專利名稱：生長激素抑制素結(jié)合肽-金屬絡(luò)合物的制作方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及治療劑、放射性治療劑、放射性診斷劑、和非放射性診斷劑以及用于制備這些診斷劑和治療劑的方法。本發(fā)明也涉及環(huán)狀肽，該肽特異性地與在哺乳動物細(xì)胞表面，特別是患腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤的哺乳動物細(xì)胞表面表達(dá)的生長激素抑制素受體結(jié)合。一方面，本發(fā)明涉及用于在哺乳動物體某部位成像的閃爍照相成像劑。在這方面，該成像劑包含一種特異性結(jié)合肽，它特異性地與生長激素抑制素受體表達(dá)的體內(nèi)細(xì)胞結(jié)合，其中通過放射性標(biāo)記物結(jié)合部分，用锝-99m(Tc-99m)標(biāo)記該肽，由此形成肽與Tc-99m的絡(luò)合物。另一方面，本發(fā)明提供放射性碘處理的成像劑。本發(fā)明也提供治療劑，它包括放射性碘處理劑、放射性金屬-試劑絡(luò)合物和非放射性金屬-試劑絡(luò)合物，所有這些治療劑都具有治療作用。本發(fā)明提供制備本發(fā)明診斷和治療劑中每一種具體的診斷和治療劑用的試劑、其放射性標(biāo)記的實例和非放射性金屬絡(luò)合物、標(biāo)記所述試劑的方法和試劑盒，該試劑盒包含本發(fā)明試劑的非放射性具體組分及便于制備本發(fā)明放射性標(biāo)記的診斷和治療劑的其它組分。
2.現(xiàn)有技術(shù)的說明生長激素抑制素是十四肽，它是內(nèi)源性地通過人和其它哺乳動物的下丘腦和胰腺而生產(chǎn)的。該肽具有式
(在G.Zubay.Biochemistry(2d ed.)，1988，(MacMillan Publishing；NewYork)，P.33中可以找到氨基酸的專用字母縮寫)。該肽在體內(nèi)發(fā)生各種生理作用。已知在生理上對中植神經(jīng)系統(tǒng)、下丘腦、胰腺、和胃腸道發(fā)生作用。
生長激素抑制素抑制胰腺釋放胰島素和胰高血糖素，抑制下丘腦釋放生長激素和減少胃分泌。因此，生長激素抑制素具有減輕人和其它哺乳動物許多疾病的臨床和治療用途，然而，由于天然存在的生長激素抑制素在體內(nèi)的半表期短，迅速被肽酶降解，因此其應(yīng)用受限制。由于該原因，在現(xiàn)有技術(shù)中已開發(fā)生長激素抑制素類似物其體內(nèi)穩(wěn)定性有了提高。
Freidinger在美國專利4,235,886中公開了用于治療人類很多種疾病的環(huán)六肽生長激素抑制素類似物。
Coy和Murphy在美國專利4,485,101中公開了合成的十二肽生長激素抑制素類似物。
Freidinger在美國專利4,611,054中公開了用于治療人類很多種疾病的環(huán)六肽生長激素抑制素類似物。
Nutt在美國專利4,612,366中公開了用于治療人類很多種疾病的環(huán)六肽生長激素抑制素類似物。
Coy等在美國專利4,853,371中公開了合成的八肽生長激素抑制素類似物。
Coy和Murphy在美國專利4,871,717中公開了合成的七肽生長激素抑制素類似物。
Coy等在美國專利4,904,642中公開了合成的八肽生長激素抑制素類似物。
Taylor等在美國專利5,073,541中公開了治療小細(xì)胞肺癌的方法。
Brady在歐洲專利申請83111747.8中公開了用于治療很多種人類疾病的二環(huán)肽生長激素抑制素類似物。
Bauer等在歐洲專利申請85810617.2中公開了用于治療很多種人類疾病的生長激素抑制素衍生物。
Eck和Moreau在歐洲專利申請90302760.5中公開了治療用八肽生長激素抑制素類似物。
Coy和Murphy在國際專利申請PCT/US 90/07074中公開了治療用的生長激素抑制素類似物。
Schally等在歐洲專利申請EPA 911048445.2中公開了治療用的環(huán)肽。
Bodgen和Moreau在國際專利申請PCT/US 92/01027中公開了用于治療增生性皮膚病的組合物的方法。
生長激素抑制素通過與在細(xì)胞表面表達(dá)的特異性受體結(jié)合來發(fā)揮作用，所述細(xì)胞包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、下丘腦、胰腺和胃腸道的細(xì)胞。已發(fā)現(xiàn)，在由這些組織產(chǎn)生的大多數(shù)具有內(nèi)分泌活性的腫瘤細(xì)胞的表面，這些具有高度親和性的生長激素抑制素結(jié)合部位被充分表達(dá)。
在臨床上，能夠使用非侵害性方法來確定病人患病部位的病理癥狀，對于醫(yī)生來說是非常有利的。這些病理學(xué)癥狀包括肺、心、肝、腎、骨和腦的疾病，也包括癌癥，血栓形成，肺栓塞，感染，炎癥和動脈粥樣硬化。
在該醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，通過檢測小量口服給藥的放射性標(biāo)記示蹤化合物(稱放射性示蹤物或放射性藥物)的分布，來對某些病理學(xué)癥狀及其范圍進(jìn)行定位或評估。檢測這些放射性藥物的方法作為成像或放射性成像方法通常是已知的。
在放射性成像中，放射性標(biāo)記物是發(fā)射γ線的放射性核素，并且利γ線檢測相機(jī)確定放射性示蹤物的位置(該方法常稱作γ閃爍照相法)。由于所選擇的放射性示蹤物或者定位在病理部位(稱作正造影劑)或者不是特異性地定位在該病理部位(稱作負(fù)造影劑)，因此可檢測到成像的部位。在很多情況下，使用一種放射性標(biāo)記的特異結(jié)合化合物作為放射性藥物，特異性地定位到體內(nèi)病理部位是特別有利的。
例如，對于某些腫瘤細(xì)胞來說，生長激素抑制素高度親和性結(jié)合部位的表達(dá)是明顯的，并且可以利用與生長激素抑制素的特異性結(jié)合來定位和定性體內(nèi)的該種腫瘤細(xì)胞。
對于那些已被修飾而含有酪氨酸(Tyr或Y)的生長激素抑制素類似物進(jìn)行放射性標(biāo)記的方法，在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。
Albert等在UK專利申請8927255.3中公開了利用生長激素抑制素衍生物，如由123I經(jīng)標(biāo)記的奧曲肽來進(jìn)行放射性成像。
Bakker等在1990，J.Nucl.Med.311501-1509中描述了放射性碘處理生長激素抑制素類似物及其在檢測體內(nèi)腫瘤中的應(yīng)用。
Bakker等在1991，J.Nucl.Med.321184-1189中講述了放射性標(biāo)記生長激素抑制素在體內(nèi)放射性成像中的應(yīng)用。
Bomarji等在1992，J.Nucl.Med.331121-1124中描述了利用碘處理的(Tyr-3)奧曲肽來成像轉(zhuǎn)移性類癌瘤。
或者，在現(xiàn)有技術(shù)中也公開了通過共價結(jié)合方法修飾肽使其含放射性核素螯合基團(tuán)來對生長激素抑制素進(jìn)行放射性標(biāo)記的方法。
Albert等在UK專利申請8927255.3中公開了利用生長激素抑制素衍生物，如由111In通過結(jié)合到端氨基的螯合基團(tuán)標(biāo)記的奧曲肽來進(jìn)行放射性成像。
Albert等在國際專利申請Wo 91/01144中公開了利用放射性標(biāo)記的肽來進(jìn)行放射性成像，這些肽與生長因子、激素、干擾素和細(xì)胞因子(Cytokines)有關(guān)，并且包含以共價鍵連接到放射性核素螯合基上的特異性識別肽。
Albert等在歐洲專利申請92810381.1中公開了具有連接螯合劑的端氨基的生長激素抑制素肽。
Faglia等在1991，J.Clin.Enclocrinol，Metab，73850-856中描述了病人中生長激素抑制素受體的檢測方法。
Kwekkeboom等在1991，J.Nucl.Med.32981 Abstrct#305中提到用111In放射性標(biāo)記生長激素抑制素類似物。
Albert等在1991，Abstract LM10，12th American Peptids，Symposium1991中描述了111In標(biāo)記的二亞乙基-三氨基五乙酸衍生物的生長激素抑制素類似物的應(yīng)用。
Krenning等在1992，J.Nucl.Med.33652-658中描述了用[111In][DTPA]奧曲肽在臨床上進(jìn)行閃爍照相。
已知各種放射性核素都可用于放射性成像，包括67Ga、99mTc(Tc-99m)、111In、123I、125I、169Yb或186Re。為了獲得人體中最佳放射性成像，必須考慮很多因素。為了最大限度地增加檢測功效，優(yōu)選使用能發(fā)射γ射線能量為100-200KeV的放射性核素。為了最大限度地減小病人所吸收的射線量，放射性核素的物理半衰期應(yīng)該盡可能地短，只要滿足成像過程的需要即可。為了能夠在任意天并且在該天的任意時間進(jìn)行檢查，最好具有一個在臨床上可隨時獲得的放射性核素源。Tc-99m是優(yōu)選的放射性核素，因為發(fā)射140KeV的γ線，其物理半衰期為6小時，并且可利用鉬-99/锝-99m發(fā)生器很容易就地獲得。在現(xiàn)有技術(shù)中所使用的其它放射性核素都比Tc-99m差。這可能是因為這些放射性核素的物理半衰期長，結(jié)果病人吸收大量射線(例如銦-111)。而且很多效果較差的放射性核素也不能利用就地發(fā)生器生產(chǎn)。
Tc-99m是一種過渡金屬，它可通過金屬絡(luò)合部分很好進(jìn)行螯合。能夠結(jié)合Tc-99m的放射性標(biāo)記的絡(luò)合部分，它們能共價連接到各種特異性結(jié)合的化合物上，從而提供了對這些特異性結(jié)合化合物進(jìn)行放射標(biāo)記的方法。這是因為，通常大多數(shù)容易獲得的Tc-99m的化學(xué)物種如高锝酸鹽(TcO4-)不能直接結(jié)合到大多數(shù)特異性結(jié)合化合物上，其結(jié)合強(qiáng)度足以用作放射性藥物。Tc-99m與這些放射性標(biāo)記的絡(luò)合部分進(jìn)行絡(luò)合一般需要用還原劑如氯化亞錫將高锝酸鹽還原。
在現(xiàn)有技術(shù)中已知用螯合劑來絡(luò)合Tc-99m。
Byrne等在美國專利4,434,151中描述了含Tc-99m螯合劑的高半胱氨酸。
Fritsberg在美國專利4,444,690中描述了一系列基于N，N’-二(巰基乙?；?-2，3-二氨基丙酸酯的锝螯合劑。
