專(zhuān)利名稱(chēng)：黑色素瘤分化相關(guān)基因(mda 7)在逆轉(zhuǎn)癌性表型中的應(yīng)用的制作方法
此項(xiàng)申請(qǐng)是1996年6月16日提交的美國(guó)編號(hào)為08/696,573申請(qǐng)的部分繼續(xù)申請(qǐng)。其內(nèi)容引入本申請(qǐng)作為參考。
這里公布的發(fā)明受到政府資助，該資助來(lái)自健康和人類(lèi)服務(wù)部NCI/NIH，資金批準(zhǔn)號(hào)CA 35675。因此，美國(guó)政府對(duì)此項(xiàng)發(fā)明擁有一定權(quán)利。
在本申請(qǐng)全文中，各種參考文獻(xiàn)均注明于括弧內(nèi)。這些已發(fā)表的文章作為一個(gè)整體被引入該申請(qǐng)作為參考，其目的是為了更充分地描述與此項(xiàng)發(fā)明相關(guān)的技術(shù)現(xiàn)狀。每部分實(shí)驗(yàn)?zāi)┪部梢圆殚喌竭@些被引用的參考文獻(xiàn)的完整文獻(xiàn)目錄。發(fā)明背景癌的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，受多因子調(diào)控，分階段進(jìn)行，包括腫瘤生成中正負(fù)調(diào)節(jié)因子基因的協(xié)調(diào)表達(dá)和抑制(1-5)。基于顯性轉(zhuǎn)化或腫瘤發(fā)生表型轉(zhuǎn)移之上的直接克隆策略已經(jīng)識(shí)別出一些正向作用的致癌基因(6-9)。相形之下，檢測(cè)和克隆那些抑制細(xì)胞表型的基因，被證明更困難，更難以把握(10-15)。要分離直接參與生長(zhǎng)和分化調(diào)控的基因，一種直接的方法是在生長(zhǎng)活躍的癌細(xì)胞cDNA文庫(kù)和受誘導(dǎo)不可逆地失去增殖能力和分化終止的癌細(xì)胞cDNA文庫(kù)間進(jìn)行差式雜交(13,14)。這一實(shí)驗(yàn)策略已應(yīng)用于人黑色素瘤細(xì)胞。經(jīng)人β-干擾素(IFN-β)和歐瑞香脂(MEZ)共同處理，細(xì)胞誘導(dǎo)分化終止，結(jié)果克隆到一個(gè)以前不曾在DNA數(shù)據(jù)庫(kù)中被描述的新的黑色素瘤分化相關(guān)基因(mda)(13,14)。在協(xié)調(diào)生長(zhǎng)和控制細(xì)胞周期方面，由于mda-6基因，一個(gè)等同于細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)的激酶廣譜抑制因子p21的基因(17)，被鑒定和克隆，使特異mda基因的直接作用明顯了(13-16)。p21在生長(zhǎng)調(diào)控中的重要性已被充分證明。象WAF-1,CIP-1和SDI-1一樣，許多實(shí)驗(yàn)室采用不同的方法已將p21單獨(dú)分離出來(lái)(18-20)。這些研究表明，與增殖調(diào)控相關(guān)的特異基因受誘導(dǎo)可能對(duì)抑制人癌細(xì)胞生長(zhǎng)和終止其分化的過(guò)程有所貢獻(xiàn)。
mda-7基因是從分化誘導(dǎo)物(β干擾素和MEZ)處理過(guò)的人黑色素瘤(HO-1)差式文庫(kù)中克隆到的(13,14)。其cDNA全長(zhǎng)1718個(gè)核苷酸，主要開(kāi)放閱讀框編碼一個(gè)由206個(gè)氨基酸組成，分子量為23.8KDa的新蛋白(21)。以往的研究顯示mda-7被誘導(dǎo)后能抑制生長(zhǎng)并誘發(fā)人黑色素瘤細(xì)胞分化終止(14,21)。mda-7的表達(dá)也與黑色素瘤的進(jìn)行性呈負(fù)相關(guān)，例如，生長(zhǎng)活躍的正常人黑色素細(xì)胞比轉(zhuǎn)移性的黑色素瘤細(xì)胞表達(dá)更多的mda-7(21)。甚至，mda-7能使在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染測(cè)定中和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的含地塞米松(DEX)誘導(dǎo)的mda-7基因的人黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制(21)。這些研究表明mda-7可能對(duì)人黑色素細(xì)胞和黑色素瘤的生理有貢獻(xiàn)。當(dāng)在人黑色素瘤細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)時(shí)，它具有抑制生長(zhǎng)的性質(zhì)。
mda-7基因在國(guó)際專(zhuān)利合作條約申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/US94/12160，國(guó)際申請(qǐng)日為1994年10月24日，國(guó)際公開(kāi)號(hào)為WO95/11986中有描述，其內(nèi)容引入本申請(qǐng)作為參考。
此項(xiàng)發(fā)明報(bào)導(dǎo)了mda-7在不同來(lái)源的癌細(xì)胞中，包括胸，中樞神經(jīng)系統(tǒng)，子宮頸，結(jié)腸，前列腺和結(jié)締組織，是一個(gè)潛在的生長(zhǎng)抑制基因。在缺失p53和/或成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(RB)基因或p53和RB基因產(chǎn)物匱乏的癌細(xì)胞中，克隆形成受到抑制。但是，與癌細(xì)胞相比較，mda-7在正常人乳腺上皮細(xì)胞，人皮膚成纖維細(xì)胞和鼠胚胎成纖維細(xì)胞中的表達(dá)誘發(fā)在量上較弱的生長(zhǎng)抑制。當(dāng)mda-7在人子宮頸癌細(xì)胞(HeLa)和前列腺癌細(xì)胞(Du-145)中穩(wěn)定表達(dá)時(shí)，它對(duì)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化相關(guān)的性質(zhì)具負(fù)效應(yīng)。當(dāng)用遺傳上修飾的表達(dá)反義mda-7基因的Ad5載體感染HeLa細(xì)胞，抵消MDA-7蛋白后，mda-7的這種負(fù)效應(yīng)被逆轉(zhuǎn)。這些現(xiàn)象說(shuō)明mda-7在明顯有不同遺傳缺失的人癌細(xì)胞中具廣泛的抑制活性，是一個(gè)新的生長(zhǎng)抑制基因。發(fā)明概述此項(xiàng)發(fā)明提出了通過(guò)向癌細(xì)胞中引入帶有黑色素瘤分化相關(guān)基因(mda-7)的核酸，并使該基因在適宜條件下表達(dá)來(lái)逆轉(zhuǎn)細(xì)胞癌性表型的方法。同時(shí)還提出了通過(guò)向患者體內(nèi)癌細(xì)胞中引入上述核酸逆轉(zhuǎn)患者體內(nèi)癌細(xì)胞癌性表型的方法。
它還提出了通過(guò)向癌細(xì)胞引入黑色素分化相關(guān)基因(mda-7)的基因產(chǎn)物逆轉(zhuǎn)細(xì)胞癌性表型的方法。本發(fā)明也提出了通過(guò)向患者體內(nèi)癌細(xì)胞引入上述基因產(chǎn)物逆轉(zhuǎn)患者體內(nèi)細(xì)胞癌性表型的方法。
另外，此項(xiàng)發(fā)明還提供了一種含有可有效逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞癌性表型的量的黑色素瘤分化相關(guān)基因的核酸和制藥上可接受的載體的藥物組合物。它還提供了一種含有可有效逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞癌性類(lèi)型的量的黑色素瘤分化相關(guān)基因的基因產(chǎn)物和制藥上可接受的載體的藥物組合物。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1．mda-7的表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞潮霉素抗性克隆形成的影響。HeLa細(xì)胞分別用10μg pREP4(RSV)載體，mda-7反向插入pREP4的載體(RSV-MDA-7-Antisense)或mda-7正向插入pREP4的載體(RSV-MDA-7-Sense)轉(zhuǎn)染，并在含100μg潮霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。
