本發(fā)明涉及一種葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向介孔二氧化硅納米粒及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，癌癥已經(jīng)成為威脅人類生命健康的一個(gè)主要原因，目前每年在全球奪去700多萬人的生命。癌癥治療的方法目前主要有如下幾種，如：化學(xué)治療、放射療法、外科手術(shù)、生物療法、基因治療、光動(dòng)力學(xué)治療、癌癥疫苗等。發(fā)展比較早且使用廣泛的治療方法是化學(xué)治療和放射療法，其主要缺點(diǎn)在于：治療手段對(duì)癌細(xì)胞的靶向性不高，不能有效區(qū)分癌細(xì)胞和正常細(xì)胞，特別是化療及一些蛋白質(zhì)藥物具有很高的細(xì)胞毒性，在治療的同時(shí)也對(duì)正常機(jī)體器官造成很大損傷。按照傳統(tǒng)的給藥方式，小分子藥物在體內(nèi)隨機(jī)分布，真正蓄積到病患部位進(jìn)而發(fā)揮藥效的只是少部分藥物，多數(shù)都被代謝排出體外，生物利用度很低。

靶向性藥納米物傳遞是一種既可以提高治療靶向性又比較容易實(shí)現(xiàn)的治療途徑，主要依靠藥物分子通過靶向特異性到達(dá)病變部位，殺滅致病病毒、修復(fù)受損組織或消除疾病癥狀。概括而言，靶向性藥物輸送體系具有如下主要優(yōu)點(diǎn)：高度靶向性，減少毒副作用；增加非水溶性藥物在體內(nèi)的分散量，穩(wěn)定藥物在體內(nèi)的存在；濃集藥物并能夠調(diào)節(jié)藥物的釋放速度；改變藥物給藥途徑，如將需要靜脈注射的藥物制成方便的口服藥物。目前關(guān)于體內(nèi)靶向功能的藥物載體成功用于臨床報(bào)道極其少見，導(dǎo)致靶向藥物的臨床應(yīng)用進(jìn)展緩慢。

介孔二氧化硅納米粒子(MSNs)由于其緩釋、控釋的特點(diǎn)，被公認(rèn)為是一種優(yōu)良的抗癌藥物載體系統(tǒng)。介孔二氧化硅具有良好的生物相容性和生物可降解性，在人體無毒，無積累。由于其高比表面和大孔隙度的特點(diǎn)，介孔二氧化硅擁有高的藥物包封率和載藥量。因此它在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有很誘人的應(yīng)用前景和極高的商業(yè)價(jià)值，廣泛應(yīng)用于負(fù)載抗癌藥的納米藥物。另外，通過對(duì)硅球表面的修飾，可以較方便引入其他基團(tuán)，增加藥物性能。但是這種納米藥物不具有主動(dòng)靶向的功能。靶向治療已經(jīng)成為癌癥納米技術(shù)領(lǐng)域非常重要的研究方向。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞表面常會(huì)出現(xiàn)一些受體的表達(dá)異常，這為靶向治療提供了基礎(chǔ)。

腫瘤細(xì)胞表面存在特異的葉酸受體((Folate Receptor，F(xiàn)R)，可專一性識(shí)別含有葉酸的載體，并與之特異性結(jié)合，通過細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入肝癌細(xì)胞并釋放藥物。靶向配體的導(dǎo)入要求納米粒子表面有可鏈接的反應(yīng)官能團(tuán)，在納米藥物表面修飾一層聚多巴胺(polydopamine，pD，PDA)被認(rèn)為是一種在納米藥物表面引入化學(xué)反應(yīng)官能團(tuán)較簡(jiǎn)單的方法，多巴胺的分子結(jié)構(gòu)如下：

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向介孔二氧化硅納米粒。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向介孔二氧化硅納米粒的制備方法。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向介孔二氧化硅納米粒的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

本發(fā)明一個(gè)方面提供了一種葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向介孔二氧化硅納米粒的制備方法，其特征是包括如下步驟：