Byrne等在美國專利4,571,430中描述了含Tc-99m螯合劑的高半胱氨酸。
Btyrne等在美國專利4,575,556中描述了含Tc-99m螯合劑的高半胱氨酸。
Nosco等在美國專利4,925,650中描述了Tc-99m螯合的絡(luò)合物。
Konclo等在歐洲專利申請公開號483700 A1中描述了制備Tc-99m與巰基-Gly-Gly-Gly部分絡(luò)合物的方法。
歐洲專利申請?zhí)?4109831.2中描述了用作腎功能監(jiān)測劑的二氨基，二巰基Tc-99m配位體及其鹽。
Davison等在1981，Inory.Chem 201629-1632中公開了氧锝螯合的絡(luò)合物。
Fritzberg等在1982，J.Nucl.Med.23592-598中公開了基于N，N′-二(巰乙?；?-2，3-二氨基丙酸酯的Tc-99m螯合劑。
Byrne等在1983，J.Nucl.Med.24P126中描述了含Tc-99m螯合劑的高半胱氨酸。
Byrne等在1988，Inorg.Chem.272154-2161中描述了對過量配位體不穩(wěn)定的锝-99中性絡(luò)合物。
Misra等在1989.Tet.Lett.301885-1888中描述了用于放射性標(biāo)記的二胺二巰基化合物。
在本領(lǐng)域中已知利用螯合劑來放射性標(biāo)記特異性結(jié)合的化合物。
Gansow等在美國專利4,472,509中講述了生產(chǎn)和純化Tc-99m螯合物軛合的單克隆抗體的方法。
Stavrianopoulos在美國專利4,943,523中講述了含金屬螯合部分的可檢測分子。
Fritberg等在歐洲專利申請86100360.6中描述了二巰基、二氨基或二氨基羧酸或胺絡(luò)合物，用于制備锝標(biāo)記的造影劑。
Albert等在UK專利申請8927255.3中公開了利用生長激素抑制素衍生物如用111In通過結(jié)合到端氨基的螯合基標(biāo)記的奧曲肽進(jìn)行放射性成像。
Albert等在國際專利申請Wo 91/01144中描述了利用放射性標(biāo)記的肽來進(jìn)行放射性成像，這些肽與生長因子、激素、干擾素和細(xì)胞因子有關(guān)，并且包含以共價鍵結(jié)合到放射性核素螯合基上的特異性識別肽。
Fischman等在國際專利申請公開號Wo 93/13317中公開了結(jié)合到螯合基部分上的趨化(chemotactic)肽。
Kwekkeboom等在1991，J.Nucl.Med.32981 Abstract#305提到用111In放射性標(biāo)記生長激素抑制素類似物。
Albert等在1991，Abstract LM10，12th American Peptide Symposium1991中描述了關(guān)于111In標(biāo)記的二亞乙基-三氨基五乙酸衍生的生長激素抑制素類似物的應(yīng)用。
Cox等在1991，Abstract.7th International Symposium onRadiopharmacology，P.16中公開了在通過閃爍照相對體內(nèi)內(nèi)分泌腫瘤進(jìn)行放射定位時，Tc-99m-，131I-和111In標(biāo)記的生長激素抑制素的應(yīng)用。
在現(xiàn)有技術(shù)中，已知用Tc-99m標(biāo)記某種特異性結(jié)合的化合物的方法。
Hnatowich在美國專利4,668,503中描述了Tc-99m蛋白質(zhì)放射性標(biāo)記。
Tolman在美國專利4,732,684中描述了靶分子與金屬硫蛋白(metallothionein片段的軛合。
Nicoloni等在美國專利4,861,869中描述了用于與生物分子如抗體形成軛合物的雙官能偶聯(lián)劑。
Frizberg等在美國專利4,965,392中描述了用于標(biāo)記蛋白質(zhì)的各種以S-保護(hù)的巰基乙?；拾滨８拾彼釣榛A(chǔ)的螯合劑。
Schochat等在美國專利5,061,641中描述了直接標(biāo)記至少含一個“側(cè)”巰基的蛋白質(zhì)。
Fritzberg等在美國專利5,091,514中描述了用于標(biāo)記蛋白質(zhì)的以各種與保護(hù)的巰基乙酰基甘氨?；拾彼釣榛A(chǔ)的螯合劑。
Gustavson等在美國專利5,112,953中公開了用于放射性標(biāo)記的Tc-99m螯合劑。
Kasina等在美國專利5,175,257中描述了各種靶分子與Tc-99m螯合基的混合物。
Dean等在美國專利5,180,816中公開了用Tc-99m通過雙官能螯合劑放射性標(biāo)記蛋白質(zhì)的方法。
Sundrehagen，在國際專利申請公開號Wo 851/03231中公開了Tc-99m標(biāo)記的蛋白質(zhì)。
Reno和Bottino在歐洲專利申請87300426.1中公開了用Tc-99m放射性標(biāo)記抗體。
Bremer等在歐洲專利申請87118142.6中公開了Tc-99m放射性標(biāo)記抗體分子。
Pak等在歐洲專利申請Wo 88/07382中公開了用Tc-99m標(biāo)記抗體的方法。
Goedemans等在PCT申請WO 89/07456中公開了用環(huán)狀巰基化合物，尤其是2-iminothiolane及其衍生物放射性標(biāo)記蛋白質(zhì)。
Dean等在國際專利申請公開號WO 89/12625中講述了用于Tc-99m標(biāo)記蛋白質(zhì)的雙官能偶聯(lián)劑。
Schoemaker等在國際專利申請公開號Wo 90/06323中公開了含金屬結(jié)合區(qū)的嵌合蛋白質(zhì)。
Thomback等在EPC申請?zhí)?0402206.8中公開了利用含硫基的化合物，尤其是用2-iminothiolane及衍生物來制備和使用放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)或肽。
Gustavson等在國際專利申請公開號Wo 91/09876中公開了用于放射性標(biāo)記蛋白質(zhì)的Tc-99m螯合劑。
Rhodes，在1974，Sem.Nucl.Med.4281-293中講述了用锝-99m標(biāo)記人血清白蛋白。
Khaw等在1982，J.Nucl.Med.231011-1019中公開了用Tc-99m標(biāo)記具有生物活性的大分子的方法。
Schwartz等在1991，Bioconjugate Chem.2333中描述了通過使用肼基煙酰胺基，用Tc-99m標(biāo)記蛋白質(zhì)的方法。
在現(xiàn)有技術(shù)中已報道了在放射性標(biāo)記肽方面的嘗試。
Ege等在美國專利號4,832,940中講述了在成像定位的T淋巴細(xì)胞中所使用的放射性標(biāo)記的肽。
Morgan等在美國專利號4,986,979中公開了用于炎癥部位成像的方法。
Flanagan等在美國專利號5,248,764中描述了放射性標(biāo)記螯合部分和心鈉素衍生的肽之間的軛合物。
Ranby等在1988，PCT/US 88/02276中公開了用于檢測動物體中血纖蛋白沉積物的方法，它包括通過共價鍵將放射性標(biāo)記的化合物結(jié)合到血纖蛋白上。
Lees等在1989，PCT/US 89/01854中講述了用于動脈顯像的放射性標(biāo)記的肽。
Morgan等在國際專利申請公開號Wo 90/10463中公開了用于炎癥部位顯像的方法。
Flanagan等在歐洲專利申請?zhí)?0306428.5中公開了Tc-99m通過一組有機(jī)螯合劑分子對合成的肽片段進(jìn)行放射性標(biāo)記。
Stecttle在PCT申請公開號WO90/15818中描述了Tc-99m標(biāo)記含RGD的低聚肽。
Rodwell等在1991，PCT/US 91/03116中公開了“分子識別單位”與“效應(yīng)區(qū)”的軛合物。
Cox在國際專利申請?zhí)朠CT/US 92/04559中公開了放射性標(biāo)記的含兩個半胱氨酸基的生長激素抑制素衍生物。
Rhocles等在國際專利申請公開號Wo 93/12819中講述了含金屬離子結(jié)合區(qū)的肽。
Lyle等在國際專利申請公開號Wo 93/15770中公開了Tc-99m螯合劑和用Tc-99m標(biāo)記的肽。
Coughlin等在國際專利申請公開號Wo 93/21151中公開了用于放射性標(biāo)記靶分子的含硫脲基的雙官能螯合劑。
Knight等在1990，37th Annual Meeting of the Society of Nuclear Medicine，Abstraet#209中闡明了用Tc-99m標(biāo)記的肽進(jìn)行血栓顯像。
Babich等在1993，J.Nucl.Med.341964-1974中公開了Tc-99m標(biāo)記的含肼基煙酰胺基的衍生物的肽。
在1993年7月6日頒分的美國專利號5,225,180中公開了直接標(biāo)記生長激素抑制素，生長激素衍生物，生長激素的類似物或肽的方法，所述肽與生長激素受體結(jié)合并且至少含2個形成二硫化物或者其中的二硫化物被還原為巰基形式的半胱氨酸，該專利在參考文獻(xiàn)中引用。
螯合劑在對肽進(jìn)行放射性標(biāo)記中的應(yīng)用和用Tc-99m標(biāo)記肽的方法是現(xiàn)有技術(shù)中已知的并且公開于美國專利申請序號07/653,012，07/807,062，07/871,282，07/893,981，07/955,466，08/092,355和08/095,760中。
目前仍需要合成(設(shè)計適宜的生產(chǎn)程序并順利通過管理驗收)體內(nèi)穩(wěn)定性增加的生長激素抑制素的類似物。它們在治療上，當(dāng)用Tc-99m或其它可檢測的放射性同位素進(jìn)行放射性標(biāo)記后用于體內(nèi)腫瘤的成像時，可作為閃爍成像劑；并且當(dāng)用具有細(xì)胞毒性的放射同位素，如錸-188進(jìn)行射性標(biāo)記時，可作為放射性治療劑。本發(fā)明提供少量合成的生長激素抑制素的類似物是專用來滿足該需要的。
發(fā)明概要本發(fā)明提供生長激素抑制素類似物，它包括治療和診斷用的環(huán)肽。治療上的應(yīng)用包括放射性治療用；診斷上應(yīng)用包括放射性診斷用。該類似物尤其是指閃爍成像用的環(huán)肽。與天然生長激素抑制素不同，本發(fā)明環(huán)肽不包含二硫鍵。本發(fā)明也提供包含環(huán)肽生長激素抑制素類似物的環(huán)肽試劑，其中該肽包含共價連接的金屬離子的結(jié)合部分。本發(fā)明提供這些環(huán)肽、環(huán)肽試劑和放射性標(biāo)記的環(huán)肽試劑，它們都是閃爍照像成像劑、放射性診斷劑和放射性治療劑。本發(fā)明閃爍照相成像劑包括用放射性同位素(尤其是锝-99m)進(jìn)行放射性標(biāo)記的環(huán)肽試劑。本發(fā)明的放射性治療劑包括用細(xì)胞毒性放射性同位素(尤其是錸-186或錸-188)進(jìn)行放射性標(biāo)記的環(huán)肽試劑。也提供制備和使用這些環(huán)肽、環(huán)肽試劑及其放射性標(biāo)記的實例的方法。
