專利名稱：：結(jié)合使用可溶性補(bǔ)體受體-1(scr1)和脒基苯基或脒基萘基酯治療炎癥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及對(duì)抑制補(bǔ)體激活有協(xié)同作用的蛋白酶抑制劑和人可溶性補(bǔ)體受體1的治療組合物。所述組合物可用于治療與補(bǔ)體激活有關(guān)的炎癥或免疫性疾病。1型補(bǔ)體受體(CR1)存在于多種細(xì)胞的膜上，如紅細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、B細(xì)胞、某些T細(xì)胞、脾分枝狀濾泡細(xì)胞、腎小球足狀突細(xì)胞。CR1能與補(bǔ)體成分C3b和C4b結(jié)合，因此也被稱作C3b/C4b受體?，F(xiàn)在已知道CR1的一種異型的結(jié)構(gòu)組成和初級(jí)序列(Klickstein等，1987，J.Exp.Med.1651095-1112；Klickstein等，1988，J.Exp.Med.1681699-1717；Hourcade等，1988，J.Exp.Med.1681255-1270，WO89/09220，WO91/05047)。它是由30個(gè)短的同等重復(fù)片段(SCRs)組成，每個(gè)重復(fù)片段包含大約60-70個(gè)氨基酸。對(duì)于每個(gè)SCR，在其平均65個(gè)氨基酸中，大約有29個(gè)是保持不變的。有人認(rèn)為，每個(gè)SCR通過(guò)二硫鍵形成一個(gè)三維的三環(huán)結(jié)構(gòu)，在第三和第一個(gè)半胱氨酸基團(tuán)、以及第四和第二個(gè)半胱氨酸基團(tuán)之間形成二硫鍵。并且，CR1進(jìn)一步排列形成四條長(zhǎng)的同型重復(fù)片段(LHRs)，每7個(gè)SCR形成一條。按照一個(gè)領(lǐng)頭序列，CR1分子的構(gòu)成順序是N-端LHR-A，其后是兩個(gè)重復(fù)片段，LHR-B和LHR-C，下面是最大的C-端LHR-D，緊接著是另外兩個(gè)SCRs，25個(gè)殘基構(gòu)成的所謂轉(zhuǎn)移膜區(qū)域，43個(gè)殘基構(gòu)成的細(xì)胞質(zhì)尾部。幾種可溶性CR1片段已經(jīng)借助DNA重組技術(shù)通過(guò)從被表達(dá)的DNA中切除轉(zhuǎn)移膜區(qū)域產(chǎn)生(WO89/09220，WO91/05047)。可溶性CR1片段具有功能活性，能與補(bǔ)體成分C3b和/或C4b結(jié)合，并證明具有由其所包含的區(qū)域決定的因子1的輔助因子活性。這種結(jié)構(gòu)在體外可抑制與補(bǔ)體相關(guān)的功能，如嗜中性細(xì)胞氧化進(jìn)發(fā)、補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血作用、以及C3a和C5a的產(chǎn)生。一個(gè)特定的可溶性結(jié)構(gòu)sCR1/pBSCR1c在體內(nèi)逆向被動(dòng)阿圖斯反應(yīng)中還表現(xiàn)了活性(WO89/09220，WO91/05047，Yeh等，1991，J.Immunol.146250-256)，對(duì)后部缺血性心肌炎癥和心肌壞死具有抑制作用(WO89/09220，WO91/05047，Weisman等，Science，1990，249145-151；Dupe.R.等，Thrombosis＆Haemostasis(1991)65(6)695)，還能提高移植器官組織的存活率(Pruitt&Bollinger，1991，J.Surg.Res.50350，Pruitt等，1991Transplantation52868)，在幾種疾病的動(dòng)物模型中，對(duì)補(bǔ)體激活表現(xiàn)出治療性抑制作用，例如對(duì)于肺損傷(Rabinovici等，1992J.Immunol.1491744-1750，Mulligan等，1992，J.Immunol.1483086-3092)、腸道局部缺血(Hill等，1992FASEBJ.6A1049)和急性心肌梗塞(Weisman等，1990Science249146-151，Dupe等，1991，同上)都有治療作用。在許多病例中，治療這些動(dòng)物模型疾病所需要的sCR1的劑量較大(大于5mg/kg)。因?yàn)閟CR1是一種借助哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)所產(chǎn)生的生物藥劑產(chǎn)品，因此希望能降低使用劑量，從而降低治療費(fèi)用。已知某些羧酸的脒基苯基和脒基萘基酯是補(bǔ)體激活作用的抑制劑，并且具有抗胰蛋白酶、抗血纖維蛋白溶酶、抗激肽釋放酶和抗凝血酶活性(GB2095-239，GB2083-818)。