專利名稱：嵌合白細(xì)胞介素－6可溶性受體/配體蛋白質(zhì)和其類似物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及依賴于可溶性IL-6受體(sIL-6R)的對(duì)抗作用的白細(xì)胞介素-6(IL-6)生物活性的領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及從sIL-6R和IL-6的基本天然存在形式及其生物活性類似物的融合構(gòu)建的新嵌合sIR-6R/IL-6蛋白質(zhì)，它特定地可用于通過抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)治療癌，增強(qiáng)骨髓移植，治療肝紊亂及其它IL-6相關(guān)癥狀。
本發(fā)明的背景和現(xiàn)有技術(shù)白細(xì)胞介素-6(IL-6)是已知的細(xì)胞因子，它的生物活性是通過含有兩個(gè)不同蛋白質(zhì)，一個(gè)是IL-6受體(IL-6R或gp80)和另一個(gè)gp130的膜受體系統(tǒng)介導(dǎo)的(Hirano等人，1994年綜述)。對(duì)應(yīng)于gp80的細(xì)胞外區(qū)域的IL-6R(sIL-6R)的可溶性形式是作為血液和尿中的糖蛋白發(fā)現(xiàn)的人體的天然產(chǎn)物(Novick等人，1990，1992)。sIL-6R的例外特性是它們?cè)谠S多細(xì)胞類型包括人細(xì)胞上作為IL-6的潛在的括抗劑作用(Taga等人，1989；Novick等人，1992)。這是由于即使沒有g(shù)p80的胞質(zhì)內(nèi)區(qū)，sIL-6R仍然能夠引發(fā)應(yīng)答IL-6的gp130的二聚化，這依次介導(dǎo)了隨后的IL-6特異的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和生物效應(yīng)(Murakami等人，1993)。活性的IL-6受體復(fù)合物是由于兩條gp130鏈，兩個(gè)IL-6R和兩個(gè)IL-6配體形成六聚體結(jié)構(gòu)(Ward等人，1994；Paonessa等人，1995)，其中sIL-6R與gp130具有兩種類型的相互反應(yīng)，這兩種反應(yīng)是IL-6特異生物活性所必須的(Halimi等人，1995)。
利用sIL-6R的處理導(dǎo)致了在許多細(xì)胞類型中IL-6生物活性增強(qiáng)。一個(gè)實(shí)施例是當(dāng)加入sIL-6R時(shí)，IL-6在較大程度上抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，如小鼠骨髓白血病M1細(xì)胞(Taga等人，1989)，人胸癌T47D細(xì)胞(Novick等人，1992)或人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(Ganapathi等人，1996)。IL-6在體內(nèi)具有抗轉(zhuǎn)移活性(Katz等人，1995)，并且sIL-6R也可以增強(qiáng)IL-6的這樣的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)(Mackiewicz等人，1995)。加入sIL-6R增強(qiáng)IL-6的另一個(gè)活性是刺激造血干細(xì)胞以便生產(chǎn)多譜系菌落(Sui等人，1995)。本發(fā)明人也已經(jīng)觀察到腦少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的初級(jí)培養(yǎng)物的生存是得到sIL-6R和IL-6聯(lián)合的支持的(Oh，1997)，而IL-6單獨(dú)在這樣的培養(yǎng)物中很少存活(Kahn和DeVellis，1994)。這一發(fā)現(xiàn)表明，當(dāng)與sIL-6R結(jié)合時(shí)，IL-6可以模仿其它親神經(jīng)細(xì)胞因子如纖毛親神經(jīng)因子(CNTF)或白血病抑制因子(LIF)的活性，它們也是通過gp130作用的，正如IL-11和制癌蛋白M的情況(Hirano等人，1994)。
在試圖提供可以結(jié)合上面提到的IL-6和sIL-6R的功能的分子時(shí)，最近有報(bào)道在重組的酵母細(xì)胞中，在富甘氨酸的接頭連接的截短的人IL-6R序列的區(qū)段和IL-6之間產(chǎn)生了融合蛋白質(zhì)(Fischer等人，1997)。這一融合蛋白質(zhì)基本只包括IL-6R細(xì)胞因子受體N區(qū)和細(xì)胞因子受體C區(qū)，并且因此基本缺乏所有的IL-6R免疫球蛋白(Ig)狀區(qū)域，和受體膜前區(qū)(在C區(qū)和跨膜區(qū)之間的區(qū)域)。正如它代表了sIL-6R的截短形式，這截短了通過上面提到的富甘氨酸接頭基本與IL-6的整個(gè)成熟形式連接的融合蛋白質(zhì)中的sIL-6R。除了缺乏天然sIL-6R的一些部分，在酵母細(xì)胞中產(chǎn)生的這一融合蛋白不具有糖基化圖譜，而如果融合蛋白是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞特別是例如在人細(xì)胞中則會(huì)產(chǎn)生這樣的糖基化圖譜。事實(shí)上，與具有預(yù)期的分子量約85千道爾頓的基本含有所有天然sIL-6R和IL-6氨基酸殘基和在哺乳動(dòng)物(例如人)細(xì)胞中完全糖基化的融合產(chǎn)物相反，這一酵母產(chǎn)生的融合蛋白質(zhì)具有約57千道爾頓的分子量(見下面的實(shí)施例2)。
在開發(fā)可以用于治療病人的重組蛋白質(zhì)中的一般實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，為了避免引發(fā)抗體和非天然重組產(chǎn)物觀察到的其它副作用，保留盡可能接近天然形式的這些蛋白質(zhì)是重要的，正如它們是在人體中發(fā)現(xiàn)的。由于這一原因，利用重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)生產(chǎn)糖基化蛋白質(zhì)，如盡可能相似于天然人蛋白質(zhì)的化學(xué)形式的干擾素-β或粒細(xì)胞菌落刺激因子(Chernajovsky等人，1984，Holloway，1994)是有利的。不能適當(dāng)糖基化的細(xì)菌或微生物如酵母也會(huì)引起蛋白質(zhì)鏈的錯(cuò)誤折疊，導(dǎo)致免疫原性反應(yīng)。這對(duì)于翻譯后N-和O-糖基化以及磷酸化嚴(yán)重修飾的IL-6(Revel，1989綜述)，和對(duì)于N末端和C末端氨基酸恒定和已經(jīng)確定的糖蛋白，人血液和尿中的天然sIL-6R特別重要(Novick等人，1990和與本發(fā)明人共同擁有的美國專利第5,216,128號(hào)和它對(duì)應(yīng)的EP 413908 B1)。
因此看來，上面提到的在部分sIL-6R和IL-6之間的融合蛋白可能產(chǎn)生缺點(diǎn)，特別是用于治療人的方面，由于它缺乏部分sIL-6R，以及它在酵母生產(chǎn)中可能產(chǎn)生了蛋白質(zhì)不正確的糖基化。
在此之前，還沒有公開融合分子含有在人體液中發(fā)現(xiàn)的天然sIL-6R和天然IL-6，并且是在人或其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的。
因此,本發(fā)明的一個(gè)目的是提供含有天然sIL-6R和天然IL-6(以任何順序)的融合分子，它是由哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是利用非常低濃度的這樣的融合蛋白(sIL-6R/IL-6嵌合體)抑制高度轉(zhuǎn)移的黑素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，這些細(xì)胞是單獨(dú)抗IL-6或sIL-6R的。
本發(fā)明另一個(gè)目的是在骨髓移植方案中利用這樣的融合蛋白(sIL-6R/IL-6嵌合體)用于將人造血干細(xì)胞移植入體內(nèi)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是在其它IL-6相關(guān)的紊亂，例如，肝癥狀或神經(jīng)學(xué)癥狀中利用這樣的融合蛋白。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有上面提到的天然sIL-6R-天然IL-6融合蛋白質(zhì)(sIL-6R/IL-6嵌合體)的藥物組合物用于治療癌癥，用于骨髓移植方案，和用于其它IL-6相關(guān)的紊亂，例如，肝癥狀和神經(jīng)學(xué)癥狀。
本發(fā)明的其它目的和方面將在下面本發(fā)明的公開內(nèi)容中闡述或產(chǎn)生。
本發(fā)明概要根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)產(chǎn)生了許多融合蛋白(嵌合體)，每個(gè)基本含有所有來自人體液的天然存在的sIL-6R和基本含有所有天然存在的人IL-6的成熟形式，每個(gè)都由短至3個(gè)氨基酸殘基，或較長(zhǎng)例如13個(gè)氨基酸殘基的短接頭肽連接(參見下面和實(shí)施例1和2)。但是，應(yīng)該注意到，在這些融合蛋白質(zhì)中，接頭肽可以缺失，并且sIL-6R成份可以直接連接到IL-6成份。因?yàn)榇矸翘烊话被嵝蛄械慕宇^可以是在病人中引發(fā)抗體的免疫原性表位，優(yōu)選具有需要的生物活性的直接融合的sIL-6R/IL-6嵌合體，同時(shí)，當(dāng)服用這樣的嵌合體時(shí)，就會(huì)使誘導(dǎo)形成這樣潛在有害抗體的危險(xiǎn)最小。
當(dāng)在人或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生上面的嵌合體時(shí)，對(duì)于減少嵌合蛋白質(zhì)產(chǎn)物的潛在的免疫原性，如在天然存在的分子中發(fā)現(xiàn)的包括Ig狀區(qū)的整個(gè)sIL-6R序列的轉(zhuǎn)化，以及人或哺乳動(dòng)物細(xì)胞導(dǎo)入的適當(dāng)?shù)奶腔捌渌g后修飾也是重要的。
但是，在嵌合蛋白的sIL-6R和IL-6成份之間的接合點(diǎn)使用非常短的約3個(gè)氨基酸的接頭是可能的。這樣的短接頭可以不是免疫原性表位。當(dāng)然也可能使用多達(dá)約30個(gè)氨基酸的較長(zhǎng)的接頭以便分離兩個(gè)成份，但必須小心，必須進(jìn)行生物學(xué)效能和安全性實(shí)驗(yàn)以便保證含有這樣的接頭的嵌合分子不是免疫原性的。
事實(shí)上，根據(jù)本發(fā)明，這樣的較長(zhǎng)接頭不是嵌合蛋白的活性所必需的，表明當(dāng)基本所有天然存在的sIL-6R和IL-6成份的序列插入嵌合分子時(shí)，嵌合體的適當(dāng)折疊不需要較長(zhǎng)的接頭[參見實(shí)施例3和圖5，其中也涉及了具有非常短(3個(gè)氨基酸)的接頭的sIL-6R/IL-6嵌合體和具有較長(zhǎng)(30個(gè)氨基酸)接頭的相似嵌合體的比較]。
根據(jù)本發(fā)明，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)有效地產(chǎn)生了這些融合蛋白或sIL-6R/IL-6嵌合體，以便產(chǎn)生在通常非應(yīng)答IL-6或sIL-6R的腫瘤細(xì)胞上具有潛在活性，并且高度有效地保證人骨髓移植細(xì)胞的成功移入的糖基化產(chǎn)物(參見下面和實(shí)施例1～4)。事實(shí)上，在這樣的骨髓移植中，sIL-6R/IL-6嵌合體是移植非定向多(潛)能造血干細(xì)胞的存活和增殖所必需的。另外，從本發(fā)明所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以及從其它分析知道，可以制備本發(fā)明的sIL-6R/IL-6嵌合蛋白的各種類似物，它們基本具有sIL-6R/IL-6嵌合體的相同生物活性，這些類似物是已經(jīng)缺失，附加或被其它替代的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的sIL-6R/IL-6嵌合體，對(duì)這樣的類似物的唯一限制是它們保留了大部分天然存在的sIL-6R和IL-6序列。例如，優(yōu)選地，加入到天然存在的sIL-6R和IL-6序列的氨基酸限制到20個(gè)氨基酸，這些加入優(yōu)選地是在sIL-6R和IL-6之間的接合的位點(diǎn)處，即接頭分子。同樣，優(yōu)選地，從sIL-6R和IL-6序列的缺失限制到20～30個(gè)氨基酸，其它氨基酸殘基替代sIL-6R和IL-6序列中的氨基酸殘基也優(yōu)選地限制到20～30個(gè)氨基酸。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)獲得的如此修飾的類似物基本保留了天然存在序列組成的sIL-6R/IL-6嵌合體的生物活性，并且當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，基本保留了天然存在序列組成的嵌合體的相同的糖基化圖譜，前面所述的所有缺失，附加和替代是可接受的。
因此，本發(fā)明提供了嵌合糖基化可溶白細(xì)胞介素-6受體(sIL-6R)-白細(xì)胞介素-6(IL-6)蛋白(sIL-6R/IL-6)及其生物活性類似物，它們含有在基本所有天然存在的sIL-6R形式，和基本所有IL-6的天然存在形式之間融合的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，所述的sIL-6R/IL-6及其類似物以與天然存在sIL-6R和IL-6D糖基化相似方式糖基化。
本發(fā)明的上面的嵌合蛋白的實(shí)施例包括(i)嵌合sIL-6R/IL-6蛋白及其生物活性類似物，其中所述的sIL-6R通過肽接頭分子與IL-6融合。
(ii)如在(i)中所述，嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)及其生物活性類似物，其中所述的接頭非常短，約3～4個(gè)氨基酸殘基的非免疫原性接頭。
