專利名稱：生產(chǎn)非共價復(fù)合的多價蛋白體亞基疫苗的改進(jìn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于粘膜和非腸胃給藥的，非共價復(fù)合的多價蛋白體疫苗的生產(chǎn)方法及其組合物。
背景技術(shù)：
為了使多價亞基疫苗能夠激發(fā)針對每個組成部分的最佳免疫應(yīng)答，相應(yīng)的組成部分必須適當(dāng)結(jié)合并使每一個都能與免疫系統(tǒng)接觸，從而使得它們能夠被免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞有效地識別和加工。早先的這類非共價復(fù)合疫苗的實(shí)例包括蛋白體疫苗，它們由奈瑟氏菌屬外膜蛋白體非共價地與多種抗原復(fù)合而成，抗原包括肽、脂肽、跨膜或類毒素蛋白、多糖或脂多糖(LPS)(1987年7月23日的專利申請07/065,440，“免疫原性肽疫苗及其制備方法”(“Immunogenic peptide vaccinesand methods of preparation”)；1989年4月12日的專利申請07/336,952，“用于大蛋白質(zhì)和多肽的免疫增強(qiáng)系統(tǒng)”(Immunopotentiaing system for large protiansand polypeptides”)；1992年10月8日申請的07-958,426，“利用了包含蛋白體和脂多糖的疏水性復(fù)合物的口用或鼻用疫苗”(Oral or Intranasal Vaccines UsingHydrophobic Complexes Having Proteosomes and Lipopolysaccharides)；1993年3月11日申請的08/029,666，“用于制備免疫原性物質(zhì)的免疫增強(qiáng)系統(tǒng)”(Immunopotentiaing system for Preparation ofImmunogenic Materials)；1993年10月29日申請的08/143,365，“用于制備免疫原性物質(zhì)的免疫增強(qiáng)系統(tǒng)”(Immunopotentiaing system for Preparation of Immunogenic Materials)；1993年10月29日申請的93/10,402，“亞微米乳劑用于疫苗佐劑”(Submicron Emulsions asVaccine Adjuvants”)；1994年5月18日申請的08/063,613，“固體脂肪納米乳液用作疫苗傳遞的載體”(Solid Fat Nanoemulsions as Vehicles for Vaccine Delivery)和出版物，Orr,N.,Robin,G.,Cohen,D.,Arnon,R.和Lowell,G.H.(1993).“口用或鼻用弗萊克斯納氏志賀氏菌2a和宋內(nèi)志賀氏菌蛋白體-脂多糖疫苗在動物模型中的免疫原性和效力”(Immunogenicity and Efficacy of Oral or Intranasal Shigellaflexneri 2a and Shigella sonnei Proteosome-Lipopolysaccharide Vaccines in AnimalModels)。《傳染與免疫》(Infect.Immun.)61:2390；Mallett,C.P.,T.L.Hale,R.Kaminski,T.Larsen,N.Orr.,D.Chohen，和G.H.Lowell.1995.“在患志賀氏菌病的鼠模型中用蛋白體-志賀氏菌脂多糖疫苗經(jīng)鼻腔或腸胃道免疫來抵抗致死性肺炎”(Intranasal or intragastric immunization with proteosome-Shigellalipopolysaccharide vaccines protect against lethal pneumonia in a murine model ofshigellosis)《傳染與免疫》(Infect.Immun.)63:2382-2386；Lowell GH,KaminskiRW,Grate S等(1996)“鼻內(nèi)和肌內(nèi)蛋白體-葡萄球菌腸毒素B(SEB)類毒素免疫在小鼠體內(nèi)的抗致死性SEB中毒的免疫原性和效力(Intranasal and intramuscularproteosome-staphylococcal enterotoxin B(SEB)toxoid vaccines:immunogenicity andefficacy against lethal SEB intoxication in mice)《傳染與免疫》(Infect.Immun.)64:1706-1713；Lowell,G.H.(1990)“用于肽和蛋白質(zhì)疫苗的改良制備方法的蛋白體、疏水性錨結(jié)構(gòu)、Iscoms和脂質(zhì)體”(Proteosomes,HydrophobicAnchors,Iscoms and Liposomes for Improved Presentation of Peptide and ProteinVaccines)《新一代疫苗》(New Generation Vaccines):G.C.Woodrow和M.M.Levine編，(Marcel Dekker,NY)第12章(pp.141-160)和Lowell,G.H.,W.R.Ballou,L.F.Smith,R.A.Wirtz,W.D.Zollinger和W.T.Hockmeyer.1988.“蛋白體-脂肽疫苗對瘧疾CS肽免疫原性的加強(qiáng)”(Proteosome-lipopeptide vaccine:enhancement ofimmunogenicity for malaria CS peptides)《科學(xué)》(Science)240:800)。
本文全面引用參考了以上文獻(xiàn)。
