專利名稱：肽類的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生長激素釋放抑制因子肽類，制備它們的方法，含它們的藥物制劑和它們作為放射性藥物用于例如放射性治療生長激素釋放抑制因子受體陽性瘤(positive tumors)的用途。
采用放射性化合物的腫瘤的放射性療法具有選擇性地將腫瘤及其次生腫瘤作為目標的優(yōu)點，所以，可限制對正常組織的放射劑量。放射性治療劑應該能在靶器官如腫瘤上迅速蓄積和有高的滯留性并迅速從循環(huán)系統(tǒng)清除以便減少全身的放射劑量?；隍系姆派湫越饘俚姆派湫灾委焺┰跓崃W上和/或動力學上也應該是穩(wěn)定的，以防止該放射性金屬的損失。反復給藥的放射性治療劑不應該是產(chǎn)生免疫的。
GB-A-2,225,579公開了帶至少一個螯合基團的生長激素釋放抑制因子肽類，它能被放射性標記用于體內(nèi)診斷和治療。這些化合物能與生長激素釋放抑制因子受體結(jié)合，(例如被腫瘤或次生腫瘤表達或過度表達的受體)。EP-A2-607,103公開生長激素釋放抑制因子肽類，它們含借助間隔基(spacer group)與其末端氨基相接的雙官能多氨基多羧酸螯合基團。但是，盡管雙官能螯合基團(八齒)和間隔基存在導致生成的結(jié)合物的某些性質(zhì)的改變，仍然迫切需要進一步改良性質(zhì)的放射性藥物，尤其具高的靶/腎比放射性藥物，以便將腎中的放射劑量減至最小。
正如在下文中公開的，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)含直接(即無間隔基)與生長激素釋放抑制因子肽類的末端氨基結(jié)合的單官能DOTA(1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸)的生長激素釋放抑制因子肽類具有改良的特性。尤其它們具有更好的腫瘤/腎比，因此到達腎的放射劑量更低。
按照本發(fā)明提供游離形式、鹽形式或與放射性核素配合形式的具如下式I的化合物 式中M是陽離子和A是苯丙氨酸或酪氨酸。
很容易理解，在上邊DOTA式中每個聯(lián)接二個氮原子的“ ”鍵代表l，2一亞乙基。
當A是苯丙氨酸時，式I化合物的肽部分相當于oclrcotidc。當A是酪氨酸時，肽部分相當于[Tyr3]-0clrcotidc。
A優(yōu)選酪氨酸。
M可以是H+或羧基的任意成鹽陽離子，例如一價陽離子或一當量的多價陽離子，例如，堿金屬離子如鈉、鉀離子或取代或未取代的銨離子。
式I化合物也可以如內(nèi)鹽的形式(當M是H+時)或酸加成鹽形式存在。酸加成鹽包括如加入有機、聚合或無機酸所得鹽，例如水合氯化物(chlorhydracc)、乙酸鹽、三氟乙酸鹽或乳酸鹽。
所謂放射性核素指α-或β-射線核素或帶有俄歇電子級聯(lián)(Auger-e--cascades)的核素。適合的核素包括如64Cu、67Cu或放射性鑭系元素，尤其90Y、140La、161Tb、169Er、153Sm、177Lu、166Dy、166Ho或175Yb，以161Tb和90Y為佳，以90Y最好。
本發(fā)明也包括制備式I化合物的方法。它們可通過與已知方法類似方法制備，例如，式I化合物可按如下過程制備a)除去至少一個被保護形式式I化合物中存在的保護基團，或b)通過酰胺鍵聯(lián)結(jié)兩個肽單元，其中之一含至少一個保護或未保護形式的氨基醇，而其中另一個含DOTA基團，其中該酰胺鍵采用的方式應能獲得式I的所需的氨基酸順序，然后可任選完成該過程的步驟a)，或c)以這樣的方式聯(lián)接DOTA和保護或未保護形式的所需的生長激素釋放抑制因子肽類，以使從DOTA衍生的基團固定在該肽類的末端氨基上，然后可任選完成步驟a)，或d)氧化其氨基酸順序如式I中所述的DOTA-肽，其中半胱氨酸的巰基以游離形式存在以便生成兩個半胱氨酸基通過-S-S-橋聯(lián)接的式I化合物。于是，獲得游離形式、鹽形式或以與放射性核素配合形式的式I化合物。