1)將介孔二氧化硅和藥物溶于溶劑中，反應(yīng)至完全，分離獲得載有藥物的介孔二氧化硅初始納米粒；

2)將步驟1)所得介孔二氧化硅初始納米粒加入溶液中，并加入多巴胺鹽酸鹽，反應(yīng)至完全，分離獲得載有藥物的被聚多巴胺包裹的介孔二氧化硅納米粒；

3)將步驟2)所得載有藥物的被聚多巴胺包裹的介孔二氧化硅納米粒加入弱堿水溶液，依次加入還原劑和靶向配體巰基-聚乙二醇-葉酸，反應(yīng)至完全后分離獲得葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向介孔二氧化硅納米粒。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述藥物為抗腫瘤藥物，優(yōu)選為紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素、香豆素-6、順鉑、5-氟尿嘧啶、喜樹堿、布洛芬或10-羥基喜樹堿。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，權(quán)利要求1中的溶劑選自能夠溶解藥物的溶劑，優(yōu)選為水溶液或有機(jī)試劑，更優(yōu)選為水、緩沖鹽溶液、丙酮、二氧六環(huán)、二甲基亞砜、二氯甲烷、乙腈、四氫呋喃或N,N-二甲基甲酰胺。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，步驟1)中介孔二氧化硅與藥物的比例為，介孔二氧化硅：藥物＝10：1-10，優(yōu)選地，步驟1)中藥物加入溶液中的濃度為0.2mg/ml-5mg/ml。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，步驟2)中加入多巴胺鹽酸鹽至其濃度為0.2-1.0mg/mL。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，步驟2)中的溶液選自pH＝8-9的PBS緩沖溶液、Tris緩沖溶液、碳酸鈉水溶液、碳酸氫納水溶液或氫氧化鈉水溶液。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，步驟3)中弱堿性溶液的pH為8.5～12，優(yōu)選地，弱堿性溶液選自PBS緩沖溶液、Tris緩沖溶液、碳酸鈉水溶液、碳酸氫納水溶液或氫氧化鈉水溶液；

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，步驟3)中的還原劑選自三(2-羧乙基)膦。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，步驟3)中加入還原劑至其濃度為0.1～1mg/mL，加入巰基-聚乙二醇-葉酸至其濃度為0.1～10mg/mL；優(yōu)選地，步驟1)和步驟2)中納米粒加入溶液中的濃度為0.1mg/ml-1mg/ml。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，步驟1)或步驟2)中的分離為機(jī)械分離，選自離心分離、過濾分離。

本發(fā)明另一個(gè)方面提供了前述制備方法制備獲得的葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向介孔二氧化硅納米粒。

本發(fā)明再一個(gè)方面提供了葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向介孔二氧化硅納米在制備治療抗腫瘤的藥物中的用途，或在作為藥物靶向傳遞載體的藥物中的用途。

在本發(fā)明的一個(gè)具體技術(shù)方案中，提供了一種葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向介孔二氧化硅納米粒的制備方法，包括如下步驟：

(1)按比例，稱取100mg介孔二氧化硅和10～100mg的親水或疏水性藥物，溶于8～10ml去離子水(親水性藥物)或2～8ml有機(jī)溶劑(疏水性藥物)中，在攪拌條件下，反應(yīng)6～24小時(shí)，10000～20000rpm離心15～30min，棄上清液，洗滌，沉淀經(jīng)真空干燥得載有藥物的介孔二氧化硅初始納米粒；

(2)按1mg～10mg:1mL的比例將所述初始介孔二氧化硅納米粒重懸于10mM，pH＝8.5的Tris緩沖液中，加入多巴胺鹽酸鹽使?jié)舛葹?.2～1.0mg/mL，反應(yīng)3～12小時(shí)，10000～20000rpm離心15～30min，收集沉淀，用去離子水洗滌，真空干燥，獲得載有藥物的被聚多巴胺包裹的介孔二氧化硅納米粒；