為了在實(shí)踐中將疫苗用于抵抗疾病，經(jīng)常因?yàn)閭€體易于受多種生物引起的疾病感染而需要同時使用多種這樣的抗原。而且，這多種生物無論它們是否彼此相關(guān)通常具有地域流行性，所以，需要保護(hù)的個體就可能需要多種疫苗。
至今，利用簡單的透析已經(jīng)生產(chǎn)出了需要將組成部分非共價復(fù)合的疫苗，在該方法中，組成部分與可透析性除垢劑被置于透析管中，混合物透析7至10天以去除除垢劑。由于以下原因，該系統(tǒng)實(shí)際存在的缺點(diǎn)使得該技術(shù)不能進(jìn)一步發(fā)展和工業(yè)化1)時間過程的時間長由于過高的成本和因時間長而增加了機(jī)械或生物組成部分降解或污染的可能性，在透析疫苗時需要連續(xù)數(shù)周的使用GMP原料很不實(shí)際；2)污染污染機(jī)會增加透析管很難滅菌，透析管需要手工開啟和關(guān)閉系統(tǒng)，因而會在加料和放料時使組分受到污染。由于在加料和放料之間有許多天的時間，所以，在過程前幾天的可能有的少量污染會在透析的許多天內(nèi)放大，使得該方法無法生產(chǎn)出疫苗。透析袋穿孔的危險性會導(dǎo)致產(chǎn)品流失。3)溫度由于時間很長，透析必須在4℃進(jìn)行；4)透析液的體積為了制備出用于將過程放大的疫苗，必須使用大量的透析液，因?yàn)橥ǔＰ枰肝龉芡獾囊后w與管內(nèi)液體之比為200∶1。所以，例如少量生產(chǎn)2升的疫苗需要每天400升的管外液體-每10天4,000升-而生產(chǎn)20至200升就需要40,000至4,000,000升。與本發(fā)明的方法相比，這樣的用量十分浪費(fèi)和不實(shí)際；由于大量生產(chǎn)成問題，所以透析管不能放大；5)不能方便地監(jiān)測除垢劑是否完全去除，因而不能達(dá)到最大疫苗效率。由于透析袋被放在有200體積緩沖液的容器中，測定除垢劑的去除不僅是不實(shí)際的而且是不可行的；6)此外，至今還沒有方法測定在優(yōu)選實(shí)施例中使用的除垢劑Empigen BB的存在。
本發(fā)明解決的第二個問題是證明該方法能夠生產(chǎn)和傳遞多價疫苗。組成部分可以被制造在一起，也可以單獨(dú)產(chǎn)生然后在給藥前混合在一起。本發(fā)明展示了制備此類疫苗的最佳途徑。
發(fā)明概述本發(fā)明的主題廣義地說涉及蛋白體-兩親決定基疫苗的生產(chǎn)和制造，這些疫苗被設(shè)計成經(jīng)非腸胃道使用或特別用于粘膜給藥來誘導(dǎo)系統(tǒng)性(血清)和粘膜(包括呼吸道和腸道)抗體應(yīng)答，給藥途徑包括但不限于呼吸道(例如鼻內(nèi)、咽內(nèi)和肺內(nèi))、胃腸道(例如口腔或直腸)或局部使用(例如結(jié)膜或眼內(nèi))。兩親決定基是具有疏水性和親水性區(qū)域的分子，將它適當(dāng)?shù)嘏c蛋白體配制在一起時，它會與蛋白體成一直線而形成一種復(fù)合體，該復(fù)合體能夠在接受體中激發(fā)免疫應(yīng)答。典型的兩親決定基包括糖脂，脂糖(包括脫毒脂多糖)，脂肽，跨膜、包被或類毒素蛋白質(zhì)，或者具有固有疏水性氨基酸錨結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或肽?？梢杂筛锾m氏陰性菌獲取這類決定基，其中包括埃希氏桿菌、克雷伯氏桿菌、假單胞菌、嗜血桿菌(hemphilusbrucella)、和奈瑟氏菌。更具體地說，本發(fā)明涉及如下蛋白體疫苗，在該疫苗中，腦膜炎球菌外膜蛋白蛋白體制劑(由腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏菌或其它奈瑟氏菌種的任何菌株來制備)與天然或脫毒的志賀氏菌或奈瑟氏菌脂多糖或脂寡糖非共價復(fù)合成疫苗，該疫苗被設(shè)計成抵抗包含該復(fù)合體任一組成部分的革蘭氏陰性菌引起的疾病，其中包括由腦膜炎球和奈瑟氏菌引起的。更具體地說，本發(fā)明涉及包含LPS的蛋白體疫苗，LPS誘導(dǎo)抗體應(yīng)答，識別志賀氏菌脂多糖的類型特異性體細(xì)胞多糖O抗原，由此提供對志賀氏菌病的同源性保護(hù)。更具體地說，與蛋白體復(fù)合后誘導(dǎo)抗志賀氏菌保護(hù)性免疫應(yīng)答的脂多糖從宋內(nèi)氏志賀氏菌或類志賀鄰單胞菌制備并純化以得到抗宋內(nèi)氏志賀氏菌病的免疫性，從弗萊克斯納志賀氏菌2a制得以得到抗弗萊克斯納志賀氏菌2a病的免疫性，并依此類推，使用來自同源或抗原交叉反應(yīng)性生物的LPS提供對由弗萊克斯納志賀氏菌2a(或3a)、鮑伊德氏志賀氏菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌等引起的志賀氏菌病的同源免疫性。更具體地說，本發(fā)明描述了多價蛋白體-志賀氏菌疫苗的成功給藥，即分別使用來自弗萊克斯納志賀氏菌2a(用于弗萊克斯納志賀氏菌2a病)和類志賀鄰單胞菌或宋內(nèi)氏志賀氏菌(用于宋內(nèi)氏志賀氏菌病)的LPS制備的兩種蛋白體疫苗一起給藥，由此誘導(dǎo)產(chǎn)生識別兩種微生物的抗體，繼而提供對這兩種疾病的保護(hù)。最具體地說，本發(fā)明涉及如下蛋白體-志賀氏菌LPS疫苗，其中使用中空纖維滲濾技術(shù)將來自B族2b型腦膜炎球菌的蛋白體與類志賀鄰單胞菌的LPS復(fù)合，形成經(jīng)呼吸道粘膜和/或胃腸道給藥的疫苗，以誘導(dǎo)識別宋內(nèi)氏志賀氏菌的體細(xì)胞O抗原LPS的抗體，由此抵抗由該微生物引起的志賀氏菌病?？梢允褂闷渌Ｒ?guī)超濾/滲濾法，例如平面式濾膜或?yàn)V膜濾柱。