(iii)如在(ii)中所述，嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)及其生物活性類似物，其中所述的接頭是序列E-F-M的三肽(Glu-Phe-Met)。
(iv)如在(i)中所述，嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)及其生物活性類似物，其中所述的接頭是序列E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M(Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met)(SEQ ID NO1)的13個(gè)氨基酸的肽。
(v)嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)是本發(fā)明命名的在sIL-6R的C未端Val-356和IL-6的N末端Pro-29之間具有序列E-F-M的三肽接頭的sIL-6RδVal/IL-6，所述的嵌合蛋白具有圖3所述的序列。
(vi)嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)，是本發(fā)明命名的sIL-6RδVal/L/IL-6，在sIL-6R的C末端Val-356和IL-6R的N末端Pro-29之間具有序列E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M的13個(gè)氨基酸肽接頭，所述的嵌合蛋白質(zhì)具有圖3中所述的序列，其中所述的13個(gè)氨基酸肽序列替代了圖3的位置357～359之間的序列E-F-M的三肽。
(vii)嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)，其中在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以完全加工形式生產(chǎn)了所述的蛋白質(zhì)。
(viii)嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)在人細(xì)胞中產(chǎn)生。
(ix)嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生。
(x)如上的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)及其生物活性類似物，其中通過能夠抑制高度惡性的癌細(xì)胞的生長(zhǎng)來鑒定所述的嵌合蛋白質(zhì)和類似物。
(xi)如上的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)及其生物活性類似物，其中通過能夠抑制高度惡性的黑素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)來鑒定所述的嵌合蛋白質(zhì)和類似物。
(xii)如上的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)及其生物活性類似物，其中通過能夠引發(fā)骨髓移植中人造血細(xì)胞移入體內(nèi)來鑒定所述的嵌合蛋白質(zhì)和類似物。
(xiii)如上的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)及其生物活性類似物，其中通過能夠保護(hù)肝抵抗肝毒素試劑來鑒定所述的嵌合蛋白質(zhì)和類似物。
本發(fā)明還提供上面提到的編碼嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)及其生物活性類似物的DNA序列。
另外，本發(fā)明也提供了如上提到的含有編碼嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)和本發(fā)明的生物活性類似物的DNA序列的DNA載體，所述的載體適于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)所述的嵌合蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的DNA載體的實(shí)施例包括(i)DNA載體，其中載體適于在人細(xì)胞中表達(dá)所述的嵌合蛋白質(zhì)。
(ii)DNA載體，其中當(dāng)在哺乳動(dòng)物或人細(xì)胞中表達(dá)所述的載體時(shí)，表達(dá)的嵌合蛋白質(zhì)具有允許哺乳動(dòng)物或人細(xì)胞完全加工嵌合蛋白質(zhì)和將完全加工嵌合蛋白質(zhì)從細(xì)胞分泌到所述細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中的序列。
(iii)如上的DNA載體，其中所述的載體是本發(fā)明命名的質(zhì)粒pcDNAsIL-6R/IL-6，其中包括pcDNA3載體，含有在巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子控制下的編碼嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)的DNA序列。
(iv)如上的DNA載體，其中所述的載體是本發(fā)明命名的質(zhì)粒pcDNAsIL-6R/L/IL-6，其中包括pcDNA3載體，含有在巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子控制下的編碼嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)的DNA序列，并且其中在編碼所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)的所述的DNA序列中在放置于編碼sIL-6R部分的序列和編碼蛋白質(zhì)的IL-6部分的序列之間的EcoRI位點(diǎn)插入了編碼接頭肽的接頭序列。
同樣，本發(fā)明也提供含有如上所述的DNA載體的轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，即能夠表達(dá)由所述的載體攜帶的，完全加工表達(dá)蛋白和分泌到所述細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中的sIL-6R/IL-6嵌合蛋白質(zhì)序列。
這些轉(zhuǎn)化細(xì)胞的實(shí)施例是pcDNA sIL-6R/IL-6載體轉(zhuǎn)染的本發(fā)明敘述的人胚腎細(xì)胞293(HEK293)，所述的細(xì)胞能夠表達(dá)sIL-6R/IL-6嵌合蛋白，完全加工所述的蛋白，和以約85千道爾頓糖蛋白的形式分泌所述的蛋白到所述細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。
轉(zhuǎn)化細(xì)胞的另一個(gè)實(shí)施例是本發(fā)明敘述的利用pcDNA sIL-6R/IL-6載體轉(zhuǎn)染的CHO(中國倉鼠卵巢)細(xì)胞，所述的細(xì)胞能夠表達(dá)sIL-6-R/IL-6嵌合蛋白，以約85千道爾頓糖蛋白的形式完全加工所述的蛋白質(zhì)到所述的細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。
本發(fā)明也提供了生產(chǎn)如上所述的嵌合蛋白質(zhì)及其生物活性類似物的方法，包括在適于表達(dá)的條件下生長(zhǎng)前面所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，加工和分泌所述的蛋白質(zhì)或類似物到所述細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，和從所述的培養(yǎng)基通過利用特異于sIL-6R的單克隆抗體的免疫親和層析純化所述的蛋白質(zhì)或類似物。
本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)具有許多用途包括
(i)利用嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)或類似物，其任何一個(gè)的鹽及其混合物作為癌細(xì)胞的抑制劑。
(ii)利用如(i)所述，作為高度惡性的黑素瘤細(xì)胞的抑制劑。
(iii)利用嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)或類似物，其任何一個(gè)的鹽，及其混合物作為引發(fā)骨髓移植中人造血細(xì)胞的移入的活性成份。
(iv)利用嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)或類似物，其任何一個(gè)的鹽，及其混合物，作為增加血細(xì)胞生成，用于治療肝和神經(jīng)系統(tǒng)病癥，或用于IL-6或sIL-6R的其它用途的活性成份。
同樣，本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)可以用于制備許多醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥的藥劑，即嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)或類似物，其任何一個(gè)的鹽及其混合物，用于制備通過抑制癌細(xì)胞治療癌癥的藥劑，或用于制備通過引發(fā)骨髓移植中的人造血細(xì)胞的移入增強(qiáng)骨髓移植的藥劑，或用于制備增強(qiáng)血細(xì)胞生成的藥劑，或用于制備治療神經(jīng)系統(tǒng)紊亂的藥劑，或用于制備利用IL-6或sIL-6R的其它用途的藥劑。
另外，本發(fā)明也提供作為含有活性成份的，如上所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)或其類似物和藥物可接受載體，稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。
本發(fā)明的這一藥物組合物的實(shí)施例包括(i)用于治療哺乳動(dòng)物癌癥的藥物組合物。
(ii)增強(qiáng)骨髓移植的藥物組合物。
(iii)用于治療肝和神經(jīng)系統(tǒng)紊亂或用于增強(qiáng)血細(xì)胞生成或用于IL-6或sIL-6R的其它應(yīng)用的藥物組合物。
本發(fā)明也提供治療哺乳動(dòng)物中的癌癥，增強(qiáng)骨髓移植，治療肝和神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，增強(qiáng)血細(xì)胞生成，或IL-6或sIL-6R的其它應(yīng)用的方法，包括以合適劑量和適宜的給藥途徑，給病人服用所述的藥物組合物。
為了避免疑惑，本發(fā)明涉及任何順序的IL-6和sIL-6R之間的嵌合體，即N末端和C末端部分可以逆轉(zhuǎn)，且之后嵌合體是IL-6-sIL-6R蛋白質(zhì)，雖然在本發(fā)明中統(tǒng)稱為sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)。
從本發(fā)明下面的詳細(xì)的公開內(nèi)容闡述或表示了本發(fā)明的其它方面和實(shí)施例。
附圖的簡(jiǎn)要說明

圖1A～圖1C表示用于構(gòu)建編碼嵌合蛋白質(zhì)的嵌合DNA分子的各種載體，試劑和加工步驟的圖解，其中嵌合蛋白在Val 356殘基結(jié)束的sIL-6R的天然形式接在天然的，成熟的序列之后，如實(shí)施例1中詳細(xì)敘述的IL-6的加工形式的結(jié)構(gòu)是保守的；圖2A和圖2B表示通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(A)和通過生物活性圖譜(B)鑒定sIL-6RδVal/IL-6p86嵌合體進(jìn)行的分析獲得的結(jié)果，其中在圖2A中，顯示了從加載利用編碼嵌合蛋白的載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得的分泌蛋白質(zhì)樣品的親和層析柱洗脫的電泳免疫純化部分的考馬斯染色的凝膠的再生。