專利名稱：3′－單磷酸化寡核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及修飾的寡核苷酸，尤指磷酸化修飾的寡核苷酸。
寡核苷酸包括反義寡核苷酸、抗基因寡核苷酸(亦稱三螺旋形成寡核苷酸)等可用于抑制基因的表達(dá)，是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新的治療方法(Wagner，RW，Nature，1994，372，333-335；Crook，ST，Annu．Rev．Pharmacol．Toxical1992，32，329-376；Helene，C，Eur．J．Cancer，1994，30A，1721-1726；Crooke，ST，Antisense Nucleic acids Drug Dev1996，6，141-147．)。其作用機(jī)制包括阻遏病毒基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯，也可阻遏人體內(nèi)有害基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，以及通過(guò)體內(nèi)的RNase H酶的作用使靶RNA降解，是一類專一性高、毒副作用小的治療藥物。目前已進(jìn)入臨床試驗(yàn)的反義寡核苷酸有抗HIV的GEM91(Ⅱ期)，抗炎癥的ISIS2302(Ⅱ期)，抗癌癥的ISIS3521(Ⅰ期)及ISIS5132(Ⅰ期)，抗艾滋病患者的CMV視網(wǎng)膜炎的ISIS2922(Ⅲ期)，治療慢性髓性白血病的LR-3001(Ⅰ期)等(Genetic EngineeringNews，1996，16，29-34)。
由于寡核苷酸片段進(jìn)入人體后，易受到人體內(nèi)酶系統(tǒng)的作用而被降解，即進(jìn)入人體的寡核苷酸未達(dá)到靶器官、靶細(xì)胞就被降解因而不能達(dá)到預(yù)期的治療效果(Hoke，G．Det al．Nucleic Acids Res1991，19，5734-5748)。因此，提高寡核苷酸的穩(wěn)定性，尤其是提高其抗酶解能力顯得非常關(guān)鍵，這樣，不僅可以提高療效、減少藥品用量，亦可進(jìn)一步降低治療成本和減少副作用。
為了提高寡核苷酸的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其在人體內(nèi)的半衰期，人們采用不同的方法對(duì)寡核苷酸進(jìn)行了一系列的化學(xué)修飾和結(jié)構(gòu)改造，已有許多文獻(xiàn)報(bào)道，例如采用硫磷酸二酯鍵代替磷酸二酯鍵的方法(WO 9115500，1991)；將兩個(gè)寡核苷酸片段以3＇與3＇相連，或5＇與5＇相連(EP 464638，1992)等。目前，反義寡核苷酸大多采用化學(xué)修飾方法來(lái)增加其穩(wěn)定性，在諸多化學(xué)修飾中，硫磷酸修飾被認(rèn)為是最理想的一種。但是，它必竟是非天然的，進(jìn)入細(xì)胞后異質(zhì)性大。而且其合成價(jià)格也比非修飾的寡核苷酸高，其化學(xué)穩(wěn)定性也不如天然的磷酸二酯鍵。硫磷酸修飾寡核苷酸還具有非專一性作用，它能與細(xì)胞內(nèi)的一些重要的蛋白質(zhì)相結(jié)合，影響細(xì)胞的信號(hào)傳遞及其他生物功能；它具有很強(qiáng)的免疫原性，可以刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)；另一方面，采用硫磷酸二酯鍵替代物，在體內(nèi)的代謝降解產(chǎn)物亦可能對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用(Stein CA，Trends in Biotechnology，1996，14，147-149)。為了尋找更好的修飾方法，本發(fā)明進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。
本發(fā)明的目的是提供一種3＇-單磷酸化寡核苷酸，以增加寡核苷酸穩(wěn)定性，降低毒副作用。