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)非共價復(fù)合疫苗的方法1)減少了所需的時間，2)減少了污染可能性，3)將生產(chǎn)此類疫苗的溫度提高至常溫，4)能夠有效地將該生產(chǎn)過程放大，從而只需要少量的反應(yīng)劑，5)能夠安全而有效的取樣透析液，從而能夠重復(fù)測定除垢劑的去除速度，由此使得操作的效率最優(yōu)化。這直接提高了疫苗的復(fù)合效率，從而提供在低劑量時具有可測得的較高免疫原性的疫苗。在該方法中，產(chǎn)品的總體質(zhì)量顯著提高。6)此外，本發(fā)明描述了一種測定優(yōu)選實(shí)施例中使用的除垢劑Empigen BB的存在的方法?？梢杂闷渌赏肝龀竸﹣泶鍱mpigen BB。此外，使用本發(fā)明的方法還被證明能夠?qū)⒁呙缫砸欢ǖ姆绞嚼鋬龈稍锶缓笾匦滤?，該方式保留了?jù)疫苗免疫原性測定的疫苗最佳效力。
本發(fā)明方法使用中空纖維超濾/或滲濾柱來去除除垢劑以進(jìn)行復(fù)合。通過改變?yōu)V柱的容積，生產(chǎn)一批疫苗的透析時間可從7至10天以上減少至72小時以下，通常在48或24小時以下。由于使用的時間很短，反應(yīng)溫度可以由4℃提高至常溫，但不損害生產(chǎn)過程或產(chǎn)品的品質(zhì)。雖然生產(chǎn)過程在約20℃進(jìn)行，但也可考慮0℃至40℃。由于系統(tǒng)是封閉的，所以大大減少了污染的可能性。此外，通過加大容積可以在較短的時間內(nèi)處理大量的物質(zhì)，從而能夠有效和可重復(fù)地將該方法放大以進(jìn)行工業(yè)化發(fā)展。而且，使用本發(fā)明的方法測定優(yōu)選實(shí)施例中使用的除垢劑Empigen BB可以對透過液重復(fù)取樣來測定除垢劑是否被去除。本方法的獨(dú)特性需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，因?yàn)?，使用待?fù)合組成部分在其中以較之靜態(tài)透析管快得多的速度通過透析管的中空纖維技術(shù)相當(dāng)于或改進(jìn)了利用靜態(tài)透析袋緩慢透析7至10天而完成的將疫苗結(jié)構(gòu)復(fù)合成免疫原性物質(zhì)，這并不是顯而易見的。
因?yàn)楦鶕?jù)待非共價復(fù)合的組成部分的大小，所用濾膜的公稱分子量截留值可選自1,000,3,000,5,000,10,000,30,000,50,000或更大，該系統(tǒng)可以方便地改用于將天然或脫毒的脂多糖、脂質(zhì)體、肽、脂肽、脂糖、多糖、神經(jīng)節(jié)苷脂或跨膜、包被或天然或脫毒蛋白質(zhì)相互復(fù)合或與腦膜炎球菌外膜蛋白的蛋白體制劑復(fù)合。
生成的產(chǎn)品可以用作非腸胃道給藥或粘膜給藥的疫苗，即通過呼吸道或胃腸道，例如鼻腔、口腔，通過咽吸入、局部或直腸給藥。在所給的實(shí)施例中，蛋白體被證明與類志賀鄰單胞菌LPS非共價復(fù)合形成疫苗，該疫苗誘導(dǎo)對抵抗宋內(nèi)氏志賀氏菌病所必需的抗送內(nèi)氏志賀氏菌LPS應(yīng)答。
該方法分三階段預(yù)備操作；將蛋白體與兩親決定基例如類志賀鄰單胞菌LPS復(fù)合；然后進(jìn)行無菌過濾。
為了最好地傳遞多價疫苗，本發(fā)明證明最好的方法是單獨(dú)制備特定的疫苗，然后在同一天用兩種單獨(dú)制備的疫苗各自以其最佳濃度進(jìn)行免疫。也實(shí)踐或預(yù)見了其它可能性，例如在形成非共價復(fù)合體的過程中制備雜合體疫苗。


圖1用蛋白體-類志賀鄰單胞菌LPS疫苗進(jìn)行的鼻內(nèi)免疫劑量遞減的幾種制劑引發(fā)的血清IgG應(yīng)答。
圖2用蛋白體-類志賀鄰單胞菌LPS疫苗進(jìn)行的鼻內(nèi)免疫劑量遞減的幾種制劑引發(fā)的血清IgA應(yīng)答。
圖3蛋白體-類志賀鄰單胞菌LPS(抗宋內(nèi)氏志賀氏菌病)和蛋白體-弗萊克斯納氏志賀氏菌2a疫苗在同一天一起給藥或分開數(shù)周給藥產(chǎn)生了對宋內(nèi)氏志賀氏菌和弗萊克斯納氏志賀氏菌2a兩者的良好免疫原性。
圖4蛋白體-志賀氏菌LPS疫苗的免疫金標(biāo)記電子顯微照片顯示志賀氏菌LPS與蛋白體載體的結(jié)合。
圖5蛋白體-類志賀鄰單胞菌LPS疫苗在志賀氏菌病動物模型中抵抗致死性宋內(nèi)氏志賀氏菌性肺炎。
圖6用蛋白體-弗萊克斯納氏志賀氏菌2a LPS疫苗經(jīng)鼻腔或口腔免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生了血清中的抗志賀氏菌LPS IgG和IgA，和在腸洗液和肺洗液中的IgA，它們可在免疫后持續(xù)30至60天。
圖7用一劑或兩劑抗宋內(nèi)氏志賀氏菌的蛋白體-類志賀鄰單胞菌LPS疫苗，使用不同的疫苗量對人進(jìn)行鼻腔或口腔免疫誘導(dǎo)了抗志賀氏菌LPS IgA、IgG和IgM外周血ASC應(yīng)答，和血清、唾液和尿液抗體應(yīng)答。
圖8以非復(fù)合類志賀鄰單胞菌LPS上樣后HPLC流份中的LPS，以及通過上樣蛋白體-類志賀鄰單胞菌LPS疫苗后LPS與蛋白質(zhì)在HPLC流份中的共洗脫證明LPS與蛋白體蛋白質(zhì)的非共價復(fù)合。
圖9小鼠對腦膜炎球菌外膜蛋白-脫毒脂寡糖疫苗的殺菌抗體應(yīng)答，抗腦膜炎球菌株9162的幾何平均對數(shù)效價。
詳細(xì)說明實(shí)施例1該實(shí)施例詳細(xì)說明了蛋白體-類志賀鄰單胞菌疫苗的生成方法，其中包含約2至3克蛋白質(zhì)。通過適當(dāng)放大濾膜柱的容積和適當(dāng)增加處理量，該方法可相應(yīng)放大至使用多10至100倍的物質(zhì)量。通過使用具有截留待復(fù)合抗原的適當(dāng)分子量截留值的適當(dāng)大小的濾膜，本方法可以相應(yīng)地適用于將蛋白體與其它天然或脫毒脂多糖、脂質(zhì)體、肽、脂肽、脂糖、多糖、神經(jīng)節(jié)苷脂或跨膜、包被或天然或脫毒蛋白質(zhì)相互復(fù)合或與腦膜炎球菌外膜蛋白的蛋白體制劑復(fù)合。本方法使用的除垢劑之一為Empigen BB；該方法也可使用能夠溶解組成部分任何可透析除垢劑。該方法使用A/G Technology的濾柱，但也可使用任何其它品牌的柱式超濾/滲濾系統(tǒng)。