本發(fā)明提供物質(zhì)的組合物，它包含特異性結(jié)合肽，該肽特異性地結(jié)合到哺乳物體內(nèi)的生長激素抑制素受體上，并共價連接到金屬離子絡(luò)合部分。本發(fā)明物質(zhì)的組合物具有下式環(huán)(N-CH3)-Phe-Tvr-(D-Trp)-Lys-Val-Hcy.(CH2COX)其中X為(氨基酸)n-B-(氨基酸)m-Z。其中B為含硫基的部分，該部分是半胱氨酸、高半胱氨酸、異半胱氨酸、或青霉胺；(氨基酸)n和(氨基酸)m各自為初級α-或β-氨基酸，它不包含巰基；Z為-OH或-NH2；n和m各自分別為2-5和0-5的整數(shù)。
在描述本發(fā)明物質(zhì)組合物的通式中，應(yīng)該知道，術(shù)語“環(huán)”和下面劃線的氨基酸序列連接起來是指下面劃線的序列通過肽鍵將該序列中的第一個氨基酸的端氨基與該序列中最后一個氨基酸的端羧基連接起來而使該序列環(huán)化。如果接著是小括號內(nèi)的一項如“(CH2COX)”，則這一項應(yīng)當(dāng)將其理解為是指通過共價鍵將小括號內(nèi)的這個序列連接到下面劃線的氨基酸序列中含硫羥的氨基酸側(cè)鏈的硫原子上與其形成硫鍵。因此，在上述化學(xué)結(jié)構(gòu)中，應(yīng)該知道，-CH2COX基是共價連接到高半胱氨酸的側(cè)鏈硫原子上的。實施例2中顯示該化學(xué)結(jié)構(gòu)的實例。
本發(fā)明物質(zhì)組合物的優(yōu)選實例具有下式的化合物環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcy(CH2CO.GGCK.酰胺)本發(fā)明物質(zhì)的組合物具有許多診斷和治療用途。
因此，本發(fā)明一方面提供用于制備放射性標(biāo)記的閃爍照相成像劑的試劑，其中所述成像劑用于富含抑生長素受體的哺乳動物體各部位的成像。在該實施方案中，金屬離子絡(luò)合部分包含放射性標(biāo)記的結(jié)合部分，并且該試劑通過與所述部分形成絡(luò)合物來形成放射性標(biāo)記的絡(luò)合物。在本發(fā)明該方面的一個實施方案中，將該試劑在還原條件下與Tc-99m絡(luò)合，形成閃爍照相成像劑。
因此，本發(fā)明也包括閃爍照相成像劑，它們是本發(fā)明試劑與Tc-99m的絡(luò)合物，還包括放射性標(biāo)記該試劑的方法。本發(fā)明提供的Tc-99m放射標(biāo)記的絡(luò)合物是在還原劑存在下將本發(fā)明試劑與Tc-99m反應(yīng)而形成的。優(yōu)選的還原劑包括(但不限制于)連二亞硫酸離子、亞錫離子和亞鐵離子。也可以通過將預(yù)先還原的本發(fā)明Tc-99m絡(luò)合物進(jìn)行配位體交換，用Tc-99m標(biāo)記本發(fā)明試劑來形成本發(fā)明絡(luò)合物。
本發(fā)明用于制備閃爍照相成像劑的試劑其優(yōu)選實例是具有下式的化合物環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGCK酰胺)優(yōu)選的成像劑包括這種試劑的Tc-99m絡(luò)合物。
本發(fā)明也提供制備閃爍照相成像劑用的試劑盒，其中所述成像劑是用Tc-99m放射性標(biāo)記的本發(fā)明試劑。用Tc-99m標(biāo)記本發(fā)明試劑的試劑盒包含一個密封的管形瓶，其中包含預(yù)先測定量的本發(fā)明一種試劑和其量足以用Tc-99m標(biāo)記該試劑的還原劑。
本發(fā)明的第二方面是提供成像劑，其中用碘的放射性同樣素，優(yōu)選I-123、I-125、或I-131來放射性標(biāo)記本發(fā)明物質(zhì)的組合物。本發(fā)明提供放射性碘處理的成像劑，它們是具有放射性標(biāo)記碘的本發(fā)明試劑的絡(luò)合物。
制備放射性碘處理的成像劑用的試劑其優(yōu)選實例是具有下式的化合物環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGCK酰胺)優(yōu)選的成像劑包括經(jīng)放射性碘處理的這種具體試劑。
本發(fā)明第三方面是提供非放射性標(biāo)記的成像劑，它包括這樣的試劑，該試劑是與順磁金屬離子或顆粒絡(luò)合的本發(fā)明物質(zhì)組合物。在本發(fā)明該方面的實例中，順磁金屬離子是用絡(luò)合金屬離子的部分來絡(luò)合的。在使用顆粒，特別是使用超順磁金屬顆粒的實例中，通過共價鍵或使用Weissleder等所述的方法(1992.Radiology.182381-385)，將本發(fā)明物質(zhì)的組合物連接到超順磁顆粒上。本發(fā)明提供了用于磁共振成像的該成像劑。也提供了制備這些非放射性標(biāo)記的成像劑的方法。
本發(fā)明用于制備非放射性標(biāo)記的成像劑的試劑優(yōu)選實例是具有下式的化合物環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGCK酰胺)優(yōu)選的非放射性標(biāo)記的成像劑包括該試劑的高鐵離子絡(luò)合物。
本發(fā)明也提供治療劑。本發(fā)明的第四方面是提供未與金屬離子絡(luò)合的本發(fā)明物質(zhì)的組合物本身作為治療劑。本發(fā)明提供的該治療劑的優(yōu)選實例是具有下式的化合物環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGCK酰胺)在第五方面，本發(fā)明提供放射性標(biāo)記的治療劑，它包括制備該治療劑的試劑，其中所述治療劑是本發(fā)明提供的物質(zhì)的組合物。在這些實施方案中，提供本發(fā)明物質(zhì)的組合物，其中，金屬離子絡(luò)合部分與發(fā)射β-粒子或發(fā)射轉(zhuǎn)化電子的放射性同位素絡(luò)合。發(fā)射β-粒子的放射性同位素的優(yōu)選實例為錸-186和錸-188。優(yōu)選發(fā)射轉(zhuǎn)化電子的放射性同位素為錫-117m。本發(fā)明提供本發(fā)明物質(zhì)組合物的這些放射性同位素絡(luò)合物，用于放射性治療生長激素抑制素受體表達(dá)的病理細(xì)胞和組織，特別是腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞。也提供制備這些治療用本發(fā)明物質(zhì)組合物的放射性同位素絡(luò)合物的方法。
本發(fā)明提供的制備這些放射性治療劑的優(yōu)選試劑的實例為具有下式的化合物環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGCK酰胺)優(yōu)選的放射性治療劑包括發(fā)射β-粒子或轉(zhuǎn)化電子的金屬離子與該試劑的絡(luò)合物。
另一方面，所提供的本發(fā)明放射性治療劑是這樣的一些放射性治療劑，其中用碘的放射性同位素(優(yōu)選I-125或I-131，或用砹-211)放射性標(biāo)記本發(fā)明物質(zhì)的組合物。本發(fā)明也提供其放射性治療劑本身以及放射性標(biāo)記該試劑的方法。
本發(fā)明提供的制備這些放射性碘處理或放射性砹處理的治療劑用的試劑，其優(yōu)選實例是具有下式的化合物環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGCK酰胺)優(yōu)選的放射性治療劑包括該試劑的放射性碘處理或放射性砹處理的一些具體治療劑。
所提供的治療劑是非放射性標(biāo)記的金屬原子絡(luò)合劑，它包含的試劑是與非放射性金屬原子如銅、鋅或錸絡(luò)合的本發(fā)明物質(zhì)的組合物。在本發(fā)明該方面的實例中，非放射金屬離子與金屬離子絡(luò)合部分絡(luò)合。本發(fā)明提供的這些治療劑所治療的疾病是其相關(guān)組織的細(xì)胞中過渡表達(dá)了生長激素抑制素受體。該治療劑是治療過渡表達(dá)生長激素抑制素受體的腫瘤細(xì)胞。也提供制備這些與非放射性標(biāo)記的金屬原子絡(luò)合的治療劑的方法。
本發(fā)明提供的制備非放射性標(biāo)記的治療劑的優(yōu)選試劑實例為具有下式的化合物環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGCK酰胺)優(yōu)選的非放射性標(biāo)記治療劑包括該試劑的錸絡(luò)合物。
本發(fā)明提供通過體外化學(xué)合成制備含肽的本發(fā)明具體試劑的方法。在優(yōu)選實例中，通過固相肽合成法合成肽。
本發(fā)明提供了本發(fā)明的診斷劑和放射性診斷劑、以及治療劑和放射性治療劑的使用方法。就放射性標(biāo)記的本發(fā)明這些具體試劑，例如Tc-99m標(biāo)記的閃爍照相成像劑而言，按診斷或治療有效量的本發(fā)明診斷或放射性診斷劑，或者治療或放射性治療劑來給藥。在放射性診斷實施方案中，用常規(guī)方法，如γ閃爍照法來檢測放射性標(biāo)記的定位。在非放射性診斷的實施方案中，用磁共振成像技術(shù)來定位本發(fā)明順磁金屬標(biāo)記的診斷劑的積累部位。本發(fā)明提供的成像劑用于腫瘤成像，尤其是用于初期或轉(zhuǎn)移期腫瘤部位的成像，其中所述的腫瘤細(xì)胞表達(dá)生長激素抑制素受體(SSTR)，尤其是那些在臨床上用常規(guī)方法難以檢測的初期或轉(zhuǎn)移期腫瘤細(xì)胞。另外，本發(fā)明成像劑還用于檢測那些與疑難病或病理有關(guān)的T細(xì)胞蓄積的部位，例如患有肺結(jié)核的病人可產(chǎn)生T細(xì)胞蓄積。