(3)按1mg～10mg:1mL的比例將載有藥物的被聚多巴胺包裹的納米粒分散在pH為8.5～12的弱堿水溶液中，加入三(2-羧乙基)膦使?jié)舛葹?.1～1mg/mL，加入靶向配體巰基-聚乙二醇-葉酸使?jié)舛葹?.1～10mg/mL，反應(yīng)3～12小時(shí)，10000～20000rpm離心15～30min，收集納米粒子，用去離子水洗滌，冷凍干燥得葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向介孔二氧化硅納米粒。

在本發(fā)明中所用的巰基-聚乙二醇-葉酸為市售產(chǎn)品，其分子量為1000-5000，優(yōu)選為2000。

有益效果

本發(fā)明的葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向納米粒的制備方法簡(jiǎn)單，無污染。所獲得的葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向納米粒具有良好腫瘤靶向性、生物相容性以及生物可降解性，實(shí)驗(yàn)證明，可靶腫瘤細(xì)胞，并對(duì)腫瘤有治療作用。

附圖說明

圖1為動(dòng)態(tài)光散射測(cè)的實(shí)施例1制備的葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向納米粒MSN-DOX@PDA-PEG-FA(載阿霉素)粒度分布。

圖2為實(shí)施例1制備的葉酸和聚多巴胺修飾的宮頸癌靶向納米粒MSN-DOX@PDA-PEG-FA(載阿霉素)的透射電子顯微鏡(TEM)圖譜。

圖3為載阿霉素(DOX)的MSNs、MSNs-DOX和MSNs-DOX@PDA的氮?dú)馕?脫附曲線。

圖4為載阿霉素MSNs-DOX、MSNs-DOX@PDA、MSNs-DOX@PDA-PEG-FA的體外粒釋放曲線。

圖5為空白MSNs、MSNs@PDA-PEG-FA納米粒(與載藥納米粒相同納米粒懸液濃度)在72小時(shí)對(duì)Hela細(xì)胞的細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖6為載阿霉素MSNs-DOX、MSNs-DOX@PDA、MSNs-DOX@PDA-PEG-FA與空白MSNs、MSNs@PDA、MSNs@PDA-PEG-FA納米粒(與載藥納米粒相同納米粒懸液濃度)72小時(shí)內(nèi)對(duì)Hela細(xì)胞的細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，商品化的阿霉素DOX做對(duì)比。

圖7為激光共聚焦掃描電子顯微鏡(CLSM)觀察用載阿霉素的納米粒孵育2小時(shí)的Hela細(xì)胞。細(xì)胞核用DAPI染成藍(lán)色，載阿霉素納米顆粒是紅色的，分別通過DAPI通道和Cy3通道觀察細(xì)胞攝取情況。

圖8為載阿霉素的納米粒對(duì)腫瘤的抑制效果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。所述方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所述原材料如無特別說明均能從公開商業(yè)途徑而得。

實(shí)施例1

一種葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向介孔二氧化硅納米粒的制備方法，包括如下步驟：

(1)稱取100mg介孔二氧化硅MSNs和10mg的阿霉素，溶于8ml去離子水中，在攪拌條件下，避光反應(yīng)6小時(shí)，20000rpm離心15min，棄上清液，用去離子水洗滌，以除去游離的阿霉素，沉淀經(jīng)真空干燥得載阿霉素的介孔二氧化硅初始納米粒MSNs-DOX；

(2)按5mg:1mL的比例將所述初始介孔二氧化硅納米粒MSNs-DOX重懸于10mM，pH＝8.5的Tris緩沖液中，加入多巴胺鹽酸鹽至其濃度為0.5mg/mL，避光反應(yīng)3小時(shí)，10000rpm離心30min，收集沉淀，用去離子水洗滌，以除去未反應(yīng)的多巴胺鹽酸鹽，真空干燥后獲得載阿霉素的被聚多巴胺包裹的介孔二氧化硅納米粒MSNs-DOX@PDA；