5.0.0.1預(yù)備操作5.0.0.1無菌過濾本方法中使用的30％Empigen BB除垢劑儲備液5.0.0.2制備2X TEEN/2％Empigen(0.1M Tris,0.02M EDTA二鈉，0.3M氯化鈉，WFI和2％Empigen,pH8.0)5.0.0.3為了透析去除除垢劑，制備150升(L)TNS溶液(Tris Normal Saline)，其中含有0.05M Tris,0.15M氯化鈉，pH8.0。
5.0.0.4制備用于UF濾柱清洗的10L氫氧化鈉。
5.0.0.5解凍所需量的類志賀鄰單胞菌2a脂多糖(LPS)。
5.0.1蛋白體與弗萊克斯納氏志賀氏菌2a LPS復(fù)合5.0.1.6在LPS中加入等體積的2X TEEN緩沖液，充分混合。
5.0.1.7解凍和稱量蛋白體總量，以毫克(mg)為單位，使之等于在步驟5中解凍的LPS量)。
5.0.1.8在每升蛋白體中加入30毫升經(jīng)無菌過濾的Empigen。充分混合并與步驟5中制備的LPS混合。
5.0.1.9將兩種組分充分混合。通常，在攪拌板和攪拌棒上15分鐘即可。
5.0.1.10為了透析去除除垢劑以形成蛋白體復(fù)合體，用公稱分子量截留孔徑為10,000的A/G Technology,Inc.制造的中空纖維濾柱與無菌二氧化硅管和一蠕動泵連接，構(gòu)建成一超濾系統(tǒng)(根據(jù)切向流技術(shù))。無菌壓力表被置于濾柱的進(jìn)料和出料側(cè)以監(jiān)測運(yùn)行過程中的壓力。在濾柱的出料側(cè)安置一背壓閥以調(diào)節(jié)背壓。
5.0.1.11清洗超濾系統(tǒng)并用WFF和0.5N NaOH在50℃滅菌60分鐘以上。該系統(tǒng)用WFI沖洗，在使用前用TNS緩沖液平衡。
5.0.1.12在線安置一無菌儲器，流入液從該儲器中抽入，返回的截留物返還到同一儲器中。隨著液體流經(jīng)柱狀濾膜(滲透或過濾)，通過直接添加和連續(xù)補(bǔ)料系統(tǒng)用TNS緩沖液將儲器重新充滿。將二氧化硅管與裝有TNS緩沖液的儲器和樣品儲器連通，然后密封，建立一連續(xù)進(jìn)料系統(tǒng)。隨著液體因過濾而流出樣品儲器，產(chǎn)生的真空將TNS緩沖液從其儲器中吸入樣品儲器。如果該系統(tǒng)保持氣密性，儲器中的樣品液位將保持恒定。
5.0.1.13啟動循環(huán)泵以開始滲濾。調(diào)節(jié)泵速和背壓閥，使得背壓為15±4psi。
5.0.1.14每流過10至15升取樣滲透液，利用Empigen沉淀素測試法進(jìn)行測試，由此證實(shí)Empigen BB的逐步去除。該測試包括連續(xù)稀釋滲透液和標(biāo)準(zhǔn)溶液，標(biāo)準(zhǔn)溶液中包含已知量的Empigen BB，在溶液中加入HCl進(jìn)行酸化，然后加入連續(xù)稀釋的SDS(十二烷基硫酸鈉)形成測試板型測試。當(dāng)Empigen與SDS等量時沉淀量最大。如此，記錄形成最大沉淀的SDS、滲透液和標(biāo)準(zhǔn)物的稀釋度就可確定Empigen的含量。隨著滲濾的進(jìn)行，Empigen含量越來越少，含有較少SDS的試管將成為沉淀最多的試管。沉淀可以通過用分光光度計在600納米處測定OD值來定量。
5.0.1.15對于本實(shí)施例中的組分用量，需連續(xù)滲濾至至少120升滲透液接受了處理，并且在Empigen沉淀素測試法中沒有明顯的沉淀(600納米處的最大OD值小于0.05)。
5.0.1.16滲濾之后需將產(chǎn)品成份濃縮至最終體積，使得OD280接近6.0。將系統(tǒng)排空，并用300至400毫升“TNS”緩沖液洗滌。將系統(tǒng)再次放空，將兩次的排放液合并。先用大量的WFI然后用0.5N NaOH在50℃再循環(huán)60分鐘以上，如此清洗濾柱。用WFI沖洗去NaOH，將該系統(tǒng)保存在0.01N NaOH中。
5.0.2無菌過濾5.0.2.17根據(jù)需要可以對復(fù)合體進(jìn)行無菌過濾。蛋白體濃度的調(diào)節(jié)可以在0.22微米的過濾之前或之后進(jìn)行。無菌過濾通常使用Millipore Corp.的過濾單元進(jìn)行。這類單元稱為Millipaks，它們具有不同的大小。在包裝操作之前將濾過液保存在4℃，并進(jìn)行無菌測試。
5.0.3.0特殊目的通過去除除垢劑將腦膜炎球菌外膜蛋白蛋白體的GMP制劑與弗萊克斯納氏志賀氏菌2a脂多糖組合成非共價復(fù)合體。
5.0.3.1應(yīng)用該GMP過程產(chǎn)生了大量蛋白體與弗萊克斯納氏志賀氏菌2a脂多糖的非共價復(fù)合體，可用作抗弗萊克斯納氏志賀氏菌2a感染的疫苗。
實(shí)施例2腦膜炎奈瑟氏球菌9162菌株的純化外膜蛋白(蛋白體)與堿脫毒的純化自8532菌株的腦膜炎奈瑟氏球菌L8脂寡糖的非共價復(fù)合。
5.1.0取出保存的批號為0136的9162外膜蛋白(蛋白體)與批號為0203的脫毒腦膜炎球菌L8脂寡糖(LOS)在室溫下解凍。將500毫克LOS溶解在無菌蒸餾水中形成的一定體積(182ml)的LOS液與400毫克蛋白質(zhì)溶解在0.05M Tris-HCl、0.15M NaCl、0.01M EDTA和0.1％Empigen BB中形成的一定體積的蛋白體溶液(306ml)混合。
5.1.2Empigen BB(30％溶液)經(jīng)0.22微米孔徑的濾膜進(jìn)行無菌過濾，在混合后的蛋白體和LOS溶液中加入六十分之一體積的該溶液，在室溫下攪拌1小時。
5.1.3使用A/G Technology分子量截留孔徑為3000的超濾柱UFP-3-C-6進(jìn)行超濾，由此去出蛋白體和LOS溶液中的除垢劑緩沖液，代之以無菌蒸餾水。
5.1.4裝置的搭建、滅菌、洗滌與實(shí)施例1中所述的相同。進(jìn)料壓力為15±4psi，滲透液的流速為每分鐘175毫升。
5.1.5每流過3至4升，用實(shí)施例1中所述的沉淀方法測試一次滲透液中的Empigen BB。超濾進(jìn)行至試驗(yàn)中無沉淀生成后再流過5升。收集總共37升滲透液。