并且在圖2B中顯示了每個(gè)從親和層析柱洗脫的上面提到的部分的生物活性(F10.9黑素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制)的圖解表示，在實(shí)施例2和3中已詳細(xì)敘述；圖3描述了sIL-6RδVal/IL-6嵌合體的氨基酸序列(一字母密碼)，其中顯示的是分子的不同區(qū)域，包括N末端信號(hào)肽(線在序列的頂部)，免疫球蛋白狀(Ig-狀)區(qū)域，細(xì)胞因子受體N區(qū)域(下劃線)，細(xì)胞因子C區(qū)域(線在序列的上部)，和受體膜前區(qū)(在C區(qū)和跨膜區(qū)之間的區(qū)域)，嵌合體的所有sIL-6R部分；以及嵌合體的成熟IL-6成份(下劃線)，在實(shí)施例1和2敘述；圖4A和圖4B顯示了利用sIL-6R/IL-6嵌合蛋白處理4天(B)和未處理(A)的培養(yǎng)基中的F10.9黑素瘤細(xì)胞的圖解，其中在圖4B中，表示了如實(shí)施例3所述，利用sIL-6R/IL-6嵌合體處理的這樣的轉(zhuǎn)移黑素瘤細(xì)胞(F10.9細(xì)胞)中誘導(dǎo)的形態(tài)學(xué)變化；圖5是在各種嵌合體濃度范圍，從約0.12納克/毫升～150納克/毫升，sIL-6R/IL-6嵌合蛋白抑制F10.9黑素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)的圖解說明，其中將如實(shí)施例3中所述的只含有3個(gè)氨基酸接頭IL-6RIL-6的嵌合體與含有長(zhǎng)13個(gè)氨基酸接頭(IL-6RLIL-6)的嵌合體進(jìn)行比較；圖6是分離的IL-6單獨(dú)(圓點(diǎn)曲線的上面的含有開放的方塊的曲線)，濃度范圍從0～40納克/毫升的IL-6，和sIL-6R單獨(dú)(在垂直軸上所有曲線的會(huì)聚點(diǎn)，其中IL-6濃度為零)對(duì)F10.9黑素瘤細(xì)胞缺乏生長(zhǎng)抑制效果，以及以各種濃度一起加入IL-6和sIL-6R，其中IL-6濃度范圍為10納克/毫升～40納克/毫升，和對(duì)每個(gè)IL-6濃度，加入的sIL-6R的三個(gè)濃度是100納克/毫升，200納克/毫升和400納克/毫升觀察到的生長(zhǎng)抑制效果，如下面三個(gè)曲線說明的(含有開放的三角和圓環(huán)的兩個(gè)點(diǎn)曲線和含有封閉的方塊完整的曲線)，如實(shí)施例3中所述；圖7是如實(shí)施例4所述，在對(duì)SCID-NOD小鼠進(jìn)行骨髓移植過程中，顯示成功移入人造血干細(xì)胞需要sIL-6R/IL-6嵌合蛋白質(zhì)的DNA印跡影印的放射自顯影的再生(兩個(gè)右手的道代表接受sIL-6R/IL-6嵌合蛋白質(zhì)以及其它需要的因子，SCF，F(xiàn)LT-3的小鼠，這和三個(gè)左手的道相反，它們表示僅接受了SCF和FLT-3和SCF，F(xiàn)LT-3以及分離的，即，非融合的IL-6和sIL-6R的小鼠)；圖8是比較IL-6和sIL-6R混合物，sIL-6R/IL-6嵌合體的親和特征，實(shí)心方塊描述的嵌合體和實(shí)心菱形塊描述的混合物的值的斯卡查德圖，斜率是4～1；圖9顯示了比較sIL-6R+IL-6的混合物之一或sIL-6R之一(沒有IL-6)sIL-6R/IL-6嵌合體對(duì)F10.9黑素瘤細(xì)胞的較高的活性；圖10顯示了sIL-6R/IL-6嵌合體抵抗肝毒性的保護(hù)作用，這些值表示了4個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值，實(shí)心方塊表示IL-6-/-小鼠，實(shí)心菱形塊表示接受IL-6的IL-6-/-小鼠，和實(shí)心星表示接受嵌合體的IL-6-/-小鼠；圖11描述了IL-6-sIL-6RδVal嵌合體3e的氨基酸序列(一字母密碼)，接頭為下劃線；和圖12顯示了比較sIL-6R/IL-6嵌合體(實(shí)心方塊)和兩個(gè)突變體[Mutt39(HD)-實(shí)心菱形塊]和MuttNHD-輕微實(shí)心的星，嵌合體3e(黑實(shí)心星)對(duì)圖9的黑素瘤細(xì)胞的生物活性，如實(shí)施例9所述。
本發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明涉及嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)及其生物活性類似物，它們基本具有融合在一起的所有sIL-6R的天然存在形式和基本所有IL-6的天然存在形式，可以通過短至3個(gè)氨基酸的接頭肽融合的位點(diǎn)，并且該嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)或類似物具有與天然存在的sIL-6R和IL-6一樣的糖基化的量或方式。發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別是人細(xì)胞(參見下面的實(shí)施例1～4)或CHO細(xì)胞(參見下面的實(shí)施例6)中根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)在這樣的細(xì)胞中有效地表達(dá)，且有待于高度糖基化，并分別對(duì)IL-6或sIL-6R顯示完全沒有應(yīng)答的腫瘤細(xì)胞上具有潛在的活性。
更具體地說，根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)觀察到(參見下面的實(shí)施例1～3)，本發(fā)明的前述嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)在比當(dāng)利用非融合sIL-6R和IL-6的混合物需要的濃度更低的濃度引起高度惡性哺乳動(dòng)物細(xì)胞如F10.9黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。這是考慮了F10.9黑素瘤細(xì)胞當(dāng)利用單獨(dú)的IL-6或sIL-6R處理時(shí)繼續(xù)正常生長(zhǎng)并且只有當(dāng)接觸相對(duì)高劑量的非融合IL-6和sIL-6R的聯(lián)合時(shí)抑制生長(zhǎng)的事實(shí)后特別明顯的結(jié)果。因此，本發(fā)明的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)是比它的單獨(dú)部分的混合物，即非融合IL-6和sIL-6R的混合物更具潛力的高度惡性黑素瘤細(xì)胞的抑制劑。所以，本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)特定地可用作治療各種癌癥的活性成份。
嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)的較高的活性是通過比非融合IL-6和sIL-6R的混合物更高的gp130親和力說明的(實(shí)施例7)。
另外，根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)(參見下面實(shí)施例4)，本發(fā)明的嵌合sIL-6R/IL-6分子特定地可用于增強(qiáng)骨髓移植。事實(shí)上，利用已知方案在嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠中移入人骨髓細(xì)胞，其中干細(xì)胞因子(SCF)和Flt3配體可用于使大多數(shù)能夠長(zhǎng)期移入受體骨髓的原始多能造血干細(xì)胞生存和增殖，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)因子，SCF和Flt3配體對(duì)于促進(jìn)人細(xì)胞移入受體小鼠骨髓是不夠的，并且這只是當(dāng)同時(shí)加入嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)時(shí)移入成功。這一發(fā)現(xiàn)表明在這樣的移入方案中嵌合蛋白質(zhì)是必需的。在同樣的實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)獨(dú)立地加入時(shí)，非融合IL-6和sIL-6R對(duì)于促進(jìn)成功的骨髓移植是不夠的，并且當(dāng)一起加入時(shí)，比嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)活性更少，即在100納克/毫升的有效濃度時(shí)，sIL-6R/IL-6嵌合蛋白質(zhì)促進(jìn)成功的骨髓移植，而當(dāng)一起加入時(shí)，甚至在較高的濃度(sIL-6R從125～1250納克/毫升，IL-6從50～200納克/毫升)，兩個(gè)獨(dú)立的非融合sIL-6R和IL-6在促進(jìn)這樣的移植時(shí)活性更少。
優(yōu)選地，本發(fā)明上述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)是人細(xì)胞或任何適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，如能夠與人細(xì)胞一樣糖基化蛋白質(zhì)，并且如人細(xì)胞一樣導(dǎo)入翻譯后修飾的倉鼠CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的重組糖基化sIL-6R/IL-6嵌合體。一個(gè)重要的特征是除了在嵌合蛋白質(zhì)的sIL-6R和IL-6成份之間摻入了非常短的三肽或較長(zhǎng)的接頭肽以外，這樣產(chǎn)生的嵌合糖蛋白是如人體中發(fā)現(xiàn)的天然sIL-6R和IL-6親代分子一樣沒有截短，沒有加入外部非天然多肽序列。
為了制備上述本發(fā)明的優(yōu)選的嵌合蛋白質(zhì)，應(yīng)該考慮天然存在的sIL-6R和IL-6的如下特征已知存在于人細(xì)胞膜的IL-6R是編碼含有信號(hào)肽，免疫球蛋白(Ig)狀區(qū)，細(xì)胞因子結(jié)合區(qū)，跨膜區(qū)和細(xì)胞質(zhì)區(qū)的468個(gè)氨基酸的cDNA產(chǎn)生的(Yamasaki等人，1988)。在體液中發(fā)現(xiàn)的sIL-6R的可溶形式，如來自膜的成熟IL-6R，具有對(duì)應(yīng)于Leu-20的N末端(Novick等人，1990)和對(duì)應(yīng)于剛剛在IL-6R的跨膜區(qū)之前的Val-356的C末端(參見共同擁有的美國專利第5,216,128號(hào)，和歐洲專利413.908 B1)。為了將這一sIL-6R序列與IL-6融合，在Val-356之后導(dǎo)入EcoRI限制位點(diǎn)。在這一EcoRI位點(diǎn)之后導(dǎo)入了在IL-6cDNA的Pro-29開始和在Met-212結(jié)束的成熟IL-6的序列(Zilberstein等人，1986；Hirano等人，1986)。在這一EcoRI位點(diǎn)中，同時(shí)可以，但不是必須的，導(dǎo)入需要長(zhǎng)度的接頭肽以便在嵌合蛋白質(zhì)中隔離sIL-6R和IL-6成份。正如下面的實(shí)施例中所述，正如這樣的可能的嵌合蛋白質(zhì)的實(shí)施例產(chǎn)生了兩個(gè)不同的嵌合蛋白質(zhì)，在這一EcoRI位點(diǎn)，一個(gè)具有三肽接頭，另一個(gè)具有13個(gè)氨基酸殘基接頭，二者具有基本等同的生物活性。
本發(fā)明也涉及上述嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)的類似物，該類似物基本保留了只具有sIL-6R和IL-6的天然存在序列的嵌合蛋白質(zhì)的相同的生物活性。這樣的類似物可以是在嵌合蛋白質(zhì)的sIL-6R和/或IL-6成份中缺失，疊加或被其它替代了多達(dá)30個(gè)氨基酸殘基的一個(gè)類似物，以致這樣的修飾相對(duì)于嵌合蛋白質(zhì)本身沒有改變嵌合蛋白質(zhì)類似物的生物活性，并且其中這樣的類似物的sIL-6R成份保留了信號(hào)肽，Ig狀區(qū)，細(xì)胞因子受體N區(qū)，細(xì)胞因子受體C區(qū)，和受體膜前區(qū)的天然存在結(jié)構(gòu)(在加工之前，參見圖3)。同樣，這樣的嵌合蛋白類似物應(yīng)該基本保留IL-6成份的天然存在的成熟形式。各種類似物大多數(shù)可以在嵌合蛋白質(zhì)分子中連接sIL-6R和IL-6成份的接頭肽的位點(diǎn)相互區(qū)別和區(qū)別于基本的嵌合蛋白質(zhì)分子(只基本含有天然存在的sIL-6R和IL-6序列)。這樣的接頭可以多達(dá)30個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度，作用是在嵌合蛋白質(zhì)中使sIL-6R和IL-6成份相互分離。關(guān)于這樣的接頭，應(yīng)該小心選擇它的序列(所以也在適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)測(cè)試中生物學(xué)地測(cè)試每個(gè)這樣的類似物)，以致將不導(dǎo)致使它失活的嵌合蛋白質(zhì)的不正確的折疊，或?qū)⒉粚?dǎo)致使嵌合蛋白質(zhì)類似物成為引發(fā)抗待治療的病人中的抗體的免疫原蛋白質(zhì)，此外的結(jié)果是將這樣的類似物至少作為中期或長(zhǎng)期藥劑是無效的。
關(guān)于上述本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)的類似物，這些類似物是其中不同的氨基酸殘基替代了一個(gè)或多個(gè)和多達(dá)約30個(gè)本發(fā)明的基本嵌合蛋白質(zhì)的氨基酸殘基，或缺失，或在本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)原始序列(基本含有天然存在的sIL-6R和IL-6序列)中附加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，而與本發(fā)明的基本嵌合蛋白質(zhì)比較，沒有相當(dāng)大地改變得到的產(chǎn)物的活性。通過已知的合成和/或定位誘變技術(shù)或其任何其它已知的技術(shù)可以制備這些類似物。
任何這樣的類似物優(yōu)選地具有足夠復(fù)制基本sIL-6R/IL-6嵌合體的氨基酸序列，如具有其基本相似的活性。所以，可以確定通過包括將類似物進(jìn)行下面的實(shí)施例2～4闡述的生物活性測(cè)試的常規(guī)實(shí)驗(yàn)，是否任何給定的類似物基本具有如本發(fā)明的基本嵌合蛋白質(zhì)的相同的活性。
根據(jù)本發(fā)明所用的嵌合蛋白質(zhì)的類似物，或編碼其的核酸包括如本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明表示的技術(shù)和指導(dǎo)不經(jīng)過實(shí)驗(yàn)可以常規(guī)獲得的取代肽或聚核苷酸的有限套數(shù)的基本對(duì)應(yīng)序列。對(duì)于蛋白質(zhì)化學(xué)和結(jié)構(gòu)的詳細(xì)說明，參見Schulz，G.E.等人，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的原理，Springer-Verlag，紐約，1978；和Creighton，T.E.，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子特性，W.H.Freeman和Co.舊金山，1983，它們都引入本發(fā)明作為參考。對(duì)于核苷酸序列替代的表示，如密碼子優(yōu)先，參見Ausubel等人，出處同上，在A.1.1-A.1.24和Sambrook等人，分子生物學(xué)的當(dāng)前方案，Interscience組約，6.3和6.4章(1987，1992)，在附錄的C和D。