(3)按5mg:1mL的比例將步驟(2)獲得的MSNs-DOX@PDA分散在pH為8.5的碳酸氫鈉水溶液中，加入三(2-羧乙基)膦使?jié)舛葹?.1mg/mL，加入靶向配體巰基-聚乙二醇-葉酸(M＝2000)使?jié)舛葹?mg/mL，避光反應(yīng)3小時(shí)，10000離心30min，收集納米粒子，用去離子水洗滌，冷凍干燥得葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向介孔二氧化硅納米粒MSNs-DOX@PDA-PEG-FA(載阿霉素(Doxorubicin，DOX))。

步驟(1)，步驟(2)，步驟(3)獲得的納米粒的Zeta電位(Zetasizer Nano ZS)分別在-16mV、-7mV和-5mV左右，表面電荷的絕對(duì)值比較高，顆粒之間相互排斥作用較強(qiáng)，因而在分散相中高度穩(wěn)定。

為測(cè)試納米粒子的載藥量，在制備納米粒子的過程中，所有的上清液和清洗液均被收集混合，收集的樣品經(jīng)0.45μm濾膜過濾后，用HPLC測(cè)試溶液中藥品濃度。HPLC使用反相C-18色譜柱，流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖溶液(25mmol/L Na₂HPO₄ 30mmol/L NaH₂PO₄,pH 5.0)：乙腈：水(30:50:20,v/v/v)，流動(dòng)相使用前經(jīng)0.45μm濾膜過濾，并超聲處理。每次進(jìn)樣20μl，流動(dòng)相流速為1mL/min，紫外波長(zhǎng)為233nm。測(cè)得三種納米粒子的載藥量分別為10.53％、8.76％、7.82％。

如圖1所示，動(dòng)態(tài)光散射測(cè)的實(shí)施例1制備的納米粒MSNs-DOX@PDA-PEG-FA(載阿霉素)粒度分布較均勻，平均粒徑大約在200nm左右。

如圖2所示，實(shí)施例1制備的納米粒MSNs-DOX@PDA-PEG-FA(載阿霉素)的透視電鏡結(jié)果，可以看出納米粒子粒徑呈單一分布，形狀為球形，表面有規(guī)則分布的孔道，粒子粒徑大約在200nm左右。

如圖3所示，通過BJH法計(jì)算出的納米粒子的孔徑大小?？梢钥闯觯瞻准{米粒MSNs的孔徑約為2.56nm，載入阿霉素(DOX)以后MSNs-DOX的孔徑減小至2.32nm，當(dāng)載藥以后的納米粒包被多巴胺得到的MSNs-DOX@PDA孔徑進(jìn)一步減小到了2.07nm。

如圖4所示，透析法測(cè)定納米粒的粒緩釋曲線，實(shí)施例1各步驟獲得的三種納米粒子各15mg分別分散于5ml釋放介質(zhì)PBST溶液(由8.5g NaCl、2.2g Na₂HPO₄、0.3g NaH₂PO₄、1.0g吐溫-80和去離子水1000ml組成，并經(jīng)高壓滅菌而得，調(diào)節(jié)pH為5.6。)中，形成懸液。將納米顆粒懸液置于透析袋中，封好袋口。密閉的透析袋放入50ml離心管中，加入15ml PBST，置于恒溫水浴搖床中于37℃，120rpm振蕩。在一定時(shí)間間隔內(nèi)，從離心管中取出10ml溶液用于分析，同時(shí)補(bǔ)充等量的新鮮PBST于離心管中。收集的樣品經(jīng)0.45μm濾膜過濾后，用HPLC測(cè)試溶液中藥品濃度，測(cè)試條件和測(cè)載藥量時(shí)所用HPLC的條件相同。根據(jù)數(shù)據(jù)繪制載藥納米顆粒體外釋放曲線，所得結(jié)果見圖4。圖4顯示載阿霉素MSNs-DOX、MSNs-DOX@PDA、MSNs-DOX@PDA-PEG-FA的體外粒釋放曲線，由圖可見，7天后，三種納米粒產(chǎn)品的體外粒釋放率分別達(dá)到了46.9％,37.2％和38.3％，三種納米粒具有相似的釋放曲線，呈兩相釋放特征并伴隨初始的“突釋效應(yīng)”，易滿足臨床要求。