5.1.6截留物是澄清的，經(jīng)0.22微米孔徑的濾膜無菌過濾并對蛋白質(zhì)和LOS進(jìn)行測試后，作為產(chǎn)物保存在4℃。
5.1.7將產(chǎn)物稀釋至每毫升0.2毫克蛋白質(zhì)，將NaCl濃度調(diào)節(jié)至0.15M。加入0.01％的Thimerasol作為防腐劑，形成的溶液在無菌條件下分裝到最終的小玻璃瓶中，貼上標(biāo)簽，保存于-70℃。
5.1.8以生理鹽水溶液和吸附在作為佐劑的氫氧化鋁上的形式給藥，在小鼠中測試該產(chǎn)品的免疫原性。結(jié)果如表1所示，表1中結(jié)果顯示，在通過腹膜內(nèi)注射對小鼠給藥時，疫苗復(fù)合體是免疫原性的。
表1．鼠對腦膜炎球菌外膜蛋白-脫毒脂寡糖疫苗的殺菌抗體應(yīng)答，抗腦膜炎球菌9162菌株的幾何平均對數(shù)效價

注在第0天和第28天對每組十個放養(yǎng)CD-1小鼠經(jīng)腹膜內(nèi)注射給藥。
5.1.9通過在復(fù)合前和復(fù)合后對蛋白體和LOS組分進(jìn)行柱色譜來檢驗(yàn)蛋白體與LOS的復(fù)合(圖9)。在Sephacryl S300低壓柱上對腦膜炎球菌L8 LOS和最終的蛋白體/LOS復(fù)合體進(jìn)行色譜分析。在0.05M Tris-HCl、0.01M EDTA、0.15MNaCl緩沖液中進(jìn)行柱色譜。對蛋白質(zhì)的分析為測定280納米處的吸光度，對LOS的分析是通過其對ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)的抑制，該方法中，L8單克隆抗體與吸附在塑料測試板上純化的L8 LOS的結(jié)合被來自Sephacryl柱的流份的連續(xù)稀釋液所抑制。在復(fù)合前LOS集中在流份39以寬峰從柱上洗出。復(fù)合后，LOS以集中在約流份33的峰與蛋白體共洗脫。
5.1.10特殊目的通過去除除垢劑將腦膜炎球菌外膜蛋白蛋白體的GMP制劑與脫毒腦膜炎球菌脂寡糖組合成非共價復(fù)合體。
5.1.11應(yīng)用該GMP過程產(chǎn)生了大量蛋白體與脫毒腦膜炎球菌脂寡糖的非共價復(fù)合體，可用作抗腦膜炎奈瑟氏球菌感染的疫苗。
實(shí)施例3本實(shí)施例又涉及蛋白體-類志賀鄰單胞菌疫苗的生產(chǎn)。該方法也可通過放大薄膜濾柱的容積和適當(dāng)增加處理量相應(yīng)地放大至使用10至1000倍物料。
5.8.1制備25毫升經(jīng)無菌過濾的Empigen BB(30％溶液)5.8.1.1用100毫升的、濾膜孔徑為0.2微米的Nalgene一次性過濾單元過濾約25毫升經(jīng)無菌過濾的Empigen BB(30％溶液)。
5.8.2制備4升含2％Empigen BB的TEEN 2X(包含0.1M Tris,0.02M EDTA二鈉，0.3M氯化鈉，WFI和2％Empigen BB溶液)。
5.8.3制備10升“TNS”溶液共15次，總體積達(dá)150升TNS包含0.15M氯化鈉，0.05M Tris緩沖液pH8.0±0.2。
5.8.4制備10升0.5N的氫氧化鈉。
5.8.6如果必要，解凍類志賀鄰單胞菌脂多糖(LPS)以備與蛋白體復(fù)合，記錄批號、LPS濃度、以毫克為單位的LPS的需用量和取出的LPS的計算體積。
5.9.0將蛋白體與類志賀鄰單胞菌脂多糖LPS復(fù)合5.9.1制備用于復(fù)合的LPS5.9.1.2將LPS等份匯集在潔凈、無菌、有刻度的5升瓶中。測定總體積，確定LPS的總量。
5.9.1.3與實(shí)施例5.9.1.2.中使用的LPS體積相同的2X TEEN緩沖液，測定合并后的總體積，然后加入一攪拌棒，用配套的攪拌棒和攪拌板攪拌15±2分鐘。
5.9.2制備用于復(fù)合的蛋白體5.9.2.1視需要記錄蛋白體自然解凍的總時間5.9.2.2將蛋白體等份匯集在潔凈、無菌的1升量筒中。測定總體積并確定蛋白體總量。
5.9.2.3將一定體積的蛋白體，其中以毫克計的含量與步驟5.9.1.2.中所用的相等，從步驟5.9.2.2.的量筒中轉(zhuǎn)移到另一潔凈、無菌、1升量筒中。
5.9.2.4在含有蛋白體的量筒中按每升蛋白體30毫升的量加入經(jīng)0.22微米過濾的30％Empigen BB。用攪拌棒混合15±2分鐘。
5.9.3蛋白體與類志賀鄰單胞菌LPS的復(fù)合5.9.3.1在緩慢攪拌的同時，將步驟5.9.3.2制備的蛋白體加入含有LPS的5升瓶中，然后攪拌15±2分鐘。
5.9.3.3取出1毫升樣品保存在-75℃，用于在以后利用Lowry法測定蛋白質(zhì)濃度和利用KDO測試測定LPS濃度。
5.9.4通過超濾/滲濾去出除垢劑5.9.4.1超濾系統(tǒng)的具體系統(tǒng)設(shè)置A/G Technology,Inc.中空纖維濾柱，10,000NMWC孔徑，容納體積為6，超濾柱。
注必需對新的濾柱進(jìn)行調(diào)試，沖洗去甘油。這可以通過在無背壓條件下用6升WFI沖洗6sq/ft或以下濾柱來進(jìn)行。不要將滲透液循環(huán)到進(jìn)料儲器中。
注各步超濾后都必需進(jìn)行清洗、滅菌和保存。新的濾柱必需在使用前進(jìn)行清洗和滅菌。
5.9.4.2搭建和滅菌A/G超濾系統(tǒng)。清洗和滅菌是通過用2-3升0.5N氫氧化鈉在50±5℃再循環(huán)至少60分鐘。用4至5升WFI沖洗系統(tǒng)，然后用2至3升TNS(0.05M Tris/普通生理鹽水，pH8.0±0.2)沖洗至少20±5分鐘。
5.9.4.3測定UF系統(tǒng)(包括試管)中的滯留體積，將充滿了液體的進(jìn)料管和出料管由儲器轉(zhuǎn)移到1升量筒中，然后將UF系統(tǒng)抽空。
5.9.4.4將一個側(cè)面有把手的2升容器放在洗槽中，在超濾過程中用微融的冰包裹。
5.9.4.5將1.7-1.9升步驟5.9.3.3.制備的蛋白體-LPS混合物轉(zhuǎn)移到該2升容器中。在容器上蓋上配有兩個10毫升滴管的兩孔塞，將超濾系統(tǒng)的進(jìn)料管和出料管與容器的滴管接通。
