本發(fā)明公開了救必應(yīng)酸的新用途，具體為救必應(yīng)酸在制備抗流感病毒藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
流行性感冒病毒(簡(jiǎn)稱流感病毒)可引起急性呼吸道感染，會(huì)對(duì)人類的健康造成威脅。其中，甲型流感病毒由于抗原性易發(fā)生變異，由其引發(fā)的甲型h1n1流感具有流行面廣、傳染性強(qiáng)、發(fā)病率高等特點(diǎn)。目前，應(yīng)對(duì)流感病毒主要是通過(guò)疫苗和藥物治療。其中，m2離子通道抑制劑金剛烷胺類以及神經(jīng)氨酸酶抑制劑是許多國(guó)家在臨床上常用的抗流感病毒藥物，但是這兩類抗病毒藥物現(xiàn)在均出現(xiàn)不同程度的耐藥性，且有一定的毒副作用。因此，尋找新的、高效低毒的抗流感病毒藥物顯得十分重要和緊迫。
救必應(yīng)酸(分子式為c30h48o5)，可提取自冬青科冬青屬植物鐵冬青ilexrotundathunb.的干燥樹皮，其原料中藥救必應(yīng)來(lái)源豐富，低廉，顯示出救必應(yīng)酸良好的藥物應(yīng)用前景。
救必應(yīng)酸屬五環(huán)三萜化合物，具有五環(huán)三萜母核。五環(huán)三萜類化合物的結(jié)構(gòu)通式為：
式中，r為cooh、coo―β―d―葡萄糖基或其他藥學(xué)上可接受的基團(tuán)。當(dāng)式中的r為cooh時(shí)，化合物名為救必應(yīng)酸(rotundicacid)。
目前，專利文獻(xiàn)cn101856357a公開了救必應(yīng)酸具有防治心腦血管疾病，包括心絞痛、心肌梗死、腦梗死的作用。專利文獻(xiàn)cn102391352a公開了救必應(yīng)酸的氨基酸衍生物具有體外抗腫瘤活性。但尚未見(jiàn)關(guān)于救必應(yīng)酸抗流感病毒作用的研究報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的在于公開救必應(yīng)酸的新藥用用途，具體涉及救必應(yīng)酸在制備抗流感病毒藥物中的應(yīng)用。包括h1n1流感病毒。
并進(jìn)一步公開，救必應(yīng)酸在制備治療由流感病毒引起的肺炎藥物中的應(yīng)用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明首次公開救必應(yīng)酸在制備抗流感病毒藥物中的新用途。經(jīng)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，證明救必應(yīng)酸抗h1n1流感病毒的ic50值為5.8μg/ml，與陽(yáng)性藥利巴韋林作用相當(dāng)。小鼠流感模型藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)，救必應(yīng)酸可顯著降低流感感染小鼠的肺指數(shù)，并且對(duì)h1n1呈現(xiàn)一定的量效特征。
具體實(shí)施方式
為更好理解本發(fā)明內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實(shí)施例。
實(shí)施例1救必應(yīng)藥材提取物的制備
取救必應(yīng)藥材適量，粉碎，過(guò)1號(hào)篩，藥材加8倍量70％(體積分?jǐn)?shù))乙醇，加熱回流提取2次，每次1h，過(guò)濾，合并提取液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，在80℃下減壓濃縮至稠膏狀。將濃縮液轉(zhuǎn)移置減壓干燥箱中，在80℃下繼續(xù)進(jìn)行干燥、粉碎，即得救必應(yīng)藥材提取物。
實(shí)施例2體外流感病毒抑制實(shí)驗(yàn)
1.實(shí)驗(yàn)材料
1.1受試藥物：救必應(yīng)酸(從救必應(yīng)中提取得到，純度＞98％)。
1.2對(duì)照藥物：利巴韋林，齊墩果酸，救必應(yīng)藥材提取物(見(jiàn)實(shí)施例1)
1.3病毒株：甲型h1n1流感病毒鼠肺適應(yīng)株(fm/1/47株)。雞胚傳代，bsl-3(生物安全實(shí)驗(yàn)室三級(jí))實(shí)驗(yàn)室內(nèi)檢測(cè)，分裝，-80℃保存。
1.4細(xì)胞模型：狗腎細(xì)胞mdck細(xì)胞
上述藥物均經(jīng)二甲基亞砜(dmso)充分溶解后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2.實(shí)驗(yàn)方法
2.1病毒毒力的測(cè)定
將mdck細(xì)胞按5×104/ml濃度接種96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，37℃、5％co2培養(yǎng)，形成細(xì)胞單層鋪滿狀態(tài)。將100μl10倍系列稀釋得到的6個(gè)濃度的病毒液，依次接種到長(zhǎng)滿單層mdck細(xì)胞層的96孔板中，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照。37℃、5％co2病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變(cpe)，連續(xù)觀察3天，用mtt法進(jìn)行檢測(cè),在酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度od值，用reed-muench法計(jì)算病毒半數(shù)感染劑量(tcid50)，每濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。
測(cè)定結(jié)果：mdck細(xì)胞受到流感病毒攻擊后，細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡，在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上主要表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮，核固縮，碎裂等，在細(xì)胞周圍形成典型的圓形凋小體。用reed-muench法計(jì)算結(jié)果得：病毒毒力tcid50為10-4.5。
2.2救必應(yīng)酸細(xì)胞毒性測(cè)定
