專利名稱：紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的制作方法
本申請(qǐng)是1989.10.13日申請(qǐng)的美國專利申請(qǐng)421444的部分后續(xù)申請(qǐng)，在此列入該專利申請(qǐng)作為參考。本發(fā)明涉及紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體或其混合物和特異異構(gòu)體或其混合物的制備方法，以及含有這種異構(gòu)體或其混合物的藥物組合物和利用這種異構(gòu)體和組合物的治療方法。
紅細(xì)胞生成素是一種糖蛋白激素，包含在紅細(xì)胞系祖代細(xì)胞進(jìn)入紅血球的成熟過程中。在循環(huán)中血紅細(xì)胞濃度的調(diào)節(jié)是十分重要的。天然產(chǎn)生的紅細(xì)胞生成素是通過胎兒存活期的肝和通過成人的腎而產(chǎn)生的，并且在血液中循環(huán)，刺激在骨髓中產(chǎn)生血紅細(xì)胞。由于腎的紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)生減少，則腎衰竭的后果將不可避免地是貧血癥。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過基因工程技術(shù)，包括由用編碼紅細(xì)胞生成素基因轉(zhuǎn)換的宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)產(chǎn)物表達(dá)來產(chǎn)生的重組體紅細(xì)胞生成素，在用于處置由慢性腎衰竭引起的貧血癥是有效的。
到目前為止，制取紅細(xì)胞生成素的能力是十分有限。雖然人尿中存在蛋白質(zhì)，但是排泄量太低，無法將其作為用于治療目的的紅細(xì)胞生成素的可利用資源?；加邪l(fā)育不全的貧血癥的患者，具有的尿紅細(xì)胞生成素水平高于健康人，但這種尿的提供量是很有限的，作為資源是不實(shí)際的。在J.Biol.Chem.，252，5558(1977)中Miyake等人介紹了人尿紅細(xì)胞生成素的純化方法，作為原料，使用了發(fā)育不全貧血癥患者的尿。
在美國專利US4703008中，Lin描述了鑒定，克隆和表達(dá)編碼紅細(xì)胞生成素基因的方法。例如，在美國專利US4667016中Lai等人提出了從支持含重組紅細(xì)胞生成素質(zhì)粒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長的細(xì)胞培養(yǎng)基中純化重組紅細(xì)胞生成素的方法。由在重組質(zhì)粒上含有紅細(xì)胞生成素基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主的表達(dá)和回收生物活性的重組紅細(xì)胞生成素，首次獲得適用于治療應(yīng)用的紅細(xì)胞生成素的量。另外，基因順序知識(shí)以及制得更大量的純化蛋白導(dǎo)致了更詳細(xì)地了解該蛋白作用方式。
蛋白的生物活性取決于其結(jié)構(gòu)。尤其是，蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)(即，其氨基酸順序)提供信息，在其合成過程和合成后，通過多肽能夠形成二級(jí)(如α-螺旋線形或β-片形)以及三級(jí)(完全三維疊合)結(jié)構(gòu)。通過引入突變或通過化學(xué)或酶處理來分裂適宜的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，這可能造成生物活性的降低。
在原核生物的生物體中，通過上述結(jié)構(gòu)大大地抑制了蛋白的生物活性。與原核生物細(xì)胞的蛋白不同，由真核生物細(xì)胞產(chǎn)生的許多細(xì)胞表面和分泌蛋白可以用一種或多種寡糖基團(tuán)改性。這種改性是指糖基化，它可以顯著地影響蛋白的物理特性，而且對(duì)蛋白的穩(wěn)定性、分泌作用、及亞細(xì)胞的定位也可能是很重要的。合適的糖基化對(duì)生物活性可能是必要的。事實(shí)上，真核生物的生物體的某些基因，如果在缺少糖基化蛋白的細(xì)胞過程的細(xì)菌中表達(dá)時(shí)(如E.coli)，則產(chǎn)生的蛋白由于缺乏糖基化作用而具有少量或沒有活性。
糖基化作用發(fā)生在沿多肽主鏈的特定位點(diǎn)上，通常有兩種類型當(dāng)主鏈?zhǔn)琼樞駻sn-X-Ser/Thr的部分時(shí)，其中X可以是除了脯氨酸以外的任何氨基酸，則O-連接的寡糖連接到絲氨酸或蘇氨酸殘基上，而N-連接的寡糖連接到天門冬酰胺殘基上。發(fā)現(xiàn)在每一類型中，N-連接和O-連接的寡糖的結(jié)構(gòu)和糖殘基不同。在兩種類型中通常發(fā)現(xiàn)的一種類型糖是N-乙酰神經(jīng)氨酸(下文稱為唾液酸)。唾液酸往往是N-連接和O-連接的寡糖兩者的末端殘基，通過其負(fù)電荷，使糖蛋白具有酸性。
人尿制取的紅細(xì)胞生成素和具有人的紅細(xì)胞生成素氨基酸順序1～165的重組紅細(xì)胞生成素(在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá))都含有三個(gè)N-連接和一個(gè)O-連接的寡糖鏈，它們一共含有糖蛋白總分子量的約40%。N-連接的糖基化發(fā)生在位于24、38和83位置的天門冬酰胺殘基上，而O-連接的糖基化發(fā)生在位于126位置的絲氨酸殘基上(Lai等人，J.Biol.Chem.261，3116(1986);Broudy等人，Arch.Biochem.Biophys.，265，329，(1988))。已經(jīng)表明，寡糖鏈可以用末端唾液酸殘基改性。糖基化紅細(xì)胞生成素的酶處理除去所有唾液酸殘基，造成體內(nèi)活性損失但是并不影響體外活性(Lowy等人，Nature，185，102(1960);Goldwasser等人，J.Biol.Chem.249，4202(1974))。這種現(xiàn)象可以借助于在與肝的結(jié)合蛋白的唾液糖蛋白(asialoglycoprotein)的相互作用時(shí)，從循環(huán)中迅速清除唾液紅細(xì)胞生成素來解釋(Morrell等人，J.Biol.Chem.243，155(1968);Briggs等人，Am.J.Physiol.227，1385(1974);Ashwell等人，Methods Enzymol.50，287(1978))。因此，只有當(dāng)紅細(xì)胞生成素經(jīng)唾液酸化以避免其與肝的結(jié)合蛋白相結(jié)合時(shí)，紅細(xì)胞生成素才具有體內(nèi)生物活性。
紅細(xì)胞生成素的寡糖鏈的其它組成的作用還沒有很好確定。已經(jīng)表明，非糖基化的紅細(xì)胞生成素與糖基化形式相比較，其體內(nèi)活性大大降低。但是仍然保持體外活性(Dordal等人，Endocrinology 116，2293(1985);Lin專利，同上)。然而，在另一項(xiàng)研究中，通過糖基化位點(diǎn)的天門冬酰胺或絲氨酸殘基的突變，可以單獨(dú)或一起除去N-連接或O-連接的寡糖鏈，這樣就明顯地降低了由哺乳動(dòng)物細(xì)胞所產(chǎn)生的改性的紅細(xì)胞生成素的體外活性(Dube等人，J.Biol.Chem.263，17516(1988))。
使用某些技術(shù)，如等電點(diǎn)聚焦(IEF)可以將糖蛋白如紅細(xì)胞生成素分成不同的電荷形式。有人已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了有關(guān)粗制和部分純化的紅細(xì)胞生成素制劑的IEF研究(Lukowsky等人，J.Biochem 50，909(1972);Shelton等人，Biochem.Med.12，45(1975);Fuhr等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.98，930(1981))。多數(shù)情況下，在這些研究中通過IEF可以辨別三或四個(gè)具有紅細(xì)胞生成素活性的片段，并且都沒有進(jìn)行碳水化合物含量的鑒定。另外，也沒有進(jìn)行片段等電點(diǎn)與其生物活性之間的相互關(guān)系。
在Miyake等人(同上)的報(bào)導(dǎo)中，討論了在從人尿中純化尿紅細(xì)胞生成素的過程中，由羥基磷灰石色譜得到的標(biāo)記為Ⅱ和ⅢA的二個(gè)紅細(xì)胞生成素片段具有相同的特異活性。對(duì)片段Ⅱ和ⅢA以后的碳水化合物分析表明，片段Ⅱ的平均唾液酸含量大于片段ⅢA(Dordal等人，同上)。
本發(fā)明的目的在于提供具有確定的唾液酸含量和生物活性的紅細(xì)胞生成素的所分離和離析的異構(gòu)體。含有該分子的藥物組合物有利于治療。
本發(fā)明涉及紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體。本發(fā)明還提供了一種制備紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的方法，該方法包括將純化的紅細(xì)胞生成素進(jìn)行制備的等電點(diǎn)聚焦，并從凝膠中洗脫單獨(dú)的異構(gòu)體。本發(fā)明也提供了含有紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的可藥用組合物。本發(fā)明還涉及提高哺乳動(dòng)物血細(xì)胞比容程度的方法，包括給藥可治療量的這些組合物以提高網(wǎng)織紅細(xì)胞和血紅細(xì)胞的生產(chǎn)。
本發(fā)明涉及一種制備具有大于或小于每分子定數(shù)的唾液酸的紅細(xì)胞生成素分子混合物的方法，該方法包括將含有紅細(xì)胞生成素的材料進(jìn)行離子交換色譜。本發(fā)明還包括一種制備具有大于或小于每分子予定數(shù)的唾液酸的紅細(xì)胞生成素分子的混合物的方法，該方法包括將含有紅細(xì)胞生成素的材料進(jìn)行色譜聚焦。
