本發(fā)明涉及知母中薩爾薩皂苷元新的藥理作用，尤其是薩爾薩皂苷元對早期糖尿病腎病等糖尿病微血管并發(fā)癥的防治作用。

背景技術：

糖尿病腎病(diabeticnephropathy，dn)是糖尿病微血管并發(fā)癥中最為常見的一種，是糖尿病(diabetesmellitus，dm)患者致死、致殘的主要原因，也是導致終末期腎病(esrd)的最主要原因。糖尿病患病人數(shù)在逐年遞增。國際糖尿病聯(lián)盟(idf)發(fā)布了“idf全球糖尿病概覽”第七版，截止2015年，世界dm成人患者達到4.15億，其中中國為1.096億，位列第一，其次是印度及美國，分別為0.692億和0.293億。糖尿病患者若長期處于高血糖狀態(tài)，即使血糖水平恢復正常，仍然會發(fā)生糖尿病相關的并發(fā)癥。早期糖尿病腎病的臨床表現(xiàn)主要有：蛋白尿、腎小球高濾過率、腎小球基底膜輕度增厚、腎小球系膜基質(zhì)擴張等。dn的發(fā)生與發(fā)展主要是由遺傳易感性及環(huán)境因素(高血糖)的相互作用引起的；環(huán)境因素還包括高血脂、高血壓等因素，但高血糖更加重要。dn的發(fā)病機制相當復雜，但目前主流觀點認為：長期高血糖導致的氧化應激、炎癥、晚期糖基化終末產(chǎn)物(ages)形成、ras軸及多元醇通路激活等在dn的發(fā)病過程中發(fā)揮著主導作用。而且，近幾年的大量研究證實，代謝記憶(metabolicmemory)是糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)展過程中一個獨特的現(xiàn)象。代謝記憶強調(diào)了這樣一個事實：之前的長期高血糖暴露和糖尿病狀態(tài)導致的對心血管等組織器官的長期損害效應，即使在血糖恢復正常后仍然持續(xù)存在。代謝記憶研究表明，阻止糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展不僅僅是嚴格的血糖控制(metabolicmemoryappearstobemorethanjusttightglucosecontrolnecessarytopreventdiabeticcomplications)。持續(xù)的高血糖狀態(tài)誘導的氧化應激和晚期糖基化終末產(chǎn)物的形成可能是形成高糖代謝記憶的基礎。在臨床上，代謝記憶體現(xiàn)為患者服用降糖藥物后，雖然血糖水平恢復正常，但糖尿病腎病癥并不隨著血糖降低而因此大大改善，降血糖與糖尿病腎病并不存在必然的聯(lián)系。因此，糖尿病腎病的發(fā)病機制及防治研究仍然是本世紀全世界醫(yī)藥界重要的研究課題之一。

知母(rhizomeanemarrhena)是治療消渴證(現(xiàn)代之糖尿病)的經(jīng)典中藥，在治療消渴證的中藥復方中出現(xiàn)的頻率較高。知母皂苷(timosaponin)是中藥知母的主要活性成分，為甾體皂苷，也是知母中含量最高的活性成分，約為6％；知母中包含a-i、a-ii、a-iii、a-iv、b-i、b-ii、b-iii、c、e1及i等30種結(jié)構(gòu)已經(jīng)明確的單體皂苷，其中a-iii、b-ii等含量較高。a-iii可脫糖基生成a-i，a-iii和a-i直接脫糖基生成薩爾薩皂苷元(sarsasapogenin,sar)，b-ii等通過糖苷酶處理脫糖基能夠轉(zhuǎn)變成a-iii。薩爾薩皂苷元又稱為菝葜皂苷元，是知母中最主要的皂苷元，分子式為c27h44o3，相對分子量為416.64da。此外，知母中還含有雙苯吡酮類成分，如芒果苷等，含量為1％左右?，F(xiàn)代藥理學研究表明，知母皂苷具有降血糖、降脂、抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集及抗血栓形成、抗癌等多種藥理活性，可用于防治動脈粥樣硬化、糖尿病、衰老、認知損害、骨質(zhì)疏松癥、腦中風及癌癥等。

