專利名稱：新型化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人白細胞介素4(IL4)和/或人白細胞介素13(IL13)的拮抗劑，它可用于治療IL4和/或IL13的不良作用導致的病癥，例如某些IgE介導的過敏性疾病、T細胞介導的自身免疫病癥以及對感染原的不當免疫應(yīng)答。
白細胞介素是分泌型肽類免疫應(yīng)答介質(zhì)。各種已知的白細胞介素對于免疫系統(tǒng)細胞的發(fā)育、活化、增殖和分化具有多種作用。IL4在這樣的功能中具有生理功用，但是也會導致疾病的形成。具體地說，IL4與B淋巴細胞的發(fā)育途徑相關(guān)聯(lián)，從而導致IgE抗體的產(chǎn)生，該抗體是過敏性疾病的標志，如外源性哮喘、鼻炎、過敏性結(jié)膜炎、過敏性皮炎和過敏反應(yīng)。IL4也可用作T淋巴細胞通用的生長和分化因子，在一些自身免疫疾病中可能造成組織損傷，例如胰島素依賴性糖尿病、多發(fā)性硬化以及風濕性關(guān)節(jié)炎，以及移植排斥。IL4還抑制細胞介導的應(yīng)答的產(chǎn)生，該應(yīng)答是控制感染性疾病所需的。因此，對于IL4對T或B淋巴細胞的作用，對該作用的拮抗作用對這些疾病可能有有益的效果。IL13是最近被分離出的，在許多生物特性方面與IL4相似(Minty，A.等，(1993)，自然，卷362，248-250頁)，包括一些受體結(jié)構(gòu)/功能的方面(Aversa，G.等，(1993)，實驗醫(yī)學雜志，第178卷，2213-2218頁)。
人的IL4由一個129個氨基酸的，具有2個可能的N-糖基化位點和組成3個二硫鍵的6個半胱氨酸的單肽鏈組成(Le，H.V.等，(1988)，生物化學雜志，第263卷，10817-10823頁)。IL4的氨基酸序列和這些二硫鍵的位置是已知的(Carr，C.等，(1991)，生物化學，第30卷，1515-1523頁)。
10HIS-LYS-CYS-ASP-ILE-THR-LEU-GLN-GLU-ILE-ILE-LYS-THR-LEU-ASN-20 30SER-LEU-THR-GLU-GLN-LYS-THR-LEU-CYS-THR-GLU-LEU-THR-VAL-THR-
40ASP-ILE-PHE-ALA-ALA- SER-LYS-ASN-THR-THR-GLU-LYS-GLU-THR-PHE-50 60CYS-ARG-ALA-ALA-THR-VAL-LEU-ARG-GLN-PHE-TYR-SER-HIS-HIS-GLU-70LYS-ASP-THR-ARG-CYS-LEU-GLY-ALA-THR-ALA-GLN-GLN-PHE-HIS-ARG-80 90HIS-LYS-GLN-LEU-ILE-ARG-PHE-LEU-LYS-ARG-LEU-ASP-ARG-ASN-LEU-100TRP-GLY-LEU-ALA-GLY-LEU-ASN-SER-CYS-PRO-VAL-LYS-GLU-ALA-ASN-110 120GLN-SER-THR-LEU-GLU-ASN-PHE-LEU-GLU-ARG-LEU-LYS-THR-ILE-MET-129ARG-GLU-LYS-TYR-SER-LYS-CYS-SER-SER二硫鍵位于第3和127位、第24和65位、以及第46和99位殘基之間。隨糖基化程度的不同，IL4的分子量從15KDa(無糖基化)到60KDa或更多(過糖基化的IL4)不等。
人的IL4的DNA序列也被描述于Yokota，T.等，P.N.A.S.，1986年第83卷5894-5898頁。
WO93/10235描述了IL4的一些突變體，它們是IL4的拮抗劑或部分拮抗劑。
EP-A-0464 533公開的融合蛋白包含免疫球蛋白分子的恒定區(qū)的不同部分和另一個人類蛋白或其一部分。
本發(fā)明提供了一種可溶蛋白，它具有IL4和/或IL13拮抗劑或部分拮抗劑活性，包含一個與至少一個人類免疫球蛋白恒定區(qū)或其片段融合的IL4突變體或變異體。
術(shù)語“突變體或變異體”包括了任何在施用到人體內(nèi)部以后保持拮抗IL4和/或IL13的能力的分子，如IL4蛋白截短的或其它的衍生物。這樣的其它的衍生物可以通過氨基酸的添加、刪除、替代或重排或?qū)ζ溥M行化學修飾來制備。
編碼IL4突變體或變異體的DNA聚合體可以通過常規(guī)的方法來制備，如對編碼IL4的cDNA進行定點突變，例如G.Winter等，自然，1982年第299卷756-758頁或Zoller和Smith，1982年，核酸研究，第10卷，6487-6500頁；或缺失突變，例如Chan和Smith，核酸研究，1984年第12卷2407-2419頁或G.Winter等，Biochem.Soc.Trans.1984年第12卷224-225頁；或聚合酶鏈式反應(yīng)，例如Mikaelian和Sergeant，核酸研究，1992年第20卷376頁。
此處所使用的“具有IL4和/或IL13拮抗劑或部分拮抗劑活性”意思是在Spits等所描述的檢測方法中(免疫雜志，第139卷1142頁(1987))，IL4刺激的T細胞增殖以劑量依賴性方式被抑制。
適合的IL4突變體在WO 93/10235中公開，其中天然存在于野生型IL4第120至128位任一位置的至少一個氨基酸被一個不同的天然氨基酸替換。具體地說，天然存在于第124位的酪氨酸被一個不同的天然氨基酸替換，例如甘氨酸或更優(yōu)選的天門冬氨酸。
免疫球蛋白可以是任何亞類(IgG，IgM，IgA，IgE)，但優(yōu)選的是IgG，例如IgG1、IgG3或IgG4。所述恒定區(qū)或其片段可以來自于重鏈或輕鏈，或同時來自于這兩種鏈。本發(fā)明包括免疫球蛋白組分中的突變，該突變刪除了天然免疫球蛋白中不需要的特性，例如Fc受體結(jié)合特性，和/或?qū)肓诵枰奶匦?，例如穩(wěn)定性。舉例來說，Angal S.，King D.J.，Bodmer M.W.，Turner A.，Lawson A.D.G.，Roberts G.，Pedley B.和Adair R.在《分子免疫學》1993年第30卷105-108頁中描述了一種IgG4分子，其中殘基241(Kabat編號)從絲氨酸變?yōu)楦彼?。這一變化增加了IgG4分子的血清半衰期。Canfield S.M.和Morrison S.L.在《實驗醫(yī)學雜志》第173卷1483-1491頁中描述了殘基248(Kabat編號)在IgG3中從亮氨酸到谷氨酸和在小鼠IgG2b中從谷氨酸到亮氨酸的變化。前者中谷氨酸對亮氨酸的替代降低了免疫球蛋白與FcγRI受體有關(guān)的親和性，后者中亮氨酸對谷氨酸的替代增加了親和性。EP0307434公開了IgG中不同的突變，包括殘基248(Kabat編號)L到E的突變。
優(yōu)選的恒定區(qū)或其片段是人的IgG重鏈恒定區(qū)的全部的或基本的部分，更優(yōu)選的是IgG4。一方面，IgG組分由IgG1的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域以及鉸鏈區(qū)組成，鉸鏈區(qū)包括參與重鏈間二硫鍵結(jié)合的半胱氨酸殘基，例如IgG1鉸鏈區(qū)殘基11和14(Frangione B.和Milstein C.，自然，第121卷939-941頁，1967)。優(yōu)選地，IgG1組分由相應(yīng)于IgG1的鉸鏈區(qū)中1至4和6至15位殘基、CH2的1至110和CH3的1至107位殘基組成，見Ellison J.，Berson B.和Hood L.E.在《核酸研究》1982年第10卷4071至4079頁中的描述。鉸鏈區(qū)中的殘基5通過將核酸序列中的TGT變成GCC而將公開的IgG1序列中的半胱氨酸變?yōu)楸彼帷Ａ硪环矫?，IgG組分來自于IgG4，它包括CH2和CH3結(jié)構(gòu)域以及鉸鏈區(qū)，鉸鏈區(qū)含有參與重鏈間二硫鍵結(jié)合的半胱氨酸殘基，例如IgG4鉸鏈區(qū)的殘基8和11(Pinck J.R.和Milstein C.，自然，1967年第216卷941-942頁)。優(yōu)選地，該IgG4組分由相應(yīng)于IgG4的鉸鏈區(qū)中1至12位殘基、CH2的1至110和CH3的1至107位殘基組成，見Ellison J.，Buxbaum J..和Hood L.在《DNA》1981年第1卷11至18頁的描述。在IgG4中的一種合適的突變的實施例中，鉸鏈區(qū)的殘基10(殘基241，Kabat編號)從野生型的絲氨酸(S)變?yōu)楦彼?P)，并且CH2的殘基5(殘基248，Kabat編號)從野生型的亮氨酸(L)變?yōu)楣劝彼?E)。
IL4突變體或變異體與Ig恒定區(qū)或其片段的融合是通過一個組分的C末端連接到另一個組分的N末端實現(xiàn)的。優(yōu)選地，IL4突變體或變異體是通過其C末端與Ig恒定區(qū)或其片段的N末端融合的。
在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No4，SEQ ID No7或SEQ ID No10所示。
另一方面，本發(fā)明提供了一種制備本發(fā)明化合物的方法，該方法包括在重組宿主細胞中表達編碼該化合物的DNA的以及回收產(chǎn)物。
包含編碼該化合物的核酸序列的DNA聚合體也形成本發(fā)明的一部分。
在一個優(yōu)選的方面，DNA聚合體包含SEQ ID No3，SEQ ID No6，SEQ ID No9，或由其組成。
本發(fā)明的方法可以用常規(guī)的重組技術(shù)完成，如《分子克隆-實驗室手冊》(Maniatis等，冷泉港1982年出版)和《DNA克隆》I、II、III卷(D.M.Glover編，IRL出版公司)所述。
具體地說，該方法可以包括如下步驟i)制備一種可復(fù)制的表達載體，可以在宿主細胞中表達包含編碼該化合物的核酸序列的DNA聚合體；ii)用該載體轉(zhuǎn)化宿主細胞；iii)在允許表達該DNA聚合體以生產(chǎn)該化合物的條件下培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化的宿主細胞；并iV)回收該化合物。
本發(fā)明還提供了一種通過縮合適當?shù)膯尉?、二聚或寡聚核苷酸單元來制備DNA聚合體的方法。
制備過程可以通過化學的、酶促的或兩者結(jié)合的方法在體內(nèi)或體外進行。于是，DNA聚合體可以用常規(guī)的方法通過酶促連接適當?shù)腄NA片段來制備，方法的描述見D.M.Roberts等，生物化學，1985年第24卷5090-5098頁。
DNA片段可以如下獲得用適當?shù)南拗菩悦盖懈畎韬塑账嵝蛄械腄NA，化學合成，在DNA或RNA模板上酶促聚合，或結(jié)合使用上述方法。
限制性酶的切割反應(yīng)在適當?shù)木彌_液中，在20℃-70℃的溫度下進行，一般體積為50μl或更少，含有DNA 0.1-10μg。
體外的DNA酶促聚合反應(yīng)可以使用例如DNA聚合酶I(Klenow片段)的DNA聚合酶，在根據(jù)需要包含三磷酸核苷dATP、dCTP、dGTP和dTTP的適當?shù)木彌_液中，在10℃-37℃的溫度下進行，體積一般為50μl或更少。
DNA片段的酶促連接反應(yīng)可以使用例如T4 DNA連接酶的DNA連接酶，在適當?shù)木彌_液中，在4℃至環(huán)境溫度下進行，體積一般為50μl或更少。
DNA聚合體或其片段的化學合成可以通過常規(guī)的磷酸三酯、亞磷酸酯或氨基磷酸酯化學法，使用固相技術(shù)進行，例如在以下文獻中所述《基因片段的化學和酶促合成實驗室手冊》(H.G.Gassen和A.Lang編著)，Verlag Chemie，Weinheim(1982)，或其它科學出版物，例如M.J.Gait，H.W.D.Matthes，M.Singh，B.S.Sproat和R.C.Titmas，核酸研究，1982年第10卷6243頁，B.S.Sproat和W.Bannwarth，四面體通訊，1983年第24卷5771頁，M.D.Matteucci和M.H.Caruthers，四面體通訊，1980年第21卷719頁，M.D.Matteucci和M.H.Caruthers，美國化學協(xié)會雜志，1981年第103卷3185頁，S.P.Adams等，美國化學協(xié)會雜志，1983年第105卷661頁中、N.D.Sinha、J.Biernat、J.McMannus和H.Koester，核酸研究，1984年第12卷4539頁，以及H.W.D.Matthes等，EMBO雜志，1984年第3卷801頁。優(yōu)選地使用自動DNA合成儀。
DNA聚合體優(yōu)選地通過連接兩個或更多DNA分子來制備，這些DNA分子的總和包含有編碼該化合物的DNA序列。一個根據(jù)本發(fā)明的具體方法包括連接編碼IL4突變體或變異體的第一DNA分子和編碼免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或其片段的第二DNA分子。
DNA分子可以通過使用適當?shù)南拗菩悦盖懈顜в兴杳艽a序列的載體或通過使用聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)來獲得。