本發(fā)明的類似物的優(yōu)選的變化是已知的″保守″替代。在基本具有天然存在的sIL-6R和IL-6序列的嵌合蛋白質(zhì)中的保守氨基酸替代可以包括在具有足夠相似的生化特性的基團(tuán)內(nèi)的同義氨基酸，在基團(tuán)的成員之間的替代將保留分子的生物學(xué)功能，Grantham，科學(xué)，185卷，862～864(1974)。在上面定義的序列中也可以進(jìn)行插入和缺失氨基酸而不改變它們的功能，特別是如果插入或缺失只包括幾個(gè)氨基酸，例如在30個(gè)以下，并且優(yōu)選地在10個(gè)以下，并且不除去或替代功能構(gòu)型的關(guān)鍵氨基酸，例如半胱氨酸殘基，Anfinsen，″控制蛋白質(zhì)鏈的折疊的原理″，科學(xué)，181卷，223～230(1973)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，出現(xiàn)了這樣的缺失和/或插入產(chǎn)生的類似物。
優(yōu)選地，同義氨基酸基團(tuán)是表I中定義的那些。更優(yōu)選地，同義氨基酸基團(tuán)是表II中定義的那些。并且最優(yōu)選地，同義氨基酸基團(tuán)是表III中定義的那些。表I同義氨基酸的優(yōu)選基團(tuán)氨基酸 同義基團(tuán)Ser Ser，Thr，Gly，AsnArg Arg，Gln，Lys，Glu，HisLeu Ile，Phe，Tyr，Met，Val，LeuPro Gly，Ala，Thr，ProThr Pro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，ThrAla Gly，Thr，Pro，AlaVal Met，Tyr，Phe，Ile，Leu，ValGly Ala，Thr，Pro，Ser，GlyIle Met，Tyr，Phe，Val，Leu，IlePhe Trp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，PheTyr Trp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，TyrCys Ser，Thr，CysHis Glu，Lys，Gln，Thr，Arg，HisGln Glu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，GlnAsn Gln，Asp，Ser，AsnLys Glu，Gln，His，Arg，LysAsp Glu，Asn，AspGlu Asp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，GluMet Phe，Ile，Val，Leu，MetTrp Trp表II同義氨基酸的更優(yōu)選的基團(tuán)氨基酸同義基團(tuán)Ser SerArg His，Lys，ArgLeu Leu，Ile，Phe，MetPro Ala，ProThr ThrAla Pro，AlaVal Val，Met，IleGly GlyIle Ile，Met，Phe，Val，LeuPhe Met，Tyr，Ile，Leu，PheTyr Phe，TyrCys Cys，SerHis His，Gln，ArgGln Glu，Gln，HisAsn Asp，AsnLys Lys，ArgAsp Asp，AsnGlu Glu，GlnMet Met，Phe，Ile，Val，LeuTrp Trp表III同義氨基酸的最優(yōu)選的基團(tuán)氨基酸 同義基團(tuán)SerSerArgArgLeuLeu，Ile，MetProProThrThrAlaAlaValValGlyGlyIleIle，Met，LeuPhePheTyrTyrCysCys，SerHisHisGlnGlnAsnAsnLysLysAspAspGluGluMetMet，Ile，LeuTrpMet
在可用于獲得本發(fā)明的嵌合蛋白的類似物的蛋白質(zhì)中產(chǎn)生氨基酸替代的例子包括任何已知方法的步驟，如授予Mark等人的美國專利RE33,653，4,959,314，4,588,585和4,737,462；授予Koths等人的5,116,943；授予Namen等人的4,965,195；授予Chong等人的4,879,111；和授予Lee等人的5,017,691中表示的，和美國專利第4,904,584號(hào)中表示的賴氨酸替代的蛋白質(zhì)(Shaw等人)。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，用于本發(fā)明的任何嵌合蛋白質(zhì)的類似物具有基本對(duì)應(yīng)于上面提到的本發(fā)明的基本嵌合蛋白質(zhì)的氨基酸序列。術(shù)語″基本對(duì)應(yīng)于″是用于理解含有不影響特別是在它涉及抑制癌細(xì)胞增殖或促進(jìn)骨髓移植的能力的范圍中，其基本特征的基本嵌合蛋白質(zhì)的序列的變化最小的類似物。通常認(rèn)為是在″基本對(duì)應(yīng)于″的范圍內(nèi)的變化的類型是從編碼本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)的DNA的常規(guī)誘變技術(shù)產(chǎn)生的，導(dǎo)致少數(shù)幾個(gè)小的修飾，并且以上面討論的方式篩選需要的活性。
本發(fā)明的類似物包括與DNA或RNA在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼基本含有所有編碼sIL-6R和IL-6的天然存在序列的本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)的核酸如DNA或RNA編碼的那些。例如，這樣的雜交DNA或RNA可以是編碼具有例如圖3中闡述的序列，但由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性即，由于這一簡(jiǎn)并性一些不同核苷酸序列仍然編碼相同的氨基酸序列，與天然起源的核苷酸序列有核苷酸序列區(qū)別的相同蛋白質(zhì)的一個(gè)。另外，正如上面也提到的，氨基酸變化(缺失，疊加，替代)的量限制在約30個(gè)氨基酸，以致變化的量最大，本發(fā)明的類似物將是基本保留在sIL-6R成份中的引導(dǎo)序列(在加工之前)，Ig狀區(qū)，細(xì)胞因子受體N-和C-區(qū)和受體膜前區(qū)(在C區(qū)和跨膜區(qū)之間的區(qū))和基本所有的IL-6成份的那些。這樣的核酸可作為確定是否它編碼保留本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)的功能活性的多肽的引物候選物。術(shù)語″嚴(yán)格條件″指本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)稱為″嚴(yán)格″的那些雜交和隨后的洗滌條件。參見Ausubel等人，分子生物學(xué)中的當(dāng)前方案，出處同上，Interscience，紐約，6.3和6.4章，(1987，1992)，和Sambrook等人，出處同上。沒有限制地，嚴(yán)格條件的例子包括比研究的雜交的計(jì)算Tm低12～20℃，例如2×SSC和0.5％ SDS 5分鐘，2×SSC和0.1％ SDS15分鐘，0.1×SSC和0.5％ SDS 37℃ 30～60分鐘，然后，在68℃0.1×SSC和0.5％ SDS 30～60分鐘的洗滌條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的嚴(yán)格條件依賴于DNA序列的長(zhǎng)度，寡核苷酸探針(如10～40個(gè)堿基)或混合的寡核苷酸探針。如果利用了混合的探針，優(yōu)選四甲基氯化銨(TMAC)而不是SSC。參見Ausubel，出處同上。
本發(fā)明的術(shù)語″鹽″指本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)或其類似物的羧基基團(tuán)的鹽和氨基基團(tuán)的酸加入鹽。通過本領(lǐng)域已知的方法可以形成羧基基團(tuán)的鹽，包括無機(jī)鹽，例如，鈉，鈣，銨，鐵或鋅鹽等，和例如與胺，如三乙醇胺，精氨酸，或賴氨酸，哌啶，普魯卡因等形成的有機(jī)堿性鹽。酸加入鹽包括例如，與礦質(zhì)酸如鹽酸或硫酸的形成鹽，和與有機(jī)酸如乙酸或草酸形成的鹽。當(dāng)然，任何這樣的鹽必須基本具有與本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)或它的類似物相似的活性。
本發(fā)明也涉及編碼上述嵌合蛋白質(zhì)及其類似物的DNA序列以及在適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物中，優(yōu)選地人細(xì)胞中攜帶表達(dá)這樣的DNA序列的DNA載體。本發(fā)明的載體的實(shí)施例是含有包括在巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子控制下的sIL-6R/IL-6融合序列的pcDNA3載體(Invitrogen)的質(zhì)粒pcDNA sIL-6R/IL-6。
本發(fā)明也涉及能夠表達(dá)上述蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物優(yōu)選地人細(xì)胞。這樣的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的實(shí)施例是分泌85千道爾頓糖蛋白的融合sIL-6R/IL-6嵌合體的pcDNA sIL-6R/IL-6轉(zhuǎn)染的人胚腎細(xì)胞293(HEK293，ATCC CRL1573)。
其它實(shí)施例是與上述pcDNA sIL-6R/IL-6區(qū)別在于在EcoRI位點(diǎn)插入了編碼10個(gè)另外的氨基酸的短接頭的質(zhì)粒pcDNA sIL-6R/L/IL-6?？梢詫?dǎo)入許多各種長(zhǎng)度的不同序列以便使sIL-6R和IL-6之間的距離最佳化。
本發(fā)明也包括IL-6成份在sIL-6R之前的嵌合蛋白質(zhì)(正如圖11所示)。
本發(fā)明另外涉及生產(chǎn)和純化本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)或其類似物的方法，包括在適于將嵌合蛋白質(zhì)產(chǎn)物表達(dá)和分泌進(jìn)入培養(yǎng)基的條件下生長(zhǎng)上面的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后通過利用下面實(shí)施例2和5提到的抗sIL-6R單克隆抗體34.4的免疫親和層析純化分泌的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明也涉及含有作為活性成份的sIL-6R/IL-6嵌合體或其類似物或其混合物或其鹽和藥物可接受載體，稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物的實(shí)施例包括增強(qiáng)IL-6型反應(yīng)的藥物組合物，用于治療癌癥，用于骨髓移植，用于增加血細(xì)胞生成，特別是凝血細(xì)胞生成，用于治療神經(jīng)系統(tǒng)病癥，用于治療肝紊亂，與IL-6或相關(guān)細(xì)胞因子的其它用途。
通過將嵌合蛋白質(zhì)或它的類似物與生理可接受載體，和/或穩(wěn)定劑和/或賦形劑混合，并通過在劑量小瓶中凍干制備成劑量形式制備用于給藥的本發(fā)明的藥物組合物。給藥的方法可以通過相似試劑的任何可接受的給藥方式，并且將取決于待治療的病癥，例如靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，皮下，通過局部注射或局部應(yīng)用，或連續(xù)地輸入等。待給藥的活性化合物的量取決于給藥的途徑，待治療的疾病，和病人的癥狀。例如局部注射在體重基礎(chǔ)上將需要比靜脈內(nèi)輸入更低的蛋白質(zhì)的量。
本發(fā)明也涉及利用嵌合蛋白質(zhì)或它的類似物或其混合物用于治療癌癥，用于骨髓移植，用于增強(qiáng)血細(xì)胞生成，特別是凝血細(xì)胞生成，用于治療神經(jīng)系統(tǒng)病癥，用于保護(hù)由于化學(xué)物(例如，四氯化碳，乙醇，paracetamol)或其它原因(例如病毒，外傷)的壞死性疾病的病人中的肝組織和用于IL-6或相關(guān)細(xì)胞因子的其它用途。同樣，本發(fā)明也涉及用于制備治療上面提到的病癥或用于上面提到的適應(yīng)癥的藥劑中的嵌合蛋白質(zhì)或其類似物或其混合物。
除了上面提到的治療方法，也涉及了利用該嵌合體和/或編碼它的DNA的來自體內(nèi)的過程和基因治療方案。
在下面的非限制性實(shí)施例和附圖中將更詳細(xì)地說明本發(fā)明。
實(shí)施例1構(gòu)建sIL-6RδVal/IL-6嵌合體表達(dá)載體在圖1A～圖1C中，顯示除了所有各種起始和中間載體，各種試劑和反應(yīng)步驟，構(gòu)建攜帶編碼sIL-6RδVal/IL-6嵌合蛋白質(zhì)的序列的表達(dá)載體的步驟的流程圖。這一構(gòu)建步驟基本利用了本領(lǐng)域已知的構(gòu)建選擇的表達(dá)載體的技術(shù)(參見，例如Sambrook等人，1989)，過程簡(jiǎn)要如下在(λ)gt11噬菌體中克隆來自人胸癌T47D細(xì)胞的cDNA文庫，并且利用起源于Yamasaki等人(1988)的IL-6R序列的寡核苷酸探針篩選。分離了具有整個(gè)人IL-6R編碼序列的一個(gè)λgt11cDNA克隆。從λgt11通過EcoRI切出插入片斷，并且克隆在大腸桿菌噬菌體質(zhì)粒Blue Script pBS/SK(Stratagene克隆系統(tǒng)，LaJolla，加利福尼亞)的多克隆位點(diǎn)(MCS)中。通過EcoRI切出這一質(zhì)粒pBS/SK-IL-6R(圖1)，然后末端平齊化，再利用EcoRV裂解分離在IL-6R的EcoRV位點(diǎn)為末端的959堿基對(duì)(bp)的IL-6R的5’片斷(等同1203)。在MCS的EcoRV裂開的新的pBS/SK載體中克隆從瓊脂糖凝膠電泳提取的這一片斷(圖1中的pBS/SK-sIL-6R-RV)。
