專利名稱：k受體的阿片樣肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及合成的阿片樣肽，具體涉及作為高選擇性κ受體活化劑的阿片樣肽，更具體地說涉及如下活化劑，它(a)不會穿透到腦內(nèi)，并且(b)具有長期的體內(nèi)抗傷害感受活性。
背景技術(shù)：
κ阿片樣物質(zhì)受體(KOR)存在于腦，脊索，中樞和外周神經(jīng)末梢，(軀體和內(nèi)臟)一級感覺傳入神經(jīng)細胞體，以及免疫細胞。激活KOR的分子一般稱之為κ活化劑。
已知，激活腦內(nèi)KOR會產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。基于這一發(fā)現(xiàn)，人們試圖開發(fā)腦透過性非肽類κ活化劑，用作新的鎮(zhèn)痛劑以避免作用于μ阿片樣物質(zhì)受體(MOR)的嗎啡類似物的副作用(便秘，呼吸抑制，依賴性和成癮性)。已經(jīng)在動物和人體內(nèi)確認這類化合物具有鎮(zhèn)痛活性而沒有“μ阿片樣物質(zhì)”的副作用。然而，全身性κ活化劑的開發(fā)卻中斷了，因為它們被顯示也具有一定的副作用，例如多尿、嗜睡和煩躁，這些都是由腦內(nèi)κ受體介導的。
除脊柱上的KOR之外，外周和脊索內(nèi)的KOR也會產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。然而，外周和脊索內(nèi)的KOR與全身性κ活化劑的任何副作用都不相關(guān)。所以，只要能夠產(chǎn)生不進入腦內(nèi)的κ受體阿片樣活化劑(通過外周給予或脊髓給予)，就能夠獲得安全的新鎮(zhèn)痛劑。
在小腸和結(jié)腸中度局部炎癥所致痛覺過敏模型中，κ活化劑都具有外周抗傷害感受作用，而應(yīng)激性腸綜合征(IBS)，包括局部內(nèi)臟超敏反應(yīng)(可能與炎癥相關(guān))引起的劇烈內(nèi)臟疼痛，也是外周κ活化劑的作用靶。除胃腸道之外，表現(xiàn)出涉及一級感覺傳入神經(jīng)活化和/或致敏(即局部炎癥)的病理情況的其他內(nèi)臟也被認為是所述κ受體的阿片樣物質(zhì)適宜的作用靶。κ活化劑還通過抑制一級傳入神經(jīng)釋放物質(zhì)P抑制軀體組織內(nèi)的神經(jīng)性炎癥，而且還知道它對免疫系統(tǒng)具有作用，主要的對免疫細胞的抑制作用。
特別需要的是如下肽不進入腦內(nèi)，與對MOR相比具有很高的KOR親和性，具有很強的效力和效果，在體內(nèi)具有長期的持續(xù)作用。美國專利5，610，271公開了含有4個D型異構(gòu)氨基酸殘基的四肽，它們結(jié)合KOR，但這些肽并不具備所有上述優(yōu)良特性。
發(fā)明概述本發(fā)明揭示了一類肽，它們對KOR具有高度的選擇性，具有長期的體內(nèi)活性，沒有任何明顯的腦透過作用。這些肽含有一段4個D型異構(gòu)氨基酸序列，其C末端是單取代或雙取代的酰胺。所述化合物的通式為H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-取代酰胺其中，Xaa1是(A)D-Phe，(CαMe)D-Phe，D-Tyr，D-Tic或D-Ala(環(huán)戊基或噻吩基)，A是H，NO2，F(xiàn)，Cl或CH3；Xaa2是(A’)D-Phe，D-1Nal，D-2Nal，D-Tyr或D-Trp，A’是A或3，4Cl2；Xaa3是D-Nle，(B)D-Leu，D-Hle，D-Met，D-Val，D-Phe或D-Ala(環(huán)戊基)，B是H或CαMe；Xaa4是D-Arg，D-Har，D-nArg，D-Lys，D-Ily，D-Arg(Et2)，D-Har(Et2)，D-Amf，D-Gmf，D-Dbu，D-Orn或D-Ior。優(yōu)選的酰胺包括乙酰胺，酰嗎啉，硫代酰嗎啉，4-吡啶甲基酰胺，哌嗪(piperazide)，丙酰胺，環(huán)丙酰胺，二乙基酰胺和取代苯甲酰胺。