如圖5和圖6分別為納米粒在24小時(shí)和48小時(shí)對(duì)宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞毒性結(jié)果，采用MMT發(fā)測(cè)定該納米粒子的細(xì)胞毒性：將Hela細(xì)胞(ATCC,Rockville,MD)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞培養(yǎng)12h貼壁后，棄去陳舊培養(yǎng)基，用PBS沖洗一次，加入待測(cè)樣品、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照分別培養(yǎng)24h、48h。在規(guī)定的時(shí)間間隔后，棄去陳舊培養(yǎng)基，用PBS沖洗一次，每孔加入100μl含MTT 1mg/ml的細(xì)胞培養(yǎng)基，37℃孵育4h后，棄去MTT，每孔加入100μl的二甲基亞砜(DMSO)，黑暗37℃培養(yǎng)2h，振蕩10min，用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm波長(zhǎng)的吸光度。

結(jié)果表明，不載藥的納米粒MSN@PDA-PEG-FA具有良好的生物相容性，因?yàn)樵诓煌{米粒懸液濃度下它對(duì)Hela細(xì)胞沒有明顯的毒性；而載阿霉素的三種納米粒具有明顯的細(xì)胞毒性。

此外，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明載阿霉素的MSN-DOX、MSN-DOX@PDA和MSN-DOX@PDA-PEG-FA對(duì)Hela細(xì)胞的毒性具有時(shí)間和濃度依賴性。

將Hela細(xì)胞懸液均勻接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，再加入1ml培養(yǎng)基，37℃、5％CO₂孵箱中培養(yǎng)24h。于Hela細(xì)胞中加入5μg/ml的載阿霉素的納米顆粒，繼續(xù)培養(yǎng)2h。另外，在MSN-DOX@PDA-PEG-FA組同時(shí)加入葉酸作為受體競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)觀測(cè)細(xì)胞對(duì)納米粒子的攝取情況，來觀察MSN-DOX@PDA-PEG-FA的靶向情況。納米粒子與細(xì)胞孵育相應(yīng)的時(shí)間后，去除培養(yǎng)基，用冰冷的PBS沖洗三次，加入多聚甲醛固定細(xì)胞20min，棄去多聚甲醛，加入DAPI染液孵育5min，再用PBS沖洗三次，可以在細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)中通過對(duì)細(xì)胞核的定位來確定載阿霉素納米粒在細(xì)胞中的位置。

圖7是用激光共聚焦掃描電子顯微鏡觀察Hela細(xì)胞對(duì)載阿霉素的兩種納米顆粒(MSN-DOX@PDA和MSN-DOX@PDA-PEG-FA)的攝取結(jié)果。從圖中可以看出，僅僅在與細(xì)胞孵育2h后，納米粒就已經(jīng)被細(xì)胞所攝取，并且與沒有葉酸修飾的納米粒子MSN-DOX@PDA相比，加入載阿霉素的葉酸和聚多巴胺修飾的MSNs-DOX@PDA-PEG-FA一組顯示出更強(qiáng)的熒光信號(hào)。但是當(dāng)MSN-DOX@PDA-PEG-FA同時(shí)加入葉酸后，則熒光減弱。這些結(jié)果表明制備的MSN-DOX@PDA-PEG-FA有較好的肝臟靶向性。