GB2083818公開(kāi)了式(A)的化合物其中，Z代表-(CH2)a-、-(CH2)b-CH(R3)-、-CH＝C(R)4-或-O-CH(R4)-，這里a是0、1、2或3，b是0、1或2，R3是具有1至4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，或者是具有3至6個(gè)碳原子的環(huán)烷基，R4是氫原子或者具有1至4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，其中-CH(R3)-、＝C(R4)-或-CH(R4)-部分與-COO基團(tuán)連接；R1和R2可以相同或不相同，它們各自代表氫原子、具有1至4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基、-O-R5、-S-R5、-COOR5、-COR6、-O-COR7、-NHCOR7、-(CH2)c-NR8R9、-SO2NR8R9、NO2、CN、鹵素、CF3、亞甲二氧基、或其中c是0、1或2，R5是氫原子、具有1至4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基、或芐基，R6是氫原子或者具有1至4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，R7是具有1至4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，R8和R9可以相同或不同，各自是氫原子、具有1至4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基、或氨基保護(hù)基，R10是氫原子、二甲基或CF3。GB2095239公開(kāi)了通式(B)的化合物其中，R11代表具有1至6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基、具有2至6個(gè)碳原子和1至3個(gè)雙鍵的直鏈或支鏈鏈烯基、R13-(CH2)d-、R14-(CH2)e-、其中R13是具有3至6個(gè)碳原子的環(huán)烷基或具有3至6個(gè)碳原子和1或2個(gè)雙鍵的環(huán)鏈烯基，d是0、1、2或3，R14是氨基或胍基或者被保護(hù)的氨基或胍基，e是1至5的數(shù)，R15和R16可以相同或不同，各自是氫原子、具有1至4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基、-OR17、亞甲二氧基、-SR17、-COOR17、-COR18、-OCOR19、-NHCOR19、-(CH2)f-NR20R21(其中f是0、1、2)、-SO2NR20R21、鹵原子、-CF3、NO2、CN、或其中，R17是氫原子、具有1至4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基或芐基，R18是氫原子、具有1至4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，R19是具有1到4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，R20和R21可以相同或不同，各自是氫原子、具有1至4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基或氨基保護(hù)基團(tuán)，R22是O、S或NH，R23是2′，3′-二甲基或3′-CF3基，Y是-(CH2)g-(其中g(shù)是0、1、2或3)、-(CH2)h-CHR24-(其中h是0、1或2)或-CH＝CR25-，R24是具有1至4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，并且CHR24部分的碳原子與COO基連接，R25是氫原子或具有1至4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，并且CR25部分的碳原子與COO基連接；R12代表-R25、-OR26、-COOR27、一個(gè)或兩個(gè)相同的鹵原子、-NH2、-SO3H、或其中R26是具有1至4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，R27是氫原子或具有1至4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，R28是氫原子或胍基。還知道另一些羧酸的脒基苯基酯能抑制凝固路徑中的蛋白酶(A.D.Turner等，1986Biochem.254929-35)，并且也已經(jīng)用于可逆性地酰基化血纖維蛋白溶解酶的活性中心(US4,285,932、US4,507,282、EP0,297,882，R.A.G.Smitn等，1985ProgressinFibrinolysisVII227-231)。US4,285,932、US4,507,283和EP0,297,882公開(kāi)了式(C)化合物其中Rx是可被一或兩個(gè)選自下述基團(tuán)的取代基任意取代的苯甲?；u素、C1-6烷基、C2-6鏈烯基、C1-6烷氧基、C1-6鏈烷酰氧基、C1-6鏈烷酰氨基、氨基、二甲氨基或胍基；或者是可被C1-6烷基、呋喃基或苯基任意取代的丙烯酰基，其中苯基部分可被C1-6烷基任意取代。因此，這類化合物并非補(bǔ)體蛋白酶體系的特異性抑制劑。已經(jīng)有人描述了CR1相關(guān)多肽與某些有機(jī)化合物構(gòu)成的協(xié)同組合物(WO92/10205)。