以上的反應可按與已知方法類似的方法完成，例如下例中所述的方法。在這些反應中，需要時，可使用適用于肽類或DOTA螯合基團的保護基團作為官能基團，該官能基團不參與該反應。所謂保護基團也可包括具官能基團的聚合物樹脂。DOTA可以游離酸的形式，可作為酸酐或活性酯(例如與N-羥基琥珀酰亞胺)用在步驟c)過程中。
與放射性核素的配合過程可在室溫下按照現(xiàn)有技術(shù)已知的方法來進行，例如，使未配合的式I化合物與能產(chǎn)生所需放射性核素的鹽反應。
式I的未配合化合物與得到放射性核素的鹽的配合過程在60°～120℃下進行為佳，以在80°～100℃下進行更好。當完成配合過程的溫度≥100℃時，可在高壓釜內(nèi)進行。加熱下的配合過程可容易地在短時間內(nèi)進行，例如10～20分鐘。當該放射性核素是90Y時，優(yōu)選的能生成90Y鹽是99YCl3。
在避免微量金屬污染的條件下，上述反應可容易地進行。優(yōu)選使用去離子蒸餾水，超純試劑，不加載體放射性物質(zhì)等，以便降低微量金屬的作用。
式I化合物在與放射性核素配合后具有藥物活性，所以，它們可作為有效的放射性藥物用在體內(nèi)治療生長激素釋放抑制因子受體陽性腫瘤和次生性腫瘤，這可由標準試驗所表明。
特別是式I化合物對生長激素釋放抑制因子受體具有親合性，這可通過體外按照J.C.Reubi(Life Sc.36，1829(1985))和C Bruns等(Biochem.J.，265，39(1990))公開的結(jié)合分析方法對其作評估。
據(jù)觀察式I化合物例如與90Y或161Tb配合的式I化合物與生長激素釋放抑制因子受體結(jié)合具有良好的親合性和專一性，其pKD值約8.0～10.0。
實施例1化合物以高度親合性與在小鼠皮質(zhì)或AR42J胰腺腫瘤細胞上表達的生長激素釋放抑制因子受體結(jié)合它以[125I][Tyr3]-octreotide作為特定的配位體，具有的pKi值為8.9±0.1。實施例2的化合物是生長激素釋放抑制因子受體的特定配位體，它能被oct-reotide從生長激素釋放抑制因子受體上置換，其pIC50＝9.0±0.3。
式I的配位化合物對生長激素釋放抑制因子受體的親合性也可按照標準試驗方法，例如在GB-A-2,225,579上公開方法，通過體內(nèi)試驗來表明。例如，在一項試驗中，以5μCi的劑量給患外分泌胰腺腫瘤的小鼠腹膜內(nèi)注射(i.p.injection)實施例2的化合物后2小時，該化合物產(chǎn)生顯著的腫瘤部位蓄積；在生長激素釋放抑制因子受體陽性腫瘤部位的存在量為9.53±0.70％ID/g，而在生長激素釋放抑制因子受體陽性正常組織中蓄積明顯較少量的放射性，例如在胰腺它的量為1.52±0.08％ID/g。所謂％ID/g指的是每克組織注射的放射性劑量的百分比。實施例2化合物提供注射后24小時的高的腫瘤/腎比，以及高的腫瘤/肝比和腫瘤/股骨比。骨髓被認為是對放射性最敏感的器官，只有少量的放射性在骨部位蓄積是有利的。
與放射性核素配合的式I化合物對帶有生長激素釋放抑制因子受體的腫瘤細胞具有抗增殖作用，例如像在裸鼠試驗中所表明的一樣。