本發(fā)明提供一種3＇-單磷酸化寡核苷酸，其結(jié)構(gòu)式可用5＇d(NNN……NNN)p3＇或oligo(dN)-3＇P表示，式中N=A、G、C、T；p3＇或3＇P=3＇為單磷酸基團(tuán)。它是采用3＇-磷酸固相柱(3＇-phosphate CPG Glen Research公司產(chǎn)品，全稱2-[2-(4，4-二甲氧基三苯甲氧基)乙磺酰]乙基-丁二酰長(zhǎng)鏈烷基胺-微孔玻璃珠(2-[2-(4，4-Dimethoxy trityloxy)ethylsulfomyl]ethyl-succinoyl long chain alkylamino-CPG))，在ABI 391EP DNA合成儀上合成，經(jīng)濃氨水脫去保護(hù)基得3＇-單磷酸化寡核苷酸。
為了顯示本發(fā)明3＇-單磷酸化寡核苷酸對(duì)酶降解的穩(wěn)定性，用蛇毒磷酸二酯酶代表體內(nèi)的3＇→5＇核酸外切酶，用DNase Ⅰ代表體內(nèi)的內(nèi)切核酸酶在體外比較了不修飾的寡核苷酸、3＇-單磷酸化寡核苷酸、硫磷酸修飾的寡核苷酸及3＇部分硫磷酸修飾的寡核苷酸對(duì)3＇→5＇核酸外切酶和內(nèi)切核酸酶的穩(wěn)定性，進(jìn)一步還比較了它們?cè)谘逯屑凹?xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)3＇-磷酸化修飾的寡核苷酸片段具有抗蛇毒磷酸二酯酶的性質(zhì)，在血清中和細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性明顯高于3＇不修飾的或3＇部分硫磷酸修飾的寡核苷酸，略高于硫磷酸修飾的寡核苷酸。而且，3＇-磷酸化修飾不影響寡核苷酸進(jìn)入細(xì)胞的速度，這一點(diǎn)優(yōu)于硫磷酸修飾的寡核苷酸。上述結(jié)果說(shuō)明血清和細(xì)胞中主要存在的是3＇→5＇外切核酸酶，而該酶作用時(shí)需提供具有3＇-OH的底物，當(dāng)寡核苷酸3＇OH基團(tuán)被磷酸化后，就不能作為3＇→5＇外切核酸酶的底物，因而能抗3＇→5＇外切核酸酶作用，延長(zhǎng)了在人體血清中的滯留時(shí)間，能夠更有效地被運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞中。在細(xì)胞甲由于3＇-單磷酸化寡核苷酸穩(wěn)定性高，因此能更有效地與目的基因的互補(bǔ)序列相結(jié)合。
3＇-單磷酸化寡核苷酸只有被磷酸單酯酶切去3＇磷酸后才能被3＇→5＇外切核酸酶降解。3＇-單磷酸化寡核苷酸在血清中和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高，表明在血清中和細(xì)胞內(nèi)磷酸單酯酶活性不高。
此外，由于DNA復(fù)制時(shí)需要3＇為OH的引物，3＇-單磷酸化寡核苷酸引物一旦與DNA結(jié)合還能阻遏病毒DNA的復(fù)制或RNA反轉(zhuǎn)錄。目前在使用的反義寡核苷酸中大多是硫磷酸修飾的、3＇為OH的寡核苷酸，它沒(méi)有阻遏病毒DNA復(fù)制或RNA反轉(zhuǎn)錄的作用。3＇-單磷酸化寡核苷酸對(duì)正常的堿基配對(duì)沒(méi)有影響，因此能夠保證這種經(jīng)修飾的寡核苷酸正確地、專一地與靶DNA或RNA配對(duì)。概括而言，依據(jù)病毒或腫瘤基因等有害基因DNA或RNA特定順序而設(shè)計(jì)的、3＇-單磷酸化寡核苷酸片段能夠?qū)Ｒ坏嘏c靶DNA或RNA結(jié)合，阻遏病毒DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯，也可阻遏人體內(nèi)有害基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，也可利用體內(nèi)RNaseH使被3＇-單磷酸化寡核苷酸結(jié)合的靶RNA降解。因此，由于上述作用機(jī)制和優(yōu)越的性能，3＇-單磷酸化寡核苷酸有更多的生物功能。另外的針對(duì)乙型肝炎病毒設(shè)計(jì)的一種反義寡核苷酸的研究證明，3＇-單磷酸化修飾比不修飾的寡核苷酸對(duì)于乙型肝炎病毒基因表達(dá)的抑制作用強(qiáng)一倍以上。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明中提供的3＇-單磷酸化寡核苷酸具有比硫磷酸修飾的寡核苷酸還要高的穩(wěn)定性和容易被細(xì)胞攝取的優(yōu)點(diǎn)。而且，由于磷酸基團(tuán)為天然核酸中固有成份，因此采用磷酸基團(tuán)作為修飾基團(tuán)并沒(méi)有引入非天然的修飾成份，其代謝降解產(chǎn)物無(wú)任何毒副作用，因此，與其它化學(xué)修飾方法相比使用時(shí)更為安全，其綜合性能優(yōu)于目前應(yīng)用最廣的硫磷酸取代的寡核苷酸。3＇-單磷酸化寡核苷酸能專一地與靶DNA或RNA結(jié)合，阻遏病毒DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。因此，3＇-單磷酸化寡核苷酸有望成為一種臨床上有效的藥物。