圖2．反義mda-7對(duì)pREP載體HeLa cl 1和表達(dá)mda-7(S)的HeLa cl2細(xì)胞單層生長(zhǎng)的影響。HeLa cl 1(pREP4轉(zhuǎn)化HeLa細(xì)胞的克隆)和HeLa cl 2(表達(dá)mda-7的HeLa細(xì)胞克隆)在不受或被10個(gè)含表達(dá)反義mda-7的5型腺病毒重組子(Ad5)〔Ad.mda-7(AS)〕的噬菌斑感染后的生長(zhǎng)狀況。結(jié)果是由差異≤10％的三個(gè)重復(fù)得到的平均細(xì)胞數(shù)。
圖3．反義mda-7對(duì)HeLa,HeLa cl 1和HeLa cl 2細(xì)胞中大分子量MDA-7復(fù)合蛋白(HMC),MDA-7蛋白和肌動(dòng)蛋白的影響。HeLa和HeLa cl1(pREP4載體轉(zhuǎn)化的HeLa克隆)不用或用10個(gè)Ad.mda-7(AS)噬菌斑感染96小時(shí)甲硫氨酸35S標(biāo)記。HMC,MDA-7和肌動(dòng)蛋白的量用免疫沉淀分析法測(cè)定。10個(gè)Ad.mda-7(AS)噬菌斑感染HeLa cl 2(表達(dá)mda-7的HeLa克隆)對(duì)其蛋白水平的影響是在24小時(shí)，48小時(shí)，72小時(shí)和96小時(shí)后用免疫沉淀法測(cè)定甲硫氨酸35S標(biāo)記細(xì)胞的細(xì)胞裂解物來(lái)決定的。對(duì)照突變株Ad5,H5d1434感染HeLa cl 2造成的影響，是10個(gè)噬菌斑感染細(xì)胞96小時(shí)后，由免疫沉淀分析甲硫氨酸35S標(biāo)記細(xì)胞的細(xì)胞裂解物來(lái)決定的。
圖4A和4B．在含DEX可誘導(dǎo)表達(dá)的mda-7基因的Du-145克隆中mda-7RNA和蛋白的合成。
圖4A．細(xì)胞在不含或含10-6M DEX的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)96小時(shí)后分離總RNA用于Northerh雜交實(shí)驗(yàn)。分別用mda-7，新霉素抗性基因(neoR)和GAPDH作探針。
圖4B．細(xì)胞在不含或含10-6M DEX的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)96小時(shí)后，細(xì)胞蛋白被甲硫氨酸35S標(biāo)記并用識(shí)別MDA-7和肌動(dòng)蛋白的抗體進(jìn)行免疫共沉淀。
圖5．已建立的人子宮頸癌(HeLa)異源移植入無(wú)胸腺裸鼠，生長(zhǎng)受到抑制。
圖6．Ad.mda-7S對(duì)HeLa腫瘤體積比的影響。結(jié)果表明Ad.mda-7S能在裸鼠體內(nèi)抑制腫瘤的進(jìn)行性。發(fā)明的詳細(xì)描述為促進(jìn)理解隨后的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)部分，一些常用方法和/或術(shù)語(yǔ)在Sambrook,et al(45)中有描述。
此項(xiàng)發(fā)明提出了向癌細(xì)胞中引入含黑色素瘤分化相關(guān)基因(mda-7)的核酸，并在適宜條件下表達(dá)該基因從而逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞癌性表型的方法。
同時(shí)，它還提出了向患者體內(nèi)癌細(xì)胞引入含黑色素瘤分化相關(guān)基因(mda-7)的核酸，并使之在適宜條件下于患者胞內(nèi)表達(dá)來(lái)逆轉(zhuǎn)細(xì)胞癌性表型的方法。
同細(xì)胞引入核酸的方法在技術(shù)上已廣為人知。裸露的核酸分子可以用直接轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入細(xì)胞，或者可以埋入脂質(zhì)體內(nèi)。因此，本發(fā)明提供了上述方法，其中，核酸是通過(guò)裸露DNA技術(shù)，腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體，EB病毒載體，皰疹病毒載體，減毒的HIV載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，牛痘病毒載體，脂質(zhì)體，抗體包被的脂質(zhì)體，機(jī)械法或電穿孔法被導(dǎo)入細(xì)胞的。以上引用的方法只是作為將核酸導(dǎo)入細(xì)胞可行性方法的舉例。其它方法也有可能應(yīng)用于此發(fā)明中。
在上述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，黑色素瘤分化相關(guān)基因(mda-7)與一個(gè)調(diào)控因子相連后，其表達(dá)受到此調(diào)控因子的控制。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這個(gè)調(diào)控因子或是誘導(dǎo)型，或是組成型的?？烧T導(dǎo)的調(diào)控因子象可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，在本技術(shù)領(lǐng)域中是公知的。同樣地，人們也知道如啟動(dòng)子類(lèi)能進(jìn)行直接地組成型表達(dá)的調(diào)控因子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)控因子其組織特異性。因此，mda-7的表達(dá)也將表現(xiàn)相同的組織特異性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，癌細(xì)胞以存在缺陷型腫瘤抑制基因?yàn)樘卣鳌＿@個(gè)缺陷型腫瘤抑制基因包括，但又不局限于p53，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(RB)或p16ink4a基因。
在另一個(gè)上述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，癌細(xì)胞以存在一個(gè)起顯性作用的致癌基因?yàn)樘卣?。特別地，此顯性作用致癌基因可以是Ha-ras，突變的p53或人乳頭狀瘤病毒基因。Ha-ras是指Harvey病毒的ras致癌基因。
在上述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，該核酸包括一種載體。該載體包括但不限于腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體，EB病毒載體，皰疹病毒載體，減毒的HIV載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和牛痘病毒載體。在一優(yōu)選實(shí)施方案中該腺病毒載體是一個(gè)表達(dá)mda-7的復(fù)制缺陷型的載體，記為Ad.mda-7S。另一實(shí)施方案中腺病毒載體具備復(fù)制能力。
該發(fā)明還提出了一種逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞的癌表型的方法，包括向癌性細(xì)胞中導(dǎo)入黑色素瘤分化相關(guān)基因(mda-7)的基因產(chǎn)物，從而治療性地逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞癌性表型。