本發(fā)明也包括人紅細(xì)胞生成素的類似物，它比人紅細(xì)胞生成素具有更多的碳水化合物鏈連接的位點(diǎn)數(shù)，如〔Asn69〕EPO;〔Asn125、Ser127〕EPO;〔Thr125〕EPO;和〔Pro124，Thr125〕EPO。


圖1所示為分離重組紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的分析等電點(diǎn)聚焦凝膠。凝膠道1～11表明異構(gòu)體在道1的較低酸性(較高pⅠ)到道11的較高酸性(較低pⅠ)范圍之內(nèi)變化。含有異構(gòu)體9～14的混合物的純化重組紅細(xì)胞生成素也示于凝膠的最左和右的道中。
圖2所示為每個(gè)紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體中的唾液酸數(shù)與每個(gè)異構(gòu)體(以每毫克紅細(xì)胞生成素多肽的單位數(shù)表示)的體內(nèi)特異活性之間的關(guān)系。在圖2A中，每種紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的濃度由Bradford蛋白分析法測定;在圖2B中，濃度通過在280nm的吸收度測定;在圖2C中，濃度通過RIA測定。
圖3所示為在不同條件下，通過陰離子交換色譜而制備的重組紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的確定的混合物的分析等電點(diǎn)聚焦凝膠。凝膠道1～6分別代表用150mM乙酸(PH4.7)，150mM乙酸(未緩沖的)，200mM乙酸(PH4.7)，250mM乙酸(PH4.7)，300mM乙酸(pH4.7)或300mM乙酸(未緩沖的)洗滌Q-瓊脂糖快速流動(dòng)柱后的高鹽洗液洗脫的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體。按上文中Lai等人的實(shí)施例2所述方法(除了其中用Q-瓊脂糖色譜替代DEAE-瓊脂糖色譜以外)所制得的含有異構(gòu)體混合物的純化的重組紅細(xì)胞生成素也示于凝膠的最左道。
圖4所示為通過將細(xì)胞有條件的培養(yǎng)基加到Q-瓊脂糖柱上以進(jìn)行降低pH和增高離子強(qiáng)度的梯度淋洗而得的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體8到12的分離。將第2到第40餾分之間的偶數(shù)部分都進(jìn)行分析等電點(diǎn)聚焦。按上文中Lai等人的實(shí)施例2所述方法除了用Q-瓊脂糖色譜替代DEAE-瓊脂糖色譜以外，而制得的含有異構(gòu)體混合物的純化的重組紅細(xì)胞生成素也示于凝膠的最左道。
圖5所示為人紅細(xì)胞生成素氨基酸順序。方塊表示天門冬酰胺殘基，上面連接碳水化合物鏈，星號(hào)表示用碳水化合物改性的蘇氨酸和絲氨酸殘基。實(shí)施例6的類似物中所提供的附加糖基化位點(diǎn)通過突變?yōu)樘扉T冬酰胺、絲氨酸和蘇氨酸而表明。
圖6A、6B和6C所示為系列克隆步驟，用于產(chǎn)生構(gòu)建用質(zhì)粒和人紅細(xì)胞生成素類似物的分析。這些類似物具有圖5所示變異的氨基酸，它提供附加的糖基化位點(diǎn)。
圖7所示為人順序紅細(xì)胞生成素和所示的紅細(xì)胞生成素類似物的COS細(xì)胞上清液的Western印跡分析。類似物〔Asn9，Ser11〕EPO，〔Asn69〕EPO，〔Asn125、Ser127〕EPO，和〔Pro124，Thr125〕EPO是按實(shí)施例6所述方法構(gòu)建的。不含附加碳水化合物鏈的類似物〔Pro125、Thr127〕EPO，〔Asn126、Ser128〕EPO和〔Thr125、Ser127〕EPO用于對(duì)比而列出的。
圖8所示為用N-聚糖酶處理后人順序紅細(xì)胞生成素和所示的紅細(xì)胞生成素類似物的COS細(xì)胞上清液的Western印跡分析。類似物〔Thr125〕EPO和〔Pro124、Thr125〕EPO是按實(shí)施例6所述方法構(gòu)建的。類似物〔Val126〕EPO，〔Pro124〕EPO，〔Pro125〕EPO，〔Thr127〕EPO，〔Pro125、Ser127〕EPO和〔Thr125、Ser127〕用于對(duì)比而示出。
圖9所示為通過細(xì)胞培養(yǎng)基的Q-瓊脂糖和C4反相色譜所獲得的池2、3和4的等電點(diǎn)聚焦凝膠，該細(xì)胞培養(yǎng)基支持用含有〔Thr125〕突變的紅細(xì)胞生成素cDNA轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的生長。按上文中Lai等人的實(shí)施例2所述方法(除了用Q-瓊脂糖色譜替代DEAE-瓊脂糖色譜)制得的含有異構(gòu)體混合物的純化重組紅細(xì)胞生成素也示于凝膠的左道和右道中。
按照本發(fā)明提供了紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體。等電點(diǎn)聚焦(IEF)是根據(jù)電荷而分離蛋白。當(dāng)將它放入pH梯度液，并受到電場作用時(shí)，蛋白會(huì)遷移到某一點(diǎn)，在該點(diǎn)它們不帶凈電荷并保留在那兒。這就是蛋白的等電點(diǎn)(PI)。在IEF上觀測到的每個(gè)區(qū)分帶都代表具有特定pI的分子，因而有相同的總電荷并稱為異構(gòu)體。本文中的術(shù)語“紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體”是指具有單一pI和具有同樣氨基酸順序的紅細(xì)胞生成素制劑。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素是已經(jīng)轉(zhuǎn)染入非人真核生物宿主細(xì)胞的外源DNA順序表達(dá)的產(chǎn)物，即，在優(yōu)選實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素是“重組紅細(xì)胞生成素”。重組紅細(xì)胞生成素有利于按照共同所有的Lin的美國專利US4703008(在此引入作為參考)所述方法而生產(chǎn)的。重組紅細(xì)胞生成素有利于按照共同所有的Lai等人的美國專利US 4667016(在此引入作為參考)中實(shí)施例2所述的一般方法而純化，或者按實(shí)施例2所述方法但用Q-瓊脂糖色譜代替DEAE-瓊脂糖色譜而進(jìn)行純化。在Q-瓊脂糖柱的改變方案中，用55mM NaCl代替用于使柱呈中性pH的緩沖液中的25mM NaCl，用140mM NaCl代替用于從柱上洗脫紅細(xì)胞生成素的緩沖液中的75mM NaCl。當(dāng)采用十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分析時(shí)，該材料以單一形式(即帶)遷移。在對(duì)純化的紅細(xì)胞生成素進(jìn)行IEF時(shí)，在凝膠上出現(xiàn)多帶，這說明存在不同電荷形式的糖蛋白。
發(fā)現(xiàn)具有尿源人紅細(xì)胞生成素氨基酸順序的重組紅細(xì)胞生成素的分立的異構(gòu)體，相當(dāng)于具有1～14唾液酸的紅細(xì)胞生成素分子，并且每種呈純化的重組紅細(xì)胞生成素的異構(gòu)體都具有體內(nèi)活性，該活性與異構(gòu)體所具有唾液酸數(shù)有關(guān)。這里所用的術(shù)語“紅細(xì)胞生成素”包括天然產(chǎn)生的紅細(xì)胞生成素、尿源人紅細(xì)胞生成素，以及非天然產(chǎn)生的、具有氨基酸順序和足以雙倍于天然產(chǎn)生的紅細(xì)胞生成素的糖基化，以使之具有引起骨髓細(xì)胞增加產(chǎn)生網(wǎng)織紅細(xì)胞和血紅細(xì)胞的體內(nèi)生物性質(zhì)的多肽。
紅細(xì)胞生成素的粗制制劑具有許多異構(gòu)體，但是按上文Lai等人專利的實(shí)施例2方法純化的材料，用IEF分析時(shí)，主要含有六種異構(gòu)體。此外，至少有一種有較高酸性的另外異構(gòu)體，按實(shí)施例4所述的色譜法已檢測出(這種在IEF凝膠上在大于14唾液酸處遷移的較高酸性的形式含有非唾液酸負(fù)電荷，正如某些電荷對(duì)唾液酸酶消化的抗體所示)。這些異構(gòu)體因唾液酸含量而彼此有所區(qū)別。正如實(shí)施例所示，通過制備的IEF分離出這些異構(gòu)體中的10個(gè)，并檢測其中五個(gè)的唾液酸含量來證實(shí)。在用于分析唾液酸含量的異構(gòu)體中，發(fā)現(xiàn)五個(gè)異構(gòu)體分別含有9.10.11.12或13個(gè)唾液酸殘基。
在紅細(xì)胞生成素的相對(duì)體內(nèi)特異活性與由5到11異構(gòu)體(這里所指的每個(gè)異構(gòu)體是用每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子的唾液酸數(shù)來表示)中每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子中的唾液酸殘基數(shù)之間存在一個(gè)關(guān)系。異構(gòu)體11～14具有基本相同的相對(duì)體內(nèi)特異活性。通過過缺氧紅細(xì)胞增多鼠的生物分析(exhypoxic polycythemic mouse bioassay)檢測異構(gòu)體5-14的體內(nèi)活性，并通過Bradford蛋白分析、280nm的吸收度或者通過放射免疫測定(RIA)對(duì)紅細(xì)胞生成素進(jìn)行每個(gè)異構(gòu)體的含量測定。RIA測定(Egrie等人，Immunobiology 172，213(1986))，以單位/ml表示，除以212770單位/mg紅細(xì)胞生成素多肽，用RIA測定的純化紅細(xì)胞生成素的平均特異活性以紅細(xì)胞生成素多肽毫克數(shù)/ml表示來給出離析的異構(gòu)體或異構(gòu)體混合物的蛋白濃度。如實(shí)施例所示，從異構(gòu)體5到異構(gòu)體11，異構(gòu)體的相對(duì)體內(nèi)特異活性逐步增加(見表2)。