DNA分子的精確結(jié)構(gòu)和其獲得的方法依賴于所需產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。設(shè)計編碼該化合物的DNA分子的適當?shù)臉?gòu)建方案對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是常規(guī)工作。
編碼該化合物的DNA聚合體在重組宿主細胞中的表達可以通過使用在宿主細胞中能夠表達DNA聚合體的可復(fù)制表達載體來進行。該表達載體是新的，也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。
可復(fù)制表達載體可以根據(jù)本發(fā)明的方法制備，通過切開與宿主細胞相容的載體以提供具有完整的復(fù)制子的線性DNA片段，并在連接條件下將該線性片段與一個或多個DNA分子結(jié)合，這些DNA分子與該線性片段共同編碼該化合物。
線性片段與多于一個DNA分子的連接根據(jù)需要可以同時進行或順序進行。
于是，該DNA聚合體可以根據(jù)需要預(yù)先形成或在構(gòu)建載體的過程中形成。
載體的選擇部分地決定于宿主細胞，它可以是原核的，如大腸桿菌，或真核的，如鼠C127細胞、鼠骨髓瘤細胞、中國倉鼠卵巢細胞或海拉細胞，真菌，如絲狀真菌或單細胞酵母，或昆蟲細胞，如果蠅細胞。宿主細胞也可以是轉(zhuǎn)基因動物細胞。適合的載體包括質(zhì)粒、噬菌體、粘粒和得自如棒狀病毒、牛痘或Semliki Forest重組病毒。
可復(fù)制表達載體的制備可以通過常規(guī)方法用適當?shù)拿赶拗菩郧懈?、聚合、連接DNA來進行，其過程描述于，例如Maniatis等，引文同上。聚合和連接可以按照上述DNA聚合體的制備方法進行。限制性切割可以在適合的緩沖液中，在20℃-70℃的溫度范圍內(nèi)進行，一般體積為50μl或更少，含有0.1-10μg DNA。
根據(jù)本發(fā)明，重組宿主細胞可以在轉(zhuǎn)化條件下，通過用本發(fā)明的可復(fù)制表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞來制備。適合的轉(zhuǎn)化條件是常規(guī)的，描述于，例如，Maniatis等，引文同上，或《DNA克隆》第II卷，D.M.Glover編著，IRL出版公司1985年出版。
轉(zhuǎn)化條件的選擇由宿主細胞確定。因此，細菌宿主如大腸桿菌可以用氯化鈣溶液處理(Cohen等，美國國家科學院院刊，1973年第69卷2110頁)或用包含RbCl、MnCl2、乙酸鉀和甘油的混合物的溶液處理，然后用3-[N-嗎啉代]-丙烷-磺酸、RbCl和甘油處理。培養(yǎng)的哺乳動物細胞可以通過DNA載體與鈣在細胞上共沉淀來轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的可復(fù)制表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
在允許DNA聚合體表達的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞是按常規(guī)進行的，其描述見如Maniatis等和《DNA克隆》，引文同上。于是，優(yōu)選地，向細胞提供營養(yǎng)物，并在低于45℃的條件下培養(yǎng)。
表達產(chǎn)物根據(jù)宿主細胞用常規(guī)方法回收。因此，當宿主細胞是細菌(如大腸桿菌)時，可用物理的、化學的或酶促方法裂解，蛋白產(chǎn)物從所得的裂解物中分離。如果產(chǎn)物從細菌細胞中分泌出來，則可以從胞質(zhì)間或培養(yǎng)基中回收。如果宿主細胞是哺乳動物的，產(chǎn)物一般從培養(yǎng)基中分離。
DNA聚合體可以整合到載體中，該載體是為分離穩(wěn)定地表達產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化的哺乳動物細胞系而設(shè)計的；例如，牛乳頭瘤病毒載體或在中國倉鼠卵巢細胞中擴增的載體(《DNA克隆》第II卷，D.M.Glover編著，IRL出版公司1985年；Kaufman R.J.等，分子和細胞生物學，1985年第5卷1750-1759頁；Pavlakis G.N.和Hamer D.H.，美國國家科學院院刊，1983年第80卷397-401頁；Goeddel D.V.等，歐洲專利申請0093619號，1983)。
本發(fā)明的化合物具有IL4和/或IL13拮抗劑活性，并因此在治療由IL4和/或IL13不良作用引起的病癥方面具有潛在的用途，這些病癥例如IgE介導的過敏性疾病和T細胞介導的自身免疫疾病或慢性微生物感染。
本發(fā)明于是進一步提供了一種藥物組合物，它包含本發(fā)明的化合物和藥用載體。
在使用時，雖然確切的組合物劑型將依賴于給藥方式，但該化合物一般以藥用組合物的形式，與人的藥用載體、稀釋劑和/或賦形劑一起使用。例如，該化合物可以以用于吸入的氣溶膠或可霧化溶液形式或以非腸道給藥的無菌溶液的形式使用。
本發(fā)明的化合物的施用劑量范圍是對IL4和/或IL13介導的病癥產(chǎn)生所需效果(例如，IgE介導的病癥被減輕或自身免疫疾病的惡化停止或好轉(zhuǎn))的劑量范圍。劑量一般隨年齡、程度或病癥的嚴重性以及禁忌癥(如果有的話)而不同。單位劑量可以從不到1mg到300mg，但是典型的是在每次1到20mg的范圍內(nèi)，每天一次或多次，例如一至六次，這樣每天的劑量達到0.02-40mg/kg的范圍。
適合于注射的化合物的存在形式可以是溶液、懸液或乳液或干粉，后者在使用前被溶于或懸于適當?shù)慕橘|(zhì)中。
液體單位劑量形式用該化合物和無熱源物質(zhì)的無菌介質(zhì)制備。根據(jù)使用的介質(zhì)和濃度，該化合物既可以溶于也可以懸于該介質(zhì)中。溶液可用于所有形式的非腸道給藥，尤其是用于靜脈注射。在制備溶液時，化合物可以溶于介質(zhì)中，如果需要，溶液可以通過加入氯化鈉制成等滲的，并且在注入適合的無菌的小瓶或安瓿中和封口之前，使用消毒技術(shù)通過滅菌過濾器過濾滅菌?；蛘?，如果溶液有足夠的穩(wěn)定性，可將其在封裝的容器中高壓滅菌?？稍诮橘|(zhì)中溶入有益的添加劑，如緩沖液、助溶劑、穩(wěn)定劑、防腐劑或殺菌劑、懸濁劑或乳化劑和/或局部麻醉劑。
使用前溶于或懸于適合的介質(zhì)的干粉的制備是在無菌區(qū)域，通過使用消毒技術(shù)將預(yù)滅菌的藥物物質(zhì)和其它成分充入滅菌的容器中來完成的?；蛘咚幬锖推渌煞秩苡谒越橘|(zhì)中，溶液用過濾法除菌，然后在無菌區(qū)域使用消毒技術(shù)將其分裝到適合的容器中。然后將產(chǎn)品冰凍干燥，容器消毒封口。
適合于肌肉、皮下或皮內(nèi)注射的非腸道懸劑基本上用相同的方式制備，不同的是滅菌的化合物被懸于滅菌的介質(zhì)而不是溶于其中，并且滅菌不能用過濾完成。該化合物可以在無菌的狀態(tài)下被分離，或者也可以在分離后滅菌，例如伽瑪照射。最好將懸濁劑如聚乙烯吡咯烷酮包含于組合物中以使化合物的分裝變得容易。
適合于從呼吸道施用的組合物包括用于吸入的氣溶膠、可霧化溶液或微細粉末。對于后者，小于50微米，特別是小于10微米的顆粒是優(yōu)選的。這樣的組合物可以用常規(guī)的方式制成，并且與常規(guī)的施用設(shè)備一起使用。
另一方面，本發(fā)明提供了一種治療由IL4和/或IL13的不良作用引起的病癥的方法，它包括給患者施用有效量的本發(fā)明的化合物。
本發(fā)明還提供了周作活性治療物質(zhì)的本發(fā)明的化合物，具體地說，是用于治療由IL4和/或IL13的不良作用引起的病癥。
本發(fā)明也提供了本發(fā)明的化合物在生產(chǎn)治療由IL4和/或IL13的不良作用引起的病癥的藥劑方面的應(yīng)用。
當本發(fā)明的化合物按照本發(fā)明施用時，預(yù)計沒有未預(yù)料到的毒性。
下述實施例說明本發(fā)明。
實施例1 IL4.Y124D/IgG1融合蛋白所描述的是IL4.Y124D/IgG1嵌合cDNA的構(gòu)建，相應(yīng)蛋白在哺乳動物表達系統(tǒng)中的表達及其活性。
1.編碼融合蛋白的DNA的構(gòu)建(a)IL4.Y124D編碼區(qū)的構(gòu)建用PCR誘變?nèi)说腎L4 cDNA(購自英國生物技術(shù)公司)，生產(chǎn)一種人的IL4基因變異體，該突變體已被描述(Kruse，N，Tony，H-P和Sebald，W.EMBO雜志，第11卷3237頁)，其中蛋白中的殘基124從野生型的酪氨酸突變?yōu)樘扉T冬氨酸。該IL4.Y124D cDNA被插入表達載體pTR312中，使用HindIII和BglII位點，(M.J.Browne，J.E.Carey，C.G.Chapman，A.W.R.Tyrren，C.Entwisle，G.M.P.Lawrence，B.Reavy，I.Dodd，A.Esmail&J.H.Robinson，生物化學雜志，第263卷1599頁)以形成質(zhì)粒pDB906。
為擴增IL4.Y124D分子以及在亞克隆的每個末端加入適宜的限制性位點，用20ngpDB906質(zhì)粒作為底物進行PCR反應(yīng)。PCR引物的設(shè)計包括了限制性酶切位點，通過側(cè)面連接10-15個堿基對將引物“錨定”在每個末端。引物的序列如下1)5’CGA ACC ACT GAA TTC CGC ATT GCA GAG ATA 3’(包括一個EcoRI限制性位點，GAATTC)2)5’CAC AAA GAT CCT TAG GTA CCG CTC GAA CAC TTT GA 3’(包括一個KpnI限制性位點，GGTACC)使用的引物最終濃度是5ng/μl，加入的dNTP的最終濃度是0.2mM，總反應(yīng)體積是100μl。進行31個PCR循環(huán)。循環(huán)由一個94℃1分鐘的變性步驟、一個50℃1分30秒的退火步驟，以及一個72℃1分30秒的延長步驟組成。第1循環(huán)中變性延長至5分鐘，終循環(huán)延長步驟延長至7分鐘。PCR反應(yīng)中使用購自先進生物技術(shù)公司(Advanced Biotechnologies)的2.5單位的Taq聚合酶。生產(chǎn)出587bp的PCR產(chǎn)物。使用Promega公司的“Magic PCR cleanup”試劑盒純化產(chǎn)物，然后在反應(yīng)緩沖液4中用EcoRI和KpnI切割(所有的限制性酶從GibcoBRL公司獲得)，以產(chǎn)生“粘性末端”。于37℃4小時30分鐘后，反應(yīng)加熱至70℃保持10分鐘，然后用乙醇沉淀。通過瓊脂糖凝膠電泳分析所得DNA的結(jié)果顯示有大約570bp，463bp和100bp的三個帶。570bp的片段代表IL4的全長的變異體IL4.Y124D，其存在是因為切割不完全。產(chǎn)生兩個較小片段是因為在IL4.Y124D cDNA中存在EcoRI位點。570bp的帶用GenecleanTM方法純化，并連接到Bluescript KS+TM上，后者是用EcoRI和KpnI切割然后用GenecleanTM制備的。于是得到了Bluescript KS+TM/IL4.Y124D重組體。用Promega公司的“Magic Maxiprep”的方法大量制備該重組DNA。用SmaI和KpnI將IL4.Y124D插入物從Bluescript重組體中切除。20μg的重組DNA與25單位的SmaI在反應(yīng)緩沖液4中于30℃溫育過夜。然后加入25單位的KpnI切割，于37℃溫育5小時。所得的大約580bp的片段用GenecleanTM純化以產(chǎn)生IL4.Y124D/SmaI/KpnI片段。
(b)IgG1編碼區(qū)域的構(gòu)建COSFcLink載體(表1)包含編碼鉸鏈區(qū)的氨基酸1-4和6-15、CH2的1-110和CH3的1-108的人的IgG1 cDNA，見Ellison J.，Berson B.和Hood L.E.，核酸研究，1982年第10卷4071-4079頁。通過將核酸序列中的TGT變?yōu)镚CC，鉸鏈區(qū)的殘基5從發(fā)表的IgG1序列的半胱氨酸變?yōu)楸彼帷Ｋ菑娜说腎gG漿細胞白血病ARH-77(美國典型組織保藏中心)中克隆的，使用RT-PCR和全序列測序來確認其一致性[專利申請出版物WO92/00985]。
COSFc的構(gòu)建從一個包含上述人的IgG1 cDNA的pUC18載體(pUC18-Fc)開始，它用KpnI和SacII切割，刪除CH1、鉸鏈區(qū)和CH2的一部分。刪除的區(qū)域用包含如下鉸鏈-CH2區(qū)的PCR擴增的片段來替代。使用如下的引物5’TCG AGC TCG GTA CCG AGC CCA AAT CGG CCG ACA AAA CTC ACA C3’
和5’GTA CTG CTC CTC CCG CGG CTT TGT CTT G 3’一個包含鉸鏈-CH2區(qū)的DNA片段從pUC18-Fc擴增，用KpnI和SacII切割，凝膠純化并克隆進KpnI/SacII切割的pUC18-Fc載體。通過將核酸序列中的TGT變?yōu)镚CC，存在于IgG1重鏈位置230(Kabat編號；Kabat等，《與免疫學有關(guān)的蛋白序列》(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)第5版，美國健康和人類服務(wù)部，NIH出版號91-3242(1991))的半胱氨酸變?yōu)楸彼?。PCR引物中的一個改變的DNA序列在鉸鏈區(qū)的5’末端引入了單一的KpnI位點。所得的質(zhì)粒被稱為pUC18Fcmod，對結(jié)合點和PCR擴增的區(qū)域進行測序以進行確認。