本發(fā)明提供了一種用于治療與炎癥或不適當(dāng)?shù)难a(bǔ)體激活有關(guān)的疾病或失調(diào)的方法，該方法包括對(duì)需要治療的哺乳動(dòng)物施與有效劑量的可溶性CR1蛋白和有效劑量的具有補(bǔ)體抑制活性的式(I)的脒基苯基酯或脒基萘基酯及其藥學(xué)上可以接受的鹽其中，A是可以被下述基團(tuán)任意取代的苯基C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4烷氧羰基、鹵素、NH2、磺?；⒈郊柞；駽1-4烷基苯甲酰氨基、或者萘基；B是可以被下述基團(tuán)之一任意取代的CH2＝CH-C1-6烷基、苯基及被C1-6烷基取代的苯基；被一個(gè)或兩個(gè)各自選自下述基團(tuán)的取代基任意取代的苯基鹵素、C1-6烷基、C2-6鏈烯基、C1-6烷氧基、C1-6鏈烯酰氧基、C1-6鏈烷酰氨基、氨基、二甲氨基或胍基；或者萘基。A優(yōu)選為被鹵素在2或3位任意取代的苯基，并且脒基取代基位于苯環(huán)的4位。B優(yōu)選為4位被C1-4烷氧基取代且可進(jìn)一步被鹵素任意取代的苯基。最優(yōu)選的情況是B是4-甲氧基苯基，A是4位被脒基取代的苯基或2-溴苯基。適用的鹵素的實(shí)例包括氯和溴。藥學(xué)上可接受的鹽可以通過(guò)藥學(xué)上可以接受的酸來(lái)形成，例如，馬來(lái)酸、鹽酸、氫溴酸、磷酸、乙酸、富馬酸、水楊酸、檸檬酸、乳酸、扁桃酸、酒石酸、甲磺酸和草酸。在優(yōu)選的方面中，用于復(fù)合療法的可溶性CR1成分是由核酸媒介體編碼的，此核酸媒介體選自pBSCR1c、pBSCR1s、pBM-CR1c、pBSCR1c/pTCSgpt和pBSCR1s/pTCSgpt，特別是由pBSCR1c/pTCSgpt得到的媒介體(WO89/09220)。選擇每個(gè)化合物的用量以使在標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)體測(cè)定法中抑制50％致敏紅細(xì)胞溶血所需的各成分的濃度與在同樣的測(cè)定中所需要的單個(gè)成分的濃度相比要低。這種作用效力的增加可由下面詳述的協(xié)同作用因子來(lái)解釋。本發(fā)明還提供了可溶性CR1蛋白質(zhì)和具有補(bǔ)體抑制活性的脒基苯基酯或脒基萘基酯在制備用于治療與炎癥或不適當(dāng)?shù)难a(bǔ)體激活有關(guān)的疾病或失調(diào)的藥物中的應(yīng)用。這些化合物可以按照一般的途徑給藥，例如，靜脈內(nèi)輸注或單次快速靜脈注射，也可以合在一起給藥，或者按照任何順序依次給藥。當(dāng)化合物合在一起給藥時(shí)，優(yōu)選以包含兩種成分的藥物組合物形式給藥。因此，從更進(jìn)一步的意義上來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供了含有可溶性CR1蛋白質(zhì)和具有補(bǔ)體抑制活性的脒基苯基或脒基萘基酯以及藥學(xué)上可以接受的載體的藥物組合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物可以按照常規(guī)方法配制成用于人靜脈內(nèi)給藥的藥劑。因此，再進(jìn)一步來(lái)說(shuō)，本發(fā)明還提供了配制本發(fā)明的藥物組合物的方法，該方法包括將可溶性CR1蛋白質(zhì)和式(I)的脒基苯基或脒基萘基酯及其藥學(xué)上可以接受的鹽的混合物進(jìn)行混合。本發(fā)明還提供了一種治療與炎癥或不適當(dāng)?shù)难a(bǔ)體激活有關(guān)的疾病或失調(diào)的方法，該方法包括對(duì)需要這種治療的患者施與治療上有效劑量的本發(fā)明組合物。在上述治療方法中，治療對(duì)象優(yōu)選人。用于治療上述疾病或失調(diào)的蛋白質(zhì)的有效劑量范圍是0.01-100mg/kg，優(yōu)選0.1-10mg/kg。用于治療上述疾病或失調(diào)的酯的有效劑量范圍是0.05-100mg/kg，優(yōu)選0.05-10mg/kg。所述蛋白質(zhì)對(duì)酯的重量比例優(yōu)選在1∶1至1∶20的范圍內(nèi)。組合物通常包含治療活性劑量的蛋白質(zhì)和酯以及藥學(xué)上可以接受的賦形劑或載體，例如鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖或水。所述組合物還可以含有特殊的穩(wěn)定劑如糖，包括甘露糖和甘露糖醇等，以及用于注射組合物的局部麻醉劑(包括例如利多卡因)。包含裝有一種或多種藥物組合物成分的一個(gè)或多個(gè)包裝物的藥劑盒也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明還提供了治療血栓形成性疾病的方法，特別是治療人或非人動(dòng)物的心肌梗塞的方法，該方法包括對(duì)病人施與本發(fā)明的組合物。本發(fā)明還進(jìn)而提供了一種治療成年人或非人成年動(dòng)物的呼吸窘迫綜合征(ARDS)的方法，該方法包括對(duì)病人施用本發(fā)明的組合物。本發(fā)明還提供了一種延緩接受移植的人或非人動(dòng)物的超急性同種移植排斥作用或超急性異種移植排斥作用的方法，該方法包括施用本發(fā)明的組合物。