本發(fā)明提供使用本發(fā)明生長激素抑制素類似物來減輕動物，尤其是人的某些疾病的方法。這些疾病包括但不限制于糖尿病或與糖尿病有關(guān)的視網(wǎng)膜病、肝硬化和傳染性肝炎、出血性潰瘍和其它胃腸道出血、胰腺炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌疾病、阿耳茨海默氏病、肢端肥大癥和其它疾病以及與體內(nèi)產(chǎn)生不適宜量的生長激素有關(guān)的疾病，和癌癥，特別是那些生長依賴于或受產(chǎn)生的生長激素影響的癌癥。非放射性標(biāo)記的具體治療劑也用于治療與過渡表達(dá)SSTR相關(guān)的疾病，如由過渡表達(dá)SSTR的促胃液素瘤引起的腹瀉。本發(fā)明所提供的生長激素抑制素的劑量可以與通常在治療上述疾病或其它疾病時所使用的天然生長激素抑制素的劑量相同，或者，由于本發(fā)明化合物在體內(nèi)半衰期長，也可以用較小劑量。
治療應(yīng)用也包括放射性治療腫瘤和轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤細(xì)胞摘除的腫瘤患者，其中所述腫瘤的細(xì)胞表達(dá)生長激素抑制素受體。本發(fā)明放射性治療劑的應(yīng)用包括主要治療那些用常規(guī)治療方法難以治療的腫瘤和不宜手術(shù)的腫瘤，以及作為外科手術(shù)，放射性治療或常規(guī)化療的輔助性治療。
本發(fā)明放射性標(biāo)記的具體應(yīng)用還有在外科手術(shù)期間，用作外科導(dǎo)子來確定表達(dá)生長激素抑制素受體的腫瘤組織。對于放射性同位素引導(dǎo)外科手術(shù)的這種應(yīng)用，可以在常規(guī)外科手術(shù)期間識別并切除那些外科醫(yī)生本來看不見的惡性腫瘤組織。
從下列對某些優(yōu)選實例的更詳細(xì)說明和權(quán)利要求中，可以更清楚地理解本發(fā)明特定的優(yōu)選實施方案。
附圖的簡要說明

圖1顯示患有腫瘤的鼠中，由99mTc標(biāo)記的P587的圖像，由箭頭指示，表明在該后腿腫瘤部位攝入量較高。
詳細(xì)說明優(yōu)選實施方案本發(fā)明提供環(huán)狀肽，它們是生長激素類似物并且不包含二硫鍵。因此，與天然生長激素抑制素相比，這種生長激素類似物的體內(nèi)穩(wěn)定性增加。這些環(huán)狀肽本身是使動物(包括人)的疾病緩解的治療劑。
本發(fā)明也提供放射性碘處理或放射性砹處理并因此可用于放射性治療和放射性診斷的環(huán)狀肽。
本發(fā)明提供的這些環(huán)狀的另一實施方案是環(huán)狀肽試劑，其中本發(fā)明環(huán)狀肽通過共價鍵連接到金屬離子絡(luò)合部分?？梢詫⑦@些環(huán)狀肽試劑進(jìn)行放射性標(biāo)記來做成放射性診斷或放射性治療劑。利用本發(fā)明放射性標(biāo)記的試劑進(jìn)行放射性診斷的一個實例是用來進(jìn)行閃爍照相成像，其中可測定攜帶生長激素抑制素受體的腫瘤部位和范圍。也可以用具有細(xì)胞毒性的放射性同位素如放射性治療用的錸-186或錸-188對本發(fā)明環(huán)狀肽試劑進(jìn)行有效的放射性標(biāo)記。本發(fā)明環(huán)狀肽試劑也用于制備其與非放射性金屬的絡(luò)合物，所述絡(luò)合物在治療學(xué)上是有用的。
用Tc-99m標(biāo)記是本發(fā)明的一個優(yōu)點，因為該同位素的原子核和放射活性使得它成為理想的閃爍照相成像劑。該同位素的單個光子能量為140KeV，放射性半衰期大約為6小時，并且容易從99Mo-99mTc發(fā)生器中獲得。本發(fā)明公開了其它放射性核素也可用于實施本發(fā)明。
本文中所使用的術(shù)語閃爍照相成像劑是指可以用放射性檢測方法(包括但不限制于γ-照相，Geiger-Muller計數(shù)器和閃爍檢測器探查)檢測的放射性標(biāo)記試劑。
另一方面，可以用具有細(xì)胞毒性的放射性同位素，包括但不限制于銅-67，碘-125，碘-131，錸-186，錸-188和砹-211，最優(yōu)選186Re或188Re，有效地放射性標(biāo)記本發(fā)明具體的放射性治療劑。這些具體治療劑用于治療與生長激素抑制素有關(guān)的動物(優(yōu)選人)的疾病，所述疾病包括但不限制于癌癥和其它以惡性或良性腫瘤的生長為特征的疾病，其中所述腫瘤能通過對在這些腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞表面上生長激素抑制素受體的表達(dá)，結(jié)合生長激素抑制素或生長激素抑制素類似物。
本發(fā)明提供用于制備診斷和放射性診斷劑、治療和放射性治療劑的試劑。本發(fā)明提供的該試劑包含通過共價鍵連接到特異性結(jié)合肽上的金屬離子絡(luò)合部分，其中所述特異性結(jié)合肽結(jié)合到哺乳動物體內(nèi)的生長激素抑制素受體部位。
小的化合物，優(yōu)選分子量少于10,000道爾頓的化合物具有獨特的商業(yè)優(yōu)勢。該種小化合物可以很容易生產(chǎn)。而且，它們很可能不具有致免疫性并且可迅速從血管系統(tǒng)中清除，因此可更好和更快地成像。相反，大分子，如抗體或其片段，或者通過生物學(xué)方法衍生的大于10,000道爾頓的肽，生產(chǎn)費用高，并且很可能是致免疫性的和從血流中清除慢，因此干擾體內(nèi)快速診斷。
在對共價鍵連接的放射性標(biāo)記物結(jié)合部分進(jìn)行放射性標(biāo)記的條件下，本發(fā)明提供的生長激素抑制素類似物中所包含的非二硫環(huán)鍵是穩(wěn)定的，這是本發(fā)明提供的生長激素抑制素類似物的一個優(yōu)點。相反，例如Tc-99m與通過共價鍵連接到天然生長激素抑制素上或具有二硫鍵的生長激素類似物上的Tc-99m結(jié)合部分的軛合可引起二硫鍵的還原，同時伴發(fā)生物活性的喪失。當(dāng)使用天然生長激素抑制素，或任何具有二硫鍵的生長激素抑制素類似物時，也可在體內(nèi)產(chǎn)生這種生物活性的喪失。本發(fā)明不存在類似的體內(nèi)生物活性喪失，因為在本發(fā)明每種生長激素抑制素類似物中的非二硫環(huán)鍵都包含穩(wěn)定的共價鍵。
就本發(fā)明目的而言，術(shù)語“特異性結(jié)合肽”是指特異性地結(jié)合到由大量生長激素抑制素受體(SSTR)分子所限定的哺乳動物體靶部位的任何肽化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道，“特異性結(jié)合”是指將肽定位在靶部位到周圍組織的較大范圍內(nèi)。在包含該特異性結(jié)合肽的診斷用成像劑中，這種特異結(jié)合是有利的，因為該診斷用成像劑在給藥后分布到哺乳動物全身并且這種結(jié)合放射性的試劑的特異性定位使視覺限定在體內(nèi)靶的部位。
本發(fā)明每種特異性結(jié)合肽的實例均含一個氨基酸序列。本發(fā)明中所述的氨基酸包括所有L-和D-、初級α-和β-氨基酸，可以是天然存在的、修飾的、取代的、改變的等等。本發(fā)明試劑的特異性結(jié)合肽的實例包括分子量小于大約5,000道爾頓的特異性結(jié)合肽。特別優(yōu)選的本發(fā)明特異性結(jié)合肽的實例包括這樣一些肽，它們特異性地并且具有高度親和性地結(jié)合到在SSTR表達(dá)細(xì)胞，特別是腫瘤細(xì)胞和激活性的T-淋巴細(xì)胞上的生長激素抑制素受體(SSTR)。本發(fā)明提供的包含特異結(jié)合肽的試劑包括但不限制于包含具有下列氨基酸序列的肽的試劑(除另外說明，下列肽中的氨基酸是L-氨基酸)環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GGC.酰胺)
環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GGCK.酰胺)環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GGCR.酰胺)環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GGCRD.酰胺)環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GGCRK.酰胺)環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GGCRR酰胺)環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GGCKK.酰胺)環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GGCKKK.酰胺)環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GGC.Om.酰胺)環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GGCKDK胺)環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GGC.Orn.D.Orn酰胺)環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GGC.Orn.D.酰胺)環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.KKC.酰胺)環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.KRC.酰胺)環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.RRC.酰胺)環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcv(CH2CO.KKCK.酰胺)環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GRCK.酰胺)環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcv.(CH2CO.GKCR.酰胺)(在Zubay，ibid.，P.33中可見氨基酸的單字母縮寫；其它縮寫見Legend表I)，該表中所列的試劑是說明本發(fā)明并不是限定本發(fā)明，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道，包含本發(fā)明所公開的肽或其它等同物的試劑可通過共價鍵連接到本發(fā)明的任何螯合劑部分并且在本發(fā)明范圍內(nèi)。
在優(yōu)選實例中，本發(fā)明試劑具有式
包含本發(fā)明試劑的特異性結(jié)合肽可以在體外通過化學(xué)方法合成。通常，可以在肽合成器(Synthesizer)上有效地制備這些肽。利用本文所描述的技術(shù)(例如，見實施例2，小組O)，在體外化學(xué)合成過程中，通過共價鍵將金屬離子絡(luò)合部分連接到肽上，由此可合成本發(fā)明肽。