本發(fā)明還提出了一種逆轉(zhuǎn)患者的癌細(xì)胞的癌表型的方法，包括向患者體內(nèi)癌性細(xì)胞導(dǎo)入黑色素瘤分化相關(guān)基因(mda-7)的基因產(chǎn)物，從而治療性地逆轉(zhuǎn)患者體內(nèi)癌細(xì)胞癌性表型。
在上述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，癌細(xì)胞包括，但又不局限于乳房，子宮頸，結(jié)腸，前列腺，鼻咽，肺結(jié)締組織或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞。甚至包括來(lái)源于多型成膠質(zhì)細(xì)胞癌，淋巴瘤和白血病的細(xì)胞。
此發(fā)明也提供了一種藥物組合物，包括一定量的含有可有效逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞癌性表型的黑色素瘤分化相關(guān)基因(mda-7)的核酸和制藥上可接受的載體。
這里采用的術(shù)語(yǔ)“制藥上可接受的載體”包括任何一種標(biāo)準(zhǔn)藥物載體。該藥物組合物可以制成任何適于施用的形式。適于口服的組合物包括固體形式，如藥丸，膠囊，顆粒，藥片和粉末，液體形式如溶液，糖漿，酏劑和懸浮液?？刹唤?jīng)腸道施用的形式，包括無(wú)菌溶液，乳濁液和懸浮液。
在一實(shí)施方案中，該核酸包括一種載體。該載體包括，卻不局限于腺病素載體，腺相關(guān)病毒載體，EB病毒載體，皰疹病毒載體，減毒的HIV載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和牛痘病毒載體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中該腺病毒載體是一種表達(dá)mda-7的復(fù)制缺陷型的載體，記為Ad.mda-7S。在另一實(shí)施方案中，該腺病毒載體具有復(fù)制能力。
該發(fā)明出提供了一種藥物組合物，含有一定量的能有效逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞癌性表型的黑色素瘤分化相關(guān)基因(mda-7)的基因產(chǎn)物和制藥上可接受的載體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，癌細(xì)胞包括，但并不局限于一種乳房，子宮頸，結(jié)腸，前列腺，鼻咽，肺結(jié)締組織或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞。甚至包括來(lái)自多型成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，淋巴瘤和白血病的細(xì)胞。
從下面的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，此項(xiàng)發(fā)明將得到更好的理解。但是普通技術(shù)人員一定懂得特殊的方法和結(jié)果的討論僅是對(duì)本發(fā)明的例證，隨后的權(quán)利要求將對(duì)它進(jìn)行更全面地描述。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)癌是一種以生長(zhǎng)失控為特征的疾病。腫瘤細(xì)胞常表現(xiàn)異常的細(xì)胞分化方式。人成纖維細(xì)胞干擾素重組子與抗白血病試劑歐瑞香脂(MEZ)聯(lián)合作用，可制止培養(yǎng)的人黑色素瘤細(xì)胞這些異常性狀，導(dǎo)致不可逆地生長(zhǎng)受抑，分化終止。差式雜交證實(shí)了在生長(zhǎng)受抑制，分化終止的人黑色素瘤細(xì)胞中黑色素瘤分化相關(guān)基因(mda-7)的存在，其表達(dá)水平有所上升，當(dāng)mda-7轉(zhuǎn)染帶有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)和多種遺傳性狀缺失的人腫瘤細(xì)胞時(shí)，形成的克隆數(shù)減少。相反，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，mda-7對(duì)正常細(xì)胞，包括人乳腺上皮細(xì)胞，人皮膚成纖維細(xì)胞和鼠胚胎成纖維細(xì)胞，生長(zhǎng)和克隆形成的影響在量上遠(yuǎn)不如已發(fā)現(xiàn)的它對(duì)癌細(xì)胞的影響。mda-7高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)單層生長(zhǎng)和錨定獨(dú)立性的受阻。用表達(dá)反義mda-7的腺病毒類(lèi)型5重組子感染此細(xì)胞消弱了體外生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化表型中mda-7的抑制力。mda-7抑制不表達(dá)或成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤RB和p53基因均存在缺陷的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的能力說(shuō)明這些關(guān)鍵性的腫瘤抑制因子沒(méi)有參與介導(dǎo)mda-7誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制。mad-7與以前曾描述過(guò)的生長(zhǎng)抑制基因在蛋白質(zhì)水平上缺乏同源性及它對(duì)正常細(xì)胞和癌細(xì)胞產(chǎn)生的不同效應(yīng)暗示mda-7可能代表了一類(lèi)新的具有抗腫瘤行為的癌生長(zhǎng)抑制基因。材料和方法細(xì)胞系和培養(yǎng)條件。人癌細(xì)胞系，包括MCF-7和T47D(乳房)，LS174T和SW480(結(jié)腸直腸)，HeLa(子宮頸)，Du-145(前列腺)和HONE-1(鼻咽)(9,22-25)，培養(yǎng)于Eagle’s修飾的Dulbecco’s培養(yǎng)基中，補(bǔ)加10％小牛血清(DMEM-10)，置37℃,5％CO2/95％空氣濕度的培養(yǎng)箱中。其它人細(xì)胞類(lèi)型，包括HBL-100(正常乳腺上皮細(xì)胞)，Ho-1和C8161(黑色素瘤)，GBM-18和T98G(多型成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)和Saos-2(人骨瘤)在相似條件下培養(yǎng)。正常人乳上皮早期傳代細(xì)胞(HMEC，傳代10-12)由Clonetics公司(圣迭戈，加州)提供。如Clonetics公司描述，HMEC細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)中培養(yǎng)。CREF-Trans 6(弗氏鼠胚胎成纖維細(xì)胞克隆)(9,26)和CREF Has-ras〔Ha-ras(T24)致癌基因轉(zhuǎn)化CRET細(xì)胞的克隆〕(27)培養(yǎng)于DMEM-5中。HeLacl 1是帶潮毒素抗性(HygR)癆氏肉瘤病毒RSV載體(pREP4)(lnvitrogen)轉(zhuǎn)化HeLa細(xì)胞的克隆。HeLa cl 2是帶潮霉毒抗性，表達(dá)mda-7的HeLa細(xì)胞克隆。HeLa cl 1和HeLa cl 2如所述構(gòu)建(12,21)，培養(yǎng)于含100μg/ml潮霉素的DMEM-10中。Du-145 cl 6和Du-145 cl 7帶有DEX誘導(dǎo)的mda-7基因(克隆于pMAM neo載體中)(Clontech)(21)，培養(yǎng)于含200μg/ml G418的DMEM-10中。
