍干燥的塊體提供機械支撐并且增加干重量。膨脹劑既可以為結(jié)晶狀態(tài)如氯化鈉，也可以為無定形狀態(tài)如精氨酸。
ph緩沖劑是指在約ph為5和9之間的ph范圍具有緩沖能力的化合物。緩沖能力涉及在所述ph間隔內(nèi)的緩沖劑的pka值。
離子強度供劑是指存在于制劑中以提高離子強度的離子化合物。
冷凍保護劑和凍干保護劑(冷凍/凍干保護劑)為存在于制劑中以在冷凍干燥過程的冷凍和干燥步驟中以及在冷凍干燥的產(chǎn)品的隨后存儲期間減少或甚至防止蛋白質(zhì)活性降低的化合物。
表面活性劑應當是指吸附到表面和界面上并由此抵消由吸附作用引起的因子viii的活性降低的化合物。這種類型的活性降低可能在整個制藥過程中以及在給患者施用之前或施用期間處理復溶的產(chǎn)品時發(fā)生。一些表面活性劑在溶液中形成膠束聚集體。表面活性劑的臨界膠束濃度是在其以上形成膠束的濃度。
因子viii的保護組合物是指由所選擇的賦形劑組成的制劑，所述賦形劑中的每種在制藥過程、長期存儲以及最終復溶和給患者施用過程中提供保護功能以保持因子viii的高收率。所述制藥過程具體是指生產(chǎn)過程中制造過程的最后階段，其從所制備的原料藥物的到達開始直到配置的藥物產(chǎn)品冷凍干燥結(jié)束為止。應當理解制藥工藝的步驟通常是蛋白質(zhì)制劑領域技術人員所熟知的并且包括如配制、無菌過濾、填裝到小瓶中和冷凍干燥的步驟。
活性因子viii的減少具有寬泛的意思，包括但不限于由于表面吸附、聚集、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的物理和/或化學變化引起的減少，或者由放棄不令人滿意外觀的冷凍干燥產(chǎn)物引起的減少。
r-因子viii特別地是完全或部分缺少b結(jié)構(gòu)域的剔除衍生物，從而在配制之前提供能夠極大地超過5000iu/mg的比活性。在ep-a-1136553(hauser等)和ep-a-1739179(
根據(jù)本發(fā)明，冷凍/凍干保護劑為精氨酸或蔗糖，或者精氨酸和蔗糖的組合。精氨酸通?？梢允蔷彼岬柠}或衍生物，如精氨酸鹽酸鹽。
根據(jù)本發(fā)明的膨脹劑還具有作為離子強度提供劑的附加功能，這使得合適臨床產(chǎn)品所必要的組分的數(shù)量最小化。根據(jù)本發(fā)明的膨脹劑可以是氯化鈉或精氨酸。精氨酸可以為鹽形式，特別是鹽酸鹽形式。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，冷凍/凍干保護劑為精氨酸和蔗糖的組合。膨脹劑和離子強度提供劑具體是氯化鈉。如果氯化鈉用作膨脹劑，則本發(fā)明的組合物具體包含用作冷凍/凍干保護劑的約3-15mg/ml蔗糖和約3-15mg/ml精氨酸以及用作膨脹劑的約10mg/ml至約40mg/ml氯化鈉，條件是存在至少6mg/ml的冷凍/凍干保護劑。所述組合物可以具體包含約3mg/ml至約10mg/ml特別是約4.5mg/ml至約9mg/ml蔗糖、約3mg/ml至約8mg/ml特別是約4.5mg/ml至約6.8mg/ml精氨酸以及具體約15mg/ml至約23mg/ml氯化鈉。其他合適的濃度范圍具體包括約4.5mg/ml至約6.8mg/ml的蔗糖、約4.5mg/ml至約6.8mg/ml的精氨酸以及約15mg/ml至約23mg/ml的氯化鈉。優(yōu)選地，精氨酸和蔗糖以相等的量存在。因此，所述組合物包含最多約9mg/ml的精氨酸和最多約9mg/ml的蔗糖。此外，所述組合物可以包含氯化鈣、表面活性劑和任選地包含用作ph緩沖劑的檸檬酸鈉。在另一個實施方案中，本發(fā)明的組合物包含約10mg/ml至約25mg/ml的蔗糖和10mg/ml至40mg/ml的氯化鈉。
根據(jù)另一個實施方案，所述組合物為基本上無氯化鈉的備選方案，冷凍/凍干保護劑為蔗糖，膨脹劑和離子強度提供劑為精氨酸。特別地，所述組合物包含約5mg/ml至約25mg/ml的蔗糖和約20mg/ml至約70mg/ml的精氨酸。另外，這一組合物可以包含氯化鈣、表面活性劑并且任選地包含用作緩沖劑的檸檬酸鈉。當在本文中出現(xiàn)時，術語“基本上無氯化鈉”并不是指組合物“沒有任何氯化鈉”，而是含有痕量nacl，例如＜1％，因為少量氯化鈉可能來自得自更早的制造步驟的原料藥物，但是在制藥過程中沒有添加氯化鈉。
通常，以冷凍干燥的形式提供所述組合物。在本發(fā)明的又一實施方案中，以待冷凍干燥的溶液形式或以由冷凍干燥的組合物和稀釋劑制備的復溶溶液的形式提供所述組合物。