具體地說，本發(fā)明提供了合成的阿片樣肽酰胺或其藥學上認可的鹽，它們與κ阿片樣物質(zhì)受體的親和力至少是與μ阿片樣物質(zhì)受體親和力的1，000倍，并且在體內(nèi)給予后具有長期作用，所述肽的通式為H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q其中，Xaa1是(A)D-Phe，(CαMe)D-Phe，D-Tyr，D-Tic或D-Ala(環(huán)戊基或噻吩基)，A是H，NO2，F(xiàn)，Cl或CH3；Xaa2是(A’)D-Phe，D-1Nal，D-2Nal，D-Tyr或D-Trp，A’是A或3，4Cl2；Xaa3是D-Nle，(B)D-Leu，D-Hle，D-Met，D-Val，D-Phe或D-Ala(環(huán)戊基)，B是H或CαMe；Xaa4是D-Arg，D-Har，D-nArg，D-Lys，D-Ily，D-Arg(Et2)，D-Har(Et2)，D-Amf，D-Gmf，D-Dbu，D-Orn或D-Ior。Q是NR1R2，嗎啉基，硫代嗎啉基，(C)哌啶基，哌嗪基，4-單取代或4，4-雙取代哌嗪基或ε-賴氨酰基，R1是低級烷基，取代低級烷基，芐基，取代芐基，氨基環(huán)己基，2-噻唑基，2-吡啶甲基，3-吡啶甲基，4-吡啶甲基，ω-(酰氨基)-聚亞甲基或聚(氧亞乙基)，R2是H或低級烷基；C是H，4-羥基或4-氧基。
另一方面，本發(fā)明包括上述化合物在治療內(nèi)臟疼痛之類，尿意頻數(shù)之類或IBD或自身免疫病人患者，或類似非人哺乳動物中的用途。
優(yōu)選實施例的簡要描述有關(guān)肽的命名參見Schroder ＆ Lubke，The Peptides，Academic Press，1965，其中，根據(jù)常規(guī)表示方法，N末端在左邊，C末端在右邊。如果某氨基酸殘基具有異構(gòu)體，若非另作說明，則本發(fā)明中的氨基酸代表其L異構(gòu)型。
如上所述，本發(fā)明提供不僅具有強KOR親和力而且具有長期體內(nèi)生物活性的KOR選擇性肽。所述κ選擇性阿片樣肽與KOR的結(jié)合親和力是與MOR的至少1，000倍，許多化合物則高出至少10，000倍，有些高出20，000倍或以上。然而，對許多適應(yīng)癥來說，除上述高選擇性之外，κ活化劑還應(yīng)該沒有明顯的腦透過性，而且具有長期體內(nèi)抗傷害感受活性。所以，除上述選擇性之外，優(yōu)選化合物沒有明顯的腦透過性，同時保持至少1小時的基本活性，較好的化合物可保持至少2小時的顯著活性，更好的化合物則表現(xiàn)出上述顯著活性至少3小時以上。
以下縮寫用于全文，意義一致。D-Nle表示D-正亮氨酸，D-Hle表示D-高亮氨酸。D-Har表示D-高精氨酸，D-nArg表示D-正精氨酸，它比D-Arg短一個碳原子。D-Nal表示丙氨酸的D異構(gòu)體，在β碳上被萘基取代。較好的是使用D-2Nal，即萘連接在環(huán)結(jié)構(gòu)的2位上；然而，也可以使用D-1Nal。D-Cpa和D-Fpa分別表示氯-D-Phe和氟-D-Phe，優(yōu)選D-4Cpa，D-2Fpa，D-3Fpa和D-4Fpa。D-Npa表示硝基-D-Phe，D-Mpa表示甲基-D-Phe。D-3，4Cpa表示3，4-二氯-D-Phe。D-Acp表示D-Ala(環(huán)戊基)。D-Orn表示D-鳥氨酸，D-Dbu表示α，γ-二氨基丁酸。CML表示Cα甲基Leu，CMP表示CαMePhe。D-4Amf表示D-4(NH2CH2)Phe，D-Gmf表示D-Amf(脒基)，即4位被CH2NHC(NH)NH2取代的的D-Phe。D-Tic表示D-1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸。Ala(Thi)中，Thi表示噻吩基，它最好連接在丙氨酸的2位，雖然3-噻吩基也可以。Ily和Ior分別表示異丙基Lys和異丙基Orn，它們的側(cè)鏈氨基被異丙基烷基化。
低級烷基表示C1至C6，包括環(huán)烷基，優(yōu)選C1至C4，包括環(huán)丙基和環(huán)丁基。Me，Et，Pr，Ipr，Bu，Pn和Bzl表示甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，戊基和芐基。Cyp表示環(huán)丙基，Cyb表示環(huán)丁基。雖然最好是連接在烷基鏈的末端，但也可以連接在鏈的其他位置，例如3-戊基也可以稱為乙基丙基。Ahx表示6-氨基-己基，即(CH2)6-NH2。4Acx表示4-氨基環(huán)己基，hEt表示羥乙基，即-CH2-CH2OH。取代芐基包括4Nbz和4Abz，分別表示4-硝基芐基和4-氨基芐基，Aeb表示4-(2-氨基-2-羧基乙基)芐基，即 2-，3-和4-吡啶甲基(2Pic，3Pic和4Pic)表示通過2-，3-或4-位亞甲基連接的甲基吡啶基團。Mor表示嗎啉基，即 ，Tmo表示硫代嗎啉基， Pip表示哌啶基，4-HyP和4-OxP表示4-羥基哌啶-1-基和4-氧基哌啶-1-基。Ppz表示哌嗪基。Ecp表示4-乙基氨基甲?；?哌嗪-1-基；Pcp表示4-苯基氨基甲?；?哌嗪-1-基。也可使用季銨，例如4，4-二甲基哌嗪-1-基(Dmp)或其他二-低級烷基取代。