pUC18-Fcmod中的全部鉸鏈-CH2-CH3插入?yún)^(qū)作為一個單獨的片段被KpnI和XbaI切下，然后凝膠純化，連接到用KpnI和XbaI切割的SFcR1Cos4上生成COSFc。
SFcR1Cos4是pST4DHFR的衍生物(Deen K，McDougal JS，Inacker R，F(xiàn)olena-Wasserman G，Athos J，Rosenberg J，Maddon PJ，Axel R和SweetRW.自然，第331卷82頁)，并且包含插入到巨細胞病毒(CMV)啟動子和牛生長激素(BGH)的多聚核苷酸區(qū)域之間的可溶的I型Fc受體(sFcR1)，還包含插入β球蛋白啟動子和SV40的多聚核苷酸區(qū)域之間的二氫胎還原酶cDNA，一個SV40的復(fù)制啟始區(qū)、和一個氨芐青霉素抗性基因，以在細菌中生長。用KpnI和XbaI切割載體，除去sFcR1編碼區(qū)，這樣COSFc載體就包含了插入CMV啟動子和BGH polyA區(qū)域之間的鉸鏈-CH2-CH3區(qū)。
通過在載體的單一EcoRI位點插入一個寡聚核苷酸連結(jié)子而從COSFc制備出COSFcLink載體，它重建了EcoRI位點，并且還引入了BstEII、PstI和EcoRV克隆位點。使用的寡聚核苷酸是5’AATTCGGTTACCTGCAGATATCAAGCT 3’3’GCCAATGGACGTCTATAGTTCGATTAA 5’對結(jié)合區(qū)測序以確定載體中的方向。最終載體的大小是6.37kb。
(c)編碼融合蛋白的DNA的構(gòu)建為了插入IL4.Y124DcDNA，COSFc連接載體通過用EcoRV和KpnI按如下步驟切割來制備5μg DNA與15單位的反應(yīng)緩沖液2中的EcoRV在37℃下溫育5小時，然后用乙醇沉淀。所得的DNA用反應(yīng)緩沖液4中的KpnI在37℃下切割3小時，然后用乙醇沉淀。將IL4.Y124D/SmaI/KpnI和COSFcLink/EcoRV/KpnI片段連接到一起以生成質(zhì)粒pDB951，它編碼IL4.Y124D/IgG1融合蛋白。連接是使用AmershamDNA連接試劑盒來實現(xiàn)的，產(chǎn)品編號RPN1507，反應(yīng)于16℃溫育過夜。連接反應(yīng)產(chǎn)物被轉(zhuǎn)化到Promega JM109感受態(tài)細胞(高效)中，并將其涂覆到包含50μg/ml氨芐青霉素的Luria Broth瓊脂平板上。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在Luria Broth(包含氨芐青霉素50μg/ml)中培養(yǎng)，并使用Promega“MagicMinipreps”制備DNA。IL4.Y124D/COSFcLink重組DNA的產(chǎn)生通過限制性切割和DNA測序來確定。通過DNA測序來確定IL4.Y124D的全序列和與COSFcLink DNA的結(jié)合區(qū)(表2)。重組IL4.Y124D/IgG1 DNA的編碼序列示于圖3，融合蛋白的氨基酸序列示于圖4。IL4.Y124D/COSFcLink重組DNA用氯化銫梯度制備和純化，該DNA用于瞬時轉(zhuǎn)染海拉細胞。
2.融合蛋白的表達海拉細胞在含有10％胎牛血清和1％谷氨酰胺的MEMα培養(yǎng)基(Gibco)中生長。為進行該檢測，將1×106個海拉細胞接種于15ml的含有10％新生牛血清、1％谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)基中(“種子培養(yǎng)基”)，轉(zhuǎn)染前放于75cm2的燒瓶中四天。轉(zhuǎn)染前一天，將另外12.5ml的種子培養(yǎng)基加入每個燒瓶。轉(zhuǎn)染當天，培養(yǎng)基在零時刻換為15ml的“轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基”(含有10％新生牛血清和1％非必需氨基酸的，加Earle鹽的MEM培養(yǎng)基)。在+3小時時，存在于0.125M氯化鈣、1×HBS(HEPES緩沖液)中的25μg的適當DNA加入細胞中。在+7小時時，對細胞進行甘油休克(glycerol shock，15％V/V)，然后轉(zhuǎn)入12.5ml的含有5mM丁酸鈉的種子培養(yǎng)基中溫育過夜。第二天，用BPS(Dulbecco磷酸緩沖液)清洗細胞，然后加入12.5ml的“收獲培養(yǎng)基”(包含2％的7.5％重碳酸鈉貯液的RPMI-1640)。再經(jīng)過24小時溫育后，轉(zhuǎn)移上清，在1000rpm離心5分鐘以除去細胞碎片，并保存于4℃或-20℃。
3.生物學活性為檢測上清液的IL4拮抗劑活性使用Spits等，免疫學雜志，第139卷1142頁(1987年)中所描述的方法，將人的外周血液淋巴細胞與植物凝血素(一種T細胞分裂素)一起溫育三天以上調(diào)(upregulate)IL4受體。所得的母細胞再用IL4刺激三天。用3H胸腺嘧啶的攝入檢測其增殖。
IL4.Y124D/IgG1嵌合體以劑量依賴方式抑制用133pM IL4刺激的人的外周血液T淋巴細胞對3H胸腺嘧啶的攝入。
實施例2 IL4.Y124D/IgG4融合蛋白1.編碼融合蛋白的DNA的構(gòu)建進行PCR來擴增IL4.Y124D編碼區(qū)，并在3’末端引入一個靜止(silent)核苷酸替代，該替代產(chǎn)生了一個XhoI位點。作為PCR反應(yīng)的底物，使用20ng的線性化的pDB95 1質(zhì)粒(實施例1.1(c))。使用的寡聚核苷酸引物如下1)5’ CAC AAG TGC GAT ATC ACC TTA CAG GAG ATC 3’(包括一個EcoRV限制性位點 GATATC)2)5’ CTC GGT ACC GCT CGA GCA CTT TGA GTC TTT 3’(包括一個XhoI限制性位點CTCGAG)。
進行第二個PCR反應(yīng)以擴增人的IgG4重鏈的鉸鏈-CH2-CH3區(qū)。其底物是一個合成的人的IgG4重鏈cDNA，其序列描述于表5，并且基于Genbank序列GBHUMIGCD2(Ellison J.，Buxbaum J.和Hood L.E.，DNA，1981年第1卷11-18頁)。對公開的核苷酸序列進行大量的靜止替代(silent substitution)。通過將兩個0.5kb的合成DNA片段結(jié)合而組裝該基因。每個0.5kb的片段通過將一系列的重疊(oVerlapping)寡聚核苷酸退火，然后用PCR填充間隙而生成。這兩個0.5kb的片段在SacII位點結(jié)合，并插入pCR2載體。然后分離出一個包含全部恒定區(qū)的1.0kb的ApaI-BglII片段，并連接到一個包含人化的IL4特異性可變區(qū)的表達載體pCD中。該構(gòu)建體被用作PCR底物以擴增IgG4的鉸鏈-CH2-CH3區(qū)。
用于擴增IgG4鉸鏈-CH2-CH3區(qū)的寡聚核苷酸引物如下1)5’ GGT GGA CAA CTC GAG CGA GTC CAA ATA TGG 3’(包括一個XhoI限制性位點，CTCGAG)2)5’ TTA CGT AGA TCT AGA CTA CAC TCA TTT ACC 3’(包括一個XbaI位點，TCTAGA)。
兩個PCR反應(yīng)的條件如在pDB951衍生物中所述。簡而言之，使用的引物為5ng/μl，dNTP的終濃度為0.2mM，反應(yīng)的總體積為100μl。使用購自先進生物技術(shù)公司的2.5單位的Taq聚合酶進行31個循環(huán)的PCR反應(yīng)。每個循環(huán)由94℃1分鐘的變性步驟、50℃1分30秒的退火步驟以及72℃1分30秒的延長步驟組成。第一循環(huán)的變性步驟延長到5分鐘，最后一個循環(huán)的延長步驟延長到7分鐘。
得到了大約700bp(IgG4的鉸鏈-CH2-CH3區(qū))和400bp(IL4.Y124D)的PCR產(chǎn)物，并用Promega“Magic PCR cleanup”試劑盒純化。純化的PCR反應(yīng)用下列酶切割以生成“粘性末端”IgG4用XhoI和XbaI、IL4.Y124D用EcoRV和XhoI。切割物在37℃溫育3小時，然后用乙醇沉淀。所得的DNA用凝膠電泳分析，大小約為690bp(IgG4的鉸鏈-CH2-CH3區(qū))和370bp(IL4.Y124D)。
制備一個載體，通過用EcoRV和XbaI切割pDB951(COSFcLink的IL4.Y124D)除去大部分IL4.Y124D/IgG1融合分子而將IgG4的鉸鏈-CH2-CH3區(qū)和IL4.Y124D PCR片段連接于其上。唯一保留的部分是大約75bp的IL4的5’末端，它不存在于通過PCR擴增生成的IL4.Y124DEcoRV/XhoI片段中。5μg的pDB951 DNA在總體積為30μl的反應(yīng)緩沖液2(GibcobRL)中被切割。所得的5.8kb的DNA片段用GenecleanTM方法純化。
所描述的三個片段(IL4.Y124D EcoRV/XhoI、IgG4 XhoI/XbaI的鉸鏈-CH2-CH3區(qū)以及5.8kb的用EcoRV/XbAI切割pDB951所得的片段)被連接到一起以生成質(zhì)粒pDB952，它編碼IL4.Y124D/IgG4融合蛋白。連接反應(yīng)是用購自Amersham(產(chǎn)品編號RPN 1507)的DNA連接試劑盒進行的，反應(yīng)物于16℃溫育過夜。連接反應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進PromegaJM109感受態(tài)細胞(高效)中，并涂覆到包含50μg/ml的氨芐青霉素的Luria Broth瓊脂平板上。轉(zhuǎn)化細胞在Luria Broth培養(yǎng)基(包含50μg/ml的氨芐青霉素)中培養(yǎng)，并使用Promega“Magic Minipreps”制備DNA。IL4.Y124D/IgG4重組DNA的產(chǎn)生用限制性切割來確定，并用DNA測序確定IL4.Y124D的全序列和鉸鏈-CH2-CH3區(qū)。表6描述的只是IL4.Y124D/IgG4融合分子編碼區(qū)的序列，表7包括了該融合蛋白的氨基酸序列。用氯化銫梯度法制備和純化IL4.Y124D/IgG4重組DNA，該DNA用于瞬時轉(zhuǎn)染海拉細胞。
2.融合蛋白的表達海拉細胞在含有10％胎牛血清和1％谷氨酰胺的MEMα培養(yǎng)基(Gibco)中生長。為進行該檢測，將1×106的海拉細胞接種于15ml的含有10％新生牛血清、1％谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)基(“種子培養(yǎng)基”)中，轉(zhuǎn)染前放于75cm2的燒瓶中四天，轉(zhuǎn)染前一天，將另外12.5ml的種子培養(yǎng)基加入每個燒瓶。轉(zhuǎn)染當天，培養(yǎng)基在零時刻換為15ml的“轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基”(含有10％新生牛血清和1％非必需氨基酸的、加Earle鹽的MEM培養(yǎng)基)。在+3小時時，將存在于0.125M氯化鈣、1×HBS(HEPES緩沖液)中的25μg的適當DNA加入細胞中。在+7小時時，對細胞進行甘油休克(15％v/v)，然后轉(zhuǎn)入12.5ml的含有5mM丁酸鈉的種子培養(yǎng)基中溫育過夜。第二天，用BPS(Dulbecco磷酸緩沖液)清洗細胞，然后加入12.5ml的“收獲培養(yǎng)基”(包含2％的7.5％重碳酸鈉貯液的RPMI-1640)。再經(jīng)過24小時溫育后，轉(zhuǎn)移上清液，在1000rpm離心5分鐘以除去細胞碎片，并保存于4℃或-20℃。
3.生物學活性為檢測上清液的IL4拮抗劑活性使用Spits等，免疫學雜志，第139卷1142頁(1987)中所描述的方法，將人的外周血液淋巴細胞與植物凝血素、T細胞分裂素一起溫育三天以上調(diào)IL4受體。所得的母細胞再用IL4刺激三天。用3H胸腺嘧啶的攝入檢測其增殖。
IL4.Y124D/IgG4嵌合體以劑量依賴方式抑制用133pM IL4刺激的人的外周血液T淋巴細胞對3H胸腺嘧啶的攝入。
實施例3 IL4.Y124D/IgG4 PE融合蛋白1.編碼融合蛋白的DNA的構(gòu)建如實施例2進行PCR來擴增IL4.Y124D編碼區(qū)，并在3’末端引入一個靜止核苷酸替代，產(chǎn)生一個XhoI位點。
進行第二PCR反應(yīng)來擴增人的IgG4重鏈PE變異體的鉸鏈-CH2-CH3片段。在IgG4 PE中，鉸鏈的殘基10(殘基241，Kabat編號)從野生型的絲氨酸(S)改變?yōu)楦彼?P)，并且CH2的殘基5(殘基248，Kabat編號)從野生型的亮氨酸(L)改變?yōu)楣劝彼?E)。Angal S.，KingD.J.，Bodmer M.W.，Turner A.，Lawson A.D.G.，Roberts G.，Pedley B.和Adair R.，M.在《分子免疫學》1993年第30卷105-108頁中描述了一種IgG4分子，其殘基241(Kabat編號)從絲氨酸變?yōu)楦彼?。該變化延長了IgG4分子的血清半衰期。
