本發(fā)明涉及藥物抗感染領(lǐng)域，特別是涉及撲蟯靈在制備抗結(jié)核分枝桿菌藥物中的新用途。

背景技術(shù)：

結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病，全球目前有近三分之一的人感染結(jié)核分枝桿菌，其導(dǎo)致的結(jié)核病死亡人數(shù)每年達(dá)13萬，超過其它傳染病死亡人數(shù)的總和。

目前結(jié)核治療的耐藥菌大量出現(xiàn)，尤其多重耐藥(multidrugresistanttuberculosis,mdr-tb，同時(shí)對2種或2種以上一線抗結(jié)核藥(異煙肼和利福平)耐藥)、廣泛耐藥結(jié)核菌(xdr-tb，不僅對一線抗結(jié)核藥耐藥，同對至少3種二線抗結(jié)核藥耐藥)的出現(xiàn)，使得結(jié)核防治形勢日趨嚴(yán)峻。耐藥結(jié)核治療通常治療時(shí)間長、花費(fèi)高，且治療成功率低。因此急需開發(fā)新的抗結(jié)核藥。

撲蟯靈(pyrviniumpamoate)是由美國parke-davis公司(現(xiàn)為美國pfizer公司并購)研發(fā)的一種抗蟯蟲藥。于1982年1月1日獲美國fda批準(zhǔn)上市，商品名為povan。該藥有片劑和混懸劑兩種劑型，用于治療蟯蟲寄生蟲感染。撲蟯靈的中文化學(xué)名稱：恩波酸吡維銨；英文化學(xué)名稱：pyrvinium4,4’-methylenebis(3-hydroxynaphthalene-2-carboxylate)；分子式：c75h70n6o6；分子量：1151.39；cas登記號：3546-41-6。通常人的口服劑量是5mg/kg/天，最高達(dá)350mg，在高劑量時(shí)也是安全的，如口服劑量高達(dá)35mg/kg/天，持續(xù)3-5天都是安全的(ishiii，etal.,reprofilingaclassicalanthelmintic,pyrviniumpamoate,asananti-cancerdrugtargetingmitochondrialrespiration,frontiersinoncology,2012,2:1-4)。該藥物在胃腸道上沒有可測量的吸收，約90％隨糞便排出。

撲蟯靈具有抗結(jié)核分枝桿菌作用尚沒有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明提供撲蟯靈在制備抗結(jié)核分枝桿菌藥物中的新用途，由于該藥物的安全性和藥代動(dòng)力學(xué)特性已經(jīng)在人或動(dòng)物中得到了評估，其潛在的作用可以在臨床中直接檢測，為抗結(jié)核分枝桿菌藥物的研究提供了新的方向。

本發(fā)明的第一方面，提供撲蟯靈在制備抗人和各種動(dòng)物體中結(jié)核分支桿菌藥物的應(yīng)用。

本發(fā)明的第二方面，提供撲蟯靈在制備用于治療結(jié)核分支桿菌導(dǎo)致的肺結(jié)核和肺外結(jié)核的藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，所述的肺外結(jié)核病為腸結(jié)核。

優(yōu)選地，所述結(jié)核分支桿菌是指敏感型結(jié)核分枝桿菌、多重耐藥型結(jié)核分枝桿菌、耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌、耐利福平結(jié)核分枝桿菌。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

(1)利用microsourcediscoverysystems,inc.(gaylordsville,ct,usa)提供的1280種藥物庫，鑒定出67種恥垢分枝桿菌抑菌劑。

(2)剔除藥理作用中能抑制結(jié)核桿菌生長的藥物(如異煙肼、利福平等)及有毒藥物(如醋酸苯汞、硫汞撒)，最后剩下9種藥物。

(3)對于選定的9種藥物，繼續(xù)以恥垢分枝桿菌為模式菌，分別加入不同濃度的上述9種藥物進(jìn)行檢測,其中6種藥物對恥垢分枝桿菌生長的抑制作用有劑量依賴性。

(4)對于選定的6種藥物，采用bcg和、結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株h37ra為模式菌，分別加入不同濃度的上述6種藥物進(jìn)行檢測，只有兩種藥物(氯化苯甲烴胺和撲蟯靈)對bcg和h37ra的生長抑制作用存在劑量依賴性。