差式雜交，質(zhì)料，表達(dá)載體和Northern雜交。由差式雜交鑒別和克隆mda-7是通過(guò)所述方法進(jìn)行的(13)。完整mda-7 cDNA是通過(guò)篩選重組β干擾素和MEZ處理過(guò)的HO-1 cDNA(13)文庫(kù)并使用cDNA末端的快速擴(kuò)增方法分離得到的(15)。含開(kāi)放閱讀框的mda-7 cDNA片段(核苷酸位置176-960)，PCR擴(kuò)增后通過(guò)TA克隆載體克隆入PCRⅡTM(lnvitrogen)。其插入方向用酶切圖譜來(lái)鑒定。人細(xì)胞表達(dá)構(gòu)建體是從PCRTM載體克隆到KpnⅠ-XhoⅠ片段后，以正向或反向插入pREP4載體中RSV啟動(dòng)子下游區(qū)而來(lái)〔mda-7(S)或mda-7(AS)〕?；蛘?，mda-7基因片段以正、反向插入pMAMneo載體(Clontech)。分離RNA和Northern雜交如所述進(jìn)行(9,12,13,21)。
單層生長(zhǎng)，錨定獨(dú)立和DNA轉(zhuǎn)染檢測(cè)。單層和錨定獨(dú)立生長(zhǎng)測(cè)定如前所述(8,12,26)。為研究mda-7對(duì)單層克隆形成的影響，不含插入片段，含mda-7(S)或mda-7(AS)的載體〔pREP4(RSV)〕用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染了各種細(xì)胞類(lèi)型(GIBCO/BRL)并測(cè)定了潮霉素培養(yǎng)基中抗性克隆的形成或生長(zhǎng)(12,21)。
反義mda-7腺病毒載體的構(gòu)建。復(fù)制缺陷的Ad.mda-7(AS)重組子經(jīng)兩步構(gòu)建好。首先，mda-7基因的編碼序列克隆到修飾過(guò)的Ad表達(dá)載體pAd.CMV(28)。它按順序依次是腺病毒基因組最左端355bp，細(xì)胞肥大病毒(CMV)早早期啟動(dòng)子，DNA編碼的剪切供受體位點(diǎn)，目的基因的克隆位點(diǎn)(這里指mda-7)，來(lái)自β珠蛋白的DNA編碼的多聚A信號(hào)序列和一段從EIB編碼區(qū)延伸出的約3Kbp的腺病毒序列。這一順序安排使得CMV早早期啟動(dòng)子下克隆的序列高表達(dá)，以及RNA得到適當(dāng)?shù)募庸?28)。JM17帶有克隆入修飾過(guò)的pBR322中的完整Ad基因組(30)。當(dāng)帶有mda-7的載體與JM17同源重組后在293細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了重組病毒(29)。體內(nèi)JM17提供了Ad基因組，但因太大而不能被包裝。這一限制通過(guò)它與載體間發(fā)生重組產(chǎn)生了可包裝的基因組而緩解(30)，并帶有選擇的基因。重組病毒除了在293細(xì)胞中具備復(fù)制能力，在其它人細(xì)胞中復(fù)制缺陷。該293細(xì)胞表達(dá)腺病毒EIA和EIB。兩個(gè)質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，得到感染性病毒。分析基因組證實(shí)重組子結(jié)構(gòu)，然后進(jìn)行噬菌斑純化。以上全部采用標(biāo)準(zhǔn)程序(31)。
抗體肽的生成和免疫沉淀分析。如所述制備抗PSQENEMFSIRD的抗體肽(21)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa,HeLa cl 1(潮霉素抗性pREP4載體對(duì)照HeLa克隆)，HeLa cl 2〔pREP4-mda-7(S)轉(zhuǎn)染的表達(dá)潮霉素抗性mda-7的HeLa克隆〕或者不被處理，或者被10個(gè)對(duì)照腺病毒噬菌斑(H5dl434)(32)或表達(dá)反義mda-7的重組腺病毒〔Ad.md a-7(AS)〕噬菌體斑感染。感染后不同時(shí)里將培養(yǎng)物置于37℃不含甲硫氨酸的培養(yǎng)基中1小時(shí)。離心收集細(xì)胞，在37℃ 1ml含100μCi(1Ci=37GBq)35S(NEN；Express35S)的相同培養(yǎng)基中標(biāo)記4小時(shí)。用2μg MDA-7兔多克隆抗體肽或肌動(dòng)蛋白多克隆抗體(OncogeneSiences)如所述進(jìn)行免疫沉淀分析(15,21)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果人癌細(xì)胞和Ha-ras轉(zhuǎn)化的鼠胚胎成纖維細(xì)胞內(nèi)mda-7生長(zhǎng)抑制性質(zhì)的增強(qiáng)。用DNA轉(zhuǎn)染檢測(cè)來(lái)評(píng)估m(xù)da-7表達(dá)的提高對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。mda-7(S)轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞HeLa得到的HygR克隆較pREP4和mda-7(AS)轉(zhuǎn)染HeLa得到的HygR克隆少10-15倍(圖1和表1)。
表1 mda-7對(duì)人癌細(xì)胞，鼠正常胚胎成纖維細(xì)胞(CREF)和Ha-ras轉(zhuǎn)化的CREF細(xì)胞形成單層克隆的影響細(xì)胞類(lèi)型 RSV載體aRSV-mda-7(S)bRSV-mda-7(AS)人癌細(xì)胞系CMCF-7(乳癌)118±2442±16(3.5) 146±20T47D(乳癌) 172±9 44±7(4.2) 186±28HeLa(宮頸癌) 1571±446 117±107(15.2) 1771±385LS174T(結(jié)腸癌) 130±1430±3(5.4) 160±15HONE-1(鼻咽癌) 219±1971±8(3.5) 250±19DU-145(前列腺癌) 174±1854±8(3.1) 166±12T98G(成膠質(zhì)細(xì)胞瘤) 99±9 32±4(3.6) 115±14Saos--2(骨瘤) 126±2235±6(3.9) 138±14鼠胚胎成纖維細(xì)胞CREF(正常鼠胚胎)60±1035±5(1.7) 66±7CREF-ras(轉(zhuǎn)化過(guò)的) 147±1625±4(6.0) 151±16a．對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1×106/100mm的密度涂板。分別用10μg不含插入物，含mda-7(S)或mda-7(AS)的載體〔pREP4(RSV)〕轉(zhuǎn)染細(xì)胞。24小時(shí)后，細(xì)胞以約2×105/100mm平板的密度涂于含100μg/ml潮霉素的培養(yǎng)基中。每3-4天更換一次培養(yǎng)基。在第14天或21天時(shí)平板用福爾馬林固定后Giemsa染色。計(jì)數(shù)有50或更多克隆的平板。所示的數(shù)值是4-5個(gè)重復(fù)中HygR克隆的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差。
b．括弧里的數(shù)值表示與RSV-mda-7(AS)轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比較克隆形成的降低倍數(shù)。
c．MCF-7,T47D,HeLa,LS174T,DU-145和HONE-1是分別從所示解剖學(xué)位置分離得到的人癌(Ca)細(xì)胞系。T98G是人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤多形細(xì)胞系。CREE-ras是Ha-rsa(T24)癌基因轉(zhuǎn)化的CREE克隆。