IgG4 PE突變體是用PCR誘變表5中所描述的合成的人的IgG4重鏈cDNA來產(chǎn)生的，然后被連接到pCD表達載體上。是該質(zhì)粒被用作PCR反應(yīng)的底物以擴增IgG4 PE的鉸鏈-CH2-CH3片段。IgG4 PE變異體的序列描述于表8。IgG4核苷酸序列中產(chǎn)生PE變異的改變的殘基如下所示參考表8殘基322從野生型的“T”改變?yōu)镻E變異體中的“C”；殘基333從野生型的“A”改變?yōu)镻E變異體中的“G”；以及殘基343-344從野生型的“CT”改變?yōu)镻E變異體中的“GA”。
寡聚核苷酸引物被用于擴增IgG4 PE變異體的鉸鏈-CH2-CH3區(qū)，如制備pDB952時所描述的。
獲得大約700bp(IgG4 PE突變體的鉸鏈-CH2-CH3)和400bp(IL4.Y124D)的PCR產(chǎn)物，并用Promega“Magic PCR cleanup”試劑盒純化。純化的PCR反應(yīng)物用下述酶切割以形成“粘性末端”IgG4PE用XhoI和XbaI、IL4.Y124D用EcoRV和XhoI。切割物于37℃溫育3小時，然后乙醇沉淀。所得的DNA的大小約為690bp(IgG4 PE的鉸鏈-CH2-CH3)和370bp(IL4.Y124D)。
為了獲得大量的IgG4 PE變異體的鉸鏈-CH2-CH3片段和IL4.Y124D片段，將純化并切割后的PCR產(chǎn)物與Bluescript KS+TM連接，后者是用XhoI和XbaI(對IgG4 PE的鉸鏈-CH2-CH3片段)或EcoRV和XhoI(對IL4.Y124D片段)切割而制備的，然后用GenecleanTM處理。于是生成了Bluescript KS+/IgG4 PE的鉸鏈-CH2-CH3重組體和Bluescript KS+/IL4.Y124D重組體。使用Promega的“Magic Maxiprep”方法生產(chǎn)大量的該DNA。用XhoI和XbaI將IgG4 PE的鉸鏈-CH2-CH3片段從Bluescript重組體中切除。所得的大約690bp的片段用GenecleanTM純化以產(chǎn)生大量的IgG4 PE的鉸鏈-CH2-CH3 XhoI/XbaI片段。用EcoRV和XhoI將IL4.Y124D片段從Bluescript重組體中切除，所得的大約370bp的片段用GenecleanTM純化。
制備一個載體，通過用EcoRV和XbaI切割pDB951而將IgG4 PE的鉸鏈-CH2-CH3區(qū)和IL4.Y124D PCR片段連接于其上，如制備pDB952時所描述的。
所描述的三個片段(IL4.Y124D EcoRV/XhoI、IgG4 PE變異體的XhoI/XbaI的鉸鏈-CH2-CH3以及用EcoRV/XbaI切割pDB951所得的5.8kb片段)用購自Amersham(產(chǎn)品編號RPN 1507)的DNA連接試劑盒連接到一起以生成質(zhì)粒pDB953，反應(yīng)于16℃溫育過夜。將連接反應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進Promega JM109感受態(tài)細胞(高效)中，并涂覆到包含50μg/ml的氨芐青霉素的Luria Broth瓊脂平板上。轉(zhuǎn)化細胞在Luria Broth培養(yǎng)基(包含50μg/ml的氨芐青霉素)中培養(yǎng)，并使用Promega“MagicMinipres”制備DNA。IL4.Y124D/IgG4 PE變異體重組DNA的產(chǎn)生用限制性切割來確定，并用DNA測序確定IL4.Y124D的全序列和鉸鏈-CH2-CH3 IgG4 PE變異區(qū)。表9描述的只是IL4.Y124D/IgG4 PE融合分子編碼區(qū)的序列，表10包括了該融合蛋白的氨基酸序列。用氯化銫梯度法制備和純化IL4.Y124D/IgG4 PE重組DNA，該DNA用于瞬時轉(zhuǎn)染海拉細胞。
2.融合蛋白的表達海拉細胞在含有10％胎牛血清和1％谷氨酰胺的MEMα培養(yǎng)基(Gibco)中生長。為進行該檢測，將1×106的海拉細胞接種于15ml的含有10％新生牛血清、1％谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)基中(“種子培養(yǎng)基”)，轉(zhuǎn)染前放于75cm2的燒瓶中四天。轉(zhuǎn)染前一天，將另外12.5ml的種子培養(yǎng)基加入每個燒瓶。轉(zhuǎn)染當天，將培養(yǎng)基在零時刻換為15ml的“轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基”(含有10％新生牛血清和1％非必需氨基酸的、加Earle鹽的MEM培養(yǎng)基)。在+3小時時，存在于0.125M氯化鈣、1×HBS(HEPES緩沖液)中的25μg的適當DNA加入細胞中。在+7小時時，對細胞進行甘油休克(15％v/v)，然后轉(zhuǎn)入12.5ml的含有5mM丁酸鈉的種子培養(yǎng)基中溫育過夜。第二天，用BPS(Dulbecco磷酸緩沖液)清洗細胞，然后加入12.5ml的“收獲培養(yǎng)基”(包含2％的7.5％重碳酸鈉貯液的RPMI-1640)。再經(jīng)過24小時溫育后，轉(zhuǎn)移上清液，在1000rpm離心5分鐘以除去細胞碎片，并保存于4℃或-20℃。
3.生物學活性為檢測上清液的IL4拮抗劑活性使用Spits等，免疫學雜志，第139卷1142頁(1987)中所描述的方法，將人的外周血液淋巴細胞與植物凝血素、T細胞分裂素一起溫育三天以上調(diào)IL4受體。所得的母細胞再用IL4刺激三天。用3H胸腺嘧啶的攝入檢測其增殖。
IL4.Y124D/IgG4 PE嵌合體以劑量依賴方式抑制用133pM IL4刺激的人的外周血液T淋巴細胞對3H胸腺嘧啶的攝入。
實施例4包含編碼IL4.Y124D/IgG4 PE的DNA的哺乳動物表達載體1.DNA的構(gòu)建pCDN載體(Aiyar N.，Baker E.，Wu H-L.，Nambi P.，Edwards R.M.，Trill J.J.，Ellis C.，Bergsma D.，分子和細胞生物化學，第131卷75-86頁1994年)包含CMV啟動子、一個多聚連結(jié)子克隆區(qū)，以及BGH多聚核苷酸區(qū)。該載體還包含用于GeneticinTM篩選的插入β-球蛋白啟動子和SV40多聚腺苷酸區(qū)之間的細菌新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NEO)，用于氨甲蝶呤(MTX)擴增的插入β-球蛋白啟動子和BGH多聚腺苷酸區(qū)之間的DHFR篩選盒，用于在細菌中生長的氨芐青霉素抗性基因，以及SV40復(fù)制啟始區(qū)。
為了插入IL4.Y124D/IgG4 PE cDNA，用Nde1和BstX1切割pCDN載體，方法如下15μg的DNA與30單位的反應(yīng)緩沖液2中的BstX1(Gibco-BRL)一起于55℃溫育1小時，然后乙醇沉淀。所得的DNA與反應(yīng)緩沖液2中的Nde1于37℃溫育1小時，然后乙醇沉淀。按如下方法用Nde1和BstX1切割以從pDB953(實施例3.1)制備IL4.Y124D/IgG4PE片段15μg的DNA與30單位的反應(yīng)緩沖液2中的BstX1一起于55℃溫育1小時，然后乙醇沉淀。所得的DNA與反應(yīng)緩沖液2中的Nde1于37℃溫育1小時，然后乙醇沉淀。
將IL4.Y124D/IgG4 PE Nde1/BstX1和pCDN Nde1/BstX1片段連接到一起以生成質(zhì)粒pCDN-IL4.Y124D/IgG4 PE。連接是通過使用2單位的T4 DNA連接酶(Gibco BRL)和T4 DNA連接酶緩沖液實現(xiàn)的。該反應(yīng)在16℃溫育過夜。連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進Gibco-BRL DH5a感受態(tài)細胞(亞克隆效果)中，并涂覆到包含75μg/ml的氨芐青霉素的Luria Broth瓊脂平板上。轉(zhuǎn)化細胞在Luria Broth培養(yǎng)基(包含50μg/ml的氨芐青霉素)中培養(yǎng)，并使用堿裂解法制備DNA。pCDN-IL4.Y124D/IgG4 PE DNA的產(chǎn)生用限制性切割來確定。并用DNA測序確定IL4.Y124D/IgG4 PE DNA的全序列。使用Qiagen柱來制備和純化pCDN-IL4.Y124D/IgG4 PE重組DNA，該DNA用于瞬時感染COS細胞并電穿孔至CHO細胞中以產(chǎn)生穩(wěn)定克隆。
2.融合蛋白的表達a)在COS中的瞬時表達COS-1細胞在含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中生長。在轉(zhuǎn)化前24小時，2×105的細胞接種于35mm的組織培養(yǎng)皿。將100μl無血清的DMEM中含1μg DNA的溶液加入100μl無血清的DMEM中含6μlLIPOFECTAMINE試劑(Gibco-BRL)的溶液中，小心攪拌，并在室溫溫育45分鐘。細胞用無血清的DMEM洗滌一次。在DNA-LIPOFECTAMINE溶液中加入0.8ml的無血清的DMEM，小心混合，然后將稀釋的溶液覆蓋于細胞上。細胞在37℃溫育5小時，然后加入1ml包含20％胎牛血清的DMEM。48-72小時后檢測細胞以確定表達水平。
b)電穿孔至CHO細胞中
CHO細胞，ACC-098(一種從CHO DG-44衍生的懸浮細胞系，Urlaub G.，Kas E.，Carothers A.M.和Chasin L.A.，細胞，第33卷405-412頁，1983年)在無血清的生長培養(yǎng)基WO92/05246中培養(yǎng)。15μg的pCDN-IL4.Y124D/IgG4 PE質(zhì)粒用30單位的Not1在37℃下切割3小時以使質(zhì)粒線性化，并用乙醇沉淀。所得的DNA重懸于50μl的1×TE(10mM Tris，pH8.0，1mM EDTA)中。該DNA用Bio Rad基因脈沖儀于380V和25μFd電穿孔至1×107ACC-098細胞中。該細胞重懸于生長培養(yǎng)基，濃度為2.5×104細胞/ml，并將200μl的該懸液涂覆于96孔板的每個孔中。48小時后，培養(yǎng)基換為包含400μg/mlG418(Geneticin)的生長培養(yǎng)基。篩選后21天，出現(xiàn)菌落的條件培養(yǎng)基用Elisa法篩選。最高表達菌落被轉(zhuǎn)移到24孔板中以按比例擴增(scaled up)。表1.COSFcLink載體的DNA序列，6367bpSEQ ID No1GACGTCGACGGATCGGGAGATCGGGGATCGATCCGTCGACGTACGACTAGTTATTAATAG 60TAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTT 120ACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATG 180ACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTAT 240TTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCT 300ATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGG 360GACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGG 420TTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTC 480CACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAA 540TGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTC 600TATATAAGCAGAGCTGGGTACGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCGAATTCGG 660TTACCTGCAGATATCAAGCTAATTCGGTACCGAGCCCAAATCGGCCGACAAAACTCACAC 720ATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCC 780AAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGA 840CGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCA 900TAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGT 960CCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAA 1020CAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA 1080ACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCT 1140GACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGG 1200GCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTT 1260CCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATG 1320CTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCC 1380GGGTAAATGAGTGTAGTCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCA 1440GCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCAC 1500TGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTAT 1560TCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCA 1620TGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAACCAGCTGGGGCTCGAGGGGGGATCTCCCGATC 1680CCCAGCTTTGCTTCTCAATTTCTTATTTGCATAATGAGAAAAAAAGGAAAATTAATTTTA 1740ACACCAATTCAGTAGTTGATTGAGCAAATGCGTTGCCAAAAAGGATGCTTTAGAGACAGT 1800GTTCTCTGCACAGATAAGGACAAACATTATTCAGAGGGAGTACCCAGAGCTGAGACTCCT 1860AAGCCAGTGAGTGGCACAGCATTCTAGGGAGAAATATGCTTGTCATCACCGAAGCCTGAT 1920TCCGTAGAGCCACACCTTGGTAAGGGCCAATCTGCTCACACAGGATAGAGAGGGCAGGAG 1980CCAGGGCAGAGCATATAAGGTGAGGTAGGATCAGTTGCTCCTCACATTTGCTTCTGACAT 2040AGTTGTGTTGGGAGCTTGGATAGCTTGGACAGCTCAGGGCTGCGATTTCGCGCCAAACTT 2100GACGGCAATCCTAGCGTGAAGGCTGGTAGGATTTTATCCCCGCTGCCATCATGGTTCGAC 2160CATTGAACTGCATCGTCGCCGTGTCCCAAAATATGGGGATTGGCAAGAACGGAGACCTAC 2220CCTGGCCTCCGCTCAGGAACGAGTTCAAGTACTTCCAAAGAATGACCACAACCTCTTCAG 2280TGGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAGGAAAACCTGGTTCTCCATTCCTGAGA 2340AGAATCGACCTTTAAAGGACAGAATTAATATAGTTCTCAGTAGAGAACTCAAAGAACCAC 2400CACGAGGAGCTCATTTTCTTGCCAAAAGTTTGGATGATGCCTTAAGACTTATTGAACAAC 2460CGGAATTGGCAAGTAAAGTAGACATGGTTTGGATAGTCGGAGGCAGTTCTGTTTACCAGG 2520AAGCCATGAATCAACCAGGCCACCTTAGACTCTTTGTGACAAGGATCATGCAGGAATTTG 2580AAAGTGACACGTTTTTCCCAGAAATTGATTTGGGGAAATATAAACTTCTCCCAGAATACC 2640CAGGCGTCCTCTCTGAGGTCCAGGAGGAAAAAGGCATCAAGTATAAGTTTGAAGTCTACG 2700AGAAGAAAGACTAACAGGAAGATGCTTTCAAGTTCTCTGCTCCCCTCCTAAAGCTATGCA 2760TTTTTATAAGACCATGCTAGCTTGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAA 2820AGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGT 2880TTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCAACGATAGCTTATCTGTGGGC 2940GATGCCAAGCACCTGGATGCTGTTGGTTTCCTGCTACTGATTTAGAAGCCATTTGCCCCC 3000TGAGTGGGGCTTGGGAGCACTAACTTTCTCTTTCAAAGGAAGCAATGCAGAAAGAAAAGC3060ATACAAAGTATAAGCTGCCATGTAATAATGGAAGAAGATAAGGTTGTATGAATTAGATTT3120ACATACTTCTGAATTGAAACTAAACACCTTTAAATTCTTAAATATATAACACATTTCATA3180TGAAAGTATTTTACATAAGTAACTCAGATACATAGAAAACAAAGCTAATGATAGGTGTCC3240CTAAAAGTTCATTTATTAATTCTACAAATGATGAGCTGGCCATCAAAATTCCAGCTCAAT3300TCTTCAACGAATTAGAAAGAGCAATCTGCAAACTCATCTGGAATAACAAAAAACCTAGGA3360TAGCAAAAACTCTTCTCAAGGATAAAAGAACCTCTGGTGGAATCACCATGCCTGACCTAA3420AGCTGTACTACAGAGCAATTGTGATAAAAACTGCATGGTACTGATATAGAAACGGACAAG3480TAGACCAATGGAATAGAACCCACACACCTATGGTCACTTGATCTTCAACAAGAGAGCTAA3540AACCATCCACTGGAAAAAAGACAGCATTTTCAACAAATGGTGCTGGCACAACTGGTGGTT3600ATCATGGAGAAGAATGTGAATTGATCCATTCCAATCTCCTTGTACTAAGGTCAAATCTAA3660GTGGATCAAGGAACTCCACATAAAACCAGAGACACTGAAACTTATAGAGGAGAAAGTGGG3720GAAAAGCCTCGAAGATATGGGCACAGGGGAAAAATTCCTGAATAGAACAGCAATGGCTTG3780TGCTGTAAGATCGAGAATTGACAAATGGGACCTCATGAAACTCCAAAGCTATCGGATCAA3840TTCCTCCAAAAAAGCCTCCTCACTACTTCTGGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGG3900CCTCTGCATAAATAAAAAAAATTAGTCAGCCATGCATGGGGCGGAGAATGGGCGGAACTG3960GGCGGAGTTAGGGGCGGGATGGGCGGAGTTAGGGGCGGGACTATGGTTGCTGACTAATTG4020AGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACCTGGTT4080GCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTT4140CCACACCCTAACTGACACACATTCCACAGAATTAATTCCCGATCCCGTCGACCTCGAGAG4200CTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCC4260ACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTA4320ACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCA4380GCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTC4440CGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGC4500TCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACAT4560GTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTT4620CCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCG4680AAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTC4740TCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGT4800GGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAA4860GCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTA4920TCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAA4980CAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAA5040CTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTT5100CGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTT5160TTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGAT5220CTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCAT5280GAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATC5340AATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGC5400ACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTA5460GATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGA5520CCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCG5580CAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGC5640TAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCAT5700CGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAG5760GCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGAT5820CGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAA5880TTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAA5940GTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGA6000TAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGG6060GCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCAGTCGTGC6120ACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGG6180AAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACT6240CTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACAT 6300ATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGT 6360GCCACCT 6367表2.