這里所述的體內(nèi)特異活性是相對(duì)的體內(nèi)特異活性的測量值，并不是絕對(duì)的體內(nèi)特異活性測量值。從本申請(qǐng)的目的出發(fā)，特異活性僅用于比較異構(gòu)體的相對(duì)活性，異構(gòu)體的測定采用相同測定方法，采用相同條件包括相同的內(nèi)標(biāo)，相同種類的動(dòng)物，具有用于計(jì)算特異活性的相同數(shù)據(jù)分析，測定蛋白含量的相同分析方法。本發(fā)明并不想以所報(bào)導(dǎo)的任何異構(gòu)體的任何體內(nèi)特異活性值來代表該異構(gòu)體的固有或絕對(duì)值。
本發(fā)明提供了紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體。按照本發(fā)明獲得的紅細(xì)胞生成素特異性異構(gòu)體，以及其特性，可以根據(jù)起始材料源的不同而變化。例如，從尿中獲得的人紅細(xì)胞生成素的異構(gòu)體是不同于重組紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子具有一定數(shù)的唾液酸(即大于0的固定值)的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體，該所述的數(shù)選自1-14。優(yōu)選的數(shù)為9、10、11、12、13或14。在另一實(shí)施方案中，該數(shù)大于14，優(yōu)選的為16～23。
本發(fā)明還提供了含有兩種或多種紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的組合物。在一實(shí)施方案中，組合物所含有的異構(gòu)體混合物中每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子具有大于予定數(shù)的唾液酸，如每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子的唾液酸數(shù)大于11，或每分子的唾液酸大于12，例如異構(gòu)體12、13和14的混合物。在另一實(shí)施方案中，組合物含有的異構(gòu)體混合物中每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子具有予定數(shù)的唾液酸，如每分子的唾液酸數(shù)小于12，但大于8，如異構(gòu)體9、10和11的混合物。本發(fā)明還提供了紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的組成，其中異構(gòu)體的相對(duì)量相同或不同。如異構(gòu)體9、10和11的混合物可以有各種不同比例的異構(gòu)體，如1∶1∶1，2∶3∶1或20∶20∶1。
最好的是，組合物含有低于4個(gè)異構(gòu)體的混合物，如異構(gòu)體11、12和13的混合物，或12和14的混合物或7和13的混合物。
為了生產(chǎn)紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體混合物，本發(fā)明還提供了同時(shí)離析出所選擇的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的方法。這些方法包括通過制備等電點(diǎn)聚焦技術(shù)分離單個(gè)異構(gòu)體或通過如離子交換色譜或色譜聚焦技術(shù)制備每分子具有予定數(shù)(如大于11)的唾液酸的異構(gòu)體混合物。所有這些技術(shù)都以按電荷分離蛋白作為基礎(chǔ)。
通常，離子交換色譜和色譜聚焦包括將任何粗制的人紅細(xì)胞生成素(細(xì)胞有條件的培養(yǎng)基)或純化的材料加到柱的樹脂上，其條件是要使一些或全部紅細(xì)胞異構(gòu)體結(jié)合到樹脂上。對(duì)于粗制紅細(xì)胞生成素制劑，最好將蛋白加到約PH7的柱上，而對(duì)于純化的制劑，可將蛋白加到PH7到約PH4的柱上。在用約PH4的緩沖液洗滌后，將那些仍然結(jié)合在離子交換柱上的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體，通過增加PH和鹽濃度的緩沖液或通過加入約PH4的降低PH和增加離子強(qiáng)度的梯度液洗脫。對(duì)于色譜聚焦，則異構(gòu)體通過降低PH的梯度液而從柱上洗脫或通過用高濃度鹽洗柱而洗脫。
本發(fā)明的一個(gè)具體方案涉及哺乳動(dòng)物(如，中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary)，CHO)宿主細(xì)胞，它最好合成具有大于特定數(shù)(即大于每分子10個(gè)唾液酸)的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體。紅細(xì)胞生成素分子具有N-連接或O-連接的寡糖結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可以限定分子中的唾液酸含量。例如，四觸角(四支鏈)(tetraantennary)N-連接的寡糖通常提供4個(gè)可能的連接唾液酸位點(diǎn)，而二和三觸角寡糖鏈，可以在天門冬酰胺連接位點(diǎn)上替代四觸角形式，通常最多只有2或3個(gè)連接的唾液酸。O-連接的寡糖通常提供2個(gè)唾液酸連接位點(diǎn)。因此，紅細(xì)胞生成素分子可以容納總數(shù)為14的唾液酸殘基，所提供的全部3個(gè)N-連接寡糖都是四觸角的。對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的篩選，以便優(yōu)選地將四觸角鏈加到重組紅細(xì)胞生成素上，因而使唾液酸連接位點(diǎn)數(shù)達(dá)到最多。
尿紅細(xì)胞生成素的N-連接寡糖含有呈α2，3和α2，6鍵合到半乳糖的兩種唾液酸(Takeuchi等人，J.Biol.Chem.263，3657(1988))。一般呈α2，3鍵合的唾液酸在甘露糖α1，6支鏈上加到半乳糖，而呈α2，6鍵合的唾液酸在甘露糖α1，3支鏈上加到半乳糖。加有這些唾液酸的酶(β-半乳糖α2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶和β-半乳糖α2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶)在分別將唾液酸加到甘露糖α1，6和甘露糖α1，3支鏈上是非常有效的。
缺少二氫葉酸還原酶的中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary)(CHO)細(xì)胞通常用作生產(chǎn)包括重組紅細(xì)胞生成素的重組糖蛋白的宿主細(xì)胞。這些細(xì)胞沒有表達(dá)酶β-半乳糖苷α2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶，所以沒有將呈α2，6鍵合的唾液酸加到這些細(xì)胞中所產(chǎn)生的糖蛋白的N-連接的寡糖上。(Mutsaers等人，Eur.J.Biochem.156，651(1986);Takeuchi等人，J.Chromatogr.400，207(1987))。因此，在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的重組紅細(xì)胞生成素缺少呈α2，6鍵合到半乳糖的唾液酸(Sasaki等人，(1987)同上，Takeuchi等人(1987)同上)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，用于生產(chǎn)異構(gòu)體的紅細(xì)胞生成素是在CHO細(xì)胞中制造的，用官能的β-半乳糖苷α2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞以得到呈α2，6鍵合唾液酸結(jié)合到半乳糖上。見Lee等人(J.Biol.Chem.264，13848(1989))該文引入作為參考，以公開產(chǎn)生改性CHO細(xì)胞或其它哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的技術(shù)。
本發(fā)明還包括人紅細(xì)胞生成素的某些類似物。這里所用的詞組“人紅細(xì)胞生成素的類似物”是指在人紅細(xì)胞生成素的氨基酸順序中有一個(gè)或多個(gè)變化的紅細(xì)胞生成素，這種變化導(dǎo)致使唾液酸連接位點(diǎn)數(shù)的增加。通過具有附加、刪除或替代氨基酸殘基的位點(diǎn)導(dǎo)向的誘變基因而產(chǎn)生類似物，這就改變位點(diǎn)以便于糖基化。這種類似物具有比人紅細(xì)胞生成素更多的碳水化合物鏈。
由于紅細(xì)胞生成素分子中的唾液酸含量增加，構(gòu)建了導(dǎo)致生物活性增加的類似物。通過加入糖基化位點(diǎn)，產(chǎn)生唾液酸含量大于人紅細(xì)胞生成素中所測得的唾液酸含量的類似物，這并不影響對(duì)生物活性必要的第二或第三構(gòu)型。最好人紅細(xì)胞生成素類似物具有1、2或3個(gè)N-糖基化或O-糖基化的附加位點(diǎn)。例如，在69位置的亮氨酸以天門冬酰胺取代，得到順序Asn-Leu-Ser，它可以作為N-糖基化的第四位點(diǎn)。這種變化通常使每個(gè)分子提供四個(gè)以下的附加唾液酸。產(chǎn)生附加N-或O-糖基化位點(diǎn)的其它變化實(shí)例是在125位置和127位置的丙氨酸分別變成天門冬酰胺和絲氨酸，在125位置的丙氨酸變成蘇氨酸，以及在124和125位置的丙氨酸分別變成脯氨酸和蘇氨酸。正如本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所理解的，本發(fā)明包括具有糖基化附加位點(diǎn)的人紅細(xì)胞生成素的許多其它類似物。