在本發(fā)明閃爍照相成像劑實例中，形成锝-99m與本發(fā)明試劑的絡(luò)合物。為了實現(xiàn)這一點，在還原劑存在下，將Tc-99m，優(yōu)選Tc-99m的高锝酸鹽與本發(fā)明試劑反應(yīng)。優(yōu)選的還原劑為連二亞硫酸鹽、亞錫和亞鐵離子；最優(yōu)選的還原劑為亞錫鹽如氯化亞錫。在另一優(yōu)選實例中，還原劑是固態(tài)還原劑。為了方便，絡(luò)合物和制備該絡(luò)合物用的試劑是在一個試劑盒中，所述試劑盒中包含一個密封的小瓶，該小瓶中含預(yù)先測定量的待標(biāo)記的本發(fā)明試劑和用Tc-99m標(biāo)記試劑時足夠量的還原劑。或者，可以通過將本發(fā)明試劑與預(yù)先形成的不穩(wěn)定的锝絡(luò)合物和已知作為轉(zhuǎn)移配位體的另一化合物(例如酒石酸鹽、構(gòu)櫞酸鹽、糖酸鹽或甘露糖醇)反應(yīng)來制備該絡(luò)合物。已知該過程為配位體交換并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。本發(fā)明使用的Tc-99m高锝酸鹽包括堿金屬鹽如鈉鹽、或銨鹽或低級烷基銨鹽。
通過將適宜量的Tc-99m或Tc-99m絡(luò)合物加到小瓶中并在下文實施例3中所描述的條件下反應(yīng)，可以制備锝-99m標(biāo)記的本發(fā)明閃爍照相成像劑。通常，試劑盒中也可以包含藥用佐劑物質(zhì)，如調(diào)節(jié)滲透壓的可藥用鹽、緩沖劑、防腐劑等。試劑盒中的組分可以是液體、冷凍或干燥形式。在優(yōu)選實例中，所提供的試劑盒的組分是凍干形式的?？赏ㄟ^在下文實施例3所描述的條件下反應(yīng)來制備放射性標(biāo)記的本發(fā)明閃爍照相成像劑。
本發(fā)明提供的放射性標(biāo)記試劑具有適宜量的放射活性。例如，在形成Tc-99m放射性絡(luò)合物時，通常優(yōu)選在含放射性濃度大約為每毫升0.01毫居里(mCi)到100mCi的溶液中制備放射性絡(luò)合物。
本發(fā)明所提供的成像劑可用于顯影器官如腎臟來診斷這些器官的疾病、和腫瘤，尤其是胃腸道腫瘤、骨髓瘤、小細(xì)胞肺癌和其它APUD癌、內(nèi)分泌腫瘤如髓質(zhì)甲狀腺癌和垂體刖瘤、腦腫瘤如腦脊膜瘤和星形細(xì)胞瘤，也可以成像前列腺、乳腺、結(jié)腸和卵巢的腫瘤。按照本發(fā)明，Tc-99m標(biāo)記的肽試劑以單一的單位注射劑量給藥?？梢栽谌魏纬Ｒ?guī)靜脈注射介質(zhì)如鹽水介質(zhì)，或在血漿介質(zhì)中，通過靜脈給予本發(fā)明所提供的Tc-99m標(biāo)記的肽試劑。通常，給藥的單位劑量具有的放射性為約0.01mCi-約100mCi，優(yōu)選1mCi-20mCi，其以單位劑量注射的溶液為約0.01mL-約10mL。靜脈給藥后，在幾分鐘后進(jìn)行體內(nèi)顯影。然而，如果需要，可在將放射性標(biāo)記的肽注入人體后幾小時，甚至更長的時間后顯影。在大多數(shù)情況下，足夠量的給藥劑量在大約0.1小時內(nèi)，在待顯影的區(qū)域蓄積，使得可以拍攝閃爍照片。按照本發(fā)明，可以使用任何常規(guī)診斷用閃爍照相成像的方法。
在臨床上，可以使用與生長激素抑制素受體結(jié)合的環(huán)狀肽和本發(fā)明環(huán)狀肽試劑的非放射性金屬絡(luò)合物，作為治療劑來促進(jìn)某種類型腫瘤的消除，特別是那些表達(dá)生長激素抑制素受體的腫瘤的消除。本發(fā)明生長激素類似物環(huán)狀肽也可用于減少激素的過渡分泌，這種激素的過度分泌常常伴發(fā)某些癌癥，如APUD癌。本發(fā)明用作治療劑的肽可以通過任何適宜的途徑，包括靜脈、肌肉或口服，并且在任何適宜的藥用載體中，以大約0.01-49mg/kg體重/天的劑量范圍來給藥。
本發(fā)明也提供用具有細(xì)胞毒性的放射性同位素如錸-186或錸-188來進(jìn)行放射性標(biāo)記的肽，該肽可用于放射性治療上述某些腫瘤。就該目的而言，可通過任何臨床給藥途徑，優(yōu)選通過靜脈注射來給予大約10mCi-200mCi量的放射性同位素。
在下列實施例中更詳細(xì)地說明制備和標(biāo)記這些化合物的方法。這些實施例說明上述方法和有效結(jié)果的某些方面，并且對本發(fā)明只是說明而并非限制。
實施例1固相肽的合成固相肽的合成是在0.25毫摩爾(mmol)標(biāo)度下，使用Appleid BiosystemsModel 431A型的肽合成器，使用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)端氨基保護(hù)，與二環(huán)己基-碳化二亞胺/羥基苯并三唑或2-(1H-苯并-三唑-1基)-1，13，3-四甲基尿鎓六氟磷酸鹽/羥基苯并三唑(HBTU/HOBT)偶聯(lián)，并且對于羧基端為酸的，使用對-羥甲基-苯氧基甲基聚苯乙烯(HMP)或SasrinTM樹脂，或者對于羧基端為酰胺的，使用Rink酰胺樹脂。由此進(jìn)行固相肽合成(SPPS)。
通過用三苯甲醇在三氟乙酸中進(jìn)行三苯甲基化作用，然后按照Atherton等的方法(1989，固相肽合成，IRL PressOxoford)和進(jìn)一步在下文實施例2小組J中所描述的方法進(jìn)行Fmoc衍化作用，由適宜的氨基酸制備Fmoc.Hcy(S-三苯甲游基)和Fmoc.Pen(S-三苯甲游基)。Fmoc-S-(3-Boc-氨基丙基)半胱氨酸是從甲醇鈉中的L-半胱氨酸和Boc-氨基丙基溴化物制備。然后，在pH10下，用O-9-芴基甲基O′-N-琥珀酰亞胺基碳酸酯(FmocO Su)處理。
通過用適宜的2-鹵代乙酸作為在SPPS過程中被偶聯(lián)的最后基團(tuán)，或通過用在NMP中的2-鹵代乙酸/二異丙基碳化二酰亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺或在NMP中的2-鹵代乙酸酐/二異丙基乙胺來處理結(jié)合到樹脂上的N-端游離氨基的肽，由此引入L-鹵代乙酰基。
在室溫，pH10下，將含巰基的肽與含氯乙酰基的巰基保護(hù)的Tc-99m絡(luò)合部分反應(yīng)0.5-24小時，然后視情況可用乙酸酸化并蒸發(fā)溶液，得到相應(yīng)的肽-硫化物加合物，如下文實施例2小組O中更詳細(xì)的描述。按照常規(guī)方法脫保護(hù)并純化，得到螯合劑-肽共軛物。
用在二氯甲烷中的1％TFA溶液，將與SasrinTM樹脂結(jié)合的肽裂解，得到被保護(hù)的肽。
如果需要，通過用二苯基磷?；B氮化物讓側(cè)鏈?zhǔn)鼙Ｗo(hù)的氨基端游離的胺與羧基端游離的酸反應(yīng)，在氨基和羧基端之間，將被保護(hù)的肽的前體環(huán)化，如下文實施例2小組M中更詳細(xì)的描述。
按照常規(guī)方法，將與HMP或Rink酰胺樹脂結(jié)合的產(chǎn)物裂解并在室溫下用含二氟乙酸(TFA)，或TFA和二氯甲烷以及視情況可含比例為100∶5∶5∶2.5∶2的水、苯硫基甲烷、乙烷二硫醇、和三異丙基硅烷的溶液，將被保護(hù)的環(huán)狀肽脫保護(hù)0.5-3小時。如果需要，將產(chǎn)物在三酚甲醇/TFA中重新S-三苯甲基化，并且用(Boc)2O將N-Boc基重新引入肽中。
通過制備性高效液相色譜法(HPLC)，使用Waters Delta-Pak C18柱并且經(jīng)乙腈改性的0.1％TFA水溶液梯度洗脫來純化粗品肽。柱子洗脫后，將乙腈從洗脫的餾分中蒸發(fā)掉，然后冷凍干燥。通過快速原子轟擊質(zhì)譜(FABMS)或電子噴射質(zhì)譜(ESMS)來確定如此制備并純化的每種產(chǎn)物的特性。
實施例2合成環(huán)(N-CH3)苯丙氨?；?酪氨?；?D-色氨?；?賴氨酰基-纈氨?；?高半胱氨酸，S-2-乙?；?甘氨?；?甘氨?；?半胱氨酰基-賴氨酰胺(P587)A.合成N-α-芐酯基-N-ε-叔丁氧基羰基-賴氨酸，N-羥基-琥珀酰亞胺酯向在冰水浴中冷卻的，在180ml無水四氫呋喃(THF)中的N-α-芐酯基-N-ε-叔丁氧基羰基-賴氨酸123g，60.5mmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(7.1g 61.7mmol)的混合物中，加入二異丙基碳化二亞胺(9.66ml，61.7mmol)。將該反應(yīng)混合物攪拌過夜然后過濾并將濾液蒸發(fā)。然后將濾液的殘渣溶解在少量乙酸乙酯，200ml乙醚和200ml己烷中。標(biāo)題化合物從該混合物中沉淀出來并通過過濾回收，用冷己烷洗滌并干燥，得到28.1g(58.9mmol，97％產(chǎn)率)。
B.合成N-α-芐酯基-N-ε-叔丁氧基羰基-賴氨酸?；?纈氨酸，甲酯向在150ml THF中的纈氨酸甲酯(8.38g，50mmol)和二異丙基乙胺(12.7ml，50mmol)的溶液中加入N-α-芐酯基-N-ε-叔丁氧基羰基賴氨酸，N-羥基琥珀酰亞胺酯(23.9g，50mmol)，再加入50ml THF。2小時后，蒸發(fā)除掉溶劑并向殘渣中加入50ml乙酸乙酯。將該溶液先后用200ml 5％的枸櫞酸、200ml飽和碳酸氫鈉和200ml飽和鹽水洗滌，經(jīng)無水硫酸鎂干燥，過濾并蒸發(fā)。將得到的油溶解在少量乙酸乙酯、200ml乙醚和200ml己烷中。通過過濾分離標(biāo)題化合物并干燥，得到20g(40.5mmol，81％產(chǎn)率)。
C.合成N-ε-叔丁氧基羰基-賴氨?；?纈氨酸，甲酯向在100ml乙酸乙酯的N-α-芐酯基-N-ε-叔丁氧基羰基-賴氨?；?纈氨酸，甲酯(19g，38.5mmol)和乙酸(1ml)的溶液中，加入10％含鈀碳催化劑(0.19g)并在氫氣壓下攪拌過夜。將反應(yīng)混合物在Celite上過濾，將濾液蒸發(fā)并將殘渣溶解在100ml含1ml乙酸的甲醇中。向該溶液中加入10％含鈀碳(0.19g)并在45磅/英寸2的壓力下，用Parr氫化器，將混合物氫化2小時。將反應(yīng)混合物再次經(jīng)Celite過濾并將濾液蒸發(fā)，得到13.56g標(biāo)題化合物(37.7mmol，98％產(chǎn)率)。
D.合成芴基甲氧基羰基-D-色氨酸，N-羥基琥珀酰亞胺酯向在冷水浴中冷卻的，在250ml無水THF中的N-α-芴基甲氧基羰基-D-色氨酸半水合物(25g，82.1mmol)和N-羥基正琥珀酰亞胺(9.78g，85mmol)的溶液中，加入二異丙基碳二亞胺(13.3mL，85mmol)。將反應(yīng)混合物攪拌過夜，過濾并將濾液蒸發(fā)。將殘渣溶解在甲苯和己烷中。通過過濾分離標(biāo)題化合物并干燥，得到34g(66.5mmol，81％產(chǎn)率)。