本發(fā)明提供的方法和組合物可用于治療由補(bǔ)體介導(dǎo)的或與補(bǔ)體有關(guān)的疾病，包括(但不局限于)下列疾病與補(bǔ)體有關(guān)的疾病和失調(diào)神經(jīng)性失調(diào)多發(fā)性硬化癥中風(fēng)急性熱病性多種神經(jīng)炎綜合征刨傷性腦損傷帕金森氏病過(guò)敏性腦炎與不適當(dāng)?shù)幕虍惓５难a(bǔ)體激活有關(guān)的失調(diào)血液透析并發(fā)癥超急性同種移植排斥角膜移植排斥異種移植排斥在用白介素-2治療過(guò)程中由其誘發(fā)的毒性夜間陣發(fā)性血紅蛋白尿炎性疾病自身免疫性疾病炎癥節(jié)段性回腸炎成年性呼吸窘迫綜合征溫度性損傷，包括燒傷和凍瘡眼色素層炎局部缺血后再灌注性疾病心肌梗塞氣球血管成形術(shù)誘發(fā)的疾病在心肺旁路手術(shù)或腎血液透析中的壓縮后綜合征腎局部缺血癥肝局部缺血癥感染性疾病或膿毒病多發(fā)性器官衰竭膿毒性休克免疫復(fù)合病癥和自身免疫性疾病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎全身性紅斑狼瘡(SLE)SLE性腎炎增生性腎炎腎小球腎炎溶血性貧血重癥肌無(wú)力生殖紊亂抗體或補(bǔ)體介導(dǎo)的不育癥實(shí)驗(yàn)材料BRL55730是1型可溶性補(bǔ)體受體，來(lái)源于CHO細(xì)胞中的質(zhì)粒pBSCR1c/pTCSgpt的表達(dá)產(chǎn)物(WO89/09220)。BRL24894A(APAN)是4′-甲氧基苯甲酸4-脒基苯酯鹽酸鹽(EP-0009879)。BRAPAN是4′-甲氧基苯甲酸4-脒基-2-溴苯酯鹽酸鹽(實(shí)例3)。實(shí)驗(yàn)方法通過(guò)羊紅細(xì)胞溶血反應(yīng)測(cè)定抗補(bǔ)體活性補(bǔ)體抑制劑的功能活性可以通過(guò)測(cè)定對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的羊紅細(xì)胞溶血的抑制作用來(lái)評(píng)價(jià)，所用羊紅細(xì)胞事先須用兔抗體(從DiamedixCorporation，Miami，USA得到)致敏。人血清用0.1M、pH7.4的Hepes緩沖液(含0.15MNaCl)稀釋成1∶125或1∶35.7，人血清是補(bǔ)體的來(lái)源，實(shí)際上是從自愿者的混合血清中制備的，方法如Dacie&Lewis1975年所述(PracticalHaematology5thEdition，ChurchillLivingstone，EdinburghandNewYork，PP3-4)。簡(jiǎn)而言之，先將血液溫?zé)岬?7℃保持5分鐘，除去血凝塊，用離心法將余下的血清澄清。然后將血清分裝成小量的等分，在-196℃下貯存。需要時(shí)先將此小量等分血清化凍，臨用前用Hepes緩沖液稀釋。對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的致敏羊紅細(xì)胞溶血的抑制作用可以運(yùn)用一套標(biāo)準(zhǔn)的溶血測(cè)定法來(lái)測(cè)定，測(cè)定過(guò)程是在一塊V形底面的微量滴定板上進(jìn)行，測(cè)定程序如下，實(shí)際上即Weisman等1990年(見(jiàn)上)所述的方法。標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定方法先將抑制劑用Hepes緩沖液(0.1MHepespH7.4/0.15MNaCl)稀釋成一定的濃度范圍(典型的濃度范圍是BRL55730的最后濃度為0.1μg/ml-0.00078μg/ml，APAN或BRAPAN的最后濃度為100-0.1μM)，然后將25μl此濃度范圍的抑制劑和25μl緩沖液以及50μl1∶125稀釋的血清一起在37℃溫育15分鐘。再加入經(jīng)過(guò)預(yù)熱的致敏的羊紅細(xì)胞100μl，使最后的反應(yīng)物體積為200μl，在37℃下溫育1小時(shí)。溫育后將樣品在4℃下以300g的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，然后將150μl上清液移入平底的微量滴定板中，測(cè)定410nm處的吸收，所得數(shù)值可反映每個(gè)測(cè)定溶液的溶血量。最大溶血作用可通過(guò)在不加任何抑制劑時(shí)將血清與紅細(xì)胞共同溫育(E＋S)來(lái)測(cè)定，并且從中扣除本底溶血量(E)(是通過(guò)將紅細(xì)胞與緩沖液共同溫育來(lái)測(cè)定的)。抑制劑的本底溶血作用可通過(guò)將抑制劑與紅細(xì)胞共同溫育來(lái)測(cè)定(E＋I(xiàn))，然后從測(cè)定樣品的結(jié)果中(E＋I(xiàn)＋S)將其扣除。抑制作用表示成細(xì)胞總?cè)苎饔玫陌俜謹(jǐn)?shù)，因此IH50則代表產(chǎn)生50％溶血抑制作用所需的抑制劑濃度。在一些實(shí)驗(yàn)中，血清被稀釋成1∶35.7，溫育時(shí)間減至37℃下15分鐘。其他條件均相同。最大溶血作用Amax＝(E＋S)－(E)存在抑制劑時(shí)的溶血作用Ao＝(E＋I(xiàn)＋S)－(E＋I(xiàn))抑制量IH=Amax-A0Amax]]>將抑制劑濃度對(duì)IH作圖，IH50值則可通過(guò)從此滴定曲線上讀出對(duì)應(yīng)于IH＝0.5的濃度值來(lái)測(cè)定。