實(shí)施例2

一種葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向介孔二氧化硅納米粒的制備方法，包括如下步驟：

(1)稱取100mg介孔二氧化硅MSNs和2mg阿霉素，溶于8ml去離子水中，在攪拌條件下，反應(yīng)6小時(shí)，20000rpm離心15min，棄上清液，用去離子水洗滌，以除去游離的阿霉素，沉淀真空干燥得載阿霉素的介孔二氧化硅初始納米粒MSNs-DOX；

(2)按1mg:1mL的比例將所述初始介孔二氧化硅納米粒MSNs-DOX重懸于10mM，pH＝8.5的PBS緩沖液中，加入多巴胺鹽酸鹽使?jié)舛葹?.2mg/mL，反應(yīng)5小時(shí)，20000rpm離心15min，收集沉淀，用去離子水洗滌，以除去未反應(yīng)的多巴胺鹽酸鹽，真空干燥后得載阿霉素的被聚多巴胺包裹的介孔二氧化硅納米粒MSNs-DOX@PDA；

(3)按1mg:1mL的比例將步驟(2)獲得的MSNs-DOX@PDA分散在pH為10的PBS緩沖溶液中，加入三(2-羧乙基)膦使?jié)舛葹?.2mg/mL，加入靶向配體巰基-聚乙二醇-葉酸(M＝2000)使?jié)舛葹?0mg/mL，反應(yīng)5小時(shí)，20000離心15min，收集納米粒子，用去離子水洗滌，冷凍干燥得葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向介孔二氧化硅納米粒MSNs-DOX@PDA-PEG-FA(載阿霉素)。

圖8顯示的是載阿霉素的納米粒子(MSNs-DOX@PDA-PEG、MSNs-DOX@PDA-PEG-FA)體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(4-5周齡)隨機(jī)分為五組，每只動(dòng)物右側(cè)腋下注射2×106Hela細(xì)胞，待腫瘤長(zhǎng)到體積約80mm3左右的時(shí)候開始腹腔注射治療，一組注射saline作為空白對(duì)照，一組注射商業(yè)化的阿霉素，其他三組分別注射不載藥的空白納米粒子MSNs@PDA-PEG-FA和載DOX的MSNs-DOX@PDA-PEG、MSNs-DOX@PDA-PEG-FA分別在0、4、8、12天進(jìn)行注射，16天后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死，分離出移植瘤。如圖8所示，可以看出DOX和兩種載藥的納米粒子都較為明顯的抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，兩種載藥的納米粒子的抑制效果要比DOX抑制效果好，其中載DOX的MSNs-DOX@PDA-PEG-FA表現(xiàn)出最好的治療效果。

實(shí)施例3

一種葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向介孔二氧化硅納米粒的制備方法，包括如下步驟：

(1)稱取100mg介孔二氧化硅MSNs和20mg的紫杉醇，溶于10ml二甲基亞砜中，在攪拌條件下，反應(yīng)12小時(shí)，15000rpm離心15min，棄上清液，用去離子水洗滌，以除去游離的紫杉醇和溶劑二甲基亞砜，沉淀真空干燥得載紫杉醇的介孔二氧化硅初始納米粒MSNs-DTX；

(2)按10mg:1mL的比例將所述初始介孔二氧化硅納米粒MSNs-DTX重懸于10mM，pH＝8.5的氫氧化鈉水溶液中，加入多巴胺鹽酸鹽使?jié)舛葹?.0mg/mL，避光反應(yīng)12小時(shí)，15000rpm離心20min，收集沉淀，用去離子水洗滌，以除去未反應(yīng)的多巴胺鹽酸鹽，真空干燥后得載紫杉醇的被聚多巴胺包裹的介孔二氧化硅納米粒MSNs-DTX@PDA；

(3)按10mg:1mL的比例將步驟(2)獲得的MSNs-DTX@PDA分散在pH為10的Tris緩沖溶液中，加入三(2-羧乙基)膦使?jié)舛葹?.1mg/mL，加入靶向配體巰基-聚乙二醇-葉酸(M＝2000)使?jié)舛葹?mg/mL，避光反應(yīng)3小時(shí)，10000離心30min，收集納米粒子，用去離子水洗滌，冷凍干燥得葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向介孔二氧化硅納米粒MSNs-DTX@PDA-PEG-FA(載紫杉醇(Paclitaxel，DTX))。