E.合成芴基甲氧基羰基-D-色氨?；?N-α-叔丁氧基-羰基-賴氨?；?纈氨酸，甲酯向在200ml THF中的N-ε-叔丁氧基羰基-賴氨?；?纈氨酸，甲酯(13g，36.1mmol)的混合物中，加入芴基甲氧基羰基-D-色氨酸，N-羥基琥珀酰亞胺酯(18.9g，36.1mmol)。加入二異丙基乙胺來調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物的pH至pH8，并將反應(yīng)物攪拌2天。蒸發(fā)除掉溶劑并將殘渣溶解在乙酸乙酯中，用5％的枸櫞酸，飽和碳酸氫鹽，和飽和的鹽水洗滌，然后經(jīng)硫酸鈉干燥。將溶液過濾并蒸發(fā)，將殘渣溶解在乙酸乙酯中。將該溶液幾次結(jié)晶后回收標(biāo)題化合物，得到17.3g產(chǎn)物(22.5mmol，62％產(chǎn)率)。
F.合成N-芴基甲氧基羰基-O-叔丁基酪氨酸，N-羥基-琥珀酰亞胺酯向在冷水浴中冷卻的，在250ml無水THF中的N-α-芴基甲氧基羰基-O-叔丁基酪氨酸(25g，54.3mmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(6.62g，57.5mmol)的溶液中，加入二異丙基碳化二亞胺(9.0ml，57.5mmol)，將反應(yīng)混合物攪拌過夜，過濾并將濾液蒸發(fā)。將殘渣溶解在甲苯和己烷中，通過過濾將標(biāo)題化合物分離出來并干燥，得到27.7g(49.7mmol，92％產(chǎn)率)。
G.合成N-芴基甲氧基羰基-O-叔丁基酪氨?；?D-色氨?；?N-ε-叔丁氧基羰基-賴氨?；?纈氨酸，甲酯在室溫下，將芴基甲氧基羰基-D-色氨酰基-N-ε-叔丁氧基羰基-賴氨?；?纈氨酸，甲酯(17g，22.1mmol)用40ml二乙胺和40ml THF處理1.5小時。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)，重新懸浮在100ml THF中并再蒸發(fā)三次。將殘渣溶解在120ml無水THF中，并加入N-芴基甲氧羰基-O-叔丁基酪氨酸，N-羥基琥珀酰亞胺酯(12.3g，22.1mmol)，再加入20ml無水THF和4ml二異丙基乙胺，產(chǎn)生的溶液pH為9。攪拌過夜后，將反應(yīng)物蒸發(fā)并將殘渣溶解在乙酸乙酯中。用5％的枸櫞酸，飽和碳酸氫鈉和飽和鹽水洗滌該乙酸乙酯溶液，經(jīng)硫酸鎂干燥并蒸發(fā)。將殘渣溶解在乙酸乙酯、乙醚和己烷中，標(biāo)題化合物沉淀出來。通過過濾分離沉淀的化合物并干燥，得到14.6g標(biāo)題化合物(14.8mmol，67％產(chǎn)率)。
H.合成N-芴基甲氧基羰基-N-甲基苯丙氨酸，N-羥基琥珀酰亞胺酯向在冷水浴中冷卻的，在180ml無水THF中的N-α-芴基甲氧基羰基-N-甲基苯丙氨酸(25g，62.3mmol)和N-羥基正琥珀酰亞胺(7.5g，65mmol)的溶液中，加入二異丙基碳二亞胺(10mL，64.2mmol)。將反應(yīng)混合物攪拌過夜，過濾并將濾液蒸發(fā)。將殘渣溶解在甲苯和己烷中。通過過濾分離標(biāo)題化合物并干燥，得到28.3g(57mmol，91％產(chǎn)率)。
I.合成N-芴基甲氧基羰基-N-甲基苯丙氨酸-O-叔丁基-酪氨酰基-D-色氨?；?N-ε-叔丁氧基羰基-賴氨酰基-纈氨酸，甲酯在室溫下，用35ml二乙胺和35ml THF將芴基甲氧基羰基-O-叔丁基-酪氨?；?D-色氨?；?N-ε-叔丁氧基羰基-賴氨?；?纈氨酸，甲酯(14g，14.2mmol)處理1小時。然后將反應(yīng)混合物蒸發(fā)，重新懸浮在100ml THF中并再蒸發(fā)二次。將殘渣溶解在乙酸乙酯和己烷中。產(chǎn)物O-叔丁基酪氨?；?D-色氨?；?N-ε-叔丁氧基羰基-賴氨酰基-纈氨酸，甲酯沉淀，通過過濾分離并干燥，得到9.7g(12.7mmol，90％產(chǎn)率)。將O-叔丁基酪氨?；?D-色氨?；?N-ε-叔丁氧基-賴氨?；?纈氨酸，甲酯溶解在35ml無水THF中，并加入N-芴基甲氧基羰基-N-甲基苯丙氨酸，N-羥基琥珀酰亞胺酯(6.35g，14.2mmol)，再加入3ml二異丙基乙胺，得到pH為9的溶液。攪拌過夜后，將反應(yīng)物蒸發(fā)并將殘渣溶解在乙酸乙酯中，用5％的枸櫞酸、飽和碳酸氫鈉和飽和鹽水洗滌該乙酸乙酯溶液，經(jīng)硫酸鎂干燥并蒸發(fā)。將殘渣溶解在乙酯乙酯、乙醚和己烷中，標(biāo)題化合物沉淀出來。通過過濾分離沉淀的化合物并干燥，得到12.4g標(biāo)題化合物(11.5mmol，81％產(chǎn)率)。
J.合成N-芴基甲氧羰基-S-三苯甲基高半胱氨酸a.向在干冰/乙醇浴中冷卻至-78℃下的大約400ml液氨中，加入少量元素鈉，再加入足夠量的高半胱氨酸驟熄得到的藍(lán)色鈉/氨溶液直到消耗5.7g(248mmol)鈉和9.75g(36.3mmol)高半胱氨酸并將此藍(lán)色的鈉/氨溶液持續(xù)大約15分鐘。加入氯化銨驟熄最終的藍(lán)色，然后將反應(yīng)物從冷卻浴中撤出并在氬氣流下氨蒸發(fā)。將燒瓶微熱以便蒸餾掉全部殘余的氨。
向殘渣中加入三苯基甲醇(23.6g，91mmol)并將反應(yīng)燒瓶在冰/水浴中冷卻。加入250ml三氟酸(TFA)，并在30分鐘后，將混合物蒸發(fā)，將殘渣溶解并用氯仿再蒸發(fā)三次。然后將殘渣溶解300ml水中并用5％的枸櫞酸和1MKOH調(diào)節(jié)pH至4。產(chǎn)物以膠質(zhì)形式沉淀并通過過濾收集。將殘渣與乙醚一起研制，得到S-三苯甲游離-高半胱氨酸(7g，186mmol，26％產(chǎn)率)。通過從二甲基甲酰胺(DMF)/水中結(jié)晶，過濾分離出第二批產(chǎn)物，總產(chǎn)量為24.2g(64mmol，89％)。
b.向在150ml丙酮/100ml水中的S-三苯甲游基-高半胱氨酸(20g，53mmol)的溶液中加入碳酸鈉(11.5g，109mmol)，然后加入溶解在200ml丙酮中的O-芴基甲基-O′-(N-琥珀酰亞胺基)碳酸酯(17.5g，52mmol)，所有這些加入過程大約在1小時完成。將反應(yīng)混合物攪拌大約2天，然后將有機(jī)溶劑蒸發(fā)掉。向水性殘渣中加入300ml乙酸乙酯并用1M HCl將混合物酸化。分離有機(jī)相并相繼用1M HCl、0.5M HCl和0.25M HCl洗滌，然后經(jīng)硫酸鎂干燥，過濾并蒸發(fā)。將粗品在硅膠上層析(100％氯仿→3％甲醇/氯仿)得到標(biāo)題化合物(19.4g，32mmol，62％產(chǎn)率)。
K.合成N-芴基甲氧基羰基-S-三苯甲游基-高半胱氨酸-N-甲基苯丙氨酸-O-叔-丁基酪氨酰基-D-色氨?；?N-ε-叔丁氧基羰基-賴氨酰基-纈氨酸，甲酯在室溫下，用28ml二乙胺和30ml THF，將芴基甲氧基羰基-N-甲基苯丙氨酸-O-叔丁基-酪氨?；?D-色氨?；?N-ε-叔丁氧基羰基-賴氨酰基-纈氨酸，甲酯(9.8g，8.5mol)處理1小時。然后將反應(yīng)混合物蒸發(fā)，再懸浮在100ml THF中并再蒸發(fā)三次。將殘渣溶解在乙酸乙酯和己烷中。產(chǎn)物N-甲基苯丙氨酸-O-叔丁基酪氨?；?D-色氨?；?N-ε-叔丁氧基羰基-賴氨?；?纈氨酸，甲酯沉淀，通過過濾分離并干燥，得到4.9g(8.1mmol，95％產(chǎn)率)。
向在-15℃冷卻浴中冷卻的，在50ml無水THF中的N-芴基甲氧基羰基-S-三苯甲游基-高半胱氨酸中加入N，N′-雙(2-氧-3-唑烷基)膦酰氯(Bop-Cl；2.47g，9.7mmol)和1.7ml二異丙基乙胺(9.7mmol)并將反應(yīng)混合物攪拌30分鐘，加入在50ml無水THF中的N-甲基苯丙氨酸-O-叔丁基酪氨?；?D-色氨?；?N-ε-叔丁氧基羰基-賴氨酰基-纈氨酸，甲酯(7.48g)，再加入1.7ml二異丙基乙胺。通過蒸發(fā)，將反應(yīng)物體積減少50％，然后在室溫下攪拌2天。通過蒸發(fā)除掉溶劑，并將殘渣溶解乙酸乙酯中，用5％的枸櫞酸，飽和碳酸氫鈉和飽和鹽水洗滌，并經(jīng)硫酸鎂干燥。將殘渣溶解在乙酸乙酯、乙醚和己烷中，標(biāo)題化合物沉淀，通過過濾分離沉淀的化合物，得到10.2g(6.77mmol，84％產(chǎn)率)。
L.合成S-三苯甲游基-高半胱氨酸-N-甲基苯丙氨酸-O-叔丁基-酪氨?；?D-色氨酰基-N-ε-叔丁氧基羰基-賴氨?；?纈氨酸將N-芴基甲氧基羰基-S-三苯甲基-高半胱氨酸-N-甲基苯丙氨酸-O-叔丁基-酪氨酰基-D-色氨?；?N-ε-叔丁氧基羰基-賴氨?；?纈氨酸，甲酯(10g，6.6mmol)和LiOH·2H2O在50ml TFH和4ml水中的溶液攪拌3天。再加入25mol％的LiOH·2H2O，并在2小時后，將溶劑蒸發(fā)，將殘渣溶解在乙酸乙酯中。然后用5％枸櫞酸，飽和碳酸氫鈉和飽和鹽水洗滌該溶液，經(jīng)硫酸鎂干燥，過濾并蒸發(fā)。將殘渣溶解在乙酸乙酯、乙醚和己烷中，標(biāo)題化合物沉淀，通過過濾分離并干燥。將得到的粗品在硅膠上層析，用氯仿/10％甲醇氯仿洗脫，得到3.46g純標(biāo)題化合物(47mmol，41％產(chǎn)率)。
M.合成環(huán)-N-甲基苯丙氨酸-O-叔丁基酪氨?；?D-色氨酰基-N-ε-叔丁氧基羰基-賴氨?；?纈氨酰基-S-三苯甲游基-高半胱氨酸將溶解在1740ml DMF中的S-三苯甲游基-高半胱氨酸-N-甲基苯丙氨酸-O-叔丁基-酪氨?；?D-色氨酰基-N-ε-叔丁氧基羰基-賴氨?；?纈氨酸(3.42g，2.69mmol)溶液在冰水浴中冷卻，并加入1.16ml二異丙基乙胺和二苯基磷酰基疊氮化物(DPPA；5.4g，1.16mmol)。在-20℃下，將反應(yīng)物培育5天并再加入25mol％的DPPA，然后加入100mol％二異丙基乙胺。通過蒸發(fā)除掉DMF溶劑并將標(biāo)題化合物粗品在乙酸乙酯、乙醚和己烷中結(jié)晶，得到2.43g(1.9mmol，69％)。
N.合成環(huán)-N-甲基苯丙氨酸-酪氨?；?D-色氨酰基-賴氨?；?纈氨?；?S-三苯甲基-高半胱氨酸在室溫下，用18.7ml TFA，2ml二氯甲烷，0.94ml水，0.47ml乙二硫醇和0.37ml三異丙基硅烷將環(huán)-S-三苯甲基-高半胱氨酸-N-甲基苯丙氨酸-O-叔丁基-酪氨?；?D-色氨?；?N-ε-叔丁氧基羰基-賴氨?；?纈氨酸(2.43g，1.9mmol)處理1小時。通過蒸發(fā)除掉TFA，將殘渣溶解在10ml氯仿中并傾入400ml冷乙醚中。通過過濾收集粗品的沉淀并通過C18制備性反相HPLC純化(用30％乙腈→60％乙腈/水梯度洗脫，所有溶劑都含0.1％TFA)，得到標(biāo)題化合物(1g，1.2mmol，62％產(chǎn)率)。與理論上(平均)預(yù)測的值855，09相比，快速原子轟擊質(zhì)譜(FABMS)分析表明MH+為855。