薩爾薩皂苷元(sarsasapogenin)的分子結(jié)構(gòu)式

知母皂苷a-iii(timosaponina-iii)的分子結(jié)構(gòu)式

知母皂苷a-iii(timosaponina-iii)、a-i的分子結(jié)構(gòu)式

知母皂苷b-ii(timosaponinb-ii)的分子結(jié)構(gòu)式

知母皂苷b-iii(timosaponinb-iii)的分子結(jié)構(gòu)式

技術實現(xiàn)要素：

1.發(fā)明目的

本發(fā)明的目的在于發(fā)現(xiàn)了知母中薩爾薩皂苷元新的藥理作用，即薩爾薩皂苷元對早期糖尿病腎病的防治作用。實際上，本發(fā)明涉及知母中主要甾體皂苷及其元對早期糖尿病腎病的防治作用及其可能的作用機制。

2.技術方案

知母皂苷及其苷元在制備預防與治療早期糖尿病腎病藥物中的應用。

所述的知母皂苷及其苷元在制備預防與治療早期糖尿病腎病藥物中的應用，

其特征在于所述的知母皂苷結(jié)構(gòu)式為：

知母皂苷元為薩爾薩皂苷元，其結(jié)構(gòu)式為：

所述的知母皂苷及其苷元在制備預防與治療糖尿病其他微血管并發(fā)癥藥物中的應用。

本發(fā)明公開了知母中最主要的皂苷元——薩爾薩皂苷元對鏈脲佐菌素(stz)誘導的糖尿病腎病模型大鼠的防治作用及其與ages形成、nlrp3炎癥小體活化介導的炎癥因子合成與釋放增加等的關系，主要觀察指標包括：空腹血糖、體重、腎重指數(shù)、尿蛋白、血清尿酸、ages、il-18水平、基底膜糖原沉積、細胞外基質(zhì)(四型膠原col-iv和纖連蛋白fn)聚集、nlrp3和活化形式caspase1的蛋白表達等。通過上述薩爾薩皂苷元的各種藥理試驗及其結(jié)果，來說明其對早期糖尿病腎病的防治作用，從而進一步理解本發(fā)明的實質(zhì)。

薩爾薩皂苷元對dm大鼠空腹血糖和體重的影響。我們發(fā)現(xiàn)，薩爾薩皂苷元低、高兩個劑量在給藥2、5和9周后對dm大鼠白天空腹7-8h后的血糖水平均沒有明顯影響；同時，薩爾薩皂苷元兩個劑量對每周監(jiān)測的dm大鼠的體重也沒有明顯影響。高劑量對正常大鼠空腹血糖和體重沒有影響。

薩爾薩皂苷元對dm大鼠腎臟功能的影響。實驗結(jié)果證明薩爾薩皂苷元低、高兩個劑量(20，60mg/kg)對dm大鼠的尿蛋白排泄、腎重指數(shù)及血清尿酸水平均有明顯降低作用。而高劑量對正常大鼠腎臟功能沒有明顯影響。

薩爾薩皂苷元對dm大鼠腎臟基底膜厚度及細胞外基質(zhì)的影響。實驗結(jié)果證明薩爾薩皂苷元低、高兩個劑量均可顯著降低dm大鼠腎小球基底膜糖原的沉積，從而抑制其增厚；同時，薩爾薩皂苷元低、高兩個劑量均可顯著降低dm大鼠腎臟四型膠原和纖連蛋白水平，從而抑制細胞外基質(zhì)積累。高劑量對正常大鼠腎臟的以上指標沒有明顯影響。