本發(fā)明還包括由治療有效量的特定異構(gòu)體或異構(gòu)體與適宜的稀釋劑，輔助劑和/或在紅細(xì)胞生成素治療中有用的載體的混合物所組成的藥用組合物。這里所說的“治療有效量”是指對(duì)給定條件和給藥方案來說，具有治療效果的量。紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的給藥最好通過非腸道途徑。特定途徑的選擇取決于要處理的條件。紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的給藥最好制成部分制劑含有適宜載體，如人血清白蛋白，適宜稀釋劑，如緩沖生理鹽水溶液、和/或適宜的輔助劑。所要求的劑量是應(yīng)足以提高病人的血細(xì)胞比容。并且按照要處理?xiàng)l件的嚴(yán)格性、給藥方法以及類似事項(xiàng)而變化。
下面所提供的實(shí)施例將更全面地說明本發(fā)明，但不能認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明范圍的限定。在實(shí)施例的體內(nèi)生物分析所用的紅細(xì)胞生成素標(biāo)準(zhǔn)是重組紅細(xì)胞生成素的標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)部分純化的尿源紅細(xì)胞生成素標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了標(biāo)定。因此只能測得相對(duì)的體內(nèi)特異活性。因?yàn)樗玫募t細(xì)胞生成素標(biāo)準(zhǔn)沒有直接對(duì)任何現(xiàn)有的國際標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校正，所以體內(nèi)特異活性是用“單位/毫升”、“單位/毫克”和“單位/A280”表示，而不用“IU/ml”“IU/mg”和“IU/A280”表示。
實(shí)施例1重組紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的分離按照Lin(同上)所述生產(chǎn)重組紅細(xì)胞生成素。按照共同所有的Lai等人(同上)的實(shí)施例2所述的方法純化在第一和第三異構(gòu)體分離中用作起始材料的重組紅細(xì)胞生成素。按照Lai等人(同上)所述的使用Q-瓊脂色譜改變的方法純化第二和第五異構(gòu)體分離中的起始材料。這些制劑含有與尿源人紅細(xì)胞生成素同樣氨基酸順序的重組紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的混合物，并且主要含有異構(gòu)體9到14。第四異構(gòu)體制劑的起始材料是按Lai等人實(shí)施例2方法用5mM乙酸/1mM甘氨酸/6M尿素洗滌離子交換柱時(shí)所洗脫的材料。該餾分含有小于或等于9個(gè)唾液酸的異構(gòu)體，并且在用于制備的等電點(diǎn)聚焦步驟之前按照Lai等人實(shí)施例2中所述的凝膠過濾色譜法將該餾分再進(jìn)一步純化。具有4～13唾液酸殘基的重組紅細(xì)胞生成素的純化制劑通常作為第六異構(gòu)體制劑的起始材料。該材料按照Lai等人實(shí)施例2所述方法，除了對(duì)離子交換柱進(jìn)行了修改(在PH8.4用氯化鈉梯度液洗脫重組紅細(xì)胞生成素而不用乙酸/尿素洗滌)以外，而進(jìn)行純化，該離子交換柱導(dǎo)致原始材料中存在的大部分異構(gòu)體的滯留。
基本按照LKB Application Note 198的方法，在粒狀凝膠床(Ultrodex，LKB)中對(duì)單個(gè)異構(gòu)體的六種不同制劑進(jìn)行制備等電點(diǎn)聚焦。使用Pharmalyte(Pharmacia)2.5～5兩性電解質(zhì)(Pharmacia)，而且凝膠床含有5M尿素。
在第一制劑中，將在PH7.0的6.8ml 20mM檸檬酸鈉/100mM氯化鈉中的約20mg重組紅細(xì)胞生成素加到凝膠上，并在8瓦聚焦約16小時(shí)。在等電點(diǎn)聚焦后，通過凝膠床的紙觸印跡觀察凝膠上的異構(gòu)體帶。制成印跡，然后通過將它浸漬在更換三次(每次約10分鐘，室溫)的固定溶液(40%甲醇/10%乙酸/10%TCA/3.5%磺酸水楊酸)中而固定，再進(jìn)行一次40%甲醇/10%乙酸(30～60℃)的溶液更換(約10分鐘)的浸漬，在0.125%考馬斯蘭(Coomassie Blue)R-250/40%甲醇/10%乙酸中于60℃染色15分鐘，然后在7.5%甲醇/10%乙酸中退色，以觀測所分離的異構(gòu)體。取出含有異構(gòu)體的粒狀凝膠床區(qū)(約50%樹脂)，加水(約16ml)，然后將漿料注入5.5×24.5英寸的盤中，蒸發(fā)至凈重約40克。該制劑進(jìn)行第二次聚焦并按上述方法制成凝膠觸印。從凝膠床上取出含有六種可辨異構(gòu)體中的每一個(gè)凝膠部分。
為了從凝膠中洗脫異構(gòu)體，將含有10mM Tris-HCl.PH7.0/5mM Chaps的溶液加到每個(gè)異構(gòu)體中以生成漿料。將漿料放入小柱并用Tris-Chaps緩沖液洗滌。收集流出液并分別加到用20%乙醇/10mM Tris-HCl，PH7.0平衡過的，含有Vydac C4反相樹脂的小柱上(敞口柱構(gòu)型)。用20%乙醇/
0mM Tris-HCl，PH7.0，35%乙醇/10mM Tris-HCl，PH7.0和65%乙醇/10mM Tris-HCl，pH7.0逐步展開該柱。經(jīng)65%乙醇/10mM Tris洗脫的餾分，按1∶1用PH7.0 10mM Tris-HCl稀釋，并濃縮，然后使用Centricon-10(Amicon)微濃縮器將緩沖液換成10mM Tris-HCl，PH7.0。該制劑的分析等電點(diǎn)聚焦基本上按照LKB technical note 250所述方法，使用Servalyte 3-5兩性電解質(zhì)(Serva)，在含有5M尿素的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行。
在第二制劑中，將在6.5ml去離子水中的約26mg重組紅細(xì)胞生成素加到凝膠上，并在2.5瓦聚焦35分鐘，在10瓦聚焦約17小時(shí)。在凝膠床上所見到的聚焦蛋白帶按照11個(gè)不同池取出。每個(gè)池都加入7.5ml去離子水，然后按上述方法，對(duì)各池中的20ml上清液進(jìn)行分析等電點(diǎn)聚焦。向每個(gè)池中加入5ml 1.5M Tris-HCl，PH8.8并將漿料分別裝入小柱，使液相流過。用約3體積的0.5M Tris-HCl，PH7洗滌樹脂，洗滌液與流出液合并。用具有10000道爾頓分子量的分離膜(cutoff)的Amicon一次性超濾(disposable ultrafiltration)裝置將洗脫液濃縮并將緩沖液換成20mM檸檬酸鈉/100mM氯化鈉，PH7.0。然后使?jié)饪s的溶液(約0.5ml)通過0.22微米分離膜的醋酸纖維素過濾器。根據(jù)分析等電點(diǎn)聚焦，有5個(gè)池中分別主要含有單一異構(gòu)體10、11、12、13和14。
在第三制劑中，將在21.8ml蒸餾水中的約30mg重組紅細(xì)胞生成素加到凝膠上，在2瓦聚焦25分鐘，10瓦20小時(shí)，15瓦15小時(shí)。觀測到相當(dāng)于各單個(gè)異構(gòu)體蛋白質(zhì)帶，并且從凝膠上移出。將蒸餾水加入凝膠-分離異構(gòu)體中得到一種漿料，并通過分析等電點(diǎn)聚焦分析所得的上清液。將等體積的PH7.2 1M Tris-HCl加到各漿料中，將懸浮液裝入分開的小柱，使液相流經(jīng)小柱，以洗脫異構(gòu)體。用具有10000道爾頓分子量的分離膜的Amicon一次性超濾裝置濃縮各流出液并將緩沖液換成20mM檸檬酸鈉/100mM氯化鈉，PH7.0。分析等電點(diǎn)聚焦凝膠表明所得池中主要含有單一的異構(gòu)體9、10、11、12、13和14。
用作起始材料紅細(xì)胞生成素的第四異構(gòu)體制劑含有異構(gòu)體3-9(按上述方法制備)。在基本按照上文制劑1-3所述進(jìn)行制備等電點(diǎn)聚焦之前，在Rotofor(Bio-Rad，Richmond.CA)液相等電點(diǎn)聚焦室中予分餾兩性電介質(zhì)(Pharmalyte 2.5-5)以產(chǎn)生一種兩性電介質(zhì)范圍更適合于起始材料的較低等電點(diǎn)。通過用與15克尿素混合的6.7ml Pharmalyte 2.5-5進(jìn)行予分餾，并加入純化水使體積達(dá)到50ml。用0.1M磷酸和0.1M氫氧化鈉分別作為陽極電解液和陰極電解液，在Rotofor室內(nèi)在10瓦，1℃條件下分餾該混合物5.5小時(shí)。具有測量PH4.5～約6之間的兩性電介質(zhì)餾分用于平板等電點(diǎn)聚焦。
使用Centrieluter(Amicon，Danvers，MA)和10000MW分離膜Centricon(Amicon)從異構(gòu)體中除去兩性電介質(zhì)，所用參數(shù)如下PH8.8，0.18Tris緩沖液100伏，25～30mA，3小時(shí)。通過采用Sephadex G-25(Pharmacia)的凝膠過濾，將異構(gòu)體的緩沖液換成0.1M氯化鈉。五個(gè)所得的池的分析等電點(diǎn)聚焦表明它們含有異構(gòu)體4、5、6、7和8。異構(gòu)體4具有幾個(gè)帶，這說明它可能已經(jīng)有些降解。
第五異構(gòu)體制劑，是通過在平板等電點(diǎn)聚焦過程中加入予聚焦步驟而進(jìn)行改變。在該改變中，將蛋白不是在電泳前加入兩性電解質(zhì)/尿素/凝膠混合物中，而是按照凝膠床的pH梯度液后加到等電點(diǎn)聚焦裝置中。在予聚焦75分鐘(1500伏-小時(shí))后，將距陰極2.25-4.25cm的部分凝膠床移出，與紅細(xì)胞生成素溶液混合，并加回到凝膠床中。在等電點(diǎn)聚焦之后，將異構(gòu)體10、11、12、13和14從凝膠上洗脫，并用Centricon-10(Amicon)裝置進(jìn)行超濾而從兩性電解質(zhì)中分離。