5.9.4.6開啟循環(huán)泵，將泵的設(shè)定開關(guān)調(diào)節(jié)至4-6。調(diào)節(jié)背壓夾，使進(jìn)料壓力為15±4psi。將總體積濃縮至1.0±0.1升，包括滯留體積。
5.9.4.7將1±0.1升步驟5.9.3.3.制備的混合物轉(zhuǎn)移到一個2升帶把手的容器中，重復(fù)步驟5.9.4.6。
5.9.4.8繼續(xù)步驟5.9.4.7中的轉(zhuǎn)移和步驟5.9.4.9中的濃縮，直至全部步驟5.9.3.3制備的蛋白體-LPS混合物被轉(zhuǎn)移到2升帶把手的容器中，而且包括滯留體積在內(nèi)的滯留物體積為1.4±0.2升。
5.9.4.10搭建超濾裝置，用于在液體透過濾膜流出時向2升帶把手的容器中連續(xù)補(bǔ)加TNS(0.05M Tris，一般生理鹽水)。用一10升瓶搭建一儲器，其中含有TNS，并配有一延伸至瓶底的管子。將超濾系統(tǒng)的進(jìn)料管和出料管接通。開啟循環(huán)泵，將泵的設(shè)定開關(guān)調(diào)節(jié)至4-6。調(diào)節(jié)背壓夾，使進(jìn)料壓力為15±4psi。
5.9.4.11測定UF單元的滲透液流速，并記錄測定時的進(jìn)料壓力。
5.9.4.12每處理12±0.5升收集15至20毫升滲透液樣品，貼上內(nèi)定標(biāo)簽(“滲透液No.P1、P2、P3之類”)并記錄時間、處理體積和樣品的最大OD600。利用Empigen BB沉淀素測試檢測樣品中的Empigen BB，由此驗(yàn)證Empigen被逐步去除。該測試包括分別連續(xù)稀釋滲透液和標(biāo)準(zhǔn)溶液，標(biāo)準(zhǔn)溶液中包含已知量的Empigen BB，在溶液中加入HCl進(jìn)行酸化，然后加入連續(xù)稀釋的SDS(十二烷基硫酸鈉)形成測試板型測試。當(dāng)Empigen與SDS等量時沉淀量最大。如此，記錄形成最大沉淀的SDS、滲透液的稀釋度并與標(biāo)準(zhǔn)物的稀釋度進(jìn)行比較就可確定Empigen的含量。隨著滲濾的進(jìn)行，Empigen含量越來越少，含有較少SDS的試管將成為沉淀最多的試管。沉淀可以通過用分光光度計在600納米處測定OD值來定量。
對于本實(shí)施例用的組分用量，連續(xù)超濾直至處理至少120升滲透液，并且在Empigen沉淀素測試中沒有明顯的沉淀(600納米處的最大OD值低于0.05)。
5.9.4.13將產(chǎn)物濃縮至500±50毫升的最終滯留物體積，其中包括滯留體積(步驟9.4.3)。取出0.5ml樣品，按1∶10稀釋樣品，測定OD280。
5.9.4.14濃縮滯留物的要求最小OD是5.7。如果OD低于5.7，繼續(xù)濃縮至400±50毫升，其中包括滯留體積(步驟5.9.4.3)，并再次測定OD280。
5.9.4.15當(dāng)滯留物從滯留物溶液中濾出并關(guān)閉出料管后，緩慢地逆向抽吸，直至濾柱和管路變空。將送料管和滯留物管從滯留物瓶轉(zhuǎn)移到一新的潔凈的容器中，其中含有350±50毫升TNS。反轉(zhuǎn)泵方向并緩慢地再循環(huán)TNS 2-3分鐘。
5.9.4.16 TNS再循環(huán)后，停泵，放空系統(tǒng)，將滯留物洗液收集在一潔凈、無菌的1升量筒中，測定體積和OD280。
5.9.4.17將原先的滯留物溶液(步驟5.9.4.12或5.9.4.13)與滯留物洗液(步驟5.9.4.15)合并，測定滯留物的最終體積。在無菌過濾前，一直將滯留物保存在4℃±2℃。
5.9.4.18用WFI，然后用0.5N氫氧化鈉在50±5℃的起始溫度清洗過濾單元至少60分鐘。用WFI沖凈清洗液，然后用3至4升作為保存劑的0.1NNaOH沖洗。
5.9.5無菌過濾根據(jù)需要，可以對復(fù)合體繼續(xù)無菌過濾。獲取蛋白體和LPS復(fù)合體產(chǎn)物并檢查是否有任何沉淀或渾濁。如果批量復(fù)合體產(chǎn)品是澄清的，用Millipak 40,0.22微米過濾單元將其過濾到一無菌、無熱源容器中。該步驟需在無菌櫥中進(jìn)行。
5.9.6特殊目的通過去除除垢劑將腦膜炎球菌外膜蛋白蛋白體的GMP制劑與類志賀鄰單胞菌脂多糖組合成非共價復(fù)合體。
5.9.7應(yīng)用該GMP過程產(chǎn)生了大量蛋白體與類志賀鄰單胞菌2a脂多糖的非共價復(fù)合體，可用作抗宋內(nèi)氏志賀氏菌感染的疫苗。
5.10免疫原性研究5.10.1用中空纖維超濾/滲濾制備的蛋白體-類志賀鄰單胞菌LPS疫苗的免疫原性在測試所用的最低極限劑量，利用中空纖維(HF)超濾技術(shù)去除除垢劑并促進(jìn)復(fù)合制備而成的三種不同的志賀氏菌LPS疫苗(HF-1、HF-2和GMP/HF-3)比簡單的透析法制得的制劑(DT)更有效。換言之，與利用低效已有技術(shù)制備的疫苗相比，本發(fā)明方法制備的疫苗所激發(fā)的IgG(圖1)和IgA(圖2)免疫應(yīng)答更強(qiáng)。因?yàn)楦鼜?qiáng)的免疫應(yīng)答將產(chǎn)生更好的保護(hù)作用，所以以上數(shù)據(jù)清楚地表明，本發(fā)明提供了不僅生產(chǎn)效率更高而且效力更強(qiáng)的疫苗。而且，較強(qiáng)的免疫應(yīng)答是在最低劑量給藥(每劑0.1微克)時激發(fā)的，由此表明，與已有技術(shù)相比，使用本發(fā)明所需的疫苗較少。由于在制備多價疫苗時需要多種不同的抗原，所以為了盡可能減少疫苗的給藥總量，使用在低劑量時有效的疫苗組成成份具有極大的優(yōu)越性。所以，本發(fā)明利用中空纖維技術(shù)生產(chǎn)疫苗的方法直接提高了配制具有廣譜特異性的多價疫苗的能力。因?yàn)闉榱斯I(yè)化地開發(fā)疫苗，最好能夠?qū)⒁呙缋鋬龈稍?，我們欣喜地發(fā)現(xiàn)，從水溶液中冷凍干燥HF疫苗生成的疫苗仍然能夠激發(fā)屬于所有被測劑量中最高水平的應(yīng)答。所以，在使用0.1微克HF技術(shù)制備的疫苗(進(jìn)行或不進(jìn)行冷凍干燥)給藥時，可觀測到較強(qiáng)的抗LPS IgG(圖1)和IgA(圖2)免疫原性。以上數(shù)據(jù)十分重要，因?yàn)樵趫D1和圖2中用交差線立柱GMP/HF-3表示的本發(fā)明方法的放大和GMP過程使用了該HF技術(shù)。