本發(fā)明通過(guò)以下附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步闡述，但并不限止本發(fā)明的范圍。


圖1四種寡核苷酸片段對(duì)蛇毒磷酸二酯酶降解的抗性圖2四種寡核苷酸片段對(duì)DNaseⅠ降解的抗性圖3四種寡核苷酸片段在40％人血清中的穩(wěn)定性圖4四種寡核苷酸片段在HeLa細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性圖5四種寡核苷酸片段在HeLa細(xì)胞漿中的濃度圖6四種寡核苷酸片段在HeLa細(xì)胞核內(nèi)的濃度實(shí)施例1 3＇-單磷酸化寡核苷酸片段和其它實(shí)驗(yàn)用寡核苷酸片段的合成利用ABI公司的391EP DNA合成儀合成下列四種寡核苷酸片段，其DNA順序結(jié)構(gòu)及3＇端修飾情況如下①3＇OH5＇d(ATAGGGGCAT)3＇②3＇P 5＇d(ATAGGGGCAT)p3＇③SP5＇d(A*T*A*G*G*G*G*C*A*G*A)3＇④3SP5’d(TTGAGGATGGAGCCCTGGA*C*C*A)3＇*代表硫磷酸二酯鍵位置第①條寡核苷酸的3＇為OH基團(tuán)；第②條寡核苷酸的3＇為單磷酸基團(tuán)；第③條寡核苷酸為全部核苷酸之間通過(guò)硫磷酸二酯鍵相連，3＇為OH基團(tuán)；第④條寡核苷酸的3＇端有三個(gè)硫磷酸二酯鍵，其余為磷酸二酯鍵，3＇為OH基團(tuán)。
第②條3＇-單磷酸化寡核苷酸使用0．2μmole 3＇磷酸固相柱(3＇-phosphate CPG Glen Research公司產(chǎn)品，全稱2-[2-(4，4-二甲基三苯甲氧基)乙磺酰]乙基-丁二酰長(zhǎng)鏈烷基胺-微孔玻璃珠(2-[2-(4，4-Dimethoxytrityloxy)ethylsulfomyl]ethyl-succinoyl long chain alkylamino-CPG))，在ABI391EP DNA合成儀上用0．2μmole合成順序合成。第①條3＇為OH的寡核苷酸用0．2μmole dT固相柱(Glen Research產(chǎn)品)，用相同的合成順序合成。第③條、第④條用dA固相柱(Glen Research產(chǎn)品)，用相同的合成順序合成，只有在硫磷酸修飾的位置用硫化試劑替代氧化試劑(參見(jiàn)Iyer，RT，et al.J．Org．Chem．1990，55，4693-4699)，其余均相同。合成結(jié)束后，取出掛有寡核苷酸的載體，用濃氨水55℃處理15小時(shí)脫去保護(hù)基，吸出溶液，真空濃縮至干，重新溶解于200μl 50％甲酰胺中，經(jīng)7 mol／L尿素-20％聚丙烯酰胺凝膠電泳純化，紫外燈下割帶，重蒸水浸泡，透析去鹽，濃縮后-20℃保存。測(cè)A260，計(jì)算產(chǎn)物量。
實(shí)施例2 對(duì)蛇毒磷酸二酯酶降解的穩(wěn)定性實(shí)施例1中所得到的四種寡核苷酸片段(3＇OH，3＇P，SP，3SP)分別用T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)在其5＇端標(biāo)記上32P，取50 pmol寡核苷酸片段，加50μCi[γ-32p]-ATP，2單位T4多聚核苷酸激酶，1μl 10倍緩沖液，加雙蒸水至1Oμl，37℃保溫1小時(shí)，同實(shí)施例1一樣，用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法純化標(biāo)記的寡核苷酸，分別加入未標(biāo)記的寡核苷酸至終濃度為5μmol／L，加蛇毒磷酸二酯酶至100μU／ml，緩沖液為1O mmol／L Tris-HCl，50 mmol／LMgCl2，0．1％牛血清白蛋白(BSA)，pH8．0，37℃保溫，在0、0．5、1、1．