除了形成較少的克隆外，mda-7(S)克隆和pREP4載體或mda-7(AS)轉(zhuǎn)染形成的相應(yīng)的HygR克隆相比，在大小上一般偏小(圖1)。mda-7(S)轉(zhuǎn)染其它人癌細(xì)胞系，HygR克隆的形成減少3-10倍(表1)。這些人癌細(xì)胞系包括人乳腺癌(MCF-7和T47D)，結(jié)腸癌(LS147T和SW480)，鼻咽癌(HONE-1)，前列腺癌(DU-145)，黑色素瘤(HO-1和C8161)，多型成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM-18和T98G)和骨癌(Saos-2)。mda-7(S)轉(zhuǎn)染HeLa形成的HygR克隆的平均大小比空pREF4或mda-7(AS)轉(zhuǎn)染HeLa形成的HygR克隆小。這些結(jié)果表明當(dāng)mda-7在廣譜的組織學(xué)上不同的人癌細(xì)胞內(nèi)過(guò)量表達(dá)時(shí)，它是一個(gè)潛在的生長(zhǎng)抑制基因。
為確定mda-7是否也抑制正常細(xì)胞生長(zhǎng)，是否在量上也相似于它對(duì)人癌細(xì)胞的影響，對(duì)正常人乳腺上皮(HMEC)傳代10-12次的細(xì)胞、正常乳腺上皮細(xì)胞系HBL-100，正常人皮膚成纖維細(xì)胞(傳代21)和克隆的正常鼠胚胎成纖維細(xì)胞系(CREF-Trans 6)進(jìn)行了瞬時(shí)DNA轉(zhuǎn)染測(cè)定(7,8)。因?yàn)镠MEC,HBL-100和正常人皮膚成纖維細(xì)胞，即使采用了飼養(yǎng)層也不以高頻率生成完整意義上的克隆，所以對(duì)總細(xì)胞數(shù)的影響是在不同RSV轉(zhuǎn)染后，于含潮霉素培養(yǎng)基中生長(zhǎng)2-3周后才確定。用這個(gè)方法觀察到，mda-7(S)轉(zhuǎn)染正常細(xì)胞較mda-7(AS)或pREP4載體，對(duì)總細(xì)胞數(shù)的影響分別是HMEC減少約1.1-1.6倍，HBL-100減少約1.1-1.2倍，正常人皮膚成纖維細(xì)胞減少約1.3-2.1倍(用不同細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行的三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn))。但是，對(duì)T47D人乳腺癌細(xì)胞，用類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)程序，mda-7轉(zhuǎn)染對(duì)生長(zhǎng)的抑制是載體和反義mda-7轉(zhuǎn)染的3.2-5.2倍。對(duì)CREF-Trans 6細(xì)胞，在比較mda-7(S)與mda-7(AS)和載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞間的6次獨(dú)立的轉(zhuǎn)染測(cè)定中HygR克隆的形成在0.5-2.8倍范圍內(nèi)變化(表1)，但mda-7轉(zhuǎn)染Ha-ras轉(zhuǎn)化的CREF細(xì)胞，克隆形成降低約6-8倍(表1)。這些結(jié)果說(shuō)明mda-7對(duì)正常人和嚙齒動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)和克隆形成的影響在量上弱于它對(duì)人癌和Ha-ras轉(zhuǎn)化的鼠胚胎細(xì)胞。
mda-7穩(wěn)定的和可誘導(dǎo)的表達(dá)及其表達(dá)的反義抑制對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化表型的影響。為找出mda-7(S)基因轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后細(xì)胞存活頻率降低的原因，分離了mda-7(S)轉(zhuǎn)染后生長(zhǎng)成的10個(gè)相互獨(dú)立的HygK克隆。Northerh雜交分析10個(gè)克隆的mda-7的表達(dá)情況7個(gè)克隆的mda-7mRNA檢測(cè)不到，2個(gè)克隆有低水平的mda-7mRNA,1個(gè)克隆(記為HeLacl 2)高水平mda-7mRNA。然而，所有的克隆都表現(xiàn)相當(dāng)?shù)腍ygR和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因表達(dá)水平。HeLa cl 2(表達(dá)mda-7)細(xì)胞和原始HeLa細(xì)胞或pREP4載體HeLa克隆(記為HeLa cl 1)比較，生長(zhǎng)速率低(圖2)，瓊脂上非克隆HeLa和HeLa cl 1細(xì)胞生長(zhǎng)效率約42％,HeLa cl 2(表達(dá)mda-7)細(xì)胞約25％，且克隆的平均大小較原始HeLa和pREP4載體HeLa cl 1細(xì)胞小。這些結(jié)果表明mda-7轉(zhuǎn)染后HeLa細(xì)胞的存活主要由于mda-7不表達(dá)或表達(dá)水平低。但是，mda-7表達(dá)穩(wěn)定上升的HeLa細(xì)胞，其單層培養(yǎng)和錨定獨(dú)立的生長(zhǎng)受到抑制。
為確定觀察到的HeLa cl 2(表達(dá)mda-7)體外生長(zhǎng)減弱和轉(zhuǎn)化受抑是否是mda-7表達(dá)的直接結(jié)果，采用了反義策略來(lái)直接抑制mda-7的表達(dá)。構(gòu)建了一個(gè)mda-7基因反義插入的重組Ad5載體〔Ad.mda-7(AS)〕。用它感染HeLa cl 2(表達(dá)mda-7)，生長(zhǎng)速率和瓊脂克隆效率都增加了(從約25％增至44％)，但感染HeLa cl 1(pREP4載體，不表達(dá)mda-7)或原始HeLa卻沒(méi)有這種現(xiàn)象(圖2)。相反，不含mda-7基因的對(duì)照突變Ad5載體(H5dl434)不影響原始HeLa cl 1或HeLa cl 2細(xì)胞單層或瓊脂上的生長(zhǎng)(數(shù)據(jù)未示)。
用兔mda-7特異的抗體肽和免疫沉淀分析知，HeLa cl 2(表達(dá)mda-7)細(xì)胞含高水平的約24KDa的MDA-7和約90-110KDa的大分子量復(fù)合蛋白(HMC)(圖3)。用Ad.mda-7(AS)，而非對(duì)照不表達(dá)mda-7的病毒H5d1434感染細(xì)胞，導(dǎo)致約24KDa的MDA-7和HMC蛋白量都暫時(shí)下降(21)(圖3)。Ad.mda-7(AS)感染后48小時(shí)可見(jiàn)兩種蛋白的表達(dá)水平降低，96小時(shí)內(nèi)抑制持續(xù)存在。但是，肌動(dòng)蛋白水平在病毒感染之后保持不變。這一發(fā)現(xiàn)說(shuō)明HeLa cl 2(表達(dá)mda-7)MDA-7蛋白表達(dá)的反義抑制可以直接消除mda-7誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制和錨定獨(dú)立的生長(zhǎng)受抑作用。