5.10.2使用多價疫苗的免疫原性研究如圖3所示，在同一天或相隔數(shù)周給藥蛋白體-類志賀鄰單胞菌LPS(抗宋內(nèi)氏志賀氏菌病)疫苗和蛋白體-弗萊克斯納氏志賀氏菌2a疫苗均產(chǎn)生了對以上兩種LPS組分，即宋內(nèi)氏志賀氏菌LPS和弗萊克斯納氏志賀氏菌2aLPS的良好的免疫原性。
5.11蛋白體-志賀氏菌疫苗的電子顯微照片圖4的電子顯微照片清楚地顯示了志賀氏菌LPS與蛋白體的結(jié)合。圖中，蛋白體載體為突出的不透射線的黑色斑點(diǎn)。這些斑點(diǎn)是與第二抗體連接的金顆粒，這些抗體識別特異性的抗志賀氏菌LPS抗體。所以，金顆粒斑點(diǎn)的存在表明有志賀氏菌LPS存在。可以看出，金顆粒斑點(diǎn)包圍并標(biāo)記了蛋白體載體，所以可以由此證實(shí)并看到由LPS與蛋白體非共價連接而成的蛋白體疫苗的圖象。出人意料的是，在利用電子顯微技術(shù)對用已有技術(shù)制備的DT制劑進(jìn)行檢測時，沒有發(fā)現(xiàn)利用本發(fā)明HF技術(shù)制得的疫苗都有的泡性特征(非公開結(jié)果)。
5.12蛋白體-類志賀鄰單胞菌LPS疫苗在志賀氏菌病動物模型中保護(hù)動物抵抗致死性宋內(nèi)氏志賀氏菌性肺炎。
從圖5中可以看出，根據(jù)用活菌誘導(dǎo)致死性肺炎的志賀氏菌病動物模型中的測定結(jié)果，蛋白體-類志賀菌鄰單胞菌LPS疫苗都為動物提供了極顯著的抗致死性類志賀菌鄰單胞菌感染保護(hù)。以上數(shù)據(jù)還證明，不僅是因蛋白體-類志賀菌鄰單胞菌LPS疫苗而產(chǎn)生的相應(yīng)保護(hù)性抗體，而且該鼻內(nèi)使用的亞基疫苗也能夠抵抗致死性肺炎。
5.13用蛋白體-弗萊克斯納氏志賀氏菌2a LPS疫苗經(jīng)鼻腔或口腔免疫誘導(dǎo)血清中的抗志賀氏菌LPS IgG和IgA和腸及肺洗液中的IgA，它們均可在免疫后保持30至60天。
如圖6所示，用蛋白體-弗萊克斯納氏志賀氏菌2a LPS疫苗進(jìn)行的兩種免疫在血清和肺及腸分泌液中誘導(dǎo)的抗體均可在免疫后保持30至60天。以上數(shù)據(jù)表明，蛋白體疫苗可以刺激一般粘膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體，甚至是在遠(yuǎn)離免疫位點(diǎn)的地方。具體地說，鼻腔免疫可以誘導(dǎo)產(chǎn)生腸分泌液中的抗體，反過來也一樣。這一能力將蛋白體疫苗的潛在用途推廣到可用于抵抗病原體通過全身各種粘膜通道侵染宿主。
5.14圖7顯示，用不同的疫苗量，以抗宋內(nèi)氏志賀氏菌的蛋白體-類志賀鄰單胞菌LPS疫苗對人志愿者進(jìn)行1次或2次鼻腔或口腔免疫后誘導(dǎo)了抗志賀氏菌LPS IgA、IgG和IgM外周血ASC應(yīng)答和血清、唾液及尿液中的IgA和IgG抗體應(yīng)答。如圖所示，最高劑量在全部6個志愿者中都激發(fā)了應(yīng)答，即鼻腔免疫激發(fā)劑量依賴性應(yīng)答。
疫苗在鼻腔組的每個志愿者中都激發(fā)了IgA、IgG和IgM血清應(yīng)答。此外，強(qiáng)抗體分泌細(xì)胞ASC應(yīng)答被誘導(dǎo)，表明粘膜免疫激發(fā)了抗體分泌細(xì)胞-尤其是IgA分泌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。最重要的是，在唾液、尤其是尿液中也發(fā)現(xiàn)了IgA應(yīng)答，這表明分泌性IgA是在粘膜表面產(chǎn)生的(因?yàn)?，IgA不能透過腎，尿液中的IgA反映抗體的就地分泌，而且表明該鼻腔疫苗還產(chǎn)生局部性腸IgA，因而，鼻腔疫苗可用于抵抗革蘭氏陰性菌引起的尿路感染。)。值得注意的是，在僅進(jìn)行一次免疫后就可發(fā)現(xiàn)這些ASC和抗體應(yīng)答的主反應(yīng)，這表明可能沒有必要加強(qiáng)免疫。在口腔免疫后也發(fā)現(xiàn)了IgA和IgG的ASC應(yīng)答以及尿液IgA應(yīng)答?？谇粍┬偷淖钣行в猛究赡苁窃诒匾獣r用作鼻腔初次免疫后的加強(qiáng)免疫。
5.15圖8證明了多分子蛋白體蛋白與LPS的非共價復(fù)合。該圖顯示，在使用非復(fù)合類志賀鄰單胞菌LPS后HPLC流份中的LPS在色譜柱洗脫曲線中出現(xiàn)在與使用蛋白體-LPS疫苗后的不同部分。對應(yīng)于蛋白體最大蛋白質(zhì)凝聚的峰可證明使用蛋白體-類志賀鄰單胞菌LPS疫苗后LPS和蛋白質(zhì)在HPLC流份中的共洗脫。對以上結(jié)果進(jìn)行了測定，用ELISA抑制定量LPS，用A280處的OD值定量蛋白體蛋白。HPLC色譜柱是Tosohaas G50000Pwxl，箭頭表示分子量標(biāo)準(zhǔn)物。
權(quán)利要求
1．一種制備蛋白體-兩親決定基疫苗的方法，它包括a)制備蛋白體、可透析除垢劑和兩親決定基的混合物，b)滲濾或超濾混合物以去除除垢劑，并由此形成兩親決定基-蛋白體復(fù)合體，c)監(jiān)測兩親決定基-蛋白體復(fù)合體的形成量，d)回收兩親決定基-蛋白體復(fù)合體。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備蛋白體-兩親決定基疫苗的方法，其中的超濾采用切向流。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備蛋白體-兩親決定基疫苗的方法，其中的超濾在選自以下組的系統(tǒng)中進(jìn)行中空纖維濾柱、平面式濾膜和濾膜濾柱。