將上面提到的前面獲得的pBS/SK-IL-6R DNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)以便在正向的引物1137～1156和反向的引物1505～1488之間擴(kuò)增368bp的片斷。利用剛剛在IL-6R的Val-356密碼子之后的EcoRI位點(diǎn)合成反向引物(參見圖1)，因?yàn)榍懊嬉呀?jīng)確定了Val殘基是在人尿中揮發(fā)的可溶性sIL-6R的天然形式的羧基末端氨基酸(Novick等人，1990；Oh等人，1996，共同擁有的美國專利第5,216,128號(hào)和歐洲專利第413908B1號(hào))。通過EcoRV和EcoRI；裂解PCR產(chǎn)物，并且連接進(jìn)入IL-6R的EcoRV位點(diǎn)和MCS的EcoRI位點(diǎn)之間的pBS/SK-sIL-6R-RV(圖1)。然后通過連接MCS的HindIII位點(diǎn)和在IL-6R的堿基對(duì)410的NcoI位點(diǎn)(兩個(gè)位點(diǎn)首先末端平齊化)除去5’未翻譯序列縮短得到的質(zhì)粒pBS-sIL-6R-δVal-RI，以便產(chǎn)生pBS-sIL-6R-δVal-RI-NcoI收率(圖1)。
IL-6序列起源于質(zhì)粒pKKβ2～7，如前所述(Chen等人，1988)是通過利用含有接著甲硫氨酸密碼子和IL-6的Proline-29密碼子的EcoRI位點(diǎn)，結(jié)束在BstNI(EcoRII)位點(diǎn)的合成寡核苷酸，在大腸桿菌表達(dá)載體pKK223-3(Pharmacia，Uppsala，Sweden)的EcoRI位點(diǎn)中插入BstNI裂解的IFN-β2/IL-6 cDNA(Zilberstein等人，1986)構(gòu)建的。pKK2～7的IL-6cDNA插入片斷結(jié)束在NlaIV位點(diǎn)中的終止密碼子的7個(gè)堿基對(duì)，并且接著11bp的pKK223-3載體的HindIII位點(diǎn)(圖1)。利用HindIII裂解pKKβ2～7DNA，末端平齊化，利用EcoRI再裂解，并且在pBS-sIL-6R-δVal-RI-NcoI中插入IL-6cDNA以致立即在IL-6R的Val356之后融合IL-6的成熟序列(在Pro-29開始)，由3個(gè)密碼子分開(Glu-Phe-Met)。然后，在它的MCS的SalI和NotI位點(diǎn)再裂解得到的質(zhì)粒pBS/SK-sIL-6R/IL-6(圖1)，并且在pcDNA3(Invitrogen公司，圣迭戈，加利福尼亞)的EcoRV位點(diǎn)中克隆插入片斷。得到的質(zhì)粒pCDNA3-sIL-6R/IL-6(圖1)含有強(qiáng)巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子下游的插入片斷，接著是保證sIL-6RδVal/IL-6嵌合體的有效轉(zhuǎn)錄的多聚腺苷酸化位點(diǎn)。在嵌合體中sIL-6R的5’末端的保守性保證了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)的基礎(chǔ)上，嵌合蛋白質(zhì)的信號(hào)肽功能和N末端的加工將如天然sIL-6R中。
正如上面指出的，sIL-6RδVal/IL-6構(gòu)建體的有利特征是sIL-6R的天然形式和IL-6的天然形式的融合是基本的，因?yàn)樗鼈兇嬖谟谌梭w中，并且沒有外部的多肽序列。但是，在sIL-6RδVal/IL-6構(gòu)建體中EcoRI位點(diǎn)的保守性(圖1)允許在sIL-6R和IL-6成份之間容易地導(dǎo)入接頭多肽區(qū)段。同時(shí)構(gòu)建了含有導(dǎo)入在sIL-6R的Val-356和IL-6的Pro-29之間的13個(gè)氨基酸接頭序列Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met的構(gòu)建體(sIL-6RδVal/L/IL-6)。
實(shí)施例2在人細(xì)胞中表達(dá)sIL-6RδVal/IL-6嵌合體利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物的基本標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染和用于待表達(dá)的新導(dǎo)入DNA序列的表達(dá)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的分析(方法參見例如，Sambrook等人，1989)，利用上面的質(zhì)粒構(gòu)建體(實(shí)施例1)轉(zhuǎn)染人細(xì)胞并且評(píng)估其中的表達(dá)。簡(jiǎn)言之，利用了下面的方法利用質(zhì)粒構(gòu)建體pCDNA3-sIL-6R/IL-6DNA轉(zhuǎn)染人HEK293細(xì)胞(ATCC CRL1573轉(zhuǎn)化的初級(jí)人胚腎細(xì)胞)(在上面的實(shí)施例1中闡述的)。將對(duì)數(shù)期HEK293培養(yǎng)物胰蛋白酶化，在9厘米的Nunc平板上播種(2.5×106細(xì)胞/平板)。一天后，通過CaPO4沉淀方法，利用10微克pCDNA3-sIL-6R/IL-6DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染(Sambrook等人，1989)，1小時(shí)后將培養(yǎng)基改變成DMEM-10％FCS和連續(xù)培養(yǎng)另外16小時(shí)。在將培養(yǎng)基改變成DMEM-2％FCS后，在兩個(gè)連續(xù)的48小時(shí)的時(shí)期內(nèi)收集分泌的蛋白質(zhì)。通過在1,000rpm除去碎片10分鐘，利用多克隆兔抗sIL-6R和小鼠McAB 17.6通過ELISA測(cè)試上清液的sIL-6R(Novick等人，1991)。發(fā)現(xiàn)1.2微克/毫升濃度的sIL-6R等當(dāng)物，表明在轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞中嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)的表達(dá)非常有效。
利用特異于人sIL-6R的細(xì)胞外區(qū)中的表位的單克隆抗體34.4進(jìn)行分泌的嵌合蛋白質(zhì)(sIL-6R/IL-6)的免疫純化(Novick等人，1991；Halimi等人，1995)。在小鼠的腹膜腔中生長(zhǎng)34.4雜交瘤細(xì)胞，并且通過硫酸銨沉淀從腹水中獲得的免疫球蛋白(Ig)部分。利用親和凝膠-10(Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室，Richmond，加利福尼亞)固定McAB34.4(與1毫升親和凝膠-10偶聯(lián)的15毫克Ig)。在McAB 34.4的柱上吸收含有pCDNA3-sIL-6R/IL-6轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)的上清液(0.3毫升柱吸收15毫升上清液)。在利用PBS洗滌后，通過25毫摩爾檸檬酸pH2.5洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)，然后利用1摩爾/升Hepes緩沖液pH8.5立即中和，并且對(duì)PBS過夜透析(約8～12小時(shí))。
在SDS中聚丙烯酰胺凝膠電泳的免疫純化蛋白質(zhì)的分析顯示了考馬斯藍(lán)染色的獨(dú)特的蛋白質(zhì)帶(圖2)。如預(yù)期的來自sIL-6RδVal的糖基化形式(在Oh等人，1996表示的是60千道爾頓)和糖基化IL-6(如Zilberstein等人，1986表示的23～26千道爾頓)的融合的蛋白質(zhì)分子量是85千道爾頓。sIL-6R/IL-6的氨基酸序列是543個(gè)氨基酸，在信號(hào)肽加工后預(yù)測(cè)它是524個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)或約58千道爾頓(圖3)。從人細(xì)胞中的重組DNA產(chǎn)生的sIL-6R/IL-6嵌合體的較大的尺寸表明了分子相當(dāng)大的部分的糖基化的量。
實(shí)施例3sIL-6R/IL-6嵌合體抑制轉(zhuǎn)移的黑素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)它的分化從B16黑素瘤細(xì)胞起源的F10.9克隆在C57黑/6小鼠中形成高度轉(zhuǎn)移的腫瘤，在2～3個(gè)月內(nèi)由于肺轉(zhuǎn)移而殺死動(dòng)物(Katz等人，1995)。在F10.9細(xì)胞培養(yǎng)物中加入sIL-6R/IL-6嵌合蛋白質(zhì)在細(xì)胞中產(chǎn)生深遠(yuǎn)的形態(tài)學(xué)變化，并且抑制它們的生長(zhǎng)(圖4)。嵌合體處理的F10.9細(xì)胞變得延長(zhǎng)了，突出了擴(kuò)展的樹枝狀細(xì)胞，組裝了胚黑素細(xì)胞或膠質(zhì)細(xì)胞的紡錘分化。
在含有10％FCS的0.2毫升RPMI1640培養(yǎng)基中在96孔微滴平板的孔中播種3×103個(gè)細(xì)胞之后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)量4天。在12.5％戊二醛中固定細(xì)胞30分鐘，在水中洗滌和利用0.1％結(jié)晶紫染色30分鐘。在完全洗滌和干燥之后，通過10％乙酸提取顏色，在540納米處確定光密度。嵌合體產(chǎn)生依賴劑量的生長(zhǎng)抑制，在低至10納克/毫升的嵌合(p85)蛋白的濃度下完全抑制生長(zhǎng)(圖5)。嵌合蛋白質(zhì)sIL-6RδVal/IL-6和sIL-6RδVal/L/IL-6(在sIL-6R和IL-6成份之間含有較長(zhǎng)接頭的嵌合體，參見實(shí)施例1)的活性相似。這一結(jié)果也可顯示在嵌合體的sIL-6R和IL-6成份之間的接頭肽不是嵌合體的活性所必需的，如上面的sIL-6RδVal/IL-6嵌合體只具有非常短的3個(gè)氨基酸接頭，而上面的sIL-6RδVal/L/IL-6具有較長(zhǎng)的13個(gè)氨基酸接頭肽，但兩者在抑制這些轉(zhuǎn)移細(xì)胞的生長(zhǎng)時(shí)基本具有相同的活性。相反，IL-6或sIL-6RδVal都不單獨(dú)抑制這些黑素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖6)證明了sIL-6R/IL-6(p85)嵌合體蛋白質(zhì)的獨(dú)特活性。為了獲得相似的效果，需要200～400納克/毫升IL-6和125納克/毫升sIL-6RδVal的混合物(圖6)。當(dāng)以摩爾濃度計(jì)算時(shí)，F(xiàn)10.9細(xì)胞的最大抑制需要7.5納摩爾/升IL-6和2納摩爾/升sIL-6RδVal僅對(duì)0.12納摩爾/升的sIL-6R/IL-6嵌合體。
在McAB 34.4柱上免疫純化過程中，接著p85 sIL-6R/IL-6嵌合蛋白質(zhì)的生長(zhǎng)抑制活性的測(cè)定(參見實(shí)施例2)。對(duì)應(yīng)于p85帶的強(qiáng)度的活性圖譜可在圖2中的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的不同部分觀察到。
實(shí)施例4sIL-6R/IL-6嵌合體對(duì)于人骨髓移植細(xì)胞的移入是必需的在移植進(jìn)入嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷的(SCID)小鼠中后可以研究來自人骨髓的血細(xì)胞生成干細(xì)胞的移入(Vormoor等人，1994)。將SCID-NOD小鼠進(jìn)行亞致死照射，并且在尾靜脈注射3×105人CD34+骨髓細(xì)胞。注射之前，在含有不同細(xì)胞因子聯(lián)合的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)純化的CD34+細(xì)胞3天。一個(gè)月之后，殺死小鼠，取骨收集骨髓細(xì)胞。通過與人重復(fù)DNA進(jìn)行DNA印跡影印雜交評(píng)估SCID-NOD受體小鼠中人細(xì)胞的移入。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)于能夠在受體骨髓中長(zhǎng)期移入的大多數(shù)初級(jí)多能血生成干細(xì)胞的生存和增殖，干細(xì)胞因子(SCF，青灰因子或ckit配體)和Flt3配體(flt3/flk2酪氨基酸激酶受體配體)是重要的(McKenna等人，1995)。正如圖7所示，這兩個(gè)因子本身對(duì)于促進(jìn)在SCID-NOD受體小鼠的骨髓中移入人細(xì)胞是不夠的。移入需要加入sIL-6R/IL-6嵌合蛋白質(zhì)到可檢測(cè)的明顯水平。在100納克/毫升，sIL-6R/IL-6嵌合體比分離的IL-6(50～200納克/毫升)和sIL-6R(125～1250納克/毫升)更加有活性(圖7)。需要sIL-6R/IL-6嵌合體表明這一蛋白質(zhì)是可以寄居在和再寄居于骨髓環(huán)境的非定型多能血細(xì)胞生成干細(xì)胞的生存和增殖所必須的，表明這一蛋白質(zhì)可用于骨髓移植臨床方案。
這是第一次證明了sIL-6R/IL-6嵌合體至少具有下面兩個(gè)新發(fā)現(xiàn)的活性(i)當(dāng)與SCF和Flt3配體一起加入到人血細(xì)胞生成初級(jí)原始細(xì)胞中時(shí)，它促進(jìn)它們的生存和增殖；和(ii)在免疫缺陷的小鼠中的人骨髓移植的體內(nèi)模型中它是有活性的(明顯是必需的)。