(5)計(jì)算撲蟯靈和氯化苯甲烴胺對bcg和h37ra的ic50值，氯化苯甲烴胺對h37ra的ic50值過大，撲蟯靈具有抗結(jié)核菌和抗耐藥性結(jié)核菌活性，可作為治療結(jié)核菌感染疾病的先導(dǎo)化合物，也可用于制備治療結(jié)核病藥物。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

1、由于撲蟯靈1982年1月1日獲美國fda批準(zhǔn)上市，其安全性和藥代動(dòng)力學(xué)特性已經(jīng)在人或動(dòng)物中得到了評估，其潛在的抗結(jié)核分支桿菌作用可以在臨床中直接檢測，避免了新藥審批時(shí)間過長的弊端；

2、針對目前結(jié)核病發(fā)病率高、結(jié)核桿菌多重耐藥菌株及人體免疫缺陷病毒雙重感染的出現(xiàn)，使結(jié)核病發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢的現(xiàn)狀，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)撲蟯靈具有抗結(jié)核分支桿菌和抗多種耐藥性結(jié)核分支桿菌活性的特點(diǎn)，可用于抗結(jié)核藥物的制備，對結(jié)核分枝桿菌導(dǎo)致的肺結(jié)核和肺外結(jié)核等治療具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為恥垢分枝桿菌與1280種藥物分別共培養(yǎng)48h后的a600值。

圖2為恥垢分枝桿菌與不同濃度的9種藥物共培養(yǎng)48h后的a600值，利福平作為陽性對照。

圖3為bcg和h37ra與不同濃度的6種藥物共培養(yǎng)30天后的a600值，利福平為陽性對照。

圖4為撲蟯靈和氯化苯甲烴胺在不同濃度下對bcg和h37ra的抑制率，利福平為陽性對照。

圖5為撲蟯靈化學(xué)結(jié)構(gòu)，

圖a左邊一個(gè)是用于溶解撲蟯靈的活性成分的有機(jī)酸，右邊2個(gè)是撲蟯靈的活性成分；

圖b是上圖中的撲蟯靈活性成分構(gòu)成的一個(gè)結(jié)構(gòu)。

圖6為撲蟯靈在不同濃度下對h37rv的抑制率，利福平為陽性對照。

圖7為不同濃度的撲蟯靈無細(xì)胞毒作用，即研究對鼠巨噬細(xì)胞存活率的影響。

圖8為撲蟯靈在不同濃度下對臨床分離的耐藥結(jié)核菌的抑制率。

具體實(shí)施方式

通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

【實(shí)施例1】在1280中藥物庫中鑒定出60種恥垢分枝桿菌抑菌劑

為了尋找新的結(jié)核桿菌抑制劑，我們用恥垢分枝桿菌對1280種藥物進(jìn)行初篩，以篩選新型抗結(jié)核的藥物。

1)將恥垢分枝桿菌菌種劃線接種到7h10固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)2天，挑取恥垢分枝桿菌單克隆菌落于7h9液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，兩天后利用酶標(biāo)儀檢測細(xì)菌的a600值；

2)然后將細(xì)菌濃度稀釋為2.5×10⁶cfu/ml，按照每孔200μl加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；

3)利用microsourcediscoverysystems,inc.(gaylordsville,ct,usa)提供的1280種藥物庫，通過echo聲波微量移液系統(tǒng)(labcyte，usa)將藥物分別加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，所有藥物在進(jìn)行初篩時(shí)的濃度為25μm；

4)繼續(xù)培養(yǎng)2天后，分別檢測各藥物處理后細(xì)菌溶液的a600值。

初篩之后，有67種藥物在此濃度下可以完全抑制恥垢分枝桿菌的生長(細(xì)菌生長完全受抑制后，od600＝0，見圖1)。然后根據(jù)藥物的作用，我們將藥理作用中能抑制結(jié)核桿菌生長的藥物(如異煙肼、利福平等)、有毒藥物(如醋酸苯汞、硫汞撒)剔除，最后剩下9種藥物(見表1)。

表1九種藥物的臨床作用

【實(shí)施例2】6種藥物對恥垢分枝桿菌生長的抑制作用有劑量依賴性

對于實(shí)施例1篩選定的9種藥物，繼續(xù)以恥垢分枝桿菌為模式菌，分別加入不同濃度的上述9種藥物進(jìn)行檢測。

1)將恥垢分枝桿菌菌種劃線接種到7h10固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)2天，挑取恥垢分枝桿菌單克隆菌落于7h9液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，兩天后利用酶標(biāo)儀檢測細(xì)菌的a600值；