為進(jìn)一步證實(shí)mda-7對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，Du-145人前列腺癌細(xì)胞被誘發(fā)表達(dá)受DEX誘導(dǎo)的mda-7基因。在含10-6 M DEX的培養(yǎng)中生長(zhǎng)24-96小時(shí)后，DU-145 cl 6或cl 7細(xì)胞〔含DEX誘導(dǎo)的mda-7(S)基因〕，而非原始DU-145細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生了mda-7 mRNA和蛋白(包括HMC蛋白)(圖4)。而DEX并不改變DU-145 cl 6或cl 7細(xì)胞中新霉素抗性基因(NeoR)或GAPDH的表達(dá)(圖4)。在含10-6M DEX培養(yǎng)基中生長(zhǎng)96小時(shí)的DU-145 cl 6或cl 7，與在不含DEX中生長(zhǎng)的細(xì)胞相比較其mda-7基因的誘導(dǎo)表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量下降約50％。但是，原始DU-145或pMAKMneo載體轉(zhuǎn)化的DU-145細(xì)胞在10-6M DEX的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)96小時(shí)后卻并沒(méi)有明顯的生長(zhǎng)抑制(數(shù)據(jù)未示)。這些數(shù)據(jù)表明mda-7的異位表達(dá)可以直接改變前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。實(shí)驗(yàn)討論差式雜交鑒別了生長(zhǎng)受抑和分化終止的人黑色素瘤細(xì)胞中高表達(dá)的mda基因(13,14,21)。確定這些mda基因的功能對(duì)定義人黑色素瘤和其它細(xì)胞類(lèi)型抑制生長(zhǎng)和終止分化的分子基礎(chǔ)，將是非常重要的。考慮到mda-7基因(14,21)在一系列廣泛的人癌細(xì)胞系中瞬時(shí)或穩(wěn)定表達(dá)，它現(xiàn)在被認(rèn)為是一個(gè)廣譜的生長(zhǎng)抑制基因。這一發(fā)現(xiàn)拓展了以前觀察到的人黑色素瘤細(xì)胞中MDA-7蛋白的生長(zhǎng)抑制性質(zhì)(21)。相對(duì)于mda-7對(duì)癌細(xì)胞的作用，它轉(zhuǎn)染正常人乳腺上皮細(xì)胞，正常人皮膚成纖維細(xì)胞和正常鼠胚胎成纖維細(xì)胞后只引起在量上較弱的生長(zhǎng)抑制作用。象另一個(gè)mda基因，mda-6(p21),mda-7的表達(dá)也與黑色素瘤的進(jìn)行性呈負(fù)相關(guān)，正常人黑色素細(xì)胞相對(duì)于變態(tài)的人黑色素瘤細(xì)胞存在更高水平的mda-6(p21)和mda-7(14-16,21)。既然正常黑色素細(xì)胞仍保留增殖能力，盡管和黑色素瘤細(xì)胞相比速率較低，推測(cè)mda-6(p21)和mda-7可能都是黑色素細(xì)胞/黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行性表型的負(fù)調(diào)控因子(14-16,21)。同時(shí)，mda-6(p21)和mda-7在分化終止，生長(zhǎng)不可逆地受抑制的人黑色素瘤細(xì)胞中高表達(dá)暗示這些基因可能也是分化終止表型的重要調(diào)控因子(13-16,21)。
mda-7對(duì)人癌細(xì)胞表現(xiàn)的抑制生長(zhǎng)的作用機(jī)制并非現(xiàn)在才知道。mda-7的結(jié)構(gòu)不能讓人洞察其潛在功能，因?yàn)椴淮嬖谛蛄薪Y(jié)構(gòu)域暗示其潛在的作用方式。它對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用別于已深入研究的腫瘤抑制因子基因p53(33,34)。p53在含突變p53的T47D人乳癌細(xì)胞系中瞬時(shí)表達(dá)可抑制生長(zhǎng)，但是，野生型p53轉(zhuǎn)染含野生型p 53 MCF-7人乳癌細(xì)胞系時(shí)卻不能誘發(fā)生長(zhǎng)受抑(34)。相反，mda-7能誘發(fā)T47D和MCF-7細(xì)胞相似的生長(zhǎng)抑制(表1)。mda-7引起的生長(zhǎng)抑制也與觀察到的成視網(wǎng)膜細(xì)胞癌基因(pRB),pRb-相關(guān)p107基因和假定的腫瘤抑制基因p16ink4引起的生長(zhǎng)抑制不同(25,35)。pRb和p107的過(guò)量表達(dá)抑制特異細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞增殖并采用細(xì)胞周期依賴(lài)的方式(35-37)。pRb和p107轉(zhuǎn)染含明顯正常RB基因的人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G(25)不誘發(fā)生長(zhǎng)抑制(35,37)，但是，mda-7(S)的瞬時(shí)表達(dá)能減少T98G克隆的形成(表1)。到目前為止，mda-7引起的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)還不能區(qū)分于RB家族成員p130/pRb2誘發(fā)的生長(zhǎng)抑制。p130/pRb2也能抑制T98G細(xì)胞的增殖(25)。p16ink4基因阻止含功能RB基因的細(xì)胞生長(zhǎng)，而mda-7能抑制含正常、異?；蚍枪δ躌B基因的細(xì)胞生長(zhǎng)。mda-7轉(zhuǎn)染含突變RB基因的DU-145人前列腺癌細(xì)胞系(38)和不表達(dá)RB(或野生型p53)的Saos-2人骨癌細(xì)胞，能抑制克隆的形成(表1)。同樣，在穩(wěn)定DEX誘導(dǎo)的mda-7轉(zhuǎn)化DU-145克隆中mda-7的誘導(dǎo)表達(dá)也能導(dǎo)致生長(zhǎng)抑制。這些發(fā)現(xiàn)都表明mda-7引起的生長(zhǎng)抑制不依賴(lài)于功能RB基因。所有研究顯示mda-7抑制效應(yīng)的作用機(jī)制有別于兩個(gè)最深入研究的腫瘤抑制因子基因p53和pRb，及假定的腫瘤抑制因子基因p16ink4的作用方式。
已鑒別哺乳動(dòng)物細(xì)胞的一些基因，其高表達(dá)具有抑制生長(zhǎng)或破壞DNA的功能(39,40)。三個(gè)生長(zhǎng)抑制和破壞DNA可誘導(dǎo)基因(gadd)，gdaa45,gadd153和gadd34，與髓樣分化原初應(yīng)答緊密相關(guān)的基因(MyD118)(41)和抑制野生型p53基因mdm-2(42)在胞內(nèi)受DNA破壞劑甲基甲磺酸(MMS)調(diào)控(40)。gadd45和生長(zhǎng)抑制特異基因(gas1)(43,43)受聚集的維持細(xì)胞，血清饑餓細(xì)胞或低度血清中的生長(zhǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)(40,43,44)。相反，mda-7 mRNA在黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)不受甲基甲磺酸(MMS)的處理或聚集的維持細(xì)胞誘導(dǎo)(21)。甚至在不含血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)96小時(shí)的HO-1人黑色素瘤細(xì)胞，其mda-7mRNA的表達(dá)僅增長(zhǎng)很少一點(diǎn)兒(21)。mda-7與gadd,MyD118和gas-1基因間調(diào)控作用的差異說(shuō)明mda-7可能代表一類(lèi)新的生長(zhǎng)抑制基因。