協(xié)同作用測(cè)定法測(cè)定方法與上面敘述的方法類似，不同之處是抑制劑1(例如BRL55730)在固定濃度的抑制劑2(例如APAN)存在下進(jìn)行滴定。操作程序是在血清存在下將25μl抑制劑1加入25μl抑制劑2中，然后按上述方法測(cè)定其溶血程度。協(xié)同因子的測(cè)定對(duì)于每次協(xié)同作用試驗(yàn)，兩個(gè)抑制劑均單獨(dú)滴定并共同滴定。實(shí)施例1抑制劑1BRL55730單獨(dú)滴定并在存在各種濃度抑制劑2APAN的情況下滴定。在存在和不存在APAN的情況下用[BRL55730]對(duì)IH作圖(圖1)?？稍诿恳粋€(gè)APAN濃度下估價(jià)BRL55730的IH50。第二個(gè)圖是用[APAN]對(duì)IH作圖(圖2)，據(jù)此評(píng)估出與用于協(xié)同作用試驗(yàn)的APAN濃度相對(duì)應(yīng)的IH值。然后將這些結(jié)果制成表(表1)。表1第1欄是APAN的濃度。某一特定的APAN濃度引起的抑制作用的大小由[APAN]對(duì)IH所作的圖(圖2)上評(píng)估出(第2欄)。測(cè)定每個(gè)APAN濃度下BRL55730的IH50值(第3欄)。某一特定的APAN濃度對(duì)BRL55730的IH50產(chǎn)生的作用將被扣除，即0.5-IH(APAN)(第4欄)。用該數(shù)值讀出在BRL55730單獨(dú)作用時(shí)產(chǎn)生的這種抑制水平的BRL55730的濃度(第5欄)。用調(diào)節(jié)的BRL55730的濃度除以已測(cè)得的IH50，得出協(xié)同作用因子，即第5欄值/第3欄值＝第6欄值。如果APAN的作用是疊加性的，那么該協(xié)同作用因子為1，該數(shù)值大于1表示有協(xié)同性作用，該數(shù)值越大，協(xié)同作用的程度也越強(qiáng)。等效線圖解法(isobologram)分析分別測(cè)定抑制劑1(例如BRL55730)和抑制劑2(例如APAN)的IH50。將這些實(shí)驗(yàn)測(cè)定值在等效線圖的軸上作圖，并用直線連接，稱其為疊加性直線(圖3)。這條直線代表當(dāng)兩個(gè)抑制劑結(jié)合使用時(shí)產(chǎn)生的50％抑制作用(Tallarida(1992)Pain4993-97，Miaskowski&Levine，(1992)51383-387)。因此，位于該疊加性直線上的點(diǎn)表明有疊加作用，位于該直線上面的點(diǎn)表明有拮抗作用，而位于該直線下面的點(diǎn)表明有協(xié)同作用。在固定APAN濃度的情況下滴定BRL55730，并在每個(gè)APAN濃度下測(cè)定BRL55730的IH50值。這種數(shù)據(jù)也在等效線圖的座標(biāo)上作圖(圖3)。用固定的成對(duì)濃度所作的協(xié)同作用的統(tǒng)計(jì)分析按照標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定方法對(duì)BRL55730在低于其IH50的濃度x下進(jìn)行測(cè)定。同樣對(duì)APAN在低于其IH50的濃度y下進(jìn)行測(cè)定。然后，用同樣的溶血作用測(cè)定法，對(duì)x濃度的BRL55730和y濃度的APAN共同進(jìn)行測(cè)定。可以計(jì)算出這兩個(gè)抑制劑單獨(dú)測(cè)定時(shí)和共同測(cè)定時(shí)的抑制作用量。如果發(fā)生協(xié)同作用，那么被共同測(cè)定的化合物的抑制作用應(yīng)大于這兩個(gè)抑制劑分別作用的總和，即BRL55730[x]/APAN[y]＞BRL55730[x]＋APAN[y]根據(jù)下式，用t-檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)分析。無(wú)效假設(shè)＝HOab＝a＋b(即作用是疊加性的)備擇假設(shè)＝H1ab≠a＋b(即作用不是疊加性的)將t值與t檢驗(yàn)圖表中的臨界水平相比較，其中，自由度(df)＝na＋nb＋nab－3a.血清稀釋度為1/125時(shí)APAN與BRL55730的協(xié)同作用BRL24894A(APAN)的分子量為324.24，將其在二甲亞砜(DMSO)中配成50mM的溶液。將BRL55730在10mMpH7.2的磷酸鈉緩沖液中配成5.3mg/ml的溶液。按標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定方法對(duì)兩個(gè)抑制劑進(jìn)行滴定，APAN的濃度范圍為100μM-0.78μM，BRL55730的濃度范圍為0.125μg/ml-0.00098μg/ml。對(duì)BRL55730作了兩條滴定曲線，由曲線測(cè)得其平均IH50為0.01μg/ml(圖1)，對(duì)APAN作了一條滴定曲線，由曲線測(cè)得其IH50為10μM(圖2)。為了測(cè)定協(xié)同作用，在相同的濃度范圍內(nèi)滴定BRL55730，但每次滴定均在不同固定濃度的APAN(1μM至6μM)存在下進(jìn)行(圖1)。