實(shí)驗(yàn)證明，本實(shí)施例所獲得的葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向介孔二氧化硅納米粒MSNs-DTX@PDA-PEG-FA的表征數(shù)據(jù)與實(shí)施例1無實(shí)質(zhì)性差別。

實(shí)施例4

一種葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向介孔二氧化硅納米粒的制備方法，包括如下步驟：

(1)稱取100mg介孔二氧化硅MSNs和20mg的地昔帕明，溶于10ml二氧六環(huán)中，在攪拌條件下，反應(yīng)24小時(shí)，20000rpm離心15min，棄上清液，用去離子水洗滌，以除去游離的地昔帕明，沉淀真空干燥得載地昔帕明的介孔二氧化硅初始納米粒MSNs-DES；

(2)按5mg:1mL的比例將所述初始介孔二氧化硅納米粒MSNs-DES重懸于10mM，pH＝8.5的Tris緩沖液中，加入多巴胺鹽酸鹽使?jié)舛葹?.5mg/mL，反應(yīng)3小時(shí)，15000rpm離心20min，收集沉淀，用去離子水洗滌，以除去未反應(yīng)的多巴胺鹽酸鹽，真空干燥后得載地昔帕明的被聚多巴胺包裹的介孔二氧化硅納米粒MSNs-DES@PDA；

(3)按2mg:1mL的比例將步驟(2)獲得的MSN@PDA分散在pH為10的碳酸鈉水溶液中，加入三(2-羧乙基)膦使?jié)舛葹?.1mg/mL，加入配體巰基-聚乙二醇-葉酸(M＝2000)使?jié)舛葹?mg/mL，反應(yīng)2小時(shí)，15000離心20min，收集納米粒子，用去離子水洗滌，冷凍干燥得葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向介孔二氧化硅納米粒MSNs-DES@PDA-PEG-FA(載地昔帕明(Desipramine，DES))。

實(shí)驗(yàn)證明，本實(shí)施例所獲得的葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向介孔二氧化硅納米粒MSNs-DES@PDA-PEG-FA的表征數(shù)據(jù)與實(shí)施例1無實(shí)質(zhì)性差別。

實(shí)施例5

一種葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向介孔二氧化硅納米粒的制備方法，包括如下步驟：

(1)稱取100mg介孔二氧化硅MSNs和10mg10-羥基喜樹堿(OPT)粉末溶于10ml乙腈中，在攪拌條件下，反應(yīng)24小時(shí)，10000rpm離心30min，棄上清液，用去離子水洗滌三次以除去游離的10-羥基喜樹堿，沉淀真空干燥得載10-羥基喜樹堿的初始納米粒MSNs-OPT；

(2)按2mg:1mL的比例將所述初始納米粒MSNs-OPT重懸于10mM，pH＝8.5的碳酸氫鈉水溶液中，加入多巴胺鹽酸鹽使?jié)舛葹?.5mg/mL，反應(yīng)3小時(shí)，20000rpm離心15min，收集沉淀，用去離子水洗滌，真空干燥后得載10-羥基喜樹堿的被聚多巴胺包裹的納米粒MSNs-OPT@PDA；

(3)按2mg:1mL的比例將步驟(2)獲得的MSNs-OPT@PDA分散在pH為9的碳酸鈉水溶液中，加入靶向配體巰基-聚乙二醇-葉酸(M＝2000)使?jié)舛葹?mg/mL，反應(yīng)2小時(shí)，15000rpm離心20min，收集納米粒子，用去離子水洗滌，冷凍干燥得葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向納米粒MSNs-OPT@PDA-PEG-FA(載10-羥基喜樹堿)。