AR42J小鼠胰腺腫瘤細胞受胰蛋白酶作用，將1×107腫瘤細胞(在0.2ml中)皮下注射到裸鼠的兩肋。當腫瘤達到0.1～2ml顯著的體積時，將動物隨機分為對照組和治療組。對照組動物以相應治療組最高劑量的劑量腹膜內(nèi)注射給式I的未配合化合物或者相應的式I的冷配合(coldcomplexe)化合物。每只鼠給藥量從0.8mCi至到40mCi/kg/100μl。用卡尺測量腫瘤的大小。使用公式“體積(橢圓球體)＝長度×深度×高度×0.52”計算腫瘤的體積(ml)。采用Student′sT試驗作為統(tǒng)計學計算方法。在該試驗中，在單純使用實施例2化合物一周后觀察到暫時的腫瘤收縮，腫瘤生長被延遲了兩周。相比之下對照組在約七天內(nèi)腫瘤持續(xù)增大，體積加倍。治療組的生存率顯著增高。
當用實施例2化合物治療患其它類型腫瘤的小鼠或大鼠時，如乳房癌或小細胞肺癌，取得類似的結(jié)果。
因此，在一系列特定的或選擇的實施方案中，本發(fā)明也提供1.與放射性核素配合的式I化合物或其藥學上可接受的鹽作為在體內(nèi)治療生長激素釋放抑制因子受體陽性腫瘤和次生腫瘤方面的用途
2.用于在體內(nèi)治療生長激素釋放抑制因子受體陽性腫瘤和次生腫瘤，例如用于治療該腫瘤的侵入或與其生長有關(guān)的癥狀的方法，該方法給需要這種治療的患者提供，它包括給予該患者有效治療量的與放射性核素配合的式I化合物或藥學上可接受的鹽。
3.式I化合物或其藥學上可接受的鹽在制備放射性藥物組合物方面的用途。
當然，實際采用的本發(fā)明的放射治療的劑量將根據(jù)例如被治療的具體情況而改變，例如隨已知該腫瘤類型的放射敏感性、腫瘤的體積和所需的治療而改變。通常是根據(jù)在每個器官的放射性分布和根據(jù)觀察到的靶向部位的吸收來計算所用放射劑量。式I的β-射線配合物可以在1～3周或更長時間內(nèi)分幾次給藥。指示的劑量范圍是與例如10～100mCi放射性核素如90Y或161Tb(對于161Tb優(yōu)選高放射性范圍)配合的5～100μg的式I化合物。
與放射性核素配合的式I化合物可按常規(guī)途徑給藥，特別是靜脈注射，例如以注射溶液或混懸液形式靜注。它們也通過輸注(infus-ion)有利給藥例如30～60min輸注。根據(jù)腫瘤的部位，可盡可能接近腫瘤部位給藥，例如通過導管給藥。也可將藥物分幾次劑量重復給藥。
可用與放射性核素配合的式I化合物治療的腫瘤包括例如垂體、胃腸胰、類癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、乳房、前列腺、卵巢、或結(jié)腸腫瘤、小細胞肺癌、嗜鉻細胞瘤、腎癌、皮膚癌、神經(jīng)母細胞癌、嗜鉻細胞癌、甲狀腺癌、骨髓瘤、淋巴瘤、Hodgking和非Hodgkins病、骨瘤和它們的次生腫瘤。
放射性化合物基本上從腎臟排泄。通過給予賴氨酸或精氨酸或含高含量賴氨酸和/或精氨酸的氨基酸溶液可以避免放射性蓄積保護腎臟，例如，在注射式I的配合物前或同時給予易購的氨基酸溶液如Vaminak18EF或Synthamink2-14或-10。
與放射性核素配合的式I化合物可以游離酸形式或以藥學上可接受鹽的形式存在；其鹽形式所具有的放射性量級與游離酸形式的配合物相同。
優(yōu)選與90Y配合的實施例1化合物。
按照本發(fā)明的另一方面，提供含式I化合物或與放射性核素配合的式I化合物或其藥學上可接受的鹽以及一種或一種以上的藥學上可接受的載體或稀釋劑的藥用組合物。該組合物可按常規(guī)方法制備。