在另一個實施方案中，在本發(fā)明的組合物中，表面活性劑為蛋白質(zhì)特別是重組蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)特別是重組制備的白蛋白，例如約0.5mg/ml至約5mg/ml的量。與血漿源性因子viii的傳統(tǒng)制劑中通常使用的量相比，這一量小得多并且不同，在傳統(tǒng)制劑中白蛋白僅用作冷凍/凍干保護劑。出乎意料地，白蛋白特別是重組白蛋白非常適合在室溫存儲的重組因子viii制劑中用作表面活性劑。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，表面活性劑為非離子表面活性劑，例如聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。根據(jù)本發(fā)明，表面活性劑以低于臨界膠束濃度的濃度存在，例如對于聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物而言小于約5mg/ml。
在本發(fā)明的實施方案中，所述組合物包含具有≥5000iu/mg蛋白質(zhì)的比活性的r-因子viii。
根據(jù)又一個實施方案，所述組合物具有冷凍/凍干保護劑和膨脹劑，所述膨脹劑為精氨酸，其還用作離子強度提供劑。特別地，精氨酸以約20mg/ml至約70mg/ml的量存在。另外，這一組合物可以包含氯化鈣、表面活性劑以及任選地包含用作緩沖劑的檸檬酸鈉。
各種實施的組合物都包含表面活性劑，一方面所述表面活性劑為非離子洗滌劑特別是嵌段共聚物型的聚合物非離子表面活性劑，如聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，例如泊洛沙姆(poloxamer)188，或者聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯型的非離子表面活性劑，例如聚山梨酯20或聚山梨酯80。合適的非離子表面活性劑為泊洛沙姆188，其可以在其臨界膠束濃度(cmc)以下的濃度下使用，特別地優(yōu)選在約5mg/ml以下的濃度下使用。據(jù)報道在25℃下泊洛沙姆188的cmc在20-100mg/ml的范圍內(nèi)(kabanov,a.v.等,1995,alexandridis,p.等,1994,moghimi,s.m.等,2004,nakashima,k.等,1994)。
在另一方面，所述表面活性劑為除因子viii蛋白質(zhì)之外的重組制備的蛋白質(zhì)，特別是重組人類白蛋白，特別地，這類組合物包含約0.5mg/ml至約5mg/ml的重組制備的白蛋白。
具體實施方式
在以下實施例中將更詳細地描述各種實施方案，實施例描述本發(fā)明但不應理解為對本發(fā)明范圍的限制或限定。
實施例
在實驗中使用的因子viii為根據(jù)ep1739179(
蛋白質(zhì)活性通過顯色測定法或通過一階段測定法(onestageassay)測定。
顯色法是檢測作為協(xié)同因子的因子viii的生物活性的兩階段光度計法。因子viii使因子x活化為因子xa，其依次被酶解為能夠通過分光光度法定量的產(chǎn)物。
所述一階段測定法基于含有因子viii的樣品在磷脂、接觸激活劑和鈣離子的存在下調(diào)整缺乏因子viii的血漿凝固時間的能力。在一個步驟中測定血纖蛋白凝塊的出現(xiàn)時間。
實施例1
根據(jù)以上實驗部分中的描述制備重組因子viii。本實驗對具有精氨酸與蔗糖組合的冷凍/凍干保護劑的制劑與具有用作冷凍/凍干保護劑的蔗糖或精氨酸的制劑進行比較。氯化鈉用作膨脹劑和離子強度提供劑。
在150iu/ml的初始濃度下，就冷凍干燥的制劑中因子viii的回收率對制劑進行研究。所研究的組合物列于表i中。
表i-組合物
在實驗室規(guī)模冷凍干燥器中將1.5ml整分試樣的溶液冷凍干燥。將冷凍干燥的樣品在+5℃、+25℃和+40℃下存儲最多12個月，從而評價隨時間變化的蛋白質(zhì)活性。在1.5ml注射用水中將樣品復溶，并用以上實驗部分中描述的光度法分析。結(jié)果總結(jié)在表ii中。
表ii-結(jié)果
n.a.未分析
實施例1的結(jié)果出乎意料地表明在蔗糖與精氨酸之間存在附加的協(xié)同冷凍/凍干保護作用，因為與制劑1b和1c相比，隨時間的變化制劑1a顯示更好的活性回收率。
實施例2
根據(jù)以上實驗部分中的描述制備重組因子viii。本實驗研究具有用作冷凍/凍干保護劑的蔗糖和用作膨脹劑和離子強度提供劑的精氨酸的制劑。在150iu/ml的初始濃度下，就冷凍干燥的制劑中因子viii回收率對制劑進行研究。所研究的組合物列于表iii中。