在COSFcLink載體中編碼Y124D-IgG1融合分子的DNA序列，6926bpSEQ ID No2GACGTCGACGGATCGGGAGATCGGGGATCGATCCGTCGACGTACGACTAGTTATTAATAG 60TAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTT 120ACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATG 180ACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTAT 240TTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCT 300ATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGG 360GACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGG 420TTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTC 480CACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAA 540TGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTC 600TATATAAGCAGAGCTGGGTACGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCGAATTCGG 660TTACCTGCAGATGGGCTGCAGGAATTCCGCATTGCAGAGATAATTGTATTTAAGTGCCTA 720GCTCGATACAATAAACGCCATTTGACCATTCACCACATTGGTGTGCACCTCCAAGCTTAC 780CTGCCATGGGTCTCACCTCCCAACTGCTTCCCCCTCTGTTCTTCCTGCTAGCATGTGCCG 840GCAACTTTGTCCACGGACACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCAAAACTTTGA 900ACAGCCTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTG 960CCTCCAAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGT 1020TCTACAGCCACCATGAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCCACA 1080GGCACAAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGG 1140GCTTGAATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACCAGAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAA 1200GGCTAAAGACGATCATGAGAGAGAAAGACTCAAAGTGTTCGAGCGGTACCGAGCCCAAAT 1260CGGCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGT 1320CAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGG 1380TCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACG 1440TGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA 1500CGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT 1560ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAG 1620CCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGA 1680CCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCG 1740TGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGG 1800ACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGC 1860AGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA 1920AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGTAGTCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGA 1980CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCC 2040TGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTC 2100TGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATT 2160GGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAACCAGCTGGGGCTC 2220GAGGGGGGATCTCCCGATCCCCAGCTTTGCTTCTCAATTTCTTATTTGCATAATGAGAAA 2280AAAAGGAAAATTAATTTTAACACCAATTCAGTAGTTGATTGAGCAAATGCGTTGCCAAAA 2340AGGATGCTTTAGAGACAGTGTTCTCTGCACAGATAAGGACAAACATTATTCAGAGGGAGT 2400ACCCAGAGCTGAGACTCCTAAGCCAGTGAGTGGCACAGCATTCTAGGGAGAAATATGCTT 2460GTCATCACCGAAGCCTGATTCCGTAGAGCCACACCTTGGTAAGGGCCAATCTGCTCACAC 2520AGGATAGAGAGGGCAGGAGCCAGGGCAGAGCATATAAGGTGAGGTAGGATCAGTTGCTCC2580TCACATTTGCTTCTGACATAGTTGTGTTGGGAGCTTGGATAGCTTGGACAGCTCAGGGCT2640GCGATTTCGCGCCAAACTTGACGGCAATCCTAGCGTGAAGGCTGGTAGGATTTTATCCCC2700GCTGCCATCATGGTTCGACCATTGAACTGCATCGTCGCCGTGTCCCAAAATATGGGGATT2760GGCAAGAACGGAGACCTACCCTGGCCTCCGCTCAGGAACGAGTTCAAGTACTTCCAAAGA2820ATGACCACAACCTCTTCAGTGGAAGGTAAACAGAATCTGGTGATTATGGGTAGGAAAACC2880TGGTTCTCCATTCCTGAGAAGAATCGACCTTTAAAGGACAGAATTAATATAGTTCTCAGT2940AGAGAACTCAAAGAACCACCACGAGGAGCTCATTTTCTTGCCAAAAGTTTGGATGATGCC3000TTAAGACTTATTGAACAACCGGAATTGGCAAGTAAAGTAGACATGGTTTGGATAGTCGGA3060GGCAGTTCTGTTTACCAGGAAGCCATGAATCAACCAGGCCACCTTAGACTCTTTGTGACA3120AGGATCATGCAGGAATTTGAAAGTGACACGTTTTTCCCAGAAATTGATTTGGGGAAATAT3180AAACTTCTCCCAGAATACCCAGGCGTCCTCTCTGAGGTCCAGGAGGAAAAAGGCATCAAG3240TATAAGTTTGAAGTCTACGAGAAGAAAGACTAACAGGAAGATGCTTTCAAGTTCTCTGCT3300CCCCTCCTAAAGCTATGCATTTTTATAAGACCATGCTAGCTTGAACTTGTTTATTGCAGC3360TTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTC3420ACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCAA3480CGATAGCTTATCTGTGGGCGATGCCAAGCACCTGGATGCTGTTGGTTTCCTGCTACTGAT3540TTAGAAGCCATTTGCCCCCTGAGTGGGGCTTGGGAGCACTAACTTTCTCTTTCAAAGGAA3600GCAATGCAGAAAGAAAAGCATACAAAGTATAAGCTGCCATGTAATAATGGAAGAAGATAA3660GGTTGTATGAATTAGATTTACATACTTCTGAATTGAAACTAAACACCTTTAAATTCTTAA3720ATATATAACACATTTCATATGAAAGTATTTTACATAAGTAACTCAGATACATAGAAAACA3780AAGCTAATGATAGGTGTCCCTAAAAGTTCATTTATTAATTCTACAAATGATGAGCTGGCC3840ATCAAAATTCCAGCTCAATTCTTCAACGAATTAGAAAGAGCAATCTGCAAACTCATCTGG3900AATAACAAAAAACCTAGGATAGCAAAAACTCTTCTCAAGGATAAAAGAACCTCTGGTGGA3960ATCACCATGCCTGACCTAAAGCTGTACTACAGAGCAATTGTGATAAAAACTGCATGGTAC4020TGATATAGAAACGGACAAGTAGACCAATGGAATAGAACCCACACACCTATGGTCACTTGA4080TCTTCAACAAGAGAGCTAAAACCATCCACTGGAAAAAAGACAGCATTTTCAACAAATGGT4140GCTGGCACAACTGGTGGTTATCATGGAGAAGAATGTGAATTGATCCATTCCAATCTCCTT4200GTACTAAGGTCAAATCTAAGTGGATCAAGGAACTCCACATAAAACCAGAGACACTGAAAC4260TTATAGAGGAGAAAGTGGGGAAAAGCCTCGAAGATATGGGCACAGGGGAAAAATTCCTGA4320ATAGAACAGCAATGGCTTGTGCTGTAAGATCGAGAATTGACAAATGGGACCTCATGAAAC4380TCCAAAGCTATCGGATCAATTCCTCCAAAAAAGCCTCCTCACTACTTCTGGAATAGCTCA4440GAGGCCGAGGCGGCCTCGGCCTCTGCATAAATAAAAAAAATTAGTCAGCCATGCATGGGG4500CGGAGAATGGGCGGAACTGGGCGGAGTTAGGGGCGGGATGGGCGGAGTTAGGGGCGGGAC4560TATGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGG4620GGACTTTCCACACCTGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTGCATACTTCTGCCTGC4680TGGGGAGCCTGGGGACTTTCCACACCCTAACTGACACACATTCCACAGAATTAATTCCCG4740ATCCCGTCGACCTCGAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATT4800GTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGG4860GTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGT4920CGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTT4980TGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGC5040TGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGG5100ATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGG5160CCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGAC5220GCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTG5280GAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCT5340TTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGG5400TGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCT5460GCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCAC5520TGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGT5580TCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTC5640TGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCA5700CCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGAT5760CTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCAC 5820GTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATT 5880AAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACC 5940AATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTG 6000CCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTG 6060CTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGC 6120CAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTA 6180TTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTG 6240TTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCT 6300CCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTA 6360GCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGG 6420TTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGA 6480CTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTT 6540GCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCA 6600TTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTT 6660CGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTT 6720CTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGA 6780AATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATT 6840GTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGC 6900GCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCT 6926表3.IL4.Y124D/IgG1融合分子編碼區(qū)的DNA序列，1164bpSEQ ID No3ATGGGTCTCACCTCCCAACTGCTTCCCCCTCTGTTCTTCCTGCTAGCATGTGCCGGCAAC 60TTTGTCCACGGACACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCAAAACTTTGAACAGC 120CTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCC 180AAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTAC 240AGCCACCATGAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCCACAGGCAC 300AAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTG 360AATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACCAGAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTA 420AAGACGATCATGAGAGAGAAAGACTCAAAGTGTTCGAGCGGTACCGAGCCCAAATCGGCC 480GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTC 540TTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACA 600TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGAC 660GGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTAC 720CGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAG 780TGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA 840GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAG 900AACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG 960TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCC 1020GACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGG 1080AACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGC 1140CTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA 1164表4.被編碼的IL4.Y124D/IgG1融合蛋白的序列，387aaSEQ ID No41 MGLTSQLLPP LFFLLACAGN FVHGHKCDIT LQEIIKTLNS LTEQKTLCTE51 LTVTDIFAAS KNTTEKETFC RAATVLRQFY SHHEKDTRCL GATAQQFHRH101KQLIRFLKRL DRNLWGLAGL NSCPVKEANQ STLENFLERL KTIMPEKDSK151CSSGTEPKSA DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT201CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH251QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSRDELTK301NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL351TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK*表5.合成的IgG4 cDNA的DNA序列，1006bpSEQ ID No5GCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAG60AGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCG120TGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA180GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACC240TACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCC300AAATATGGTCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGAATTTCTGGGGGGACCATCAGTC360TTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACG420TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGAT480GGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTAC540CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAG600TGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCATCGATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA660GGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAG720AACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAG780TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCC840GACGGATCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGG900AATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGC960CTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGAGTGTAGTCTAGATCTACGTATG 1006表6.IL4.Y124D/IgG4融合分子編碼區(qū)的DNA序列，1149bpSEQ ID No6ATGGGTCTCACCTCCCAACTGCTTCCCCCTCTGTTCTTCCTGCTAGCATGTGCCGGCAAC60TTTGTCCACGGACACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCAAAACTTTGAACAGC120CTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCC180AAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTAC240AGCCACCATGAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCCACAGGCAC300AAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTG360AATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACCAGAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTA420AAGACGATCATGAGAGAGAAAGACTCAAAGTGCTCGAGCGAGTCCAAATATGGTCCCCCA480TGCCCATCATGCCCAGCACCTGAATTTCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCA540AAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGAC600GTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCAT660AATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC720CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC780AAAGGCCTCCCGTCATCGATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAG840CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG900ACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG960CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTC1020CTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGC1080TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTG1140GGTAAATGA 1149表7.