薩爾薩皂苷元對dm大鼠腎臟ages水平的影響。實驗結(jié)果證明薩爾薩皂苷元低、高兩個劑量均可顯著降低dm大鼠腎皮質(zhì)中ages水平，表明薩爾薩皂苷元可明顯抑制dm狀態(tài)下腎臟ages的形成。高劑量對正常大鼠腎皮質(zhì)中ages水平?jīng)]有明顯影響。

薩爾薩皂苷元對dm大鼠腎臟nlrp3炎癥小體的影響。實驗結(jié)果證明薩爾薩皂苷元低、高兩個劑量均可顯著降低dm大鼠腎皮質(zhì)中nlrp3的蛋白表達，明顯降低活化形式的caspase1水平，以及il-18的水平，表明薩爾薩皂苷元具有明顯地抑制nlrp3炎癥小體活化的作用。

3.有益效果

以上藥理試驗結(jié)果表明本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

(1)本發(fā)明對知母皂苷及其主要苷元——薩爾薩皂苷元發(fā)現(xiàn)了新的藥理作用以及潛在的新醫(yī)藥用途，開拓了一個新的應用領域。

(2)本發(fā)明表明知母作為傳統(tǒng)中藥應用之一是降血糖，薩爾薩皂苷元雖然是知母的主要成分之一，但其沒有降血糖功效，說明其并不是降血糖的主要成分，但首次發(fā)現(xiàn)在防治早期糖尿病腎病藥理效果好，作用強，而且對正常大鼠的生化指標及腎臟功能和形態(tài)無不良影響，故本發(fā)明預示著有良好的藥用前景。根據(jù)代謝記憶學說，降血糖藥物與治療糖尿病腎病并無直接邏輯關系，降血糖并不一定能改善糖尿病腎病病癥，本發(fā)明中薩爾薩皂苷元是首先發(fā)現(xiàn)其具有抗糖尿病腎病作用。知母皂苷a-i，a-iii、b-ii擁有相同的菝契皂苷元，在體內(nèi)代謝形成薩爾薩皂苷元，故也有相似的作用。

(3)本發(fā)明表明薩爾薩皂苷元可明顯降低dm大鼠的尿蛋白排泄、腎重指數(shù)及血清尿酸水平，說明薩爾薩皂苷元能夠明顯減輕dm大鼠早期腎臟功能的損害。

(4)本發(fā)明表明薩爾薩皂苷元可顯著抑制dm大鼠腎小球基底膜pas陽性染色，表明其可降低糖原的沉積從而抑制基底膜增厚；同時，薩爾薩皂苷元可顯著降低dm大鼠腎臟四型膠原和纖連蛋白水平，從而抑制細胞外基質(zhì)積累。這些表明，薩爾薩皂苷元能夠明顯減輕dm大鼠早期的腎臟在形態(tài)方面的損害。

(5)本發(fā)明表明薩爾薩皂苷元對dm大鼠的空腹血糖及體重無明顯影響，但明顯阻止了大鼠dn的發(fā)展，說明薩爾薩皂苷元不是通過控制血糖狀態(tài)來發(fā)揮腎保護作用的。

(6)本發(fā)明表明薩爾薩皂苷元具有明顯降低dm大鼠腎皮質(zhì)中ages水平作用，說明薩爾薩皂苷元可明顯抑制蛋白的非酶糖化作用及ages/rage軸介導的損害。

(7)本發(fā)明表明薩爾薩皂苷元具有顯著降低dm大鼠腎皮質(zhì)中nlrp3的蛋白表達和nlrp3炎癥小體活化的關鍵分子caspase1活化形式的水平，以及nlrp3炎癥小體活化的產(chǎn)物il-18的水平，表明薩爾薩皂苷元具有明顯地抑制nlrp3炎癥小體活化的作用。