表iii-組合物
在實驗室規(guī)模冷凍干燥器中將1.5ml整分試樣的溶液冷凍干燥。將冷凍干燥的樣品在+5℃、+25℃和+40℃下存儲最多12個月，從而評價隨時間變化的蛋白質(zhì)活性。在1.5ml注射用水中將樣品復溶，并用以上實驗部分中描述的光度法分析。結(jié)果以初始值的百分比總結(jié)在表iv中。
表iv-結(jié)果
n.a.未分析
實施例2的結(jié)果表明，與作為冷凍/凍干保護劑的蔗糖組合，精氨酸令人滿意地用作膨脹劑和離子強度提供劑。
實施例3
根據(jù)以上實驗部分中的描述制備重組因子viii。本實驗對使用泊洛沙姆188或聚山梨酯80作為表面活性劑的制劑與沒有表面活性劑的制劑進行比較。冷凍/凍干保護劑為精氨酸和蔗糖的組合，氯化鈉用作膨脹劑和離子強度提供劑。在150iu/ml的初始因子viii濃度下，就冷凍干燥步驟后的因子viii回收率對表v中所列的制劑進行研究。
表v-組合物
在實驗室規(guī)模冷凍干燥器中將1.5ml整分試樣的溶液冷凍干燥。在冷凍干燥之前取樣并冷凍。在分析之前將冷凍干燥的樣品在1.5ml注射用水中復溶。用以上實驗部分中描述的光度法分析因子viii的活性。在冷凍-解凍的樣品中以及在冷凍干燥步驟后的活性回收率的結(jié)果如表vi中所示。
表vi-冷凍干燥步驟后活性回收率的結(jié)果
實施例3的結(jié)果表明在冷凍-解凍步驟期間和在冷凍干燥過程期間在制劑中都需要表面活性劑來抵消可能由表面吸附引起的蛋白質(zhì)損失。本實施例還表明，當以臨界膠束濃度(cmc)以下的濃度使用時，非離子聚合物表面活性劑泊洛沙姆188在冷凍干燥期間有效地保護因子viii。保護作用與在其cmc值以上使用的非離子表面活性劑聚山梨酯80的保護作用一樣高。
實施例4
實施例3表明在制劑中需要表面活性劑以防止由表面吸附引起的因子viii活性降低，本實施例研究重組白蛋白是否能夠用于這一目的。
根據(jù)以上實驗部分中的描述制備重組因子viii。在140iu/ml的初始因子viii濃度下，就溶液中因子viii回收率對表vii中所列的制劑進行研究。在+25℃下存儲蛋白質(zhì)制劑，并且在第0天、第3天、第7天和第10天用以上實驗部分中描述的光度法分析蛋白質(zhì)制劑。結(jié)果以初始值的百分比列于表viii中。
表vii-組合物
表viii-結(jié)果
實施例4的結(jié)果表明重組白蛋白能夠保護r-因子viii防止可能由表面吸附引起的活性降低。
實施例5
實施例3表明在制劑中需要表面活性劑以防止由表面吸附引起的因子viii活性降低，實施例4表明重組白蛋白可以用于防止溶液中蛋白質(zhì)活性的降低。本實施例研究重組白蛋白是否也在冷凍干燥步驟中保護蛋白質(zhì)防止可能由表面吸附引起的活性降低。
根據(jù)以上實驗部分中的描述制備重組因子viii。所述制劑沒有非離子洗滌劑，但是加入重組白蛋白以防止活性降低。冷凍/凍干保護劑為精氨酸和蔗糖的組合，并且使用氯化鈉作為膨脹劑和離子強度提供劑。在150iu/ml的初始因子viii濃度下，就冷凍干燥的制劑中因子viii的回收率對表vii中所列的制劑進行研究。
在實驗室規(guī)模冷凍干燥器中將1.5ml整分試樣的溶液冷凍干燥。將冷凍干燥的樣品在+5℃、+25℃和+40℃下存儲最多12個月，從而評價隨時間變化的蛋白質(zhì)活性。在1.5ml注射用水中將樣品復溶，并用以上實驗部分中描述的光度法分析。結(jié)果總結(jié)在表ix中。
表ix-結(jié)果
n.a.未分析
實施例5的結(jié)果表明在冷凍干燥步驟中重組白蛋白能夠代替r-因子viii制劑(制劑4b至4d)中的非離子洗滌劑以防止可能由表面吸附引起的活性降低。其還表明重組白蛋白非常適合在要在室溫下存儲的重組因子viii制劑中用作表面活性劑。
實施例6
根據(jù)以上實驗部分中的描述制備重組因子viii。所述制劑沒有非離子洗滌劑，但是加入重組白蛋白以防止可能由表面吸附引起的活性降低。冷凍/凍干保護劑為蔗糖，并且使用氯化鈉作為膨脹劑和離子強度提供劑。在160iu/ml的初始因子viii濃度下，就冷凍干燥的制劑中因子viii的回收率對表x中所列的制劑進行研究。
表x-組合物
在實驗室規(guī)模冷凍干燥器中將1.5ml整分試樣的溶液冷凍干燥。將冷凍干燥的樣品在+5℃、+25℃和+40℃下存儲最多6個月，從而評價隨時間變化的蛋白質(zhì)活性。在1.5ml注射用水中將樣品復溶，并用以上實驗部分中描述的光度法分析。結(jié)果總結(jié)在表xi中。