O.合成環(huán)-N-甲基苯丙氨酸-酪氨?；?色氨?；?賴氨酰基-纈氨?；?S-三苯甲游基-高半胱氨酸，S-2-乙?；?甘氨?；?甘氨?；?半胱氨酰基-賴氨酰胺(P587)將環(huán)-N-甲基苯丙氨?；?酪氨酰基-D-色氨?；?賴氨?；?纈氨?；?高半胱氨酸(250mg，0.29mmol)和2-氯乙?；?甘氨?；?甘氨?；?S-三苯甲游基-半胱氨酰基-賴氨酰胺(如實施例1所述，由SPPS制備，238mg，0.35mmol)溶解在7ml乙腈和7ml 100mM碳酸鈉/0.5mMEDTA，pH10的溶液中并攪拌過夜。然后將反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干并如實施例1所述，在含三異丙基硅烷的TFA中脫保護(hù)。通過反相HLPC將標(biāo)題化合物純化，得到92.4％的理論上預(yù)計的產(chǎn)率。與理論上(平均)預(yù)測的值1257.70比，快速原子轟擊質(zhì)譜分析表明MH+為1258。由下式表示該產(chǎn)物，稱P587的結(jié)構(gòu)
實施例3放射性標(biāo)記的一般方法將0.1mg如實施例1中制備的肽試劑溶解在0.1ml水，或0.9％氯化鈉，或10％羥丙基環(huán)糊精(HPCD)，或50∶50乙醇∶水，或磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)，或50mM磷酸鉀緩中劑(pH＝5，6或7.4)中。通過用1.0ml含量不超過200mCi的Tc-99m高锝酸鈉重新配制-個Glucosacan小瓶(E.I.Dupont de Nemours，Inc.，Wilmington，DE)來制備Tc-99m葡庚糖酸鹽。并在室溫下放置15分鐘。將25μlTc-99m葡庚糖酸鹽加到試劑中并在室溫或在100℃下反應(yīng)5-30分鐘，然后通過0.2μm濾器過濾。
通過HPLC，用下列條件測定Tc-99m標(biāo)記的肽試劑純品WartersDelta-Pak RP-18分析柱，大小5μm×4.6mm×220mm，裝入每種放射性標(biāo)記的肽，在1ml/min的溶劑流速下洗脫。經(jīng)10-20分鐘，用開始為100％溶劑A(0.1％TFA/水)并且最后為100％溶劑B(0.1％TFA/90％乙腈/水)的線性梯度進(jìn)行梯度洗脫。通過一臺連接到積分記錄儀上的連機(jī)放射性檢測器，檢測放射性組分。在這些條件下，在1-4分鐘之間洗脫Tc-99m葡庚糖酸鹽和Tc-99m高锝酸鈉，同時在經(jīng)過較長的時間后洗脫Tc-99m標(biāo)記的肽。
下表說明使用本文所描述的方法，成功地用Tc-99m標(biāo)記實施例1所制備的肽。
表I肽 FABMS 放射化學(xué)產(chǎn)率 HPLCMH+(％)* RT(min)環(huán)(N-甲基)FYWDKV.-Hcy.(CH2CO.GGC.酰胺) 1129 9825.1，17.2環(huán)(N-甲基)FYWDKV.-Hcy.(CH2CO.GGCK.酰胺) 1258 99215.0環(huán)(N-甲基)FYWDKV.-Hcy.(CH2CO.GGCR.酰胺) 1285 99115.1環(huán)(N-甲基)FYWDKV.-Hcy.(CH2CO.GGCKK.酰胺) 1386 N.DN.D環(huán)(N-甲基)FYWDKV.-Hcy.(CH2CO.GGC.Om酰胺) 1244 9837.0*表1中上標(biāo)指下列標(biāo)記條件1＝在室溫下，在10％HPCD中2＝在室溫下，在50/50乙醇/水中3＝在100℃下，在0.9％NaCl中HPLC方法(由RT時間后的上標(biāo)表示)Waters-1柱，在10分鐘內(nèi)，100％溶液A→100％溶液B。
在Zubay，ibid.P33中可找到氨基酸的單字母縮寫。劃線部分表示在所連接的氨基酸衍生物基團(tuán)之間形成酰胺鍵或硫羥鍵。Acm是乙酰氨基甲基；Om是鳥氨酸；FD是D-苯丙氨酸；YD是D-酪氨酸；WD是D-色氨酸；Apc-L-[S-(3-氨基丙基)半胱氨酸；并且Hcy是高半胱氨酸。
如Seevers等(1982，Chem.Rev.82575-590)所述進(jìn)行放射性碘處理和放射性砹處理。
通過在二甲基甲酰胺或乙腈/水中，將每種本發(fā)明肽試劑與大約1摩爾當(dāng)量的如Cotton等(1966，Inorg.Chem.5；9-16)所述方法制備的氧代四溴錸酸(+5)四丁基銨鹽共溶并攪拌0.5-5天來制備非放射性錸絡(luò)合物。如上關(guān)于Tc-99m標(biāo)記的肽所述，通過反相HPLC分離錸絡(luò)合物并通過FABMS或ESMS來確定其特性。
使用Tc-99m標(biāo)記時相同的實驗條件，由適宜的高錸酸鹽來制備放射性錸絡(luò)合物，例如Re-186或Re-188絡(luò)合物，或者通過將還原劑加到肽和高錸酸鹽的溶液中，或者視情況可使用配位體轉(zhuǎn)化劑如枸櫞酸鹽并且將反應(yīng)物在室溫-100℃的溫度下培育5-60分鐘。
實施例4結(jié)合到AR42J鼠胰腺瘤細(xì)胞膜上的[125I-Tyr11]生長激素抑制素-14的抑制作用在肽試劑介導(dǎo)的抑制放射性標(biāo)記的生長激素抑制素類似物與包含生長激素抑制素受體的細(xì)胞膜結(jié)合的分析中證明了本發(fā)明各種生長激素抑制素受體結(jié)合劑在體外與生長激素抑制素受體結(jié)合的能力。
在含有10％胎牛血清(FCS)和8mM谷氨酰胺的杜皮克氏改良愛哥爾氏培養(yǎng)基(DMEM)中，在濕潤的5％CO2環(huán)境中和溫度為37℃下，培養(yǎng)表達(dá)生長激素抑制素受體的鼠胰腺瘤細(xì)胞系A(chǔ)R42J。在冷的緩沖劑(50mMTris-HCl，pH7.4)中，將收集的細(xì)胞攪勻，并在4℃下，以39,000g的轉(zhuǎn)速，將勻漿離心10分鐘。用緩沖劑將離心片洗滌兩次并再次懸浮在冰冷卻的10mM Tris-HCl緩沖劑(pH7.4)中。然后，在30℃下，將等分試樣的該細(xì)胞膜制劑與[125I-Tyr11]生長激素抑制素-14(Amersham，Arlington Heights，IL)(最終濃度為0.5nM，同位素脈沖為750,000cpm/ml，特異活性為2000Ci/mmol)和肽或本發(fā)明肽-錸絡(luò)合物(最終濃度為10-11M-10-6M)一起，在50mM，pH7.4，含1％牛血清白蛋白，5mM MgCl2，0.02mg/ml肝菌肽，0.02mg/ml苯基甲基-磺酰氟和200,00IU抑肽酶的HEPES緩沖劑中培育25分鐘。
培育后，將膜混合物通過聚乙烯亞胺洗滌的GC/F濾器(Whatman Ltd.，Maidstone，England)過濾，并用5ml冷的HEPES緩沖劑將保留在濾器上的殘渣洗滌3次。將濾器和濾器上洗滌下來的樣品在計數(shù)器上計數(shù)。為了評定非特異性結(jié)合，按所述方法，在200mn未標(biāo)記生長激素抑制素-14存在下進(jìn)行分析。如Bylmd和Yamamura(1990，Methods in Neuro-transmitter ReceptorAnalysis，Yamamura et al.，eds.，Raven PressN.Y.)所述，數(shù)據(jù)分析包括數(shù)據(jù)的Hill圖，由此得抑制常數(shù)，利用該分析和本發(fā)明試劑得到結(jié)果如下表II肽 K(nM)環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGCKK.酰胺) 0.26環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGCK.酰胺) 2.5環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGC.酰胺)2.6這些結(jié)果表明，本發(fā)明肽試劑與生長激素抑制素受體的體外結(jié)合具有高度親和性。
實施例5生長激素抑制素受體(SSTR)表達(dá)鼠腫瘤的定位作用和體內(nèi)成像如Bakker等(1991，Life Sciences 491593-1601)所述，進(jìn)行由鼠腫瘤細(xì)胞表達(dá)的生長激素抑制素受體的體內(nèi)成像。
按照每只動物0.05-0.1ml懸浮液的量，將從冷凍的腫瘤漿解凍得到CA20948鼠胰腺瘤細(xì)胞經(jīng)肌肉注射植入6周大的Lewis鼠的右側(cè)后腿中。讓腫瘤生長到大約0.5-2g時，取出，其腫瘤漿用于植入第二只首次用來作實驗的lewis鼠中。重復(fù)這種方式的腫瘤培育以便成功地獲得攜帶腫瘤的動物。用于體內(nèi)研究的攜帶腫瘤的動物通常是第三至第五代動物并且攜帶0.2～2g的腫瘤。
為了研究腫瘤中放射性示蹤物定位的特征，在注射放射性示蹤物前30分鐘，皮下給予所選擇的動物SSTR-阻滯劑量(4mg/kg)的奧曲肽。(Bakker等顯示了該實驗記錄，其結(jié)果表明，腫瘤攝入111In-[DTPA]奧曲肽的量降低40％。
將第三至第五代攜帶CA 20948腫瘤的Lewis鼠管理起來并通過背側(cè)尾靜脈注射劑量為0.15-0.2mCi的99mTc-標(biāo)記的肽，該劑量與每0.2-0.4ml含3-8μg肽相當(dāng)。
在所選擇的時間，通過頸脫位將動物處死并選擇性尸檢。將獲得的組織樣品稱重并在γ#式計數(shù)管中與等分試樣的注射劑量一起計數(shù)。
表I顯示所選擇的放射性標(biāo)記肽90分鐘的分布結(jié)果。顯然，99mTc-P587、99mTc-P617、99mTc-P726和99mTc-P736顯示腫瘤攝入和腫瘤/血比很高，這表明它們在靶(腫瘤)組織高度特異性地被攝入。
圖1顯示在攜帶腫瘤的鼠中，99mTc-P587的圖像。顯而易見，在大腿根的腫瘤中(箭頭)攝入量高。
將經(jīng)或未經(jīng)預(yù)先注射奧曲肽治療的鼠的腫瘤中99mTc-P587的攝入進(jìn)行比較，已知生長激素類似物結(jié)合到體內(nèi)生長激素抑制素受體上。在這些實驗中，通過在給予99mTc-P587前給予奧曲肽引起的受體阻滯使得腫瘤特異性攝入放射性標(biāo)記肽的量減少76％。這些結(jié)果證明了99mTc-P587的體內(nèi)結(jié)合是SSTR特異性的。
表III％1D/gNo. 肽腫瘤 血 腫瘤/血P736環(huán)(N-甲基)FYWDKV.
Hcy.(CH2CO.GGCRK.酰胺) 2.10.249P587環(huán)(N-甲基)FYWDKV.