附圖說明

圖1薩爾薩皂苷元明顯降低dm大鼠腎皮質(zhì)中pas染色陽性區(qū)域。代表性pas染色圖片，c組(a)，c+sar-h組(b)，dm組(c)，dm+sar-l組(d)，dm+sar-h組(e)，放大倍數(shù)：╳400；各組含分析統(tǒng)計的柱形圖(f)，mean±s.e.m.，n＝3，**p<0.01，與c組比較；##p<0.01，與dm組比較；

圖2薩爾薩皂苷元明顯降低dm大鼠腎皮質(zhì)中fn和co-iv水平。代表性fn的ihc染色圖片(a)，放大倍數(shù)：╳400，各組含分析統(tǒng)計的柱形圖(b)，mean±s.e.m.，n＝3，**p<0.01，與c組比較；##p<0.01，與dm組比較。代表性co-iv的ihc染色圖片(c)，放大倍數(shù)：╳400，各組含分析統(tǒng)計的柱形圖(d)，mean±s.e.m.，n＝3，**p<0.01，與c組比較；##p<0.01，與dm組比較；

圖3薩爾薩皂苷元明顯降低dm大鼠腎小球中cleavedcaspase1蛋白表達。代表性免疫熒光染色圖片，紅色表示cleavedcaspase1蛋白，藍色表示細胞核。

具體實施方式

實施例1：薩爾薩皂苷元對dm大鼠早期腎臟功能的影響

1材料與方法

1.1實驗動物雄性sprague-dawley品系大鼠，8-9周齡，190-220g，由徐州醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2藥品與試劑薩爾薩皂苷元購自北京美迪克斯生物技術有限公司(純度>98％)，stz購自美國sigma公司，cmc-na等試劑購自國藥集團化學試劑有限公司，葡萄糖測試盒、尿蛋白定量試劑盒購自南京建成生物工程研究所，尿酸測定試劑盒購自上海聚創(chuàng)醫(yī)藥科技有限公司。

1.3方法

1.3.1模型建立雄性sprague-dawley大鼠禁食不禁水12h以上，按60mg/kg一次性腹腔注射stz(臨用前溶于0.1mol/l檸檬酸鈉緩沖液，ph4.4)進行造模，造模五天后，眶靜脈叢取血約0.3ml，4℃、3000rpm離心10min，分離血清。用葡萄糖試劑盒檢測空腹血糖(fbg)，取fbg值大于250mg/dl(13.9mmol/l)和小于600mg/dl(33.3mmol/l)的大鼠作為成功的糖尿病大鼠。

1.3.2分組及給藥將造模成功的糖尿病大鼠按照血糖值隨機分為3組，分別為糖尿病模型組(dm)、薩爾薩皂苷元低(dm+sar-l)、高(dm+sar-h)劑量組，每組11只大鼠。另設正常對照組(c)和正常加高劑量組(c+sar-h)，每組10只大鼠。薩爾薩皂苷元低、高劑量組分別按20，60mg/kg灌胃(按10ml/kg體積)給予薩爾薩皂苷元(用1％cmc-na制成混懸液)，每天一次，連續(xù)9周。c組和dm組給同體積1％cmc-na。每周監(jiān)測一次體重，調(diào)整給藥體積，每兩周監(jiān)測一次空腹血糖。

1.3.3指標測定給藥約9周時，將各組大鼠放入大鼠代謝籠中，收集24h尿液，測量體積，并測定其24h尿蛋白含量。之后，各組大鼠股靜脈取血，分離血清，測定尿酸水平，其余低溫保存，備用。即刻處死，剝?nèi)蓚?cè)腎臟，分別稱重后，一部分用10％甲醛溶液固定，其余組織于-80℃保存。

1.3.3.1尿蛋白測定使用尿蛋白定量試劑盒，考馬斯亮藍法(cbb法)測定尿液中蛋白濃度，嚴格按照說明書的測定步驟進行。24h尿蛋白量(mg)＝尿蛋白濃度(mg/l)×稀釋倍數(shù)×24h尿液體積(ml)。