進(jìn)行予聚焦改變方案以使異構(gòu)體制劑的紫外吸收度特征更類似于起始重組紅細(xì)胞生成素。在光譜特征中這種改進(jìn)可以從分離的異構(gòu)體在280和260nm的吸收度的比率中看到。對(duì)于制劑2和3的異構(gòu)體(未予聚焦)，在280nm處吸收度與260nm吸收度的平均比率(A280/A260)為1.36±0.11，而對(duì)于制劑5和6(予聚焦)的A280/A260平均比率為1.68±0.20。在將異構(gòu)體＃14從計(jì)算中刪去，則對(duì)于制劑2和3，以及制劑5和6，的平均A280/A260比率分別為1.39±0.11和1.74±0.090(異構(gòu)體14的光譜極不正常，因?yàn)樗暮繕O小，因而更易于因兩性電解質(zhì)組份的痕量污染而受到干擾，或者因?yàn)樵谄桨宓入婞c(diǎn)聚焦過程中它距電極最近)。按照Lai等人實(shí)施例2所述的方法(如前所述改變，采用O-瓊脂糖作為陰離子交換樹脂)制備的重組紅細(xì)胞生成素的平均A280/A260比率為1.91±0.04。
如上所述，異構(gòu)體制劑＃6的起始材料是含有異構(gòu)體4～13的重組紅細(xì)胞生成素制劑。按第四制劑方法在Rotofor裝置中對(duì)兩性電解質(zhì)進(jìn)行予聚焦。將具有測量的PH在3.7～4.8之間的兩性電解質(zhì)餾分用于平板等電點(diǎn)聚焦。按實(shí)驗(yàn)＃5對(duì)平板床進(jìn)行予聚焦，在進(jìn)行超過濾(Centricon 10)除去載體兩性電解質(zhì)后得到異構(gòu)體9、10、11、12和13。
實(shí)施例2重組紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的唾液酸含量將按實(shí)施例1所述方法分離的異構(gòu)體和按Lai等人(同上)所述方法純化的紅細(xì)胞生成素(異構(gòu)體9～14的混合物)緩沖液改變?yōu)樵?.10～0.15M氯化鈉中，并根據(jù)Jourdian等人(J.Biol.Chem.214，430(1971))的方法的改變方案分析唾液酸含量。通過用0.35M硫酸在80℃水解30分鐘，將唾液酸殘基從糖蛋白上分裂，并在分析前將溶液用氫氧化鈉中和。為了確定所存在的紅細(xì)胞生成素蛋白的量，使用Bio-Rad提供的分析試劑和微量法步驟，以具有人紅細(xì)胞生成素氨基酸順序的重組紅細(xì)胞生成素作為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行Bradford蛋白分析(Bradford，Anal.Biochem.72，248.(1976))。其結(jié)果示于表1，以每摩爾紅細(xì)胞生成素的唾液酸摩爾數(shù)表示。按照每分子中的唾液酸數(shù)來標(biāo)記異構(gòu)體，其范圍從最低酸的(異構(gòu)體9)到最高酸的(異構(gòu)體13)。異構(gòu)體9-13示于圖1的凝膠道6-10。異構(gòu)體14的量不足以準(zhǔn)確地測量其唾液酸含量。該異構(gòu)體的唾液酸含量是通過它在IEF凝膠上相對(duì)于其它異構(gòu)體的遷移來推算的。沒有測量異構(gòu)體5-8(制劑4)的唾液酸含量，但是同樣可以從其在IEF凝膠上的遷移來推算的。
表1紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體 唾液酸的摩爾數(shù)/紅細(xì)胞生成素的摩爾數(shù)異構(gòu)體13 12.9±0.5異構(gòu)體12 11.8±0.2異構(gòu)體11 11.0±0.2異構(gòu)體10 9.8±0.3異構(gòu)體9 8.9±0.6異構(gòu)體混合物 11.3±0.2(9-14)實(shí)施例3.重組紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的活性按實(shí)施例1所述方法分離的異構(gòu)體，通過在280nm處的吸收度、Bradford蛋白分析和對(duì)紅細(xì)胞生成素的RIA方法來測定重組紅細(xì)胞生成素的存在量。用過缺氧紅細(xì)胞增多癥老鼠的生物分析法(Cotes等人，Nature，191，1065(1961))測定相對(duì)的體內(nèi)生物活性。對(duì)所生成的紅細(xì)胞生成素，使用放射免疫法定量測定所存在的紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)的含量，結(jié)果對(duì)某些異構(gòu)體具有較高的相對(duì)體內(nèi)特異活性，由于含有大量唾液酸的異構(gòu)體的免疫反應(yīng)活性明顯地降低，導(dǎo)致低估紅細(xì)胞生成素的濃度，因而就高估了最負(fù)性異構(gòu)體的相對(duì)體內(nèi)的特異活性。鼠生物分析測定，以單位/毫升表示，除以相應(yīng)的蛋白濃度，得到以單位/毫克紅細(xì)胞生成素多肽表示的體內(nèi)特異活性。這些特異活性示于表2。
在表2中，“n”是單獨(dú)異構(gòu)體制劑的數(shù)目，它與特異活性值有關(guān)。在大多數(shù)情況，在每種異構(gòu)體制劑上進(jìn)行幾種體內(nèi)分析。對(duì)于所有三欄的特異活性計(jì)算是用同樣的體內(nèi)數(shù)據(jù)，通過280nm處的吸收度、由放射免疫測定效力或由Bradford蛋白分析結(jié)果來測定單位/mg紅細(xì)胞生成素多肽。在Bradford蛋白分析中，含有異構(gòu)體9～14的純化的重組紅細(xì)胞生成素用作標(biāo)準(zhǔn)。“n”可能低于用Bradford蛋白分析的計(jì)算結(jié)果，因?yàn)樵谶M(jìn)行Bradford分析時(shí)，有些制劑已沒有了。
按Lai等人(同上)所述方法純化的和含有異構(gòu)體9～14的混合物的紅細(xì)胞生成素用作RIA和體內(nèi)分析的標(biāo)準(zhǔn)。
通過乘以0.807mg紅細(xì)胞生成素多肽/A280可以將以單位/mg紅細(xì)胞生成素多肽所表示的相對(duì)特異活性轉(zhuǎn)換為單位/A280。轉(zhuǎn)換因子是可以通過將紅細(xì)胞生成素的消光系數(shù)(1.345mg/A280)乘以紅細(xì)胞生成素糖蛋白的蛋白含量(約60%重量，Davis等人，Biochemistry 26，2633(1987))，以得到mg紅細(xì)胞生成素多肽/A280而導(dǎo)出來的(即，1.345mg紅細(xì)胞生成素/A280×0.60mg多肽/mg紅細(xì)胞生成素＝0.807mg多肽/A280)。另外，可將以單位/mg紅細(xì)胞生成素多肽表示的特異活性乘以轉(zhuǎn)換因子0.60mg多肽/mg紅細(xì)胞生成素糖蛋白，得到以單位/mg紅細(xì)胞生成素糖蛋白表示的特異活性。
表2中的數(shù)據(jù)還在圖2A、2B和2C中用圖示來達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明紅細(xì)胞生成素的相對(duì)體內(nèi)活性是作為唾液酸含量的函數(shù)而增加直到異構(gòu)體11。異構(gòu)體11～14具有基本上相同的相對(duì)體內(nèi)生物活性。(當(dāng)異構(gòu)體14的濃度用Bradford分析值表示時(shí)，這是最明顯的。Bradford值可能對(duì)異構(gòu)體14較為準(zhǔn)確，因?yàn)樗玫牧客ǔ］^低，用A280測定很困難，并且在前面所討論的最負(fù)形式的RIA中最明顯地降低反應(yīng)性)。具有較多唾液酸的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的較大的相對(duì)體內(nèi)特異活性是極相似的，這由于這些形式的循環(huán)半衰期較長之故。異構(gòu)體9和13用放射性碘(125I)標(biāo)記，并測定它們?cè)谛∈笾械那宄省．悩?gòu)體13的循環(huán)半衰期明顯地長于異構(gòu)體9。
實(shí)施例4通過Q-瓊脂糖色譜選擇重組紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體混合物將按照Lin(同上)所述的方法生產(chǎn)的重組紅細(xì)胞生成素中的細(xì)胞有條件培養(yǎng)基濃縮并對(duì)10mM Tris，PH7.2進(jìn)行透析過濾(diafiltered)。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，通過Bradford微蛋白分析法測定蛋白濃度。將含40mg總蛋白的19.6ml溶液制成有20μM CuSO4的溶液，然后經(jīng)0.45微米分離膜過濾器過濾，并裝在一個(gè)4ml床體積的、用QSepharose Fast Flow(Pharmacia)裝填的柱(1.05cm高×2.2cm直徑)上，該柱已用10mM Tris(PH6.8～7.0)在4℃平衡過。在樣品加入后，用2個(gè)柱體積的同樣緩沖液淋洗柱子。柱流速約為1ml/分鐘。安裝6個(gè)單獨(dú)的柱，利用該方法以選擇限定的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體混合物。
用6到9個(gè)柱體積的低PH緩沖液淋洗柱子，該緩沖液包括柱＃1，150mM乙酸，1mM甘氨酸，20μM CuSO4，用NaOH調(diào)至PH4.7的6M尿素;柱＃2，200mM乙酸，1mM甘氨酸，20μM CuSO4，用NaOH調(diào)至PH4.7的6M尿素;柱＃3，250mM乙酸、1mM甘氨酸，20μM CuSO4，用NaOH調(diào)至PH4.7的6M尿素;柱＃4，300mM乙酸，1mM甘氨酸，20μM CuSO4，用NaOH調(diào)至PH4.7的6M尿素;柱＃5，150mM乙酸，1mM甘氨酸，20μM CuSO4，6M尿素;柱＃6，300mM乙酸，1mM甘氨酸，20μM CuSO4，6M尿素。通過用8至11柱體積的10mM Tris-HCl，55mM NaCl，20μM CuSO4，PH7淋洗每個(gè)柱而使柱的PH增至約PH7。通過用10mM Tris-HCl，140mM NaCl，20μM CuSO4，PH7.0將確定的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體混合物由柱上洗脫。