表xi-結(jié)果
n.a.未分析
實施例6的結(jié)果表明在冷凍干燥步驟中重組白蛋白能夠代替r-因子viii制劑中的非離子洗滌劑以防止可能由表面吸附引起的活性降低。其還表明重組白蛋白非常適合在要在室溫下存儲的重組因子viii制劑中用作表面活性劑。
實施例7
本實施例研究與沒有ph緩沖劑的溶液相比，在含有作為ph緩沖劑的組氨酸的溶液中因子viii活性回收率。
根據(jù)以上實驗部分中的描述制備重組因子viii。在100iu/ml的初始因子viii濃度下，就溶液中因子viii的回收率對表xii中所列的溶液進行研究。
表xii-組合物
蛋白質(zhì)制劑存儲在+25℃下，并在第0天以及3天和7天之后用以上實驗部分中描述的光度法分析。結(jié)果以初始值的百分比列于表xiv中。
表xiv-結(jié)果
實施例7的結(jié)果表明與含有組氨酸的制劑相比，無組氨酸的制劑更好地保護因子viii。
實施例8
根據(jù)以上實驗部分中的描述制備重組因子viii。本實驗研究具有用作冷凍/凍干保護劑、膨脹劑和離子強度提供劑的精氨酸的制劑。在160iu/ml的初始濃度下，就冷凍干燥的制劑中因子viii的回收率對所述制劑進行研究。所研究的組合物如表xv中所示。
表xv-組合物
在實驗室規(guī)模冷凍干燥器中將1.5ml整分試樣的溶液冷凍干燥。將冷凍干燥的樣品在+5℃、+25℃和+40℃下存儲最多9個月，從而評價隨時間變化的蛋白質(zhì)活性。在1.5ml注射用水中將樣品復溶，并用以上實驗部分中描述的光度法分析。結(jié)果以初始值的百分比總結(jié)在表xvi中。
表xvi-結(jié)果
n.a.未分析
實施例8的結(jié)果表明，精氨酸可以為多功能賦形劑，因為其令人滿意地用作膨脹劑和離子強度提供劑以及冷凍/凍干保護劑。
參考文獻
wang,w.,wang,y.w.和kelner,d.n.,coagulationfactorviii:structureandstability(review),int.j.pharm.,259,(2003),1-15
schwegman,j.j.,hardwick,l.m.和akers,m.j.,practicalformulationandprocessdevelopmentoffreeze-driedproducts,pharm.dev.andtechn.,10,(2005),151-173
tang,x.和pikal,m.j.,designoffreeze-dryingprocessesforpharmaceuticals:practicaladvice,pharm.res.,21(2),(2004),191-200
manning,m.c.,patel,k.和borchardt,r.t.,stabilityofproteinpharmaceuticals,pharm.res.,6(11),(1989),903-918
alexandridis,p.等,micellizationofpoly(ethyleneoxide)-poly(propyleneoxide)-poly(ethyleneoxide)triblockcopolymersinaqueoussolutions:thermodynamicsofcopolymerassociation,macromolecules,27,(1994),2414-2425
kabanov,a.v.等,micelleformationandsolubilizationoffluorescentprobesinpoly(oxyethy1ene-b-oxypropylene-b-oxyethylene)solutions,macromolecules,28,(1995),2303-2314
moghimi,s.m.等,biochimicaetbiophysicaacta,2004,1689,103-113
nakashima,k.等,fluorescencestudiesonthepropertiesofapluronicf68micelle,langmuir,10,(1994),658-661
nilsson,m.等,influenceofpolydispersityonthemicellizationoftriblockcopolymersinvestigatedbypulsedfieldgradientnuclearmagneticresonance,macromolecules,40,(2007),8250-8258