實(shí)施例5在高度純化的初級(jí)造血干細(xì)胞上sIL-6R/IL-6嵌合體是活化的在Ficoll-Paque(Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)上進(jìn)行人帶血液?jiǎn)魏思?xì)胞的分級(jí)分離低密度單核細(xì)胞(NMC)，接著利用miniMACS試劑盒(Miltney Biotec，Bergisch Gladbach，德國)以便制備80％純度的CD34+細(xì)胞的群體。然后，將這些細(xì)胞通過固定的抗CD38單克隆抗體或通過熒光活化細(xì)胞分揀，回收對(duì)應(yīng)于約0.1％原始細(xì)胞的CD34+CD38-群體。將這些純化的干細(xì)胞(20,000個(gè)細(xì)胞)放置于含有50納克/毫升的干細(xì)胞因子(SCF)和100納克/毫升flt3-ligang(FL)(兩者都來自R和D系統(tǒng)，Minneapolis，MN)的0.5毫升RPMI培養(yǎng)基，10％胎牛血清(FCS)，1％小牛血清白蛋白中懸浮培養(yǎng)。將培養(yǎng)基的一半補(bǔ)充100納克/毫升的sIL-6R/IL-6嵌合體，其它沒有補(bǔ)充培養(yǎng)。在5％CO2，37℃溫育6天。通過注射(i.v)來自體內(nèi)培養(yǎng)物的所有細(xì)胞進(jìn)入亞致死照射的NOD-SCID小鼠中評(píng)估骨髓再寄生細(xì)胞的數(shù)目。在無菌條件下培養(yǎng)小鼠。在6星期后，殺死小鼠，回收它們的長(zhǎng)骨的骨髓。在含有30％FCS，50微摩爾β-巰基乙醇，50納克/毫升SCF，5納克/毫升IL-3，5納克/毫升GM-CSF，6單位/毫升紅細(xì)胞生成素(所有是R&D系統(tǒng))的半固體0.9％甲基纖維素平板上涂布這些骨髓(BW)細(xì)胞。培養(yǎng)基也含有人血清，調(diào)節(jié)到預(yù)防小鼠菌落的生長(zhǎng)。結(jié)果(表IV)表明在懸浮培養(yǎng)物中加入的sIL-6R/IL-6嵌合體與SCF和FL分別比較產(chǎn)生的從移植的小鼠中回收的人菌落形成細(xì)胞(CFU)的數(shù)目增強(qiáng)了30～50倍。這表示在6天比較0天，存在于懸浮培養(yǎng)物中的SCID再寄生干細(xì)胞的數(shù)目有大的增加。在缺乏sIL-6R/IL-6嵌合體時(shí)，在懸浮培養(yǎng)的6天中，SCF和FL產(chǎn)生的干細(xì)胞的數(shù)目沒有增加。通過實(shí)施例4中的DNA印跡影印分析從移植的NOD/SCID小鼠回收的BM細(xì)胞的DNA。當(dāng)小鼠接受利用嵌合體培養(yǎng)的細(xì)胞時(shí)，與沒有嵌合體比較，回收的人DNA的量高10倍。
如表IV中來自NOD/SCID小鼠的骨髓的CFU祖先只有當(dāng)人血細(xì)胞已經(jīng)在移植之前與sIL-6R/IL-6嵌合體培養(yǎng)時(shí)，才產(chǎn)生不同髓血統(tǒng)(巨嗜細(xì)胞和粒細(xì)胞)以及紅細(xì)胞類和淋巴類血統(tǒng)(例如，CD19+，CD56+)的造血細(xì)胞。表IV能夠再寄居NOD/SCID小鼠的骨髓的人軀干細(xì)胞在來自帶血液的CD34+CD38-培養(yǎng)天數(shù) 從移植的NOD/SCID小鼠的人細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)過程中加入BM形成的人造血菌落的數(shù)目0 4SCF+FL 6 2～3SCF+FL+sIL-6R/IL-6 6 50～100其它實(shí)驗(yàn)將sIL-6R/IL-6對(duì)帶血CD34+CD38+群體的影響與更高純化的CD34+CD38-軀干細(xì)胞比較。sIL-6R/IL-6對(duì)高度純化的細(xì)胞的體內(nèi)擴(kuò)展比更不純化的細(xì)胞更加強(qiáng)烈地增強(qiáng)了(表V)。這表明大多數(shù)初級(jí)干細(xì)胞是sIL-6R/IL-6影響細(xì)胞擴(kuò)展的優(yōu)先的靶。表V造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)展播種的細(xì)胞群體 利用SC+FL在6天 利用SC+FL+sIL-6R/IL-6(20,000個(gè)細(xì)胞) 的細(xì)胞數(shù)目 在6天的細(xì)胞數(shù)目實(shí)驗(yàn)1CD34+CD38+780,000 675,000(×0.86)CD34+CD38-42,000 153,000(×3.6)實(shí)驗(yàn)2CD34+CD38+330,000 507,000(×1.5)CD34+CD38-3,00018,000(×6.0)
在NOD/SCID小鼠注射前，通過增強(qiáng)高度純化的CD34+CD38-干細(xì)胞的培養(yǎng)物的懸浮的長(zhǎng)度測(cè)量骨髓再寄居活性的體外維持程度。在注射培養(yǎng)細(xì)胞后6星期，在受體小鼠的骨髓中對(duì)移入人DNA的比例進(jìn)行評(píng)估。在培養(yǎng)過程中，在SCF和FL中加入sIL-6R/IL-6時(shí)，在培養(yǎng)的2星期之后仍然觀察到高的移入(＞1％人DNA)，并且移入高于非培養(yǎng)細(xì)胞。相反，利用含有SCF，F(xiàn)L，GM-CSF，IL-3的培養(yǎng)物的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)顯示在培養(yǎng)1星期后，沒有保留SCID再寄居細(xì)胞(Bhata，M.等人，實(shí)驗(yàn)方法雜志，186，619～624，1997)。
這些結(jié)果顯示sIL-6R/IL-6允許擴(kuò)展和維持了能夠在受體骨髓中移入的人初級(jí)干細(xì)胞。當(dāng)增倍時(shí)，非分化狀態(tài)的干細(xì)胞保留活性。sIL-6R/IL-6嵌合體提供了培養(yǎng)移入造血細(xì)胞的新方法。這也允許利用逆病毒載體在基因治療的方案中，在移入的干細(xì)胞中導(dǎo)入基因。直到現(xiàn)在，這在人干細(xì)胞中還沒有可能性因?yàn)檫@些初級(jí)細(xì)胞正如逆病毒DNA整合需要的循環(huán)周期中不能體外生存。sIL-6R/IL-6嵌合體解決了這一問題。
實(shí)施例6在CHO細(xì)胞中IL-6R/IL-6嵌合體的產(chǎn)生如Mory等人(DNA 5，181-193，1986)所述，圖1中的質(zhì)粒sIL-6R/IL-6pcDNA3的DNA與質(zhì)粒pDHFR的DNA一起共轉(zhuǎn)染進(jìn)入中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。在50納摩爾/升氨甲喋呤中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)染體中，分離克隆L12-[IL-6R/IL-6]。在許多通道中發(fā)現(xiàn)這一克隆是穩(wěn)定的，并且半融合培養(yǎng)物通常分泌培養(yǎng)基，量為2.5微克/毫升IL-6R/IL-6嵌合體。
為了純化IL-6R/IL-6嵌合體，將在2％小牛血清中的克隆L12培養(yǎng)物中的3.25升培養(yǎng)基濃縮到200毫升。在與親和凝膠10小珠偶聯(lián)的18毫升抗人sIL-6R單克隆抗體34.4柱上吸收濃縮物并(Novick等人，雜交瘤，10，137～146，1991)洗脫。利用Hepes緩沖液，pH8.6立即中和25毫摩爾/升檸檬酸洗脫物。在10千道爾頓的截止Amicon膜上濃縮蛋白質(zhì)到最后濃度為1毫克/毫升。在SDS-PAGE上，觀察到對(duì)應(yīng)于IL-6R/IL-6嵌合體的85千道爾頓的單一帶。在利用糖基化酶(Boehringer，Mannheim)處理后，由于大小減少證明了糖基化。發(fā)現(xiàn)在4℃，CHO產(chǎn)生的IL-6R/IL-6嵌合體的生物活性至少穩(wěn)定5個(gè)月，通常儲(chǔ)藏溫度是-70℃。
實(shí)施例7IL-6R/IL-6嵌合體與gp130的親和力將CHO產(chǎn)生的IL-6R/IL-6嵌合體和人IL-6和sIL-6R的混合物與IL-6的受體系統(tǒng)的第二鏈gp130(sgp130)的可溶性形式的結(jié)合進(jìn)行比較(參見背景)。利用抗人gp130單克隆抗體包衣微滴96孔平板(Nunc)并且加入50納克/毫升sgp130(兩者來自R&D系統(tǒng)，Minneapolis)。在磷酸緩沖鹽中洗滌后，在不同的孔中以不同濃度范圍0.1到50納克/毫升加入IL-6R/IL-6嵌合體。在分開的孔中，以500納克/毫升與2到500納克/毫升濃度的人sIL-6RVal一起加入rhuIL-6(Ares-Serono，Geneva)。在4℃溫育過夜后，加入兔多克隆抗IL-6R(Oh等人，細(xì)胞因子，8，401～409，1996)，接著加入顏色反應(yīng)檢測(cè)的與辣根過氧化物酶共軛的山羊抗兔Ig(Sigma，圣路易斯)。圖8顯示了這些結(jié)果的斯卡查德圖。發(fā)現(xiàn)IL-6R/IL-6嵌合體對(duì)于gp130的親和力比分別加入的分子的兩個(gè)部分(6.3×10-11摩爾/升對(duì)2.6×10-10摩爾/升)高4倍以上。這一結(jié)果是在線內(nèi)的，并且比較在黑素瘤和在血細(xì)胞生成細(xì)胞上IL-6+sIL-6R的聯(lián)合，嵌合體具有更高的活性(圖9和實(shí)施例4)。
實(shí)施例8IL-6R/IL-6嵌合體保護(hù)肝毒性在小鼠中注射四氯化碳(CCl4)產(chǎn)生了嚴(yán)重的肝壞死導(dǎo)致動(dòng)物死亡(Slater T.F.等人，Philos.Trans.R.Soc.Biol.Sci.311，633～645，1985)。當(dāng)通過腹膜內(nèi)注射給予通常缺乏IL-6的小鼠相當(dāng)?shù)蛣┝康腃Cl4(2～3毫升/公斤體重)，在24小時(shí)的致死率是70％(圖10)。在CCl4之前1小時(shí)和在CCl4之后4小時(shí)注射CHO生成的IL-6R/IL-6嵌合體，保護(hù)了動(dòng)物，在24小時(shí)沒有看到死亡。相反，游離的rhuIL-6注射同樣沒有效果(圖10)。IL-6R/IL-6嵌合體在每次注射時(shí)劑量為2～3微克是有效的，低于沒有效果的IL-6劑量的10倍的摩爾比例。在更高劑量的CCl4(例如，3.5毫升/公斤，在圖10中)，嵌合體也有保護(hù)性，致死率低于IL-6或沒有細(xì)胞因子的。接受相同的CCl4攻擊的嵌合體處理和未處理小鼠之間致死率的差異很明顯p＜0.01。利用hematoxillin-eosin染色的肝切片的組織學(xué)觀察證明CCl4產(chǎn)生肝組織壞死，并且IL-6R/IL-6嵌合體保護(hù)肝細(xì)胞不受這一化學(xué)物的毒性影響(未示出)。
IL-6R/IL-6嵌合體的應(yīng)用可以保護(hù)由于化學(xué)物(例如，乙醇，paracetamol)或其它原因(例如，病毒性肝炎)患有壞死疾病的病人中的肝組織。
實(shí)施例9IL-6/sIL-6RδVal嵌合體的構(gòu)建和活性構(gòu)建了IL-6成份是在N末端和sIL-6R成份是在C末端的嵌合分子。在Val-356后面和接著終止密碼子的Sau3a(bp1086)和HindIII裂解質(zhì)粒pBS-sIL-6RδVal(參見實(shí)施例1)。如下合成了含有三個(gè)限制位點(diǎn)SpeI，SmaI和BamH1的接頭SpeI SmaI BamH1CT AGT GGG CCC GGG GTG GCG GGA CCC GGG CCC CAC CGC CCC TAG 5’(SEQ ID NO2)將這一sIL-6R的Sau3a的位點(diǎn)與接頭的BamH1連接，并且在Bluescript pBS SK質(zhì)粒的多倍克隆位點(diǎn)中克隆。通過PCR利用引物從pKKβ2-7DNA擴(kuò)增IL-6序列(起始密碼下劃線)SpeI正向5’GA CTA GTA GCTATGAAC TCC TTC TC(SEQ ID NO3)HaeIII反向5’AG GGC CAT TTG CCG AAG AGC C(SEQ ID NO4)在上面的接頭的SpeI和SmaI位點(diǎn)之間導(dǎo)入利用SpeI和HaeIII裂解的PCR產(chǎn)物。如下合成了含有內(nèi)部SmaI的另一個(gè)接頭BamH1-NcoISmaI5’GAT CCG GGC GGC GGG GGA GGG GGG CCC GGG C[NcoI][BamH1] GC CCG CCG CCC CCT CCT CCC GGG CCC GGT AC 5′(SEQ ID NO5)在前面的接頭的BamH1和IL-6R序列的NcoI1464之間克隆它。然后在第二個(gè)接頭的SmaI和IL-6R的NcoI之間導(dǎo)入SmaI 867到NcoI1464的IL-6R片斷。測(cè)序得到的嵌合DNA，并且在pCDNA3中再克隆以便在人HEK 293細(xì)胞中表達(dá)。這一IL-6-IL-6R嵌合體3e的氨基酸序列在圖11中表示了(接頭下劃線)。通過在抗IL-6單克隆抗體上親和層析純化的嵌合體3e(如在Novick等人，雜交瘤8561-567，1989)。在SDS-PAGE上，觀察到了75千道爾頓的帶。
圖12顯示了抑制F10.9黑素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)的IL-6-IL-6R嵌合體3e的生物活性。在同樣的實(shí)驗(yàn)中，雖然對(duì)于50％的生長(zhǎng)抑制需要更多的活性，與IL-6R/IL-6嵌合體(制劑1-3)比較顯然它更加具有活性。
制成兩個(gè)IL-6R/IL-6的突變體，其中將IL-6R/IL-6的IL-6R成份的His-280和Asp-281(圖3)通過PCR誘變分別改變成Ser和Val(突變體39或HD)，或其中另外將Asn-230改變成Asp(突變體NHD)。正如圖12中可以看到，如與IL-6R/IL-6和IL-6-IL-6R嵌合體比較，這兩個(gè)突變體幾乎沒有活性。因?yàn)樵贗L-6R中，正如分子模型(Halimi等人，1995)顯示，這些氨基酸與gp130反應(yīng)，這證明了sIL-6R/IL-6嵌合體保存了這一基本的相互作用位點(diǎn)。
IL-6-IL-6R嵌合體3e丟失了存在于IL-6R/IL-6的IL-6R的免疫球蛋白狀區(qū)。但是，剛剛從IL-6R/IL-6除去Ig-區(qū)沒有減少它在F10.9細(xì)胞上的生物活性。IL-6-IL-6R嵌合體3e與gp130的結(jié)合是另一個(gè)IL-6R/IL-6嵌合體的約30％(未示出)。這一較低結(jié)合是在黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)上的更低的活性的線內(nèi)的。
這些結(jié)果證明通過與sIL-6R的融合，封閉IL-6羧基末端在這樣的新嵌合體中保存了良好的生物活性。