簡(jiǎn)言之，mda-7作為一個(gè)負(fù)生長(zhǎng)調(diào)控因子，被描述為能誘導(dǎo)抑制含正常和突變p53和RB基因的人癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。對(duì)確定是否mda-7一般情況下就是作為腫瘤抑制基因，是否腫瘤細(xì)胞相對(duì)正常細(xì)胞中mda-7存在一些替換，它的基因組結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)將是非常重要的。mda-7啟動(dòng)子區(qū)域的識(shí)別也將使分析它在特異細(xì)胞類(lèi)型里差異表達(dá)和可為IFN-β和MEZ所誘導(dǎo)的機(jī)制成為可能。潛在的重要性和進(jìn)行深入研究的理由在于發(fā)現(xiàn)mda-7對(duì)癌細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用強(qiáng)于正常細(xì)胞。在這篇上下文中，mda-7作為以基因?yàn)榛A(chǔ)的癌癥治療干擾策略的一部分，可能被證明有用，并采取一種與野生型p53在最近測(cè)定治療特異人惡性腫癌的功效中采用的相類(lèi)似的方式。參考文獻(xiàn)1．Fisher,P.B.(1984)in Tumor Promotion andCocarcinogenesis in Vitro:Mechanisms of TumorPromotion,ed.Slaga,T.J.,(CRC,Boca Raton,FL),vol.3,pp.57-123.2．Bishop,J.M.(1991).Cell 64,235-248.3．Knudson,A.G.(1991).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,10914-10921.4．MacLachlan,T.K.,Sang,N.& Giordano,A.(1995).Crit.Rev.Eukaryotic Gene Express.5,127-156.5. Sang,N.,Baldi,A.& Giordano,A.(1995).Mol.Cell.Differ.3,1-29.6．Barbacid,M.(1987).Annu.Rev.Biochem.56,779-827.7．Bos,J.(1989).Cancer Res.49,4682-4689.8．Su,Z.-z.,Olsson,C.A.,Zimmer,S.G.& Fisher,P.B.(1992).Anticancer Res.12,297-304.9．Shen,R.,Su,Z.-z.,Olsson,C.A.& Fisher,P.B.(1995).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,6778-6782.10．Noda,M.,Kitayama,H.,Matsuzaki,T.,Sugimoto,Y.,Okayama,H.,Bassin,R.H.& Ikawa,Y.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,162-166.11．Kitayama,H.,Sugimoto,Y.,Masuzaki,T.,Ikawa,Y.
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以前的研究表明在不同來(lái)源的人腫瘤細(xì)胞中，mda-7的異位表達(dá)能抑制生長(zhǎng)，同時(shí)也減少了單層培養(yǎng)中克隆的形成(Jiang et al.,PNAS,93:9160-9165,1996)。但是，mda-7并不顯著改變正常人上皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。這些現(xiàn)象支持了這樣一個(gè)假說(shuō)mda-7是一個(gè)廣譜的癌生長(zhǎng)抑制因子基因。
mda-7選擇性地抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的能力暗示它可能對(duì)人癌癥的治療有幫助。為探索這種可能性，構(gòu)建了一個(gè)表達(dá)mda-7復(fù)制缺陷型的腺病毒。其程序與構(gòu)建表達(dá)反義mda-7的腺病毒，Ad.mda-7 AS(Jiang etal.,PNAS 93:9160-9165,1996)的程序相似。復(fù)制缺陷的重組子Ad.mda-7 S經(jīng)過(guò)兩步得到。首先，mda-7基因有義取向克隆進(jìn)修飾過(guò)Ad表達(dá)載體pAd.CMV。這一病毒按順序帶有Ad基因組左端的355bp，細(xì)胞肥大病毒(CMV)早早期啟動(dòng)，來(lái)源于β珠蛋白基因的DNA編碼的多聚A信號(hào)序列和一段從EIB編碼區(qū)延伸出的約3Kbp的腺病毒序列。這一順序安排使得CMV早早期啟動(dòng)下克隆的序列高表達(dá)，RNA得到恰當(dāng)加工。JM17帶有克隆入修飾的pBR322中的完整Ad基因組。當(dāng)帶有mda-7的載體與JM17同源重組后，體內(nèi)293細(xì)胞中產(chǎn)生了病毒重組子。體內(nèi)，JM17提供Ad基因組，但因其太大而不能被包裝。這一限制由于它與載體間發(fā)生重組產(chǎn)生了可包裝的基因組而緩解。該重組病毒在除了293細(xì)胞的人細(xì)胞中是復(fù)制缺陷的，該293細(xì)胞表達(dá)腺病毒EIA和EIB。隨著兩個(gè)質(zhì)粒的同時(shí)轉(zhuǎn)染，得到具感染性的病毒。分析基因組以進(jìn)一步證實(shí)重組子結(jié)構(gòu)，然后純化病毒。以上全部采用標(biāo)準(zhǔn)程序。
象觀察到的mda-7轉(zhuǎn)染細(xì)胞一樣，Ad.mda-7 S感染不同人癌細(xì)胞系，而非常細(xì)胞系，其生長(zhǎng)受到抑制。這些結(jié)果表明這個(gè)病毒保留有觀察到的mda-7質(zhì)粒的性質(zhì)。許多癌細(xì)胞，包括乳癌(MCF-7和T47D)，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM-18和T98G)和黑色素瘤(HO-1和C8161)經(jīng)Ad.mda-7S感染后，誘發(fā)了細(xì)胞程序化死亡(apoptosis)。對(duì)正常細(xì)胞即使用大劑量(100pfu/細(xì)胞)Ad.mda-7 S感染，也不能引發(fā)這一效應(yīng)。在另一些細(xì)胞類(lèi)型中，生長(zhǎng)抑制(如所示單層培養(yǎng)的克隆形成的抑制)明顯，但無(wú)程序化死亡跡象，如核酸形態(tài)學(xué)變化，核小體梯度的形成或陽(yáng)性TUNEL反應(yīng)。這些結(jié)果說(shuō)明Ad.mda-7S病毒能在體外選擇性地抑制人癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。甚至，在特定的癌細(xì)胞類(lèi)型中，生長(zhǎng)抑制與程序化死亡的誘發(fā)相關(guān)。這些現(xiàn)象暗示mda-7誘導(dǎo)的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制可通過(guò)多途徑發(fā)生。
異源移植人腫瘤的裸鼠模型被用來(lái)確定是否Ad.mda-7S可以抑制體內(nèi)人癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。無(wú)胸腺裸鼠，由Taconic實(shí)驗(yàn)室提供，被皮下注射PBS和matrigel混合液懸浮的一百萬(wàn)人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)(終體積0.4ml；matrigel∶PBS=1∶1)。待腫瘤生長(zhǎng)至平均體積為100-200mm3(注射后10-21天)時(shí)，將鼠隨機(jī)分為二組第1組無(wú)mda-7基因的復(fù)制缺陷型Ad；無(wú)效病毒(無(wú)，null)；第2組Ad.mda-7S。用無(wú)效病毒或Ad.mda-7S(4個(gè)部位100μl/次)進(jìn)行腫瘤間注射，每周三次，連續(xù)四周。用測(cè)徑器每周測(cè)量腫瘤2-3次。腫瘤體積按下面的公式計(jì)算pi/6×較大直徑×(較小直徑)2。處理后四周，動(dòng)物再繼續(xù)喂養(yǎng)一周，然后殺死。腫瘤終體積除以初始體積等于腫瘤體積比，被定義為癌進(jìn)行性的尺度。
已建立的異源移植HeLa，經(jīng)Ad.mda-7S處理后，在整個(gè)研究中其生長(zhǎng)均受到抑制，但是用無(wú)效病毒處理的腫瘤卻繼續(xù)進(jìn)行性生長(zhǎng)(圖5和圖6)。mda-7的抑制效應(yīng)是顯著的，p值小于0.05。這一研究進(jìn)行了多次重復(fù)并得到了相似的結(jié)果。這一數(shù)據(jù)暗示mda-7的異位表達(dá)可能對(duì)人癌癥的治療有幫助。用已建立的人乳癌腫瘤MCF-7和T47D的裸鼠實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行之中。