1.3.3.2腎重指數(shù)測定取出大鼠兩側(cè)腎臟，剝?nèi)ソM織上的被膜，生理鹽水清洗，濾紙吸干，電子天平稱重。

1.3.3.3尿酸測定使用尿酸測定試劑盒，尿酸酶法測定血清尿酸水平，嚴格按照說明書的測定步驟進行。

1.4統(tǒng)計學處理所有結(jié)果用mean±s.e.m.表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差不齊后兩組間比較采用dunnett’st3檢驗進行統(tǒng)計學分析，p<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1薩爾薩皂苷元對dm大鼠血糖和體重的影響

在整個實驗過程中，dm大鼠的fbg一直處于高水平狀態(tài)，顯著高于正常大鼠(p<0.01)。dm大鼠給予薩爾薩皂苷元兩個劑量2，5及9周后，fbg仍然處于高水平狀態(tài)，與未給藥dm大鼠比較，無統(tǒng)計學差異(見表1)。dm大鼠的體重顯著低于正常大鼠的體重(p<0.01)，薩爾薩皂苷元的兩個劑量在給藥期間均對dm大鼠的體重無顯著影響(見表2)。此外，薩爾薩皂苷元對正常大鼠的血糖和體重均無影響(見表1，2)。

表1薩爾薩皂苷元對dm大鼠空腹血糖的影響

注mean±s.e.m.，n＝9-11，**p<0.01,與c組比較。

表2薩爾薩皂苷元對dm大鼠體重的影響

注：mean±s.e.m.，n＝9-11，**p<0.01，與c組比較。

2.2薩爾薩皂苷元對dm大鼠腎重指數(shù)、尿蛋白排泄及血清尿酸的影響

dm大鼠的腎重指數(shù)明顯增加，與正常大鼠的比較有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。薩爾薩皂苷元低、高劑量均可顯著降低dm大鼠的腎重指數(shù)(p<0.01和p<0.05)，結(jié)果見表3。

dm大鼠的尿蛋白排泄顯著增加，與正常大鼠的比較有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。薩爾薩皂苷元低、高劑量均可顯著降低dm大鼠的尿蛋白排泄(均p<0.01)，結(jié)果見表4。

dm大鼠的血清尿酸水平明顯增加，與正常大鼠的比較有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。薩爾薩皂苷元低、高劑量均可顯著降低dm大鼠的血清尿酸水平(均p<0.01)，結(jié)果見表5。

表3薩爾薩皂苷元對dm大鼠腎重指數(shù)的影響

注：mean±s.e.m.，**p<0.01，與c組比較；#p<0.05，##p<0.01，與dm組比較。

表4薩爾薩皂苷元對dm大鼠尿蛋白排泄的影響

注：mean±s.e.m.，**p<0.01，與c組比較；#p<0.05，##p<0.01，與dm組比較。

表5薩爾薩皂苷元對dm大鼠血清尿酸的影響

注：mean±s.e.m.，**p<0.01，與c組比較；##p<0.01，與dm組比較。

實施例2：薩爾薩皂苷元對dm大鼠腎小球基底膜厚度及細胞外基質(zhì)含量的影響

1材料與方法

1.1實驗動物同實施例1。

1.2藥品與試劑糖原pas染色試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司，蘇木素染液購自上海博古生物科技有限公司，fibronectin抗體購自英國abcam公司，collagen-ⅳ抗體購自美國bioworld試劑公司。