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序列表(1)總的情況(i)申請(qǐng)人(A)姓名耶達(dá)研究和開發(fā)有限公司(B)街道魏茨曼科學(xué)研究所，郵政信箱95號(hào)(C)城市雷霍沃特(E)國家以色列(F)郵編76100(G)電話972-8-9344093(H)傳真972-8-9470739(A)姓名雷維爾·米歇爾(B)街道拜特巴西域5，魏茨曼科學(xué)研究所(C)城市雷霍沃特(E)國家以色列(F)郵編76100(A)姓名舍巴特·朱迪思(B)街道雷霍米勒13(C)城市雷霍沃特(E)國家以色列(F)郵編76284(A)姓名拉皮多特·茨韋(B)街道雷霍博克瑟6(C)城市內(nèi)斯-宰納(E)國家以色列(F)郵編74046(A)姓名科萊特·奧里特(B)街道雷霍拉馬特切恩14(C)城市拉馬特甘(E)國家以色列(F)郵編52232(ii)發(fā)明題目白細(xì)胞介素-6可溶性受體/配體蛋白質(zhì)，其類似物和其用途(iii)序列數(shù)目8
(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentln Release#1.0，Version#1.30版(EPO)(vi)過去的申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朓L 121284(B)申請(qǐng)日1997年7月10日(vi)過去的申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朓L 122818(B)申請(qǐng)日1997年12月30(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度13個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Glu Phe Gly Ala Gly Leu Val Leu Gly Gly Gln Phe Met15 10(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度44個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA
(xi)序列描述SEQ ID NO2CTAGTGGGCC CGGGGTGGCG GGACCCGGGC CCCACCGCCC CTAG 44(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO3GACTAGTAGC TATGAACTCC TTCTC 25(2)SEQ ID NO4資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO4AGGGCCATTT GCCGAAGAGC C 21(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度62個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA
(xi)序列描述SEQ ID NO5GATCCGGGCG GCGGGGGAGG GGGGCCCGGG CGCCCGCCGC CCCCTCCTCC CGGGCCCGGT 60AC62(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO6Gly Gly Gly Gly Asp Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Gly1 5 10(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度543個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO7Met Leu Ala Val Gly Cys Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Pro1 5 10 15Gly Ala Ala Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gln Glu Val Ala Arg20 25 30Gly Val Leu Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro35 40 45Gly Val Glu Pro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys50 55 60Pro Ala Ala Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg65 70 75 80Leu Leu Leu Arg Ser Val Gln Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys85 90 95Tyr Arg Ala Gly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val100 105 110Pro Pro Glu Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser115 120 125Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr130 135 140Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro Ala Glu Asp145 150 155 160Phe Gln Glu Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys Phe Ser Cys165 170 175Gln Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met180 185 190Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe195 200 205Gln Gly Cys Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val210 215 220Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp225 230 235 240Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg245 250 255Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp260 265 270Leu Gln His His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His275 280 285Val Val Gln Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly Glu Trp Ser290 295 300Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser305 310 315 320Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala Leu Thr Thr325 330 335Asn Lys Asp Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr340 345 350Ser Leu Pro Val Glu Phe Met Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys355 360 365Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile370 375 380Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys385 390 395 400Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu405 410 415Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys420 425 430Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr435 440 445Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe450 455 460Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val465 470 475 480Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr485 490 495Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala500 505 510Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser515 520 525Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met530 535 540(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度471個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu15 10 15Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro20 25 30Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr35 40 45Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile50 55 60Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser65 70 75 80Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala85 90 95Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu100 105 110Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr115 120 125Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln130 135 140Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn145 150 155 160Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu165 170 175Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His180 185 190Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala195 200 205Leu Arg Gln Met Gly Gly Gly Gly Asp Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly210 215 220Pro Gly Val Pro Pro Glu Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser225 230 235 240Pro Leu Ser Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser245 250 255Leu Thr Thr Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro260 265 270Ala Glu Asp Phe Gln Glu Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys275 280 285Phe Ser Cys Gln Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile290 295 300Val Ser Met Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr305 310 315 320Gln Thr Phe Gln Gly Cys Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn325 330 335Ile Thr Val Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr340 345 350Trp Gln Asp Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe355 360 365Glu Leu Arg Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met370 375 380Val Lys Asp Leu Gln His His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly385 390 395 400Leu Arg His Val Val Gln Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly405 410 415Glu Trp Ser Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu420 425 430Ser Arg Ser Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala435 440 445Leu Thr Thr Asn Lys Asp Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala450 455 460Asn Ala Thr Ser Leu Pro Val465 470