使用Amicon Centricon-10微濃縮器，將從各柱洗脫的異構(gòu)體收集液濃縮，并將溶劑改為水。這些濃縮收集液的分析等電點(diǎn)聚焦結(jié)果示于圖3。凝膠道1-6分別代表從柱1-6上洗脫的確定的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體混合物。在圖3最右邊的凝膠道中所示的“異構(gòu)體混合物”代表如上所述的加到Q-瓊脂糖柱上的細(xì)胞培養(yǎng)基，用5mM乙酸、1mM甘氨酸、20μM CuSO4、6M尿素淋洗柱子，并按上述方法將紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體混合物從柱上洗脫。在進(jìn)行分析等電點(diǎn)聚焦前，按照Lai等人(同上)所述方法對(duì)洗脫的異構(gòu)體混合物作進(jìn)一步純化。
實(shí)施例5使用低PH梯度液在Q-瓊脂糖上進(jìn)行重組紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的分餾在另一種方法中，使用降低PH和增加離子強(qiáng)度的梯度液分離紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體。按約40mg總蛋白/ml凝膠的比例，將含有培養(yǎng)基的濃縮透析過濾后的紅細(xì)胞生成素裝到Q-瓊脂糖柱上。將柱用約2個(gè)柱體積的10mM Tris HCl(PH7.0)淋洗，然后用約10柱體積的2mM乙酸/1mM甘氨酸/20μM CuSO4/6M尿素(PH約為4.8)淋洗，以除去污染的蛋白和含有少于7個(gè)唾液酸殘基的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體。使用由在6M尿素/1mM甘氨酸/20μM CuSO4中的2mM乙酸開始到40mM乙酸/6M尿素/1mM甘氨酸/20μM CuSO4(約PH4)的梯度液從柱上洗脫含有約8到約12唾液酸的異構(gòu)體。梯度液的總體積約為40柱體積。將每個(gè)約1柱體積的餾分收集在裝有1體積足以使PH達(dá)到6～8.5范圍的Tris緩沖液的容器中，以避免所收集的餾分長時(shí)間處于低PH中。對(duì)等分的餾分進(jìn)行分析等電點(diǎn)聚焦，以監(jiān)測分離。圖4表明，可以通過這種方法實(shí)現(xiàn)異構(gòu)體8-11的分離。將梯度液淋洗結(jié)束時(shí)仍結(jié)合在柱上的異構(gòu)體12-14通過用由10mM Tris-HCl、140mM NaCl，20μM CuSO4(PH7.0)組成的緩沖液洗滌而洗脫。根據(jù)Lai等人的實(shí)施例2中所述，通過反相色譜，接著用凝膠過濾色譜使異構(gòu)體(經(jīng)梯度液分離的或由NaCl溶液洗脫的)沒有污染的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例6具有附加糖基化位點(diǎn)的人紅細(xì)胞生成素的類似物A.人紅細(xì)胞生成素類似物的構(gòu)建在紅細(xì)胞生成素氨基酸順序中已有的和設(shè)想的碳水化合物連接位點(diǎn)的位置示于圖5。生成這些附加糖基化位點(diǎn)的方法概括在圖6A-C并描述于下文。
合成下面的寡核苷酸引物，以用于體外誘變[Asn4，Ser6]EPO5′CGCCCACCAAACCTCAGCTGTGACAGCCGA 3′[Asn9，Ser11]EPO5′ATCTGTACAACCGAAGCCTGGAGAGGT 3′[Asn69]EPO5′GGGCCTGGCCAACCTGTCGGAAG 3′[Asn124]EPO5′TCCCCTCCAGATAATGCCTCAGCTGC 3′[Asn125，Ser127]EPO5′CAGATGCGAACTCATCTGCTCCAC 3′[Asn163，Ser165]EPO5′AGGCCTGCAGGAATGGGAGCAGATGACCAGGTG 3′[Thr125]EPO5′TCCAGATGCGACCTCAGCTGCTC 3′[Pro124，Thr125]EPO5′CCTCCAGATCCGACCTCAGCTGC 3′下面劃線的密碼子表示失配區(qū)，其中括號(hào)內(nèi)所示的氨基酸可取代任何類型的氨基酸。
構(gòu)建〔Asn4，Ser6〕EPO，使得在Asn 4處加上一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。構(gòu)建〔Asn9，Ser11〕EPO，使得在Asn9處加上一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。構(gòu)建〔Asn69〕EPO，使得在Asn69處加上一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。構(gòu)建〔Asn125、Ser127〕EPO，使得在Asn125處加上一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。構(gòu)建〔Thr125〕EPO和〔Pro124、Thr125〕EPO，使得在Thr125處加上一個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。
合成下面的寡核苷酸引物，用于體外誘變[Asn69，Thr71]EPO5′GGGCCTGGCCAACCTGACAGAAGCTGTC 3′[Ser68，Asn69，Thr71]EPO5′CAGGGCCTGTCCAACCTGACAGAAGCTGTC 3′[Asn125，Thr127]EPO5′CAGATGCGAACTCAACGGCTCCAC 3′EPO5′ATGCGAACTCAACGGCTCCACTCACAACAATCACT 3′[Pro124，Asn125，Ser127]EPO5′CCAGATCCAAATTCATCTGCTCCACTC 3′[Pro124，Asn125，Thr127]EPO5′CCAGATCCAAATTCAACAGCTCCACTC 3′[Thr125，Thr126]EPO5′CCAGATGCGACAACAGCTGCTCCA 3′[Pro124，Thr125，Thr126，Thr131]EPO從〔Pro124、Thr125〕EPO cDNA開始，寡核苷酸引物5′AGATCCGACCACCGCTGCTCCAC 3′用于產(chǎn)生〔Pro124、Thr125、Thr126〕EPO。寡核苷酸引物5′TGCTCCACTCACAACAATCACTG 3′用于產(chǎn)生〔Pro124、Thr125、Thr126、Thr131〕EPO。
構(gòu)建〔Asn69，Thr71〕EPO和〔Ser68，Asn69，Thr71〕EPO，以在Asn69處加上一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，并增加在該位點(diǎn)的N-糖基化作用。構(gòu)建〔Asn125，Thr127〕EPO、〔Asn125，Thr127，Thr131〕EPO、〔Pro124，Asn125，Ser127〕EPO和〔Pro124，Asn125，Thr127〕EPO，以在Asn125處加上一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，并增加在該位點(diǎn)的糖基化作用。構(gòu)建〔Thr125，Thr126〕EPO和〔Pro124，Thr125，Thr126，Ser131〕EPO，以在Thr125處加上一個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，并增加在該位點(diǎn)的糖基化作用。
用于體外誘變的紅細(xì)胞生成素DNA源是質(zhì)粒Hu13-一種在pUC8中的人紅細(xì)胞生成素cDNA克隆(Law等人，Proc.Natl.Acad.Sci 83，6920(1986))。用BstEⅡ和BglⅡ限制性酶對(duì)從Hu13衍生的質(zhì)粒DNA進(jìn)行消化，對(duì)所得到的DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用由廠商(BIO101，Inc.)提供的GeneCleanTM合和方法從凝膠中分離810堿基對(duì)(bp)紅細(xì)胞生成素DNA片段。按在共同所有的Lin專利(同上)中所述，質(zhì)粒pBRgHuEPO含有作為插入pBR322衍生物中的BamHⅠ片段的紅細(xì)胞生成素基因組的基因。pBRgHuEPO也用BstEⅡ和BglⅡ消化，并回收6517bp載體片段。連結(jié)兩種片段結(jié)果為IGTl。為了構(gòu)建pEC-1，用BamHⅠ消化pDSVL(如在共同所有的Lin專利中所述(同上)并示于圖5B)，并將從含有紅細(xì)胞生成素cDNA的IGTl中分離的2.8千堿基(Kb)BamHⅠ片段連接進(jìn)去。
為了生成用于體外誘變的單鏈DNA，將pEC-1用BamHⅠ和BglⅡ進(jìn)行消化，并分離820bp紅細(xì)胞生成素cDNA片段。將它連結(jié)進(jìn)m13mp18的BamHⅠ位點(diǎn)中，生成m13-EC-1。按照Kunkel等人(Methods in Enzymol，154，367(1987))和Messing(Methods in Enzymol.101，20(1983))所述方法通過m13-EC-1傳染的大腸桿菌(E.coli)菌株RZ1032的上清液中回收單鏈DNA。為進(jìn)行體外誘變，將約1μg單鏈DNA和0.2pmole按上述一種合成的引物與6ml緩沖液(250mMTris PH7.8，50mM MgCl2和50mM二硫蘇糖醇)混合。為了使引物退火(annealing)為模板，用水將反應(yīng)體積調(diào)到10μl，將混合物加熱至65℃5分鐘，然后冷卻至室溫。為延長反應(yīng)，加入各2.5ml的dTTP、dATP、dGTP、dCTP和ATP(均為10μM)，然后再加入1μl(1單位)的大腸桿菌DNA聚合酶(Klenow片段)和1μl(1單位)的T4DNA連接酶。然后將混合物在14℃保溫過夜，并按所述(Messing同上文)用于轉(zhuǎn)換大腸桿菌JM109(Yanisch-Perron等人，Gene 33，103(1985))。