2)然后將細(xì)菌濃度稀釋為2.5×10⁶cfu/ml，按照每孔200μl加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；

3)將不同濃度(0、0.5、1、2、5、10μg/ml)的9種藥物分別加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)2天后，分別檢測各藥物處理后細(xì)菌溶液的a600值。以利福平作為陽性對照。

如圖2所示，有三種藥物(鹽酸二苯胺乙酯、甲孕酮和鹽酸異丙腎上腺素)對恥垢的生長沒有影響，撲蟯靈在極低濃度時(shí)(0.5μg/ml)就能抑制恥垢的生長，而其他五種藥物(苯扎氯胺2μg/ml、氯苯甲嗪5μg/ml、舒洛地爾10μg/ml、多柔比星1μg/ml及替尼泊苷2μg/ml)在高濃度的條件下才能基本上完全抑制恥垢的生長。

【實(shí)施例3】兩種藥物對bcg和h37ra的生長抑制有劑量依賴性

對于實(shí)施例2篩選定的6種藥物，采用bcg和h37ra為模式菌，分別加入不同濃度的上述6種藥物進(jìn)行檢測。

1)將bcg和h37ra菌種劃線接種到7h10固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)30天，挑取bcg和h37ra單克隆菌落于7h9液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，30天后利用酶標(biāo)儀檢測細(xì)菌的a600值；

2)然后將細(xì)菌濃度稀釋為2.5×10⁶cfu/ml，按照每管5ml加入到15ml離心管中；

3)分別加入不同濃度(0、0.5、1、2、5、10μg/ml)的上述6種藥物，30天后，分別檢測不同濃度藥物刺激下細(xì)菌溶液的a600值。以利福平作為陽性對照。

結(jié)果如圖3所示，只有兩種藥物(氯化苯甲烴胺和撲蟯靈)對bcg和h37ra的生長抑制作用存在劑量依賴性，而且另外四種藥物對對bcg和h37ra的生長基本沒有抑制作用。

【實(shí)施例4】撲蟯靈和氯化苯甲烴胺對bcg和h37ra兩種細(xì)菌的ic50值

為了計(jì)算出撲蟯靈和氯化苯甲烴胺對bcg和h37ra兩種細(xì)菌的ic50值，我們繼續(xù)用不同濃度的撲蟯靈和氯化苯甲烴胺與bcg和h37ra共培養(yǎng)，最后檢測不同濃度藥物作用后細(xì)菌的a600值，并通過抑制率計(jì)算公式計(jì)算兩種藥物在不同濃度下對bcg和h37ra的抑制率，估算ic50值。

1)將bcg和h37ra菌種劃線接種到7h10固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)30天，挑取bcg和h37ra單克隆菌落于7h9液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，30天后利用酶標(biāo)儀檢測細(xì)菌的a600值；

2)然后將細(xì)菌濃度稀釋為2.5×10⁶cfu/ml，按照每管5ml加入到15ml離心管中；

3)分別加入不同濃度的撲蟯靈和氯化苯甲烴胺，30天后，分別檢測不同濃度藥物刺激下細(xì)菌溶液的a600值。以利福平作為陽性對照。

4)通過抑制率計(jì)算公式計(jì)算兩種藥物在不同濃度下對bcg和h37ra的抑制率。通過graphpad6.0擬合曲線，估算ic50值。抑菌率計(jì)算：(a600實(shí)驗(yàn)組-a600陰性對照)/(a600陽性對照-a600陰性對照)。

結(jié)果如圖4所示，撲蟯靈對bcg和h37ra的ic50分別是0.75μg/ml和0.3μg/ml，而氯化苯甲烴胺對bcg和h37ra的ic50分別是4μg/ml和1.56μg/ml。通過實(shí)驗(yàn)檢測，我們發(fā)現(xiàn)撲蟯靈和氯化苯甲烴胺對bcg和h37ra的生長均有劑量依賴性的抑制作用，但是由于氯化苯甲烴胺對h37ra的ic50值過大，因而在進(jìn)行h37rv實(shí)驗(yàn)檢測時(shí)只選擇撲蟯靈(圖5撲蟯靈化學(xué)結(jié)構(gòu),圖5a或圖5b所示)進(jìn)行。