1.3方法

1.3.1pas染色

取甲醛溶液固定的腎皮質(zhì)，進行常規(guī)石蠟包埋。pas染色步驟如下：

1)腎組織石蠟切片厚度為4μm；

2)脫蠟及水化：將切片依次在二甲苯i、二甲苯ii中脫蠟各15min，分別于100％、95％、80％乙醇中各5min后進入蒸餾水；

3)拭去組織周圍多余的液體，滴加1％過碘酸于組織上使其被覆蓋，室溫、氧化6min；

4)流水沖洗5min，再用蒸餾水浸洗5min；

5)拭去液體，滴加schiff試劑于組織上，室溫避光染色23min；

6)自來水沖洗10min，蒸餾水浸洗5min；

7)拭去液體，滴加蘇木素于組織上，室溫染核2min，蒸餾水沖洗2min；

8)用1％鹽酸酒精分化2s；

9)蒸餾水沖洗2min；

10)常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，通風櫥內(nèi)晾干。

11)結(jié)果觀察：

pas染色陽性物質(zhì)(多糖和糖原)呈紅色或紫紅色，細胞核呈藍色。pas染色法是觀察腎臟形態(tài)結(jié)構(gòu)，尤其是觀察腎小球系膜、基底膜以及腎小管結(jié)構(gòu)的主要方法。取pas染色切片，每例切片取5個互不重疊的腎皮質(zhì)視野，測定每個視野下陽性染色區(qū)域面積與視野面積之比，并取其平均值，用來評價腎臟基底膜增厚程度。

1.3.2免疫組化方法檢測細胞外基質(zhì)fibronectin和collagen-ⅳ水平

1)將石蠟包埋的腎組織切片：4μm；

2)脫蠟水化：將切片依次在二甲苯i、二甲苯ii中脫蠟各15min，隨后分別于100％、95％、80％乙醇中各浸5min后用pbs溶液沖洗3次，每次3min；

3)用無屑紙拭去組織周圍多余的液體，滴加3％h2o2于組織上將其覆蓋，室溫孵育10min；

4)pbs沖洗3次，每次3min；拭去液體，滴加0.4％胃蛋白酶修復液對組織進行修復，37℃孵育30min。pbs沖洗3次，每次3min；

5)拭去液體，滴加2％bsa封閉液，室溫封閉20min。甩掉封閉液，擦去組織周圍液體；

6)將fibronectin和collagen-ⅳ抗體按照1:400的比例用一抗稀釋液進行稀釋，滴加抗體覆蓋組織，置于濕盒4℃冰箱孵育過夜；

7)pbs沖洗3次，每次3min，用紙拭去液體，滴加試劑1于組織上，置于濕盒37℃烘箱孵育20min；

8)pbs洗片3次，每次3min，拭去液體。滴加試劑2,置于濕盒37℃孵育25min；

9)pbs沖洗3次，每次3min。拭去液體，滴加蘇木素于組織上，染核2min，pbs沖洗；

10)用1％鹽酸酒精分化2s，蒸餾水沖洗2min；

11)常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。

免疫組化染色結(jié)果主要是觀察fibronectin和collagen-ⅳ在腎皮質(zhì)中的表達水平，陽性結(jié)果呈現(xiàn)黃褐色。取免疫組化切片，顯微鏡下觀察每列切片5個互不交疊的腎間質(zhì)視野，使用圖像分析軟件image-pro-plus6.0，并以積分光密度(iod)為指標對各組免疫組化染色圖片進行定量分析，以平均積分光密度即積分光密度(iod)與圖片統(tǒng)計面積(area)的比值量化結(jié)果，其大小表示相關蛋白的免疫反應強度。

1.4統(tǒng)計學處理同實施例1。

2結(jié)果

2.1薩爾薩皂苷元對dm大鼠腎皮質(zhì)中pas染色的影響

dm大鼠腎皮質(zhì)中pas染色陽性區(qū)域顯著增加，與正常大鼠腎皮質(zhì)中的比較有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。薩爾薩皂苷元低、高劑量可顯著降低dm大鼠腎皮質(zhì)中pas染色陽性區(qū)域(均p<0.01)，結(jié)果見圖1。