為通過差式雜化來鑒定突變克隆，將營養(yǎng)瓊脂上的斑轉(zhuǎn)入基因篩選濾器(New England Nuclear)中。將濾器在熱燈下干燥，然后在含有1%SDS的6x SSC中在60℃保溫1小時(shí)。為了進(jìn)行雜化，用T4多核苷酸激活酶和γ-32P-標(biāo)記的ATP對(duì)上述寡核苷酸引物(8pmole)進(jìn)行末端標(biāo)記并用濾器在6X SSC、0.5%SDS和100mg/ml鮭精子(salmonsperm)DNA培養(yǎng)過夜，其中對(duì)〔Asn124〕突變的培養(yǎng)溫度為37℃，對(duì)〔Asn4，Ser6〕突變?yōu)?5℃，對(duì)〔Thr125〕和〔Pro124，Thr125〕突變?yōu)?5℃，對(duì)〔Asn9，Ser11〕和〔Asn163，Ser165〕突變?yōu)?0℃。第二天，在室溫下用6X SSC將濾器洗滌三次，并進(jìn)行放射自顯影法。如果需要，可在升高的溫度下用6X SSC洗滌濾器，直到對(duì)具有各種類型紅細(xì)胞生成素cDNA順序的斑中可檢出少量雜化或沒有雜化。在這些條件下，鑒定出具有陽性雜化信號(hào)的克隆，并再轉(zhuǎn)染入JM109內(nèi)，以分離純化的克隆。雙脫氧(Dideoxy)鏈末端順序分析表明，對(duì)天冬酰氨、絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸殘基有突變存在。
通過煮沸法(Holmes等人，Anal.Biochem，117，193(1981))從JM109轉(zhuǎn)染細(xì)胞中回收載帶〔Asn4，Ser6〕，〔Asn9，Ser11〕，〔Asn69〕，〔Asn124〕，〔Asn125〕，〔Ser127〕，〔Asn163，Ser165〕〔Thr125〕和〔Pro124，Thr125〕改變的雙鏈m13EC-1DNAs。用BstEⅡ和XhoⅡ消化DNAs并分離810bp紅細(xì)胞生成素DNA片段。用BstEⅡ消化pEC-1，接著用BglⅡ進(jìn)行部分消化，并在60℃在10mM Tris，PH8中用細(xì)菌堿性磷酸酶將所得片段的5′末端脫磷酸60分鐘。分離缺少810bp BstEⅡ-BglⅡ片段的7kb載體片段并連接到上述紅細(xì)胞生成素片段中。所得質(zhì)粒(指定的pEC-X，其中X鑒別特定突變)在所示位置上含有具有改變氨基酸殘基的人紅細(xì)胞生成素。
通過電擊穿，將人紅細(xì)胞生成素順序的cDNA克隆和相當(dāng)于〔Asn4，Ser6〕，〔Asn9，Ser11〕，〔Asn69〕，〔Asn124〕，〔Asn125，Ser127〕，〔Asn163，Ser165〕，〔Thr125〕和〔Pro124，Thr125〕紅細(xì)胞生成素cDNA克隆的類似物轉(zhuǎn)入COS-1細(xì)胞(ATCC No CRL-1650)中。COS-1細(xì)胞由半?yún)R合盤(semi-confluent dishes)得到，用培養(yǎng)基(含有5%胎牛血清和1%L-谷氨酰胺/青霉素/鏈霉素(Irvine Scientific)的DDulbecco改性基本培養(yǎng)基)洗滌，并按4×106細(xì)胞/ml重新懸浮。將1ml細(xì)胞轉(zhuǎn)入一電擊穿杯(Bio-Rad)中，在100～200μg載體DNA和2～20μg編碼紅細(xì)胞生成素類似物的質(zhì)粒DNA存在下，在25微法拉和1600伏的條件下，用Bio-Rad Gene PulserTM進(jìn)行電擊穿。將電擊穿的細(xì)胞按每60mm組織培養(yǎng)皿，在5ml培養(yǎng)基中平鋪2×106細(xì)胞。平鋪2～4小時(shí)后，用5ml新鮮的培養(yǎng)基代替原培養(yǎng)基。在電擊穿3-5天后收集有條件的培養(yǎng)基。
B.紅細(xì)胞生成素類似物活性的分析按照Egrie等人(同上)所述進(jìn)行放射免疫分析。通過過缺氧紅細(xì)胞增多癥鼠的生物分析(Cotes等人同上)測定紅細(xì)胞生成素類似物的體內(nèi)生物活性。
按照Iscove等人(J.Cell Physiol.83，309～320(1974))所述方法，加以修改，通過紅細(xì)胞系菌落形成測定法測定體外紅細(xì)胞生成素的活性。在ficoll-paque緩沖墊層上將人骨髓細(xì)胞的單核細(xì)胞進(jìn)行部分純化，并在平鋪之前在Iscove培養(yǎng)基中洗滌，以除去粘連的細(xì)胞。培養(yǎng)基含有0.9%甲基纖維素，并不含有任何牛血清白蛋白。在培養(yǎng)8～10天后，計(jì)算紅細(xì)胞系菌落。
在粗制的COS上清液中，通過RIA和通過紅細(xì)胞系菌落形成測定，對(duì)按節(jié)A部分所述的在COS細(xì)胞中轉(zhuǎn)染和表達(dá)的紅細(xì)胞生成素類似物進(jìn)行分析。人順序紅細(xì)胞生成素具有一種可與由前面所述的分析法所測定的RIA-活性相比較的體外活性。類似物〔Asn69〕EPO、〔Asn125，Ser127〕EPO，〔Thr125〕EPO和〔Pro124，Thr125〕EPO具有一種可與RIA活性相比較的體外活性，并且證實(shí)具有附加的碳水化合物鏈(如在C部分中所測定的)。將這些類似物，通過編碼紅細(xì)胞生成素類似物的cDNA克隆轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞中，純化紅細(xì)胞生成素類似物并測量已純化類似物的體內(nèi)生物活性而作進(jìn)一步的分析。
C.Western印跡分析將按A部分中所述，用紅細(xì)胞生成素類似物cDNA轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞的含5～20單位的一定體積量的上清液，在室溫下，使用兔抗紅細(xì)胞生成素的多克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀過夜。將20～80μl1∶1的蛋白A-瓊脂糖的磷酸鹽緩沖的生理鹽水(PBS)加入免疫沉淀中，并在室溫培養(yǎng)1小時(shí)。離心樣品，用PBS洗滌，并指出，要用N-聚糖酶處理沉淀，以除去N-連接的碳水化合物鏈。通過15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳方法分析樣品，將樣品轉(zhuǎn)到硝基纖維素，并按照所述方法(Burnette等人，Anal.Biochem，112，195～203(1981);Elliot等人，Gene 79;167～180(1989))，使用鼠抗紅細(xì)胞生成素單克隆抗體的混合物進(jìn)行Western分析。一種這樣的抗體，9G8A，描述于Elliot等人的文獻(xiàn)((1989)Blood 74，Supp.1，A，1228)中。
用〔Asn69〕EPO和〔Asn125，Ser127〕EPO cDNA轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞上清液的分析表明，與人順序紅細(xì)胞生成素相比較，蛋白質(zhì)尺寸增加。這種增加的尺寸說明有附加的N-連接碳水化合鏈(圖7)。使用N-聚糖酶處理用〔Thr125〕EPO和〔Pro124，Thr125〕EPO cDNA轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的上清液表明，與人順序紅細(xì)胞生成素相比較，蛋白尺寸增加。這種增加的尺寸表明有附加的O-連接碳水化合物鏈(圖8)。
D.紅細(xì)胞生成素類似物異構(gòu)體的分離按A部分所述構(gòu)建紅細(xì)胞生成素類似物〔Thr125〕EPO。通過使用BstEⅡ和BglⅡ裂解含有〔Thr125〕突變體的質(zhì)粒pEC而分離載有〔Thr125〕突變體的810bp紅細(xì)胞生成素cDNA片段，并將片段連接到pDEC△-一種pDSα2的衍生物。在共同所有的美國專利申請(qǐng)501904中對(duì)pDSα2進(jìn)行了一般性的描述，該專利引入本文作為參改。通過下面的步驟從pDSα2得到pDEC△。
(1)通過用HindⅢ消化pDSα2 DNA，用大腸桿菌DNA聚合酶(Klenow片段)和dNTPs處理HindⅢ結(jié)合末端，并重新連接鈍端載體，而消除pDSα2的HindⅢ位點(diǎn)。所得質(zhì)粒是pDSα2△H。
(2)用SalⅠ消化pDα2△H，并用一個(gè)聯(lián)接到連接信號(hào)的3′端上的SalⅠ連接子，將具有SV40連接信號(hào)的合成寡核苷酸與之連接。合成的寡核苷酸具有以下順序5′TCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCTGCAACAAGCTGGTCGACC 3′所產(chǎn)生的質(zhì)粒是pDSα2△H連接臂。
(3)用SalⅠ消化pDSα2△H連接臂，并通過用T4 DNA聚合酶和dNTP處理結(jié)合端以純化末端。用同樣的方法使820bp BamHⅠ-BglⅡ人紅細(xì)胞生成素cDNA片段鈍化末端，并與質(zhì)粒連接。所得質(zhì)粒是pDEC。
(4)用KpnⅠ和PvuⅡ消化pDEC，通過用綠豆核酸酶處理結(jié)合端而鈍化末端。將該質(zhì)粒重新連接以消除在質(zhì)粒pDEC△中所得到的已切除的KpnⅠ-pvuⅡ片段。
將含有〔Thr125〕紅細(xì)胞生成素cDNA的質(zhì)粒pDEC△轉(zhuǎn)染入缺乏DHFR的CHO細(xì)胞中。用10000道爾頓分子量的分離膜將770ml CHO細(xì)胞有條件的培養(yǎng)基濃縮，并在10mM Tris-HCl(PH8.6)中進(jìn)行透析過濾，直到最終體積為34ml。將17ml等分量的濃縮液裝到Q-瓊脂糖快速流動(dòng)柱(柱床體積為5ml)上，該柱用相同的緩沖液平衡過，并用在10mM Tris-HCl(PH8.6)中的0～250mM NaCl的線性梯度液洗脫。不管沒有處理的或用N-聚糖酶消化的等分柱餾分都通過SDS-PAGE或IEF進(jìn)行分析，以餾分中的異構(gòu)體和/或碳水化合物組分作為基礎(chǔ)制備池(Pool)(標(biāo)為2，3和4)。將每個(gè)池加到一個(gè)Vydac C4柱(214TPB2030;1cm直徑;柱床體積1.8～2.5ml;0.34ml/分)并用2柱體積在10mM Tris-HCl(PH7.0)中的20%乙醇洗滌。用20～94%乙醇、10mM Tris(PH7.0)的線性梯度液洗脫柱子。收集流出液，用10mM Tris-HCl(PH7.0)稀釋，并裝到Q-瓊脂糖快速流動(dòng)柱中。接著，在10mM Tris-HCl(PH7.0)中洗滌后，用20mM檸檬酸鈉、250mM NaCl(PH7.0)洗脫樣品。通過IEF分析純化的〔Thr125〕池，結(jié)果示于圖9中。如上所述(Cotes等人，同上)對(duì)EPO類似物進(jìn)行體內(nèi)生物活性的分析。