【實(shí)施例5】撲蟯靈抑制結(jié)核分枝桿菌(h37rv)有劑量依賴性

對于實(shí)施例2篩選定的藥物-撲蟯靈，采用h37rv為模式菌，分別加入不同濃度的撲蟯靈藥物后，檢測細(xì)菌的a600值，并通過抑制率計(jì)算公式計(jì)算撲蟯靈在不同濃度下對h37rv的抑制率，估算ic50值。

1)將h37rv菌種劃線接種到7h10固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)30天，挑取恥h37rv單克隆菌落于7h9液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，30天后利用酶標(biāo)儀檢測細(xì)菌的a600值；

2)然后將細(xì)菌濃度稀釋為2.5×10⁶cfu/ml，按照每管5ml加入到15ml離心管中；

3)分別加入不同濃度的撲蟯靈，30天后，分別檢測不同濃度藥物刺激下細(xì)菌溶液的a600值。以利福平作為陽性對照。

4)通過抑制率計(jì)算公式計(jì)算撲蟯靈在不同濃度下對h37rv的抑制率。通過graphpad6.0擬合曲線，估算ic50值。抑菌率計(jì)算：(a600實(shí)驗(yàn)組-a600陰性對照)/(a600陽性對照-a600陰性對照)。

結(jié)果如圖6所示，撲蟯靈對結(jié)核分枝桿菌h37rv的生長抑制有劑量依賴性，其ic50為0.65μg/ml。

【實(shí)施例6】撲蟯靈的細(xì)胞毒性

為衡量撲蟯靈用于治療結(jié)核分枝桿菌感染的安全性，我們采用鼠巨噬細(xì)胞系raw264.7，分析不同濃度的撲蟯靈對鼠巨噬細(xì)胞存活率的影響，由此得出撲蟯靈對鼠巨噬細(xì)胞的ld50值，

1)raw264.7細(xì)胞在96孔板中接種100μl的細(xì)胞懸液，密度2×10⁵。

2)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)(在37℃，5％co2的條件下)，24小時(shí)后給細(xì)胞更換新鮮dmem培養(yǎng)基，向培養(yǎng)板加入不同濃度的撲蟯靈藥物(0.1-10μg/ml)。

3)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育24h，向每孔加入10μlcck-8溶液。

4)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2小時(shí)，用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度。通過graphpad6.0擬合曲線，估算lc50值。

結(jié)果如圖7所示，撲蟯靈對鼠巨噬細(xì)胞(raw264.7)的ld50為2.4μg/ml。

【實(shí)施例7】撲蟯靈對耐藥結(jié)核、多重耐藥和非結(jié)核分枝桿菌(ntm)的抑制作用。

為了研究我們篩選出來的藥物對耐藥性結(jié)核分枝桿菌和ntm生長的抑制作用，我們進(jìn)行了耐藥性結(jié)核分枝桿菌生長和ntm生長的抑制實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，撲蟯靈對耐藥性結(jié)核分枝桿菌生長的抑制有劑量依賴性，我們使用的藥物濃度分別是0，0.5，1.0，2.0，5.0，10μg/ml。

圖8撲蟯靈在不同濃度下對臨床分離細(xì)菌的抑制率。(a)、(b)、(c)、(d)和(e)分別表示撲蟯靈藥在不同濃度下對臨床分離的敏感性結(jié)核分枝桿菌、多重耐藥性結(jié)核分枝桿菌、耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌、耐利福平結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌(ntm)的抑制率。結(jié)果表明撲蟯靈藥物能夠抑制臨床耐藥株結(jié)核分枝桿菌的生長，且呈劑量依賴性，撲蟯靈藥物對各臨床菌株的ic50值見表2。

表2撲蟯靈藥物對不同細(xì)菌的ic50值

【實(shí)施例8】撲蟯靈的選擇系數(shù)(selectionindex)

選擇系數(shù)(selectionindex)計(jì)算公式：選擇系數(shù)(selectionindex)＝ld50/ic50。由選擇系數(shù)(selectionindex)計(jì)算公式得出選擇系數(shù)(selectionindex)見表3。通過撲蟯靈的選擇系數(shù)(selectionindex)值，來衡量運(yùn)用撲蟯靈治療結(jié)核分枝桿菌感染的安全性。結(jié)果表明盡管撲蟯靈的選擇系數(shù)不是很高，但是研究表明撲蟯靈藥可以高劑量持續(xù)服用3-5天，且對身體無害，該藥還是有前景的。

表3撲蟯靈藥物對不同細(xì)菌的si值

以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。