按照本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，基于與放射性核素配合的式I化合物的藥用組合物還含穩(wěn)定劑，如自由基清除劑，它阻止肽類部分自輻解。適合的穩(wěn)定劑包括例如血清白蛋白、抗壞血酸、維生素A、2，5-二羥基苯甲酸或其衍生物，或氨基酸輸注液，例如，優(yōu)選不含電介質(zhì)和葡萄糖用作腸道外蛋白補給的如易購的氨基酸輸注液如Proteinsteril KE Nephro。優(yōu)選抗壞血酸。該穩(wěn)定劑可按其與未配合式I化合物的重量比為1,000～10,000比1；優(yōu)選4,000～7,000比1容易地被使用。該藥用組合物可含其它添加劑例如調(diào)節(jié)pH在7.2～7.4之間的pH調(diào)節(jié)劑，如醋酸鈉或醋酸銨或磷酸氫二鈉。優(yōu)選將穩(wěn)定劑加到未配合的式I化合物中，在穩(wěn)定劑存在下與放射性核素配合過程或在室溫下或優(yōu)選在60～120℃下進行。該配合過程在不含空氣條件下，如在氮氣或Ar條件下，可容易地被進行。在配合過程后也可將其它穩(wěn)定劑加入該組合物中。
與放射性核素配合的式I化合物也可用于呈現(xiàn)生長激素釋放抑制因子受體的免疫疾病或炎癥，例如類風濕性關(guān)節(jié)炎的治療。
按照本發(fā)明的另一實施例，與放射性核素配合的式I化合物可用作抑制細胞治療的添加劑或輔助劑，例如，與細胞抑制劑結(jié)合使用，優(yōu)選通過充當放射致敏劑增強放射性治療效果的細胞抑制劑。適合的細胞抑制劑或放射致敏劑包括例如順氯氨鉑、5-氟尿嘧啶、環(huán)磷酰胺和阿霉素。
按照前面所述，本發(fā)明在另一方面提供4.用于治療生長激素釋放抑制因子受體陽性腫瘤侵入或與該腫瘤生長有關(guān)的癥狀的方法，該方法給需要這種治療的患者使用，它包括給予該患者有效量的a)與放射性核素配合的式I化合物或它的藥學上可接受的鹽和b)第二種藥物，這第二種藥物是細胞抑制劑。
5.用于治療腫瘤侵入或與腫瘤生長有關(guān)的癥狀的治療用組合物，例如該組合物包括含與放射性核素配合的式I化合物或其藥學上可接受的鹽的藥用組合物且還包括至少一種含細胞抑制劑的藥用組合物，例如醫(yī)用套盒。
細胞抑制劑可按已知是有效抑制細胞量或放射致敏量中任何量來使用。該細胞抑制劑可與式I放射性藥物伴隨加入或按順序安排加入。
下列實施例用于說明本發(fā)明。所有溫度均以℃為單位。使用下列縮寫詞Fmoc＝9—芴基甲氧羰基Boc＝叔丁氧羰基DOTA＝1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸DMF＝二甲基甲酰胺
將6g二水合DOTA(游離酸)溶在50ml水(pH～3.7)中，在用60ml DMF稀釋后，立即加入1g的N-羥基琥珀酰亞胺，2.7g的N，N-二環(huán)己基碳化二亞胺(DCCI)和3g的[Tyr3，ε-Boc-Lys5]-octreotide。在持續(xù)攪拌下，室溫維持反應72小時。通過硅膠60柱純化將ε-Lyr5保護化合物分離，用二氯甲烷/甲醇/50％醋酸(9/1/0.125)作為流動相。
隨后使用三氟乙酸(TFA，100％)在室溫下用10分鐘時間將Lys5保護基團裂解，并用硅膠60柱(流動相二氯甲烷/甲醇/50％醋酸(7/3/1至7/5/2)和RP18-HPLC柱(水/乙腈/1％醋酸作為緩沖液體系)純化，得到純的和勻相的，醋酸鹽形式的目標化合物。FAB-MH+1421，[α]22D＝-14.75°(95％AcOH；C＝0.52)。
實施例2用90Y標記的實施例1化合物通過將20μl的90Y(1.2mCi，0.04MHCl)加到20μl的50μM實施例1化合物(0.15MNH4OAc，0.3％BSA，pH4.5)中制備90Y標記螯合物。將該溶液在100℃保溫培養(yǎng)15min。等分取出樣品并在用C18反相HPLC分析前用4mM DTPA(pH4.5)稀釋以便確定在反應混合物中的游離未螯合90Y的量(由[90YDTPA]2-的存在得以證實)。其放射化學純度一般＞99.5％且生成的螯合物在4mMDTPA(4nM的實施例1化合物，pH4.5)中經(jīng)7天時間在動力學上穩(wěn)定。