按上述方法由這些數(shù)據(jù)計(jì)算出協(xié)同作用因子。表1BRL55730和APAN的協(xié)同作用因子的測(cè)定從表1的數(shù)據(jù)可見(jiàn)，6μMAPAN與BRL55730共同作用使IH50降低大約8倍。表1中列出了在每一個(gè)APAN濃度下算得的協(xié)同作用因子，協(xié)同作用因子大于1，表明APAN的作用大于疊加作用。在所用的濃度范圍內(nèi)協(xié)同作用因子保持相當(dāng)恒定，平均值為1.8。在0.04-0.000039μg/ml濃度范圍內(nèi)，對(duì)BRL55730進(jìn)行單獨(dú)滴定，發(fā)現(xiàn)不產(chǎn)生任何補(bǔ)體激活抑制作用的濃度大約是0.0004μg/ml。對(duì)APAN進(jìn)行單獨(dú)滴定的結(jié)果表明，濃度為4μM時(shí)，IH值為0.31，濃度為2μM時(shí)，IH值為0.16。在4μM和2μMAPAN存在下對(duì)BRL55730進(jìn)行滴定，發(fā)現(xiàn)BRL55730的濃度為0.0004μg/ml的情況下抑制作用比由APAN單獨(dú)引起的抑制作用大，表明APAN能增強(qiáng)BRL55730在無(wú)效濃度以下的活性。b.在APAN存在下對(duì)BRL55730的等效線圖解法分析按上述方法從圖1和圖2中獲取數(shù)據(jù)，繪制疊加性直線。然后將每個(gè)APAN濃度下的BRL55730的IH50(分別見(jiàn)表1的第1欄和第3欄)在等效線圖的座標(biāo)上作圖(如圖3所示)。位于疊加性直線以下的點(diǎn)表明其相互作用是協(xié)同性的。c.用固定的成對(duì)濃度對(duì)BRL55730和APAN間協(xié)同作用的統(tǒng)計(jì)分析如前面所述，以下列成對(duì)濃度測(cè)定其協(xié)同作用。(ⅰ)0.005μg/mlBRL557304μMAPAN(ⅱ)0.005μg/mlBRL557302μMAPAN(ⅲ)0.002μg/mlBRL557304μMAPAN(ⅳ)0.002μg/mlBRL557302μMAPAN下面示出每個(gè)濃度對(duì)的統(tǒng)計(jì)參數(shù)。表2濃度對(duì)(ⅰ)的統(tǒng)計(jì)分析表3濃度對(duì)(ⅱ)的統(tǒng)計(jì)分析表4濃度對(duì)(ⅲ)的統(tǒng)計(jì)分析表5濃度對(duì)(ⅳ)的統(tǒng)計(jì)分析以上數(shù)據(jù)表明，對(duì)于每個(gè)被測(cè)定的成對(duì)濃度，統(tǒng)計(jì)分析的備擇性假設(shè)是正確的，即它們的相互作用不是疊加性的，因?yàn)閍＋b＜ab，表明了協(xié)同作用。d.BRL55730對(duì)APAN的協(xié)同作用按與上述實(shí)施例1a相同的方法測(cè)定BRL55730對(duì)APAN的IH50的影響，但這里APAN在固定濃度(0.001-0.006μg/ml)的BRL55730存在下在0.78μM至100μM的范圍內(nèi)進(jìn)行滴定。BRL55730對(duì)APAN的IH50的影響示于表2中，表明BRL55730濃度為0.006μg/ml時(shí)APAN的IH50從10μM變?yōu)?μM，提高了10倍。按上述方法測(cè)定協(xié)同作用因子，其值是大于1(表6)，表明APAN和BRL55730之間的協(xié)同作用過(guò)程是可逆的。與前述實(shí)例1a不同，該協(xié)同作用因子看來(lái)取決于BRL55730的濃度。表6APAN和BRL55730的協(xié)同作用因子的測(cè)定e.在BRL55730存在下對(duì)APAN的等效線圖解法分析用圖2和表6中的數(shù)據(jù)按上述方法進(jìn)行等效線圖解法分析。數(shù)據(jù)點(diǎn)都位于疊加性直線之下，表明作用是協(xié)同性的。f.在血清稀釋度為1/35.7時(shí)APAN與BRL55730的協(xié)同作用為了測(cè)定在更濃的血清中APAN和BRL55730之間的協(xié)同作用是否能再現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)在血清稀釋度為1/35.7時(shí)進(jìn)行，此濃度是實(shí)例1a中所述的血清濃度的3.5倍。為了確定這個(gè)血清濃度不會(huì)使致敏的羊紅細(xì)胞產(chǎn)生最大的溶血，先作一預(yù)備試驗(yàn)。將50μl稀釋度為1/10至1/150的各血清與50μl0.1MHepespH7.4/0.15MNaCl緩沖液在37℃預(yù)溫育15分鐘。加入100μl紅細(xì)胞，將樣品在37℃溫育15分鐘或30分鐘。在4℃以大約300g的轉(zhuǎn)速離心15分鐘除去未溶解的細(xì)胞，然后吸取150μl上清液移入平底微量滴定板，然后在410nm波長(zhǎng)處讀取吸光度。以血清稀釋度對(duì)吸光度作圖，表明1/35.7的稀釋度的血清與紅細(xì)胞共同溫育15分鐘，引起約90％最大溶血作用。因?yàn)橐炎C明這個(gè)血清濃度是適合的，所以BRL55730與APAN的協(xié)同作用實(shí)驗(yàn)可以按與實(shí)例1a相似的方法進(jìn)行，所不同的是采用了更濃的血清，溫育時(shí)間減至15分鐘。