被編碼的IL4.Y124D/IgG4融合蛋白的序列，382aaSEQ ID No71 MGLTSQLLPP LFFLLACAGN FVHGHKCDIT LQEIIKTLNS LTEQKTLCTE51 LTVTDIFAAS KNTTEKETFC RAATVLRQFY SHHEKDTRCL GATAQQFHRH101 KQLIRFLKRL DRNLWGLAGL NSCPVKEANQ STLENFLERL KTIMREKDSK151 CSSESKYGPP CPSCPAPEFL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD201 VSQEDPEVQF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTYRVVSV LTVLHQDWLN251 GKEYKCKVSN KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL301 TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS351 RWQEGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSL GK*表8.IgG4 PE變異體的DNA序列，984bpSEQ ID No8GCTAGTACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAG 60AGCACgGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCG 120TGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA 180GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACC 240TACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCC 300AAATATGGTCCCCCATGCCCAcCATGCCCAGCgCCTGAaTTtgaGGGGGGACCATCAGTC 360TTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACG 420TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGAT 480GGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTAC 540CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAG 600TGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCaTCgATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA 660GGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAG 720AACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAG 780TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCC 840GACGGaTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGG 900AATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGC 960CTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA 984表9.IL4.Y124D/IgG4 PE融合分子編碼區(qū)的DNA序列，1149bpSEQ ID No9ATGGGTCTCACCTCCCAACTGCTTCCCCCTCTGTTCTTCCTGCTAGCATGTGCCGGCAAC 60TTTGTCCACGGACACAAGTGCGATATCACCTTACAGGAGATCATCAAAACTTTGAACAGC 120CTCACAGAGCAGAAGACTCTGTGCACCGAGTTGACCGTAACAGACATCTTTGCTGCCTCC 180AAGAACACAACTGAGAAGGAAACCTTCTGCAGGGCTGCGACTGTGCTCCGGCAGTTCTAC 240AGCCACCATGAGAAGGACACTCGCTGCCTGGGTGCGACTGCACAGCAGTTCCACAGGCAC 300AAGCAGCTGATCCGATTCCTGAAACGGCTCGACAGGAACCTCTGGGGCCTGGCGGGCTTG 360AATTCCTGTCCTGTGAAGGAAGCCAACCAGAGTACGTTGGAAAACTTCTTGGAAAGGCTA 420AAGACGATCATGAGAGAGAAAGACTCAAAGTGCTCGAGCGAGTCCAAATATGGTCCCCCA 480TGCCCACCATGCCCAGCgCCTGAATTTGAGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCA 540AAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGAC 600GTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCAT 660AATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC 720CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC 780AAAGGCCTCCCGTCaTCgATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAG 840CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG 900ACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG 960CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGaTCCTTCTTC 1020CTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGC 1080TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTG 1140GGTAAATGA 1149表10.被編碼的IL4.Y124D/IgG4 PE變異體融合蛋白的序列，382aaSEQ ID No101 MGLTSQLLPP LFFLLACAGN FVHGHKCDIT LQEIIKTLNS LTEQKTLCTE51 LTVTDIFAAS KNTTEKETFC RAATVLRQFY SHHEKDTRCL GATAQQFHRH101 KQLIRFLKRL DRNLWGLAGL NSCPVKEANQ STLENFLERL KTIMREKDSK151 CSSESKYGPP CPPCPAPEFE GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD201 VSQEDPEVQF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTYRVVSV LTVLHQDWLN251 GKEYKCKVSN KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL301 TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS351 RWQEGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSL GK*
權(quán)利要求
1.一種具有IL4和/或IL13拮抗劑活性或部分拮抗劑活性的可溶性蛋白，它包含與至少一個人類免疫球蛋白的恒定區(qū)或其片段融合的IL4突變體或變異體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中天然存在于野生型IL4中第120至128位中任一位置的至少一個氨基酸被不同的天然氨基酸替代。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的化合物，其中天然存在于第124位的酪氨酸被一個不同的天然氨基酸替代。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的化合物，其中天然存在于第124位的酪氨酸被天門冬氨酸替代。
5.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一權(quán)項的化合物，其中免疫球蛋白是IgG亞類的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的化合物，其中恒定區(qū)或其片段是人類IgG重鏈的恒定區(qū)的全部或基本部分。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的化合物，其中恒定區(qū)或其片段是人類IgG4重鏈的恒定區(qū)的全部或基本部分。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，它具有SEQ ID No4，SEQ ID No7或SEQ IDNo10所示的氨基酸序列。
9.一種制備上述權(quán)利要求中任一權(quán)項的化合物的方法，該方法包括在重組宿主細胞中表達編碼該化合物的DNA及回收產(chǎn)物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，它包括i)制備一種可復(fù)制表達載體，它能在宿主細胞中表達包含編碼所述化合物的核苷酸序列的DNA聚合體；ii)用該載體轉(zhuǎn)化宿主細胞；iii)在允許表達DNA聚合體以生產(chǎn)所述化合物的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞；以及iV)回收所述化合物。
11.一種DNA聚合體，它包含編碼權(quán)利要求1至8中任一權(quán)項的化合物的核苷酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的DNA聚合體，它包含SEQ ID No3，SEQ ID No6或SEQ ID No9的序列或由其組成。
13.包含權(quán)利要求11的DNA聚合體的可復(fù)制表達載體。
14.用權(quán)利要求13的可復(fù)制表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
15.一種藥物組合物，它包含權(quán)利要求1至8中任一權(quán)項的化合物和藥用載體。
16.一種治療由IL4和/或IL13的不良作用引起的疾病的方法，它包括給患者施用有效量的權(quán)利要求1的化合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一權(quán)項的化合物，它被用于治療。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一權(quán)項的化合物，它被用于治療由IL4和/或IL13的不良作用引起的疾病。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一權(quán)項的化合物在生產(chǎn)一種藥劑時的應(yīng)用，該藥劑被用于治療由IL4和/或IL13的不良作用引起的疾病。
全文摘要
一種具有IL4和/或IL13拮抗劑或部分拮抗劑活性的可溶蛋白，該蛋白包含與至少一個人類免疫球蛋白恒定區(qū)或其片段融合的IL4突變體或變異體。
文檔編號A61K39/395GK1164872SQ95195305
公開日1997年11月12日 申請日期1995年7月28日 優(yōu)先權(quán)日1994年7月29日
發(fā)明者M·J·布朗克, K·E·墨菲, C·G·查普曼, H·E·克林肯比得, P·R·楊, A·R·沙茲曼 申請人:史密絲克萊恩比徹姆有限公司, 史密絲克萊恩比徹姆公司