Hcy.(CH2CO.GGCK.酰胺) 3.40.616P617環(huán)(N-甲基)FYWDKV.
Hcy.(CH2CO.GGCR.酰胺) 6.70.739P726環(huán)(N-甲基)FYWDKV.
Hcy.(CH2CO.KKC.酰胺)2.50.308實施例6用Tc-99m標(biāo)記的P587表達(dá)人體生長激素抑制素受體(SSTR)的腫瘤進(jìn)行體內(nèi)成像在臨床試驗中，用Tc-99m標(biāo)記的P587試劑獲得患SSTR表達(dá)型腫瘤的病人的閃爍照相成像。
總計10名患者，女性4人，男性6人，年齡27-69歲，預(yù)先診斷患生長激素分泌型垂體腺瘤(4人)，黑素瘤(1人)，髓質(zhì)甲狀腺癌(1人)，小細(xì)胞肺癌(SCLC；1人)，非何杰金淋巴瘤(1人)或胃類癌瘤(1人)。每個病人都以每0.2-0.5mg 10-22mCi的劑量，通過靜脈注射給予Tc-99m標(biāo)記的P587。每個病人在注射后4小時都如本文所述進(jìn)行閃爍照相成像。
在注射的同時開始γ照相機(jī)成像。在最初10分鐘時，獲得作為動力學(xué)研究對象的前期圖像(10秒鐘即可獲得)，然后在注射后1，2，3和4小時獲得靜態(tài)圖像。在注射后大約10-20分鐘和在注射后大約1，2，3和4小時獲得500,000計數(shù)或20分鐘(以較短的為準(zhǔn))的前期圖像。
發(fā)現(xiàn)，在注射后30分鐘內(nèi)，由于在循環(huán)系統(tǒng)中保留注射劑量的不到10％，結(jié)果閃爍照相成像劑迅速從血流中顯現(xiàn)出來。這樣使得在注射閃爍照相成像劑后15-30分鐘，就獲得腫瘤部位的圖像。在該研究中檢測到所有已知的腫瘤，以及從前未檢測到的轉(zhuǎn)移性損害，所述轉(zhuǎn)移性損害后來通過使用計算機(jī)輔助型X線斷層照相術(shù)(CAT掃描)確定。
這些結(jié)果證明，本發(fā)明閃爍照相成像劑在檢測人體內(nèi)SSTR表達(dá)型初期或轉(zhuǎn)移期腫瘤中是非常有效的。
應(yīng)該知道，上述公開的發(fā)明強(qiáng)調(diào)了本發(fā)明的某些特定實例并且所有相應(yīng)的修飾或改變都在如權(quán)利要求中所闡述的本發(fā)明的構(gòu)思和范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種含有共價連接到金屬離子絡(luò)合部分上的特異結(jié)合肽的物質(zhì)組合物，其中該肽特異性地結(jié)合到生長激素抑制素受體上，該試劑具有式環(huán)(N-CH3)-Phe-Tvr-(D-Trp)-Lys-Val-Hcy.(CH2COX)其中X是金屬離子絡(luò)合部分，它具有式-(氨基酸)n-B-(氨基酸)m-Z其中B是含巰基的部分，它是半胱氨酸，高半胱氨酸，異半胱氨酸?；蚯嗝拱?；(氨基酸)n和(氨基酸)m各自為不包含巰基的任何一種初級α-或β-氨基酸；Z為-OH或-NH2；n為2-5的整數(shù)；并且m為0-5的整數(shù)。
2.權(quán)利要求1的物質(zhì)組合物，它具有式環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcy(CH2CO.GGCK.酰胺)。
3.權(quán)利要濟(jì)南市1的物質(zhì)組合物，它選自以下序列環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGCR.酰胺)環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGCRD.酰胺)環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGCRK.酰胺)環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGCRR.酰胺)環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.GGCKK.酰胺)和環(huán)(N-甲基)FYWDKV.Hcy.(CH2CO.KKC.酰胺)
4.用于制備在哺乳動物物體某部位成像的閃爍照相成像劑的試劑，它包含權(quán)利要求1的物質(zhì)組合物。
5.包含權(quán)利要求4試劑的閃爍照相成像劑，其中，將放射性標(biāo)記的結(jié)合部分連接到锝-99m上。
6.一種絡(luò)合物，它是在還原劑存在下將權(quán)利要求4的試劑與锝-99m反應(yīng)而制備的。
7.權(quán)利要求6的絡(luò)合物，其中還原劑為亞錫離子。
8.一種絡(luò)合物，它是通過預(yù)先還原的锝-99m絡(luò)合物的配位體交換，用锝-99m放射標(biāo)記權(quán)利要求4的試劑來制備的。
9.一種制備放射性藥用制劑的試劑盒，所述試劑盒中包含密封的小瓶，小瓶中包含預(yù)先測定量的權(quán)利要求4試劑和用锝-99m標(biāo)記試劑時足夠量的還原劑。
10.標(biāo)記權(quán)利要求4試劑的方法，它包括在還原劑存在下，將該試劑與锝-99m反應(yīng)。
11.權(quán)利要求10的方法，其中還原劑為亞錫離子。
12.權(quán)利要求5的閃爍照相成像劑在制備哺乳動物體內(nèi)某部位成像用藥物中的應(yīng)用。
13.權(quán)利要求1的物質(zhì)組合物，其中將金屬離子絡(luò)合部分與金屬離子結(jié)合。
14.權(quán)利要求13的物質(zhì)組合物，其中金屬是錸、鋅或錫。
15.權(quán)利要求1的物質(zhì)組合物，其中將金屬離子絡(luò)合部分與發(fā)射β粒子的金屬離子結(jié)合。
16.權(quán)利要求15的物質(zhì)組合物，其中發(fā)射β粒子的金屬離子是錸-186、或錸-188。
17.權(quán)利要求1的物質(zhì)組合物，其中將金屬離子絡(luò)合部分與發(fā)射轉(zhuǎn)化電子的金屬離子結(jié)合。
18.權(quán)利要求17的物質(zhì)組合物，其中發(fā)射轉(zhuǎn)化電子的金屬離子是錫-117m。
19.權(quán)利要求1的物質(zhì)組合物，用碘-125、碘-131，或砹-211對其進(jìn)行放射性標(biāo)記。
20.一種藥用組合物，包含權(quán)利要求1的物質(zhì)組合物和藥用載體。
21.一種藥用組合物，包含權(quán)利要求13的物質(zhì)組合物和藥用載體。
22.一種藥用組合物，包含權(quán)利要求14的物質(zhì)組合物和可藥用載體。
23.一種藥用組合物，包含權(quán)利要求15的物質(zhì)組合物和可藥用載體。
24.一種藥用組合物，包含權(quán)利要求16的物質(zhì)組合物和可用藥載體。
25.一種藥用組合物，包含權(quán)利要求17的物質(zhì)組合物和可藥用載體。
26.一種藥用組合物，包含權(quán)利要求18的物質(zhì)組合物和可藥用載體。
27.一種藥用組合物，包含權(quán)利要求19的物質(zhì)組合物和可藥用載體。
28.權(quán)利要求20-27的藥用組合物的應(yīng)用，用于制備治療患有表達(dá)生長激素抑制素受體的惡性良性腫瘤、或攜帶腫瘤或轉(zhuǎn)移性瘤細(xì)胞的動物的藥物。
29.一種用于制備診斷劑來確定哺乳動物體內(nèi)某部位的試劑，它包含權(quán)利要求1的物質(zhì)組合物。
30.一種包含權(quán)利要求29試劑的診斷劑，其中將金屬離子絡(luò)合部分結(jié)合到順磁金屬離子上。
31.權(quán)利要求30的診斷劑，其中順磁金屬是鐵或銅。
32.一種結(jié)合到超順磁粒子上，包含權(quán)利要求29試劑的診斷劑。
33.一種用碘-123、碘-125或碘-131放射性標(biāo)記的、包含權(quán)利要求1組合物的診斷劑。
34.一種藥用組合物，包含權(quán)利要求30的物質(zhì)成分和可藥用載體。
35.一種藥用組合物，包含權(quán)利要求32的物質(zhì)成分和可藥用載體。
36.一種藥用組合物，包含權(quán)利要求33的物質(zhì)成分和可藥用載體。
37.具有下式物質(zhì)成分的試劑
38.用锝-99m放射性標(biāo)記的權(quán)利要求37的物質(zhì)成分。
39.權(quán)利要求4的試劑，其中，在哺乳動物體內(nèi)成像的部位是初期或轉(zhuǎn)移期的生長激素受體表達(dá)型腫瘤的部位。
40.一種制品，它包括一個密封小瓶，瓶中有預(yù)先測定量的權(quán)利要求37中物質(zhì)成分和用锝-99m標(biāo)記該成分時足夠量的還原劑。
41.一種在還原劑存在下將權(quán)利要求37的試劑與锝-99m反應(yīng)而制備的絡(luò)合物。
42.權(quán)利要求41中的絡(luò)合物，其中還原劑為亞錫離子。
43.一種通過將預(yù)先還原的锝-99m的絡(luò)合物進(jìn)行配位體交換而用锝-99m標(biāo)記權(quán)利要求37的試劑來制備的絡(luò)合物。
44.一種用于制備放射性藥物制劑的試劑盒，所述試劑盒包括一個密封小瓶，瓶中含有預(yù)先測定量的權(quán)利要求37的試劑和用锝-99m標(biāo)記該試劑足夠量的還原劑。
45.標(biāo)記權(quán)利要求37中試劑的方法，它包括在還原劑存在下，將該試劑與锝-99m反應(yīng)。
46.權(quán)利要求45的方法，其中還原劑為亞錫離子。
47.锝-99m標(biāo)記的權(quán)利要求38物質(zhì)成分的應(yīng)用，用于制備使哺乳動物體某部位成像用的藥物。
48.一種藥用組合物，包含權(quán)利要求38的物質(zhì)成分和可藥用載體。
49.權(quán)利要求48的藥物組合物的應(yīng)用，用于制備作為放射性同位素引導(dǎo)外科手術(shù)的藥物，其中，給予動物有效量的權(quán)利要求48的藥物組合物并且切除含有腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞的組織，所述腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞是通過確定所給予藥用組合物的放射性部位來識別的。
全文摘要
本發(fā)明涉及包括放射性標(biāo)記的閃爍照相成像劑的診斷和放射性診斷劑、治療和放射性治療劑。本發(fā)明提供這些試劑和制備這些試劑的試劑，以及制備和使用該試劑的方法。尤其是，本發(fā)明提供用于在哺乳動物體某部位成像的放射性標(biāo)記的成像劑和非放射性標(biāo)記的成像劑以及制備這些成像劑的試劑。本發(fā)明也提供治療劑及制備這些治療劑的試劑和方法。所提供的試劑和原料試劑包含通過共價鍵連接到金屬離子絡(luò)合部分上的特異性結(jié)合肽。還提供制備這些試劑的原料試劑、方法和試劑盒、標(biāo)記這些試劑的方法、和使用這些標(biāo)記過的試劑的方法。
文檔編號C07K14/00GK1155248SQ95193841
公開日1997年7月23日 申請日期1995年5月12日 優(yōu)先權(quán)日1994年5月12日
發(fā)明者理查德·迪安 申請人:迪亞太德公司