取mdck細(xì)胞已長(zhǎng)成單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，傾去培養(yǎng)液，用pbs洗滌2次，加入不含血清的dmem培養(yǎng)基連續(xù)2倍系列稀釋(488μg/ml-3.81μg/ml)的救必應(yīng)酸藥液，100μl/孔，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照4孔。37℃、5％co2病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，用mtt法進(jìn)行檢測(cè)，在570nm波長(zhǎng)下測(cè)出各實(shí)驗(yàn)組與細(xì)胞對(duì)照組的吸收度。以對(duì)照孔為參照，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)孔細(xì)胞的活力比值。根據(jù)reed-muench法計(jì)算細(xì)胞毒性濃度cc50，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。
測(cè)定結(jié)果：救必應(yīng)酸的細(xì)胞半數(shù)毒性濃度cc50>488μg/ml。
2.3救必應(yīng)酸抗h1n1活性測(cè)試
取mdck細(xì)胞已長(zhǎng)成單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，傾去培養(yǎng)液，用pbs洗滌2次，加入100tcid50病毒液，100μl/孔，37℃、5％co2吸附2h。加入不含血清的dmem培養(yǎng)基連續(xù)2倍系列稀釋(244μg/ml-3.81μg/ml)的救必應(yīng)酸藥液,同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照組、細(xì)胞對(duì)照組、陽(yáng)性藥組、救必應(yīng)藥材提取物組和齊墩果酸組。在37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后，用mtt法進(jìn)行檢測(cè)，用酶標(biāo)儀測(cè)570nm波長(zhǎng)處的吸光度od值。按下述公式計(jì)算藥物對(duì)病毒的抑制率：病毒抑制率(％)＝(藥物處理組od均值-病毒對(duì)照組od均值)/(細(xì)胞對(duì)照組od均值-病毒對(duì)照組od均值)×100％，根據(jù)reed-muench法計(jì)算藥物對(duì)流感病毒致cpe產(chǎn)生50％抑制的濃度，即半數(shù)抑制濃度ic50，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：根據(jù)mtt結(jié)果，采用reed-muench法計(jì)算救必應(yīng)酸的半數(shù)抑制濃度ic50為5.8μg/ml，齊墩果酸的半數(shù)抑制濃度ic50為37.5μg/ml，救必應(yīng)藥材提取物的半數(shù)抑制濃度ic50>244μg/ml。陽(yáng)性藥物利巴韋林的半數(shù)抑制濃度ic50為6.8μg/ml。
結(jié)論：救必應(yīng)酸在對(duì)h1n1流感病毒具有較強(qiáng)的抑制作用，其ic50值與利巴韋林ic50值大小接近，且比齊墩果酸以及救必應(yīng)藥材提取物ic50值都要小，證明救必應(yīng)酸對(duì)h1n1流感病毒的抑制作用與陽(yáng)性對(duì)照藥物利巴韋林相當(dāng)，且強(qiáng)于齊墩果酸和救必應(yīng)藥材提取物。
實(shí)施例3體內(nèi)流感抑制實(shí)驗(yàn)
1.實(shí)驗(yàn)材料
1.1受試藥物：救必應(yīng)酸(從救必應(yīng)中提取得到，純度＞98％)。
1.2對(duì)照藥物：達(dá)菲，齊墩果酸，救必應(yīng)藥材提取物(見(jiàn)實(shí)施例1)
1.3病毒：甲型h1n1流感病毒鼠肺適應(yīng)株(fm/1/47株)。雞胚傳代，bsl-3(生物安全實(shí)驗(yàn)室三級(jí))實(shí)驗(yàn)室內(nèi)檢測(cè)，分裝，-80℃保存。
2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
balb/c小鼠體重18g-22g，80只，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
3.實(shí)驗(yàn)方法
將balb/c小鼠隨機(jī)分為8組，分別為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、達(dá)菲對(duì)照組、齊墩果酸組、救必應(yīng)藥材提取物組、救必應(yīng)酸高、中、低3個(gè)劑量組，每組10只。除空白對(duì)照組外，各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物用乙醚輕度麻醉，以15個(gè)ld50的fm1流感病毒液滴鼻感染，每只35μl。感染前一天開始灌胃給藥，每次按0.2ml/10g體重灌胃，每天1次，連續(xù)給藥5天?？瞻捉M和模型對(duì)照組在同等條件下灌胃給予等體積蒸餾水。第6天稱重后解剖，取肺，稱重量，計(jì)算肺指數(shù)與肺指數(shù)抑制率。
計(jì)算公式：肺指數(shù)＝肺質(zhì)量(g)/體重(g)×100％；肺指數(shù)抑制率＝(模型對(duì)照組平均肺指數(shù)－實(shí)驗(yàn)組平均肺指數(shù))/模型對(duì)照組平均肺指數(shù)×100％數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法：肺指數(shù)用平均值±sd值表示，組間比較采用單因素方差分析；采用spss19.0軟件處理數(shù)據(jù)。
4.實(shí)驗(yàn)結(jié)論
肺指數(shù)值越大，表示肺炎越嚴(yán)重。由表1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明的救必應(yīng)酸能夠顯著降低流感感染小鼠的肺指數(shù)，且對(duì)h1n1呈現(xiàn)一定的量效特征，表明救必應(yīng)酸對(duì)流感病毒具有防治作用。此外，救必應(yīng)酸對(duì)于流感病毒的防治效果明顯強(qiáng)于齊墩果酸與救必應(yīng)藥材提取物。本發(fā)明所述的救必應(yīng)酸可作為活性成分制備用于抗流感病毒的藥物。
表1藥物對(duì)流感病毒fm/1/47株感染小鼠肺炎模型肺指數(shù)的影響(n＝10)
注：##與空白對(duì)照組比較，p<0.05，**與模型對(duì)照組比較，p<0.01。