4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備蛋白體-兩親決定基疫苗的方法，其中的超濾系統(tǒng)是NMWC孔徑為10,000的中空纖維濾柱。
5．根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備蛋白體-兩親決定基疫苗的方法，其中的超濾系統(tǒng)是NMWC孔徑為3,000的中空纖維濾柱。
6．根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備蛋白體-兩親決定基疫苗的方法，其中對可透析除垢劑的監(jiān)測采用連續(xù)檢測透析液樣品。
7．根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備蛋白體-兩親決定基疫苗的方法，其中的監(jiān)測包括測定透析液或滯留物樣品的光密度。
8．根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備蛋白體-兩親決定基疫苗的方法，其中的監(jiān)測涉及將透析液樣品與已知量的SDS(十二烷基硫酸鈉)混合，在有除垢劑存在時就會形成沉淀，并測定沉淀量。
9．根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備蛋白體-兩親決定基疫苗的方法，其中在透析液中的除垢劑被基本清除后回收LPS-蛋白體復(fù)合體。
10．根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備蛋白體-兩親決定基疫苗的方法，其中的除垢劑是Empigen BB。
11．根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備蛋白體-兩親決定基疫苗的方法，其中的兩親決定基是脂多糖。
12．根據(jù)權(quán)利要求11所述的制備蛋白體-脂多糖疫苗的方法，其中的脂多糖來自革蘭氏陰性菌。
13．根據(jù)權(quán)利要求12所述的制備蛋白體-脂多糖疫苗的方法，其中的革蘭氏陰性菌是鄰單胞菌。
14．根據(jù)權(quán)利要求13所述的制備蛋白體-脂多糖疫苗的方法，其中的鄰單胞菌是類志賀鄰單胞菌。
15．根據(jù)權(quán)利要求12所述的制備蛋白體-脂多糖疫苗的方法，其中的革蘭氏陰性菌是志賀氏菌。
16．根據(jù)權(quán)利要求15所述的制備蛋白體-脂多糖疫苗的方法，其中的志賀氏菌是弗萊克斯納氏志賀氏菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌或鮑伊德氏志賀氏菌。
17．根據(jù)權(quán)利要求12所述的制備蛋白體-脂多糖疫苗的方法，其中的革蘭氏陰性菌是奈瑟氏菌。
18．根據(jù)權(quán)利要求17所述的制備蛋白體-脂多糖疫苗的方法，其中的奈瑟氏菌是腦膜炎奈瑟氏球菌。
19．根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備蛋白體-兩親決定基疫苗的方法，其中的蛋白體來自腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏菌。
20．根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備蛋白體-兩親決定基疫苗的方法，其中在經(jīng)監(jiān)測的除垢劑的清除速度降低或恒定后再回收LPS-蛋白體復(fù)合體。
21．根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備蛋白體-兩親決定基疫苗的方法，它還包括e)將回收得到的蛋白體-兩親決定基復(fù)合體與藥學(xué)上認(rèn)可的載體混合，形成疫苗。
22．根據(jù)權(quán)利要求21所述的制備蛋白體-兩親決定基疫苗的方法，它還包括在回收前濃縮LPS-蛋白體復(fù)合體。
23．根據(jù)權(quán)利要求22所述的制備蛋白體-兩親決定基疫苗的方法，其中的濃縮持續(xù)至達(dá)到要求的最終濃度。
24．根據(jù)權(quán)利要求21所述的制備蛋白體-兩親決定基疫苗的方法，用不同的兩親決定基實(shí)施其中的方法，形成一系列的蛋白體-兩親決定基復(fù)合體，并在步驟e)中組裝成多價疫苗。
25．利用權(quán)利要求24所述的方法制備的多價疫苗。
26．一種抵抗疾病的方法，它包括給受體使用有效量的權(quán)利要求25所述的疫苗。
27．一種抵抗疾病的方法，它包括給受體使用權(quán)利要求21所述的方法制備的疫苗。
28．利用權(quán)利要求21所述的方法制備的多價疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用滲濾或超濾技術(shù)制備適用于非腸胃或粘膜給藥的多價蛋白體－兩親決定基疫苗的方法,這樣的兩親決定基包括來自革蘭氏陰性菌,例如弗萊克斯納氏志賀氏菌、類志賀鄰單胞菌和宋內(nèi)氏志賀氏菌的脂多糖。其中的蛋白體來自B族2b型腦膜炎球菌。利用去除除垢劑的滲濾或超濾來形成疫苗中的活性蛋白體－兩親決定基復(fù)合體(非共價復(fù)合體)。使用滲濾或超濾技術(shù)減少了處理時間和污染的可能性,進(jìn)而允許使用環(huán)境溫度和進(jìn)行有效的規(guī)模放大。此外,該方法能夠?qū)ν肝鲆哼M(jìn)行可靠而連續(xù)的監(jiān)測,由此提高了整個過程的效率。生產(chǎn)一批疫苗的透析時間由7至10天以上減少至72小時以下,通常在48或24小時以內(nèi)。使用該方法使得各種抗原性組分以最優(yōu)的形式存在于多價疫苗制劑中。
文檔編號A61P31/04GK1211192SQ9619761
公開日1999年3月17日 申請日期1996年9月18日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月18日
發(fā)明者G·H·洛厄爾, W·D·佐林格, J·F·伍德 申請人:美國陸軍醫(yī)療材料研究指揮部, G·H·洛厄爾