在更濃的血清中滴定BRL55730，得到的IH50為0.14μg/ml(兩次測(cè)定的平均值)，此IH50值是在血清稀釋度為1/125時(shí)得到的IH50的14倍。與此相類似，在更濃的血清中APAN的IH50為52μM(兩次測(cè)定的平均值)，大約是在較稀的血清中IH50值的5倍。協(xié)同作用實(shí)驗(yàn)按下述條件進(jìn)行在APAN存在下對(duì)BRL55730進(jìn)行滴定，APAN的濃度范圍是2μM至18μM，BRL55730的濃度范圍是1μg/ml至0.0078μg/ml。數(shù)據(jù)匯總在表7中，表明協(xié)同作用可擴(kuò)展到更濃的血清。此例中的協(xié)同作用因子看來(lái)取決于APAN的濃度。表7在較濃的血清中BRL55730和APAN間的協(xié)同作用值g.在更濃的血清中BRL55730和APAN的等效線圖解法分析用血清稀釋度為1/35.7時(shí)BRL55730和APAN的IH50繪制疊加性直線。用表7中第1欄和第3欄的數(shù)據(jù)點(diǎn)繪制等效線圖。除2μM之外，其他所有的點(diǎn)均位于疊加性直線之下，表明有協(xié)同作用。在表7中，2μMAPAN濃度的數(shù)據(jù)點(diǎn)處的協(xié)同作用因子為1.03，在等效線圖中，該點(diǎn)位于疊加性直線上，表明在這個(gè)濃度下APAN的作用可能是疊加性的。h.BRAPAN對(duì)BRL55730的協(xié)同作用將分子量為386的4′-甲氧基苯甲酸4-脒基-2-溴苯酯鹽酸鹽(BRAPAN)在DMSO中配制成濃度為10mM的溶液，并按照實(shí)驗(yàn)方法中所述方法采用稀釋度為1/125的血清進(jìn)行滴定。從兩次單獨(dú)的測(cè)定中得到BRAPAN的IH50的平均值為3μM。先測(cè)定濃度為0.1至0.00078μg/ml的BRL55730的單獨(dú)滴定曲線，得出的IH50是0.021μg/ml。為了測(cè)定協(xié)同作用，在同樣的濃度范圍內(nèi)對(duì)BRL55730進(jìn)行滴定，但滴定在濃度范圍為0.1μM至0.9μM的BRAPAN存在下進(jìn)行。表8表明了BRAPAN對(duì)BRL55730的影響和協(xié)同作用。與相同血清稀釋度的APAN相同，協(xié)同作用因子＞1，表明BRAPAN與BRL55730有協(xié)同作用。在上述濃度范圍內(nèi)，協(xié)同作用因子保持相當(dāng)恒定，其平均值是1.7，也與APAN得到的數(shù)值非常接近。表8BRL55730和BRAPAN間的協(xié)同作用值<tablesid="table9"num="009"><tablewidth="735">123456[BRAPAN]μMIH(BRAPAN)IH50(BRL55730)μg/ml0.5-IH(BRAPAN)調(diào)整的[BRL55730]μg/ml協(xié)同作用因子000.0210.50.02110.100.0150.50.0211.40.200.0130.50.0211.620.30.010.0110.490.021.820.40.030.0130.470.0191.460.50.040.0120.460.0181.50.60.060.0080.440.0162.000.70.090.0070.410.0152.140.80.130.0070.370.0131.860.90.160.00590.340.0111.86</table></tables>i.BRAPAN對(duì)BRL55730的影響的等效線圖解法分析用實(shí)例1h中BRAPAN的數(shù)據(jù)繪制等效線圖。所有的數(shù)據(jù)點(diǎn)均位于疊加性直線的下面，表明產(chǎn)生了協(xié)同作用。實(shí)施例2sCR1(BRL55730)和APAN(BRL24894A)的組合制劑將D-甘露糖醇(Sigma.UK，60mg)溶于注射用水(9.5ml)中。再將APAN溶解于HPLC級(jí)甲醇中，在室溫(20-25℃)下攪拌5分鐘，使最后的濃度為6mg/ml。然后立刻將此溶液(0.5ml)加入甘露糖醇溶液中，振搖混勻。再加入BRL55730溶液0.2ml(濃度為5mg/ml，溶于0.2ml10mMpH7.2的磷酸鈉中)，振搖并立即在固體CO2中冷凍。再在平均壓力2-3毫巴、冷凝器溫度-60℃下冷凍干燥20小時(shí)。得到的白色固體的組成如下，將其在-70℃下干燥保存BRL557301mg；BRL24894A3mg；D-甘露糖醇60mg；磷酸鈉微量。實(shí)施例34′-甲氧基苯甲酸4-脒基-2-溴苯酯鹽酸鹽(BRAPAN)的制備此化合物由2-溴-4-氰基苯酚經(jīng)兩步制得。a.2-溴-4-脒基苯酚鹽酸鹽的制備將2-溴-4-氰基苯酚(1.35g，6.8mmol)溶于20ml乙醇中。然后將氯化氫氣體通入此經(jīng)冷卻的溶液，45分鐘后形成白色沉淀。2小時(shí)后停止通氣，將溶液中的固體于4℃放置2天。過(guò)濾分出白色固體。將此固體迅速懸浮于50ml乙醇溶液中，并加入氨在乙醇中的飽和溶液75ml。此懸浮液幾乎立即變澄清，將其攪拌24小時(shí)，再靜置類似時(shí)間。