5、2、4、8、12、24小時(shí)各取5μl，加等體積上樣緩沖液(98％甲酰胺，10mmol／L EDTA，0．025％二甲苯藍(lán)FF，0．025％溴酚藍(lán))混勻，用7 mol／L尿素-20％聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。結(jié)果顯示，3＇-單磷酸化寡核苷酸、全硫磷酸修飾的寡核苷酸以及3＇端三個(gè)硫磷酸二酯鍵的寡核苷酸對(duì)于蛇毒磷酸二酯酶的抗性作用相近，它們對(duì)蛇毒磷酸二酯酶的抗性都比3＇-OH的寡核苷酸要高許多，表現(xiàn)出顯著差異。見(jiàn)圖1。
實(shí)施例3 對(duì)DNase Ⅰ(內(nèi)切核酸酶)降解的穩(wěn)定性同實(shí)施例2一樣制得32P標(biāo)記的四種寡核苷酸，在其中分別加入未標(biāo)記的寡核苷酸至終濃度為5μmol／L，加DNase Ⅰ至100 U/ml，緩沖液為10 mmol／LTris-HCl，5 mmol／L MgCl2，0．1％BSA，pH 8．0，37℃保溫，在0、0．5、1、1．5、2、4、8、12、24小時(shí)各取5μl，加等體積上樣緩沖液混勻，用7 mol／L尿素-20％聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。結(jié)果顯示，3＇-單磷酸化寡核苷酸對(duì)于DNase Ⅰ降解的穩(wěn)定性略低于全硫磷酸修飾的寡核苷酸，但明顯高于3＇-OH寡核苷酸和3＇端三個(gè)硫磷酸二酯鍵的寡核苷酸，而其中3＇端三個(gè)硫磷酸二酯鍵的寡核苷酸對(duì)DNase Ⅰ的作用特別敏感。見(jiàn)圖2。
實(shí)施例4 在40％人血清體系中的穩(wěn)定性同實(shí)施例2一樣制得32P標(biāo)記的四種寡核苷酸，在其中分別加入未標(biāo)記的寡核苷酸至終濃度為5μmol／L，加人血清至終濃度為40％，37℃保溫，在0、0．5、1、1．5、2、4、8、12、24小時(shí)各取5μl，加等體積上樣緩沖液混勻，用7 mol／L尿素-20％聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。結(jié)果顯示，3＇-單磷酸化寡核苷酸穩(wěn)定性最好，反應(yīng)24小時(shí)后還留有近一半的量，明顯高于其他幾種結(jié)構(gòu)的寡核苷酸，3＇-OH的寡核苷酸在此體系中穩(wěn)定性最差。見(jiàn)圖3實(shí)施例5 在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性在35mm培養(yǎng)皿中接種2×105HeLa細(xì)胞，加1．5ml細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM含10％小牛血清)，于37℃5％CO2生長(zhǎng)到培養(yǎng)孔面積的40％-60％，吸去培養(yǎng)液，分別加入200μl 5＇P-32標(biāo)記的3＇OH、3＇P、SP或3SP轉(zhuǎn)染混合液(含4μl Lipofectin，3＇OH、3＇P、SP或3SP 0．2μmol/L)，5小時(shí)后，吸干轉(zhuǎn)染混合液，加入2 ml含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)，并于5，12，24，36，48，72小時(shí)消化細(xì)胞，離心沉淀細(xì)胞，用酸性溶液洗去細(xì)胞表面的寡核苷酸(參見(jiàn)Gao WY，et al．J．Biol．Chem．1990，265，20172-20178；Lappalainen K．et al．Biochim．Biophys．Acta，1994，1196，201-208)，加1ml TES液(20 mmol／L Tris-HCl pH 8．0，10 mmol／L EDTA，1％SDS)，于室溫10分鐘裂解細(xì)胞，用有機(jī)混合溶劑(苯酚∶氯仿∶異戊醇=50∶48∶2)抽提兩次，加2倍無(wú)水乙醇沉淀DNA，加10μl蒸餾水溶解，7mol／L尿素-15％聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影，然后，做黑度掃描，并以寡核苷酸轉(zhuǎn)染5小時(shí)的時(shí)候，HeLa細(xì)胞中全長(zhǎng)寡核苷酸的含量為100％，比較在不同培養(yǎng)時(shí)間后細(xì)胞中所保留的全長(zhǎng)寡核苷酸的百分比。結(jié)果顯示在HeLa細(xì)胞中，3＇P的穩(wěn)定性要明顯高于3SP及3＇OH，SP穩(wěn)定性也較高，見(jiàn)圖4。