當(dāng)描述本發(fā)明時(shí)，其中認(rèn)為是其優(yōu)選方案，但是它并不限于所公開的方案，正相反，本發(fā)明包括權(quán)利要求書的精神和范圍內(nèi)所包括的各種改變和等同物，權(quán)利要求的范圍是按照最寬的解釋，以便包括全部這類改變和等同物。
權(quán)利要求
1.一種紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體。
2.按照權(quán)利要求1的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體，其中所說的異構(gòu)體是在非人的真核宿主細(xì)胞中表達(dá)外源DNA順序的產(chǎn)物。
3.按照權(quán)利要求1的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體，其中所說異構(gòu)體包含具有1-165或1～166人紅細(xì)胞生成素氨基酸順序的紅細(xì)胞生成素。
4.按照權(quán)利要求1的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體，每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子具有特定數(shù)的唾液酸，所說的數(shù)選自1～14。
5.按照權(quán)利要求1的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體，每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子具有大于14的唾液酸。
6.按照權(quán)利要求1的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體，每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子具有14個(gè)唾液酸。
7.按照權(quán)利要求1的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體，每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子具有13個(gè)唾液酸。
8.按照權(quán)利要求1的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體，每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子具有10個(gè)唾液酸。
9.按照權(quán)利要求2的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體，其中所說的真核宿主細(xì)胞為CHO細(xì)胞。
10.一種可藥用的組合物，包括一種治療有效量的權(quán)利要求1所說的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體和藥物上可用的稀釋劑、輔助劑或載體。
11.一種組合物，含有4種以下的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的混合物。
12.一種組合物，包括每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子具有小于12個(gè)唾液酸的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的混合物。
13.按照權(quán)利要求12的一種組合物，該組合物含有每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子具有9、10和11唾液酸的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的混合物。
14.一種組合物，含有每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子具有大于11唾液酸的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的混合物。
15.按照權(quán)利要求14的組合物，該組合物含有每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子具有13-14唾液酸的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的混合物。
16.紅細(xì)胞生成素，基本上由每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子具有特定數(shù)唾液酸的紅細(xì)胞生成素分子所構(gòu)成。
17.紅細(xì)胞生成素，基本上由每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子具有特定數(shù)唾液酸的紅細(xì)胞生成素分子所構(gòu)成，該數(shù)選自1～14。
18.紅細(xì)胞生成素，含有每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子具有大于14唾液酸的紅細(xì)胞生成素分子。
19.按照權(quán)利要求16的紅細(xì)胞生成素，每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子具有14個(gè)唾液酸。
20.按照權(quán)利要求16的紅細(xì)胞生成素，每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子具有13個(gè)唾液酸。
21.按照權(quán)利要求16的紅細(xì)胞生成素，每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子具有10個(gè)唾液酸。
22.按照權(quán)利要求16的紅細(xì)胞生成素，其中所說的分子是在非人真核宿主細(xì)胞中外源DNA順序表達(dá)的產(chǎn)物。
23.按照權(quán)利要求15的紅細(xì)胞生成素，其中所說的紅細(xì)胞生成素具有人紅細(xì)胞生成素氨基酸順序。
24.一種可藥用的組合物，包括一種治療有效量的權(quán)利要求15的紅細(xì)胞生成素和藥物上可用的稀釋劑，輔助劑或載體。
25.一種組合物，含有每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子具有低于4個(gè)特定數(shù)的唾液酸的紅細(xì)胞生成素分子的混合物。
26.一種組合物，含有每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子具有少于12個(gè)唾液酸的紅細(xì)胞生成素分子的混合物。
27.一種組合物，含有每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子具有大于11個(gè)唾液酸的紅細(xì)胞生成素分子的混合物。
28.一種組合物，含有每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子具有13～14個(gè)唾液酸的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的混合物。
29.制備紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的方法，包括下列步驟將純化的紅細(xì)胞生成素進(jìn)行制備等電點(diǎn)聚焦，從凝膠上洗脫單獨(dú)的異構(gòu)體。
30.一種制備每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子具有高于予定數(shù)唾液酸的紅細(xì)胞生成素分子的混合物的方法，包括將含有紅細(xì)胞生成素的材料進(jìn)行離子交換色譜。
31.一種制備每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子具有高于予定數(shù)唾液酸紅細(xì)胞生成素分子的混合物的方法，包括將含有紅細(xì)胞生成素的材料進(jìn)行色譜聚焦。
32.一種增加哺乳動(dòng)物血細(xì)胞比容水平的方法，包括給藥治療有效量的權(quán)利要求26的組合物。
33.一種人紅細(xì)胞生成素的類似物，選自以下一組〔Asn69〕EPO;〔Asn125，Ser127〕EPO;〔Thr125〕EPO;和〔Pro124，Thr125〕EPO。
34.一種純化和分離的DNA順序，該順序基本上由編碼人紅細(xì)胞生成素類似物的DNA順序構(gòu)成，該類似物選自以下一組〔Asn69〕EPO;〔Asn125，Ser127〕EPO;〔Thr125〕EPO;和〔Pro124，Thr125〕EPO。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種每個(gè)紅細(xì)胞生成素分子具有特定數(shù)唾液酸的紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體。本發(fā)明也公開了這些異構(gòu)體的混合物，含有這些異構(gòu)體或異構(gòu)體混合物的藥用組合物，以及獲得該紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的方法。
文檔編號(hào)A61K31/00GK1051936SQ9010944
公開日1991年6月5日 申請(qǐng)日期1990年10月12日 優(yōu)先權(quán)日1989年10月13日
發(fā)明者托馬斯·韋恩·斯特里克蘭, 托馬斯·愛德華·伯恩, 史蒂文·喬治·埃利奧特 申請(qǐng)人:安姆根有限公司