將所有的揮發(fā)性物質(zhì)除去，將白色固體溶于20ml水中。加濃鹽酸5ml，致使迅速形成白色晶體，過(guò)濾分出晶體，然后用20ml乙醇和100ml乙醚重結(jié)晶。產(chǎn)量860mg(50％)，熔點(diǎn)279-80℃。1H核磁共振譜(CDCl3-d6DMSO)69.2(4H，brd，脒)，8.2(1H，d，J＝2Hz，芳基-H)，7.8(1H，m，芳基-H)，7.25(1H，J＝9Hz，芳基-H)紅外光譜(液體石蠟法)3325,3125,2300-3400,1670,1610,1585,1410,1300,1175,1045,880,835,725,620cm-1。元素分析C33.45，H3.28，N10.95％理論值C7H8N2OBrClC33.43，H3.21，N11.14％b.標(biāo)題化合物的制備向4-甲氧基苯甲酰氯(271mg，1.59mmol)的無(wú)水吡啶(5ml)溶液中，加入2-溴-4-脒基苯酚鹽酸鹽(400mg，1.59mmol)。最初的懸浮液變?yōu)槌吻宓娜芤海缓笤偕沙恋?。攪?小時(shí)后，紅外分析表明酯已形成。減壓除去吡啶，最后的微量吡啶通過(guò)與乙醇共沸除去。所得的白色固體用5∶1乙醚/乙醇(約100ml)重結(jié)晶兩次，得到白色的標(biāo)題化合物。產(chǎn)量225mg(37％)。熔點(diǎn)212-3℃。1H核磁共振譜(d6DMSO-微量CDCl3)δ9.55(4H，br，脒基苯酚NH)6.95-8.25(7H，m，芳基-H)，3.9(1H，s，OCH3)紅外光譜(液體石蠟法)2500-3400,1735,1665,1605,1580,1260,1230,1170,1070,1020和830cm-1元素分析C46.66，H3.74，N7.19％理論值C15H12N2BrClC46.72％，H3.66％，N7.26％附圖中圖1表示不同濃度的APAN對(duì)BRL55730的作用；圖2表示APAN對(duì)補(bǔ)體激活的抑制作用；圖3是按標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法繪制的BRL55730和APAN的等效線圖。權(quán)利要求1.一種治療與炎癥或不適當(dāng)?shù)难a(bǔ)體激活有關(guān)的疾病或失調(diào)的方法，該方法包括對(duì)需要治療的哺乳動(dòng)物施與有效劑量的可溶性CR1蛋白質(zhì)和有效劑量的具有補(bǔ)體抑制活性的式(I)的脒基苯基酯或脒基萘基酯及其藥學(xué)上可以接受的鹽，其中，A是可被下述基團(tuán)任意取代的苯基C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4烷氧羰基、鹵素、NH2、磺酰基、苯甲酰基或C1-4烷基苯甲酰氨基，或者萘基B是可被下述基團(tuán)之一任意取代的CH2＝CH-基C1-5烷基、苯基和C1-6烷基取代的苯基；被一個(gè)或兩個(gè)各自選自下述基團(tuán)的取代基任意取代的苯基鹵素、C1-6烷基、C2-6鏈烯基、C1-6烷氧基、C1-6鏈烯酰氧基、C1-6鏈烷酰氨基、氨基、二甲氨基或胍基；或者萘基。2.可溶性CR1蛋白質(zhì)和具有補(bǔ)體抑制活性的如權(quán)利要求1所述的式(I)的脒基苯基酯或脒基萘基酯在制備用于治療與炎癥或不適當(dāng)?shù)难a(bǔ)體激活作用有關(guān)的疾病或失調(diào)的藥物中的應(yīng)用。3.一種藥物組合物，該組合物含有可溶性CR1蛋白質(zhì)和具有補(bǔ)體抑制活性的如權(quán)利要求1所述的式(I)的脒基苯基酯或脒基萘基酯以及藥學(xué)上可以接受的載體。4.一種治療與炎癥或不適當(dāng)?shù)难a(bǔ)體激活作用有關(guān)的疾病或失調(diào)的方法，該方法包括對(duì)需要這種治療的患者施與治療上有效劑量的權(quán)利要求3的組合物。5.一種包含一個(gè)或多個(gè)包裝物的藥劑盒，所述包裝物內(nèi)裝有一種或多種權(quán)利要求3所述的藥物組合物的成分。6.一種制備權(quán)利要求3所述的藥物組合物的方法，該方法包括將可溶性CR1蛋白質(zhì)和權(quán)利要求1所述的式(I)的脒基苯基酯或脒基萘基酯的混合物進(jìn)行混合。7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5或6分別所述的治療方法、用途、組合物、治療方法、藥劑盒和制備方法，其中可溶性CR1蛋白質(zhì)是由核酸媒介體pBSCR1c/pTCSgpt編碼的蛋白質(zhì)，酯是4′-甲氧基苯甲酸4-脒基苯酯鹽酸鹽或4′-甲氧基苯甲酸4-脒基-2-溴苯酯鹽酸鹽。全文摘要一種治療與炎癥或不適當(dāng)?shù)难a(bǔ)體激活作用有關(guān)的疾病或失調(diào)的方法，該方法包括對(duì)需要治療的哺乳動(dòng)物施與有效劑量的可溶性CR1蛋白質(zhì)和有效劑量的脒基苯基或脒基萘基酯及其藥學(xué)上可以接受的鹽。文檔編號(hào)A61P29/00GK1118141SQ94191260公開(kāi)日1996年3月6日申請(qǐng)日期1994年1月21日優(yōu)先權(quán)日1993年1月22日發(fā)明者D·E·I·莫沙考斯卡,R·A·G·史密夫申請(qǐng)人:史密絲克萊恩比徹姆有限公司