實(shí)施例6 在細(xì)胞內(nèi)的分布在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種5×104HeLa細(xì)胞，加0．5ml細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM含10％小牛血清)，于37℃，5％CO2生長(zhǎng)到培養(yǎng)孔面積的40％-60％，吸去培養(yǎng)液，分別加入100μl 5＇-32P標(biāo)記的3＇OH、3＇P、SP或3SP轉(zhuǎn)染混合液(含4μl Lipofectin，3＇OH、3＇P、SP或3SP 0．2μ mol/L)，每個(gè)樣品重復(fù)三份，5小時(shí)后加入400μl含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)，并于0，2，4，8，18，24，30小時(shí)吸去培養(yǎng)液，用0．5mlPBS洗一次，再用100μl胰酶消化6分鐘，然后加100μl含10％小牛血清的DMEM，細(xì)胞計(jì)數(shù)三次，取平均值，5000轉(zhuǎn)／分離心1分鐘沉淀細(xì)胞，同實(shí)施例5用酸性溶液洗去細(xì)胞表面的寡核苷酸然后分離細(xì)胞漿及細(xì)胞核(參見(jiàn)Weintraub H，et al．Cell 1983，32，1191-1203)，胞漿及胞核分別測(cè)定同位素放射性強(qiáng)度。計(jì)算3＇OH，3＇P，SP和3SP于不同時(shí)間在胞漿及胞核中的含量，三次的重復(fù)數(shù)據(jù)取平均值。3＇OH，3＇P，SP和3SP四種寡核苷酸在細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)的濃度見(jiàn)圖5和圖6。在實(shí)驗(yàn)的條件下，3＇OH，和3＇P進(jìn)細(xì)胞比SP和3SP快，SP進(jìn)細(xì)胞較慢，3SP最慢。除3SP較長(zhǎng)以外，3＇OH與3＇P長(zhǎng)度相同，SP多一個(gè)核苷酸。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，3＇-單磷酸化修飾并不影響其進(jìn)細(xì)胞速度。
權(quán)利要求
1．一種3＇-單磷酸化寡核苷酸，其特征在于其結(jié)構(gòu)式可表示為5＇d(NNN……NNN)p3＇或oligo(dN)-3＇P，式中N=A、G、C、T；p3＇或3＇P=3＇為單磷酸基團(tuán)。
2．按權(quán)利要求1所述的3＇-單磷酸化寡核苷酸的應(yīng)用，其特征在于該寡核苷酸與靶DNA或RNA結(jié)合，在制備治療由病毒基因或人體有害基因表達(dá)而引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種3′－單磷酸化寡核苷酸,經(jīng)體外和細(xì)胞研究證明其在血清中和細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性明顯高于不修飾的寡核苷酸,略高于硫磷酸修飾的寡核苷酸,3′－單磷酸化寡核苷酸被細(xì)胞攝取的能力高于不修飾的寡核苷酸及硫磷酸修飾的寡核苷酸。由于其不帶非天然的修飾成分,其代謝降解產(chǎn)物無(wú)任何毒副作用,因此,3′－單磷酸化寡核苷酸用作治療藥物時(shí),比硫磷酸修飾的寡核苷酸更為優(yōu)越與安全。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1203919SQ9710649
公開(kāi)日1999年1月6日 申請(qǐng)日期1997年6月28日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月28日
發(fā)明者陸長(zhǎng)德, 陳錦輝, 莊旻, 邵華武, 夏宇蕾 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所