權(quán)利要求
1．一種逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞癌性表型的方法，包括向癌細(xì)胞中引入帶有黑色素瘤分化相關(guān)基因(mda-7)的核酸，并使該基因在適宜條件下得以表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)該細(xì)胞的癌性表型。
2．一種逆轉(zhuǎn)患者體內(nèi)細(xì)胞癌性表型的方法，包括向患者體內(nèi)癌細(xì)胞中引入帶有黑色素瘤分化相關(guān)基因(mda-7)，并使該基因在適宜條件下得以表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)該細(xì)胞的癌性表型。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中，該核酸包括載體。
4．根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中，該黑色素瘤分化相關(guān)基因(mda-7)與一調(diào)控因子相連，以致于其表達(dá)受此調(diào)控因子的控制。
5．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，該調(diào)控因子是可誘導(dǎo)的或組成型的。
6．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，該調(diào)控因子是具組織特異性的調(diào)控因子。
7．根據(jù)權(quán)利要求1-6的方法，其中，該核酸是以裸露DNA技術(shù)，腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體，EB病毒載體，皰疹病毒載體，減毒的HIV載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，牛痘病毒載體，脂質(zhì)體，抗體包被的脂質(zhì)體，機(jī)械法或電穿孔法被導(dǎo)入細(xì)胞的。
8．根據(jù)權(quán)利要求1-7的方法，其中，該癌細(xì)胞以胞內(nèi)存在一缺陷型的腫瘤抑制因子基因?yàn)樘卣鳌?br> 9．根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中，該腫瘤抑制因子基因是p53，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(RB)或p16ink4a基因。
10．根據(jù)權(quán)利要求1-7的方法，其中，該癌細(xì)胞以胞內(nèi)存在顯性作用的致癌基因?yàn)樘卣鳌?br> 11．根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中，該顯性作用的致癌基因是Ha-ras，突變的p53或人乳頭狀瘤病毒基因。
12．根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中，該載體是腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體，EB病毒載體，皰疹病毒載體，減毒的HIV載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或牛痘病毒載體。
13．根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中，該腺病毒載體是一個(gè)表達(dá)mda-7，復(fù)制缺陷型的載體，記為Ad.mda-7S。
14．一種逆轉(zhuǎn)細(xì)胞癌性表型的方法，包括向癌細(xì)胞中導(dǎo)入黑色素瘤分化相關(guān)基因(mda-7)的基因產(chǎn)物，從而逆轉(zhuǎn)該細(xì)胞的癌性表型。
15．一種逆轉(zhuǎn)患者體內(nèi)細(xì)胞癌性表型的方法，包括向患者體內(nèi)癌細(xì)胞中導(dǎo)入黑色素瘤分化相關(guān)基因(mda-7)的基因產(chǎn)物，從而逆轉(zhuǎn)該細(xì)胞的癌性表型。
16．根據(jù)權(quán)利要求1-15的方法，其中，所述的癌細(xì)胞是乳腺，子宮頸，結(jié)腸，前列腺，鼻咽，肺，多型成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，淋巴瘤，白血病，結(jié)締組織或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞。
17．一種藥物組合物，包括一定量的可有效逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞癌性表型的含有黑色素瘤分化相關(guān)基因(mda-7)的核酸和制藥上可接受的載體。
18．根據(jù)權(quán)利要求17中的藥物組合物，其中，該核酸包括載體。
19．根據(jù)權(quán)利要求18的藥物組合物，其中，該載體是腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體，EB病毒載體，皰疹病毒載體，減毒的HIV載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或牛痘病毒載體。
20．根據(jù)權(quán)利要求19的藥物組合物，其中，該腺病毒載體是一種表達(dá)mda-7的復(fù)制缺陷的載體，記為Ad.mda-7S。
21．一種藥物組合物，包括一定量的可有效逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞癌性表型的黑色素瘤分化相關(guān)基因(mda-7)的基因產(chǎn)物和制藥上可接受的載體。
22．根據(jù)權(quán)利要求17-21的藥物組合物，其中，所述的癌細(xì)胞是乳，子宮頸，結(jié)腸，前列腺，鼻咽，肺，多型成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，淋巴瘤，白血病，結(jié)締組織或神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞癌性表型的方法，將具有黑色素瘤分化相關(guān)基因(mda－7)導(dǎo)入該細(xì)胞，并使其在適宜條件下表達(dá)，從而治療性地逆轉(zhuǎn)該細(xì)胞的癌性表型。本發(fā)明的提供了一種通過(guò)向癌細(xì)胞中導(dǎo)入上述基因的基因產(chǎn)物來(lái)逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞的癌性表型的方法。本發(fā)明也提供了一種藥物組合物，它含有一定量的可有效逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞的癌性表型的黑色素瘤相關(guān)基因的核酸或該基因的基因產(chǎn)物以及藥用可接受的載體。本發(fā)明也提供了一種藥物組合物，它含有一定量的可有效逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞的癌性表型的黑色素瘤相關(guān)基因的核酸或該基因的基因產(chǎn)物以及藥用可接受的載體。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1238697SQ97197914
公開(kāi)日1999年12月15日 申請(qǐng)日期1997年8月15日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月16日
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