實(shí)驗(yàn)證明，本實(shí)施例所獲得的葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向介孔二氧化硅納米粒MSNs-OPT@PDA-PEG-FA的表征數(shù)據(jù)與實(shí)施例1無實(shí)質(zhì)性差別。

實(shí)施例6

一種葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向介孔二氧化硅納米粒的制備方法，包括如下步驟：

(1)稱取100mg介孔二氧化硅MSNs和2mg布洛芬(Brufen)，溶于8ml二氯甲烷中，在攪拌條件下，反應(yīng)6小時(shí)，20000rpm離心15min，棄上清液，用去離子水洗滌，以除去游離的布洛芬，沉淀真空干燥得載布洛芬的介孔二氧化硅初始納米粒MSNs-Brufen；

(2)按1mg:1mL的比例將所述初始介孔二氧化硅納米粒MSNs-Brufen重懸于10mM，pH＝8.5的PBS緩沖液中，加入多巴胺鹽酸鹽使?jié)舛葹?.2mg/mL，反應(yīng)5小時(shí)，20000rpm離心15min，收集沉淀，用去離子水洗滌，以除去未反應(yīng)的多巴胺鹽酸鹽，真空干燥后獲得載布洛芬的被聚多巴胺包裹的介孔二氧化硅納米粒MSNs-Brufen@PDA；

(3)按1mg:1mL的比例將步驟(2)獲得的MSNs-Brufen@PDA分散在pH為10的PBS緩沖溶液中，加入三(2-羧乙基)膦使?jié)舛葹?.2mg/mL，加入靶向配體葉酸巰基-聚乙二醇-葉酸(M＝2000)使?jié)舛葹?0mg/mL，反應(yīng)5小時(shí)，20000離心15min，收集納米粒子，用去離子水洗滌，冷凍干燥得葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向介孔二氧化硅納米粒MSNs-Brufen@PDA-PEG-FA(載布洛芬)。

實(shí)施例7

一種葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向介孔二氧化硅納米粒的制備方法，包括如下步驟：

(1)稱取100mg介孔二氧化硅MSNs和2mg 5-氟尿嘧啶(5-FU)，溶于10ml N,N-二甲基甲酰胺中，在攪拌條件下，避光反應(yīng)12小時(shí)，20000rpm離心15min，棄上清液，用去離子水洗滌三次以除去游離的5-氟尿嘧啶，沉淀真空干燥得載5-氟尿嘧啶的初始納米粒MSNs-5-FU；

(2)按2mg:1mL的比例將所述初始納米粒MSNs-5-FU重懸于10mM，pH＝8.5的Tris緩沖液中，加入多巴胺鹽酸鹽使?jié)舛葹?.0mg/mL，反應(yīng)3小時(shí)，20000rpm離心15min，收集沉淀，用去離子水洗滌，真空干燥后獲得載5-氟尿嘧啶的被聚多巴胺包裹的納米粒MSNs-5-FU@PDA；

(3)按2mg:1mL的比例將步驟(2)獲得的MSNs5-FU@PDA分散在pH為10的碳酸氫鈉水溶液中，加入三(2-羧乙基)膦使?jié)舛葹?.2mg/mL，加入靶向配體巰基-聚乙二醇-葉酸(M＝2000)使?jié)舛葹?mg/mL，反應(yīng)2小時(shí)，15000rpm離心20min，收集納米粒子，用去離子水洗滌，冷凍干燥得葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向納米粒MSNs-5-FU@PDA-PEG-FA(載5-氟尿嘧啶)。

實(shí)驗(yàn)證明，本實(shí)施例所獲得的葉酸和聚多巴胺修飾的腫瘤靶向介孔二氧化硅納米粒MSNs5-FU@PDA-PEG-FA的表征數(shù)據(jù)與實(shí)施例1無實(shí)質(zhì)性差別。

本實(shí)施例中還可以采用四氫呋喃和N,N-二甲基甲酰胺等有機(jī)溶劑。