2.2薩爾薩皂苷元對dm大鼠腎皮質(zhì)中細胞外基質(zhì)含量的影響

dm大鼠腎皮質(zhì)中fn和co-iv水平顯著增加，與正常大鼠腎皮質(zhì)中的比較有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。薩爾薩皂苷元低、高劑量可顯著降低dm大鼠腎皮質(zhì)中fn和co-iv水平(均p<0.01)，結(jié)果見圖2b，d。

實施例3：薩爾薩皂苷元對dm大鼠腎皮質(zhì)中ages水平及的影響

1材料與方法

1.1實驗動物同實施例1。

1.2藥品與試劑ⅰ型膠原酶購自美國sigma公司，其他常用化學試劑購自國藥集團(上海)化學試劑有限公司。

1.3方法

1.3.1ages水平測定

熒光分光光度法檢測ages水平。將保存的腎臟標本，稱重后按10倍量(w/v)加入100mm的pbs(ph7.4)緩沖液，用眼科剪刀剪成小顆粒狀，然后于低溫下超聲勻漿。勻漿液于4℃下10000rpm離心15min后，上清液用于總蛋白質(zhì)含量及其他相關指標測定。取沉淀，以雙蒸水洗滌3次，在沉淀中加入氯仿/甲醇(1:1)1.0ml，振蕩過夜。再加入甲醇/水(4:1)0.5ml，4℃下4000rpm離心5min。沉淀以甲醇1.0ml洗滌2次，雙蒸水洗滌2次，再用ph7.5,0.02mol/lhepes緩沖液(含0.1mol/lcacl2)洗2次。沉淀于1.0mlhepes緩沖液中4℃下過夜。離心去除緩沖液，將顆粒懸浮于1.0ml含ⅰ型膠原酶(290u)的hepes緩沖液中，加入甲苯和氯仿各2.0μl。以只含hepes緩沖液和膠原酶的空白管為標準，37℃振蕩24h，將消化液離心，留取上清液。用熒光分光光度法檢測上清液中的熒光強度(反映ages的含量)，激發(fā)波長為370nm,吸收波長為440nm。ages的含量以u/mg腎組織蛋白表示。

1.4統(tǒng)計學處理同實施例1。

2結(jié)果

2.1薩爾薩皂苷元對dm大鼠腎皮質(zhì)中ages含量的影響

dm大鼠腎皮質(zhì)中ages含量顯著增加，與正常大鼠腎皮質(zhì)中的比較有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。薩爾薩皂苷元低、高劑量可顯著降低dm大鼠腎皮質(zhì)中的ages含量(均p<0.01)；高劑量給予正常大鼠，ages含量沒有明顯變化，結(jié)果見表6。

表6知薩爾薩皂苷元對dm大鼠腎皮質(zhì)中ages含量的影響

注：mean±s.e.m.，**p<0.01，與c組比較；##p<0.01，與dm組比較。

實施例4：薩爾薩皂苷元對dm大鼠腎皮質(zhì)中nlrp3蛋白表達、活化的caspase1與il-18水平影響

1材料與方法

1.1實驗動物同實施例1。

1.2藥品與試劑nlrp3抗體購自美國cellsignalingtechnology公司，兔抗β-actin抗體購自美國bioworld公司，cleavedcaspase1抗體購自美國santacruz公司，westernblot一抗、二抗稀釋液、堿性磷酸酶二抗、苯甲基磺酰氟化物(pmsf)和bca蛋白質(zhì)測試盒、dapi染色液購自江蘇碧云天生物公司，na3vo4和naf購自國藥集團(上海)化學試劑有限公司，dab顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司，dylight594affinipuredonkeyanti-rabbit購自美國earthox公司，大鼠il-18elisa試劑盒購自武漢boster公司。

1.3方法

1.3.1nlrp3蛋白表達測定

westernblotting法測定nlrp3蛋白表達。取分裝保存的腎臟組織漿液(曾用于rage表達測定)，電泳分離樣品，轉(zhuǎn)膜(硝酸纖維素膜)，洗膜，封閉，一抗反應，二抗反應，顯色，掃描或拍照，imagej軟件分析蛋白表達水平的變化。采用β-actin作為內(nèi)參。