權(quán)利要求
1.嵌合糖基化可溶性白細(xì)胞介素-6受體(sIL-6R)-白細(xì)胞介素-6(IL-6)蛋白質(zhì)(sIL-6R/IL-6)及其生物活性類似物，含有在基本所有sIL-6R的天然存在形式和基本所有IL-6的天然存在形式之間融合的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，所述的sIL-6R/IL-6及其類似物以相似的方式糖基化成天然存在的sIL-6R和IL-6的糖基化形式。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)及其生物活性類似物，其中將所述的sIL-6R通過肽接頭分子與IL-6融合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)及其生物活性類似物，其中所述的接頭是非常短的，約3個(gè)氨基酸殘基的非免疫原性接頭。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)及其生物活性類似物，其中所述的接頭是序列E-F-M的三肽(Glu-Phe-Met)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)及其生物活性類似物，其中所述的接頭是13個(gè)氨基酸殘基的序列的肽，E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M(Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)，是在sIL-6R的C末端Val-356和IL-6R的N末端Pro-29之間具有三肽接頭序列E-F-M的命名的sIL-6RδVal/IL-6，所述的嵌合蛋白質(zhì)具有圖3中闡述的序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1，2和5中任一項(xiàng)所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)是命名的在sIL-6R的C末端Val-356和IL-6R的N未端Pro-29之間具有13個(gè)氨基酸肽接頭序列E-F-G-A-G-L-V-L-G-G-Q-F-M的sIL-6RδVal/IL-6，所述的嵌合蛋白質(zhì)具有圖3中闡述的序列，其中在圖3的位置357～359之間的三肽序列E-F-M被13個(gè)氨基酸肽序列替代了。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)是在IL-6的MET-212和sIL-6R的VAL-112之間具有14個(gè)氨基酸肽接頭序列G-G-G-G-D-P-G-G-G-G-G-G-P-G(SEQ ID NO6)，整個(gè)IL-6在sIL-6R序列之前的命名IL-6/sIL-6R，所述的嵌合蛋白質(zhì)具有圖11中闡述的序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1～8中任一項(xiàng)所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)以完全加工的形式在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)是在人細(xì)胞中產(chǎn)生的。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)是在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的。
12.根據(jù)權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)及其生物活性類似物，其中所述的嵌合蛋白質(zhì)和類似物由于能夠抑制高度惡性癌細(xì)胞的生長(zhǎng)而得到鑒定。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)及其生物活性類似物，其中因?yàn)槟軌蛞种聘叨葠盒院谒亓黾?xì)胞的生長(zhǎng)鑒定了所述的嵌合蛋白質(zhì)和類似物。
14.根據(jù)權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)及其生物活性類似物，其中所述的嵌合蛋白質(zhì)和類似物因?yàn)槟軌蛞l(fā)骨髓移植中人血細(xì)胞生成細(xì)胞的體內(nèi)移入而得到鑒定。
15.根據(jù)權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)和生物活性類似物，其中所述的嵌合蛋白質(zhì)和類似物因?yàn)槟軌虮Ｗo(hù)肝不受肝毒性試劑影響而得到鑒定。
16.根據(jù)權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的編碼嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)及其生物活性類似物的DNA序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的含有編碼嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)及其生物活性類似物的DNA序列的DNA載體，所述的載體適于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)所述的嵌合蛋白。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的DNA載體，其中所述的載體是適于在人細(xì)胞中表達(dá)所述的嵌合蛋白質(zhì)。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的DNA載體，其中所述的載體是適于在CHO細(xì)胞中表達(dá)所述的嵌合蛋白質(zhì)。
20.根據(jù)權(quán)利要求17～19中任一項(xiàng)所述的DNA載體，其中所述的載體是在哺乳動(dòng)物或人細(xì)胞中表達(dá)的，表達(dá)的嵌合蛋白質(zhì)具有允許哺乳動(dòng)物或人細(xì)胞完全加工嵌合蛋白質(zhì)和將完全加工的嵌合蛋白質(zhì)從細(xì)胞分泌進(jìn)入所述的細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中的序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求17～20中任一項(xiàng)所述的DNA載體，其中所述的載體是命名為含有pcDNA3載體的質(zhì)粒pcDNAsIL-6R/IL-6，pcDNA3載體含有巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子控制下的編碼嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)的DNA序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求17～20中任一項(xiàng)所述的DNA載體，其中所述的載體是命名為質(zhì)粒pcDNA sIL-6R/L/IL-6，該質(zhì)粒含有pcDNA3載體，該載體含有在巨細(xì)胞病毒控制下的編碼嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)的DNA序列，其中在編碼所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)的所述DNA序列的放置于編碼sIL-6R部分的序列和編碼蛋白質(zhì)的IL-6部分的序列之間的EcoRI位點(diǎn)插入了編碼肽接頭的接頭序列。
23.含有權(quán)利要求17～22中任一項(xiàng)所述的DNA載體的轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，能夠表達(dá)所述的載體攜帶的sIL-6R/IL-6嵌合蛋白質(zhì)序列并且完全加工表達(dá)的蛋白質(zhì)和將它分泌進(jìn)入所述的細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞是pcDNAsIL-6R/IL-6載體轉(zhuǎn)染的人胚腎細(xì)胞293(HEK293)，所述的細(xì)胞能夠表達(dá)sIL-6R/IL-6嵌合蛋白質(zhì)，完全加工所述的蛋白質(zhì)并且將所述的蛋白質(zhì)以約85千道爾頓糖蛋白的形式分泌進(jìn)入所述的細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。
25.生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1～14中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白質(zhì)或其生物活性類似物的方法，包括在適于表達(dá)的條件下生長(zhǎng)權(quán)利要求23或24所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，加工和將所述的蛋白質(zhì)或類似物分泌進(jìn)入所述的細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，從所述的培養(yǎng)基中純化所述的蛋白質(zhì)或類似物。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中利用特異于sIL-6R的單克隆抗體的免疫親和層析進(jìn)行純化。
27.根據(jù)權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)或類似物，其任何一個(gè)的鹽，及其混合物用于癌細(xì)胞的抑制劑。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的嵌合蛋白質(zhì)或類似物用于高度惡性黑素瘤細(xì)胞的抑制劑。
29.根據(jù)權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)或類似物，其任何一個(gè)的鹽，和其混合物作為在骨髓移植中引發(fā)人血細(xì)胞生成細(xì)胞的移入的活性成份的用途。
30.根據(jù)權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)或類似物，其任何一個(gè)的鹽，和其混合物作為保護(hù)肝不受肝毒素試劑影響的活性成份的用途。
31.根據(jù)權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)或類似物，其任何一個(gè)的鹽，和其混合物作為增強(qiáng)血細(xì)胞生成，治療肝或神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，或其它利用IL-6或sIL-6R的應(yīng)用的活性成份的用途。
32.根據(jù)權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)或類似物，其任何一個(gè)的鹽及其混合物用于制備通過抑制哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞治療哺乳動(dòng)物癌癥的藥劑，用于制備通過在骨髓移植中引發(fā)人血細(xì)胞生成細(xì)胞的移入增強(qiáng)骨髓移植的藥劑，或用于制備增強(qiáng)血細(xì)胞生成的藥劑，或用于制備治療肝或神經(jīng)系統(tǒng)紊亂的藥劑，或用于制備利用IL-6或sIL-6R的其它應(yīng)用的藥劑。
33.含有作為活性成份的權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)所述的嵌合sIL-6R/IL-6蛋白質(zhì)或其類似物和藥物可接受載體，稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的藥物組合物用于治療癌癥。
35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的藥物組合物用于增強(qiáng)骨髓移植。
36.根據(jù)權(quán)利要求33所述的藥物組合物用于治療肝或神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，或用于增強(qiáng)血細(xì)胞生成或用于利用IL-6或sIL-6R的其它應(yīng)用。
37.治療哺乳動(dòng)物中的癌癥，增強(qiáng)骨髓移植，治療肝或神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，增強(qiáng)血細(xì)胞生成或其中利用了IL-6或sIL-6R的其它應(yīng)用的方法，包括以適當(dāng)劑量形式和通過適當(dāng)給藥途徑為病人服用權(quán)利要求33～36中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。
全文摘要
提供了用于治療癌癥和肝紊亂,增強(qiáng)骨髓移植和治療其它IL－6相關(guān)癥狀的從可溶性IL－6受體和IL－6的天然存在形式的融合構(gòu)建的嵌合蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)A61P1/16GK1269835SQ98808941
公開日2000年10月11日 申請(qǐng)日期1998年7月9日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月10日
發(fā)明者米歇爾·雷韋爾, 朱迪思·舍巴特, 茨韋·拉皮多特, 奧里特·科萊特 申請(qǐng)人:耶達(dá)研究發(fā)展有限公司