實施例3用90Y標記的實施例1化合物將120μl的0.23M抗壞血酸、0.15M醋酸銨(pH4.8)、6μl的1mM的實施例1化合物和120μl的90Y(85mCi/ml，0.04M HCl)在沸水浴中的管形瓶中加熱15min。將所得溶液用乙醚、0.23M的抗壞血酸和0.15MNH4oAc或ProteinsterilR KE Nephro氨基酸輸液稀釋到1ml并在環(huán)境溫度下長期貯存。
ProteinsterilRKE Nephro氨基酸溶液含11.4g/l亮氨酸，9.63g/l賴氨酸、9.53g/l纈氨酸，7.76g/l苯丙氨酸，7.52g/l異亮氨酸，6.78g/l蘇氨酸，6.59g/l蛋氨酸，4.9g/l組氨酸和2.91g/l色氨酸。
實施例4 重復實施例1過程，只是使用ε-Boc-Lys5-octreotide得到目標化合物。MS(Ion Spray)1403(M-H)實施例590Y標記的實施例4化合物重復實施例2的標記過程得到90Y螯合物。
實施例6161Tb標記的實施例1或4化合物使用161Tb生成鹽代替90Y生成鹽，重復實施例2的標記過程得到161Tb螯合物。
權(quán)利要求
1.游離形式、鹽形式或與放射性核素配合形式的如下式式I化合物 式中，M是陽離子，和A是苯丙氨酸或酪氨酸。
2.按照權(quán)利要求1的化合物，其中A是酪氨酸。
3.按照權(quán)利要求1或2的化合物，其中該化合物與90Y配合。
4.按照權(quán)利要求1或2的化合物，其中該化合物與161Tb配合。
5.按照以上各項權(quán)利要求中任意一項的化合物，其中M是H+。
6.按照權(quán)利要求1的與放射性核素配合的式I化合物或其藥學上可接受的鹽作為放射性藥物的用途。
7.按照權(quán)利要求6作為治療生長激素釋放抑制因子受體陽性腫瘤和次生腫瘤的放射性藥物用途。
8.按照權(quán)利要求1的式I化合物或其藥學上可接受的鹽在制備放射性藥物組合物方面的用途。
9.藥物組合物，包含按照權(quán)利要求1～5任一項的式I化合物或其藥學上可接受的鹽以及一種或一種以上的藥學上可接受的載體或稀釋劑。
10.按照權(quán)利要求9的組合物，還包含穩(wěn)定劑。
11.按照權(quán)利要求10的組合物，其中的穩(wěn)定劑選自血清白蛋白、抗壞血酸、維生素A、2，5-二羥基苯甲酸或它們的衍生物和氨基酸溶液。
12.按照權(quán)利要求1的式I化合物與放射性核素配合的方法，該方法包括使式I化合物與產(chǎn)生放射性核素的化合物在60～120℃下任選在穩(wěn)定劑存在下反應。
13.用于治療腫瘤侵入或與腫瘤生長有關(guān)的癥狀的治療性組合物，該組合物包括含與放射性核素配合的式I化合物或其藥學上可接受的鹽的藥用組合物并另外包括至少一種含細胞生長抑制劑的藥用組合物。
全文摘要
游離形式或鹽形式的具有如下式I的化合物，當與α-或β-射線放射性核素或具俄歇電子級聯(lián)核素配合后，用作放射性藥物式中，M是一當量的陽離子，A是苯丙氨酸或酪氨酸。
文檔編號A61P35/00GK1127259SQ95115610
公開日1996年7月24日 申請日期1995年9月5日 優(yōu)先權(quán)日1994年9月6日
發(fā)明者R·艾伯特, C·布朗斯, P·史密夫-瓊斯, B·施托茲, G·韋克貝克 申請人:山道士有限公司