1.3.2cleavedcaspase1蛋白表達測定

免疫熒光法檢測nlrp3蛋白表達。

1)組織切片：4μm；

2)組織切片脫蠟水化：二甲苯i15min，二甲苯ii15min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，80％乙醇5min；

3)置于蒸餾水中浸泡15min，pbs洗片，5min╳3次，擦掉多余液體；

4)微波修復：將玻片放入ph6.0檸檬酸緩沖溶液中，關蓋，大火5min，小火15min，開蓋自然冷卻至室溫。pbs洗片，5min╳3次，甩掉液體并拭干多余的液體；

5)封閉：胎牛血清:pbs配比為1:200配制封閉液，每一組織40μl，加至組織上使其覆蓋組織表面，室溫封閉40min；

6)甩去組織切片表面多余的液體并拭干周圍液體，不洗，滴加cleavedcaspase-1(1:100)一抗稀釋液于切片表面，置于濕盒中4℃孵育過夜；

7)4℃取出濕盒，37℃孵育30min；

8)洗滌：pbs洗片，5min╳3次；

9)擦干組織周圍液體，避光條件下滴加熒光標記的二抗抗體(1:200)，每一切片組織上40μl，覆蓋組織表面，并于37℃避光孵育1h；

10)甩去液體，pbs洗片，5min╳3次，滴加dapi染色液，染色3min，pbs洗滌5min╳3次(避光操作)；

11)滴加抗熒光猝滅封片液于組織上，蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡，四角使用無色指甲油固定(避光操作)；

12)熒光顯微鏡下拍照。

最終結(jié)果，cleavedcaspase1蛋白為紅色熒光，細胞核為藍色熒光。

1.3.3il-18水平測定

酶聯(lián)免疫吸附分析(elisa)法測定il-18水平。取ages含量測定樣本的上清，測定腎臟中il-18水平。il-18水平測定嚴格按照各自試劑盒的操作步驟進行。

1.4統(tǒng)計學處理同實施例1。

2結(jié)果

2.1薩爾薩皂苷元對dm大鼠腎臟中nlrp3蛋白表達的影響

dm大鼠腎臟中nlrp3蛋白表達顯著增加，與正常大鼠的比較有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。薩爾薩皂苷元低、高劑量可顯著降低dm大鼠腎臟中nlrp3蛋白表達(均p<0.01)；高劑量給予正常大鼠，nlrp3蛋白表達沒有變化，結(jié)果見表7。

表7薩爾薩皂苷元對dm大鼠腎臟中nlrp3蛋白表達的影響

注：mean±s.e.m.**p<0.01，與c組比較；##p<0.01，與dm組比較。2.2薩爾薩皂苷元對dm大鼠腎小球中cleavedcaspase1蛋白表達的影響

與正常大鼠比較，dm大鼠腎小球中cleavedcaspase1蛋白表達顯著增加，薩爾薩皂苷元低、高劑量可明顯降低dm大鼠腎小球中cleavedcaspase1蛋白表達，而高劑量給予正常大鼠，腎小球中cleavedcaspase1蛋白表達沒有變化，結(jié)果見表圖3。

2.3薩爾薩皂苷元對dm大鼠腎皮質(zhì)中il-18水平的影響

dm大鼠腎皮質(zhì)中il-18水平顯著增加，與正常大鼠的比較有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。薩爾薩皂苷元低、高劑量可顯著降低dm大鼠腎皮質(zhì)中il-18水平(均p<0.01)；高劑量給予正常大鼠，il-18水平?jīng)]有變化，結(jié)果見表8。

表8薩爾薩皂苷元對dm大鼠腎皮質(zhì)中il-18水平的影響

注：mean±s.e.m.**p<0.01，與c組比較；##p<0.01，與dm組比較。