2Tzl表示2-噻唑基，即 Ely表示ε賴氨?；?，即L-賴氨酸的側(cè)鏈氨基通過酰胺鍵與C末端連接。
如上所述，R1可以是ω(酰氨基)聚亞甲基或聚(氧亞乙基)，例如Aao，Aoo，Hoh，Ghx或Gao。Aao表示8-(乙酰氨基)-3，6-二氧辛-1-基，即CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-NH-Ac。Aoo表示8-氨基-3，6-二氧辛-1-基，即CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-NH2。Hoh表示6-(L-氫乳清酰氨基)己-1-基，即(CH2)6-NH-(氫乳清?；?；L-氫乳清酸是C4N2H5(O)2-COOH。Ghx表示6-(D-葡糖酰氨基)己-1-基，即(CH2)6-NH-CO-(CHOH)4-CH2OH。Gao表示6-(D-葡糖酰氨基)-3，6-二氧辛-1-基，即CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-NH-CO-(CHOH)4-CH2OH。
D-Phe或取代D-Phe最好位于1位。苯環(huán)可在2，3和/或4位被取代，一般優(yōu)選2或4位的氯代或氟代。還可以甲基化α碳原子。也可以使用與D-Phe類似的等價殘基，包括D-Ala(噻吩基)，D-Ala(環(huán)戊基)，D-Tyr和D-Tic。2位殘基最好是D-Phe或取代D-Phe，該取代優(yōu)選苯環(huán)4位碳上的取代或3位和4位上的取代。或者，可以使用萘基取代的D-丙氨酸，以及D-Trp和D-Try。3位最好是D-Nle，D-Leu，D-CML，D-Hle，D-Met或D-Val；然而，也可以使用D-Ala(環(huán)戊基)或D-Phe。4位一般優(yōu)選D-Arg(可被二乙基取代)和D-Orn(可在δ氨基位置被例如異丙基烷基化)；然而，也可以是D-nArg和其他等價殘基，例如D-Lys(也可以在ε氨基位置被烷基化)和D-Har(可以被二乙基取代)。而且，還可以使用D-Gmf，D-Dbu，D-4Amf和D-His。
雖然預計采用4D氨基酸序列將獲得持久的生物作用，但出人意料的是，非取代酰胺的作用持續(xù)時間很短，只有在C末端加入一個取代酰胺才獲得了持久的作用。單取代的形式可以是甲基，乙基，丙基，環(huán)丙基或吡啶甲基，以及羥乙基、噻唑基、氨基環(huán)己基、芐基和取代芐基等其他相當?shù)臍埢?。通常，單取代酰胺?yōu)選低級烷基或吡啶甲基。除單取代酰胺之外，還可以是二烷基取代，例如二乙基氨基；然而，所述取代C末端是嗎啉基，硫代嗎啉基或哌啶基，后者可以是非取代的，或被4-羥基或4-氧基所取代。也可以使用哌嗪基或4-單取代或4，4-二取代哌嗪基，例如ε-賴氨?；?。
我們發(fā)現(xiàn)，結(jié)合通常是因為四肽的氨基酸序列，較好的是，選擇性κ受體阿片樣肽與κ受體結(jié)合親和力的Ki等于或低于2nM。被認為主要為連接C末端的酰胺結(jié)構(gòu)所致作用持久性可用前文所述抗傷害感受試驗來測試，最好的肽其基本生物活性可持續(xù)2或3小時，同時對腦沒有明顯的影響。
上述阿片樣肽的一個優(yōu)選亞類具有如下通式H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q其中Xaa1是D-Phe(非取代或被CαMe，2F，4F或4Cl取代)，或D-Ala(環(huán)戊基或噻吩基)；Xaa2是(A’)D-Phe，D-1Nal，D-2Nal或D-Trp，A’是H，4F，4Cl，4NO2或3，4Cl2；Xaa3是D-Nle，D-Leu，D-CML，D-Met或D-Acp；Xaa4是D-Arg，D-Arg(Et2)，D-Lys，D-Ily，D-Har，D-Har(Et2)，D-nArg，D-Orn，D-Ior，D-Dbu，D-Amf和D-Gmf。Q是NR1R2，Mor，Tmo，Pip，4-Hyp，Oxp或Ppz，R1是Me，Et，Pr，Bu，hEt，Cyp，Bzl或4-吡啶甲基，R2是H或Et。
上述κ阿片樣肽另一個優(yōu)選亞類具有如下通式H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q其中Xaa1是D-Phe，D-4Fpa，D-2Fpa，D-4Cpa，D-Acp或D-Ala(Thi)；Xaa2是D-Phe，D-4Fpa，D-4Cpa，D-3，4Cpa，D-1Nal，D-2Nal或D-Trp；Xaa3是D-Nle，D-Met，D-CML或D-Leu；Xaa4是D-Arg，D-Lys，D-Har，D-nArg或D-Orn；Q是NR1R2，Mor，Tmo，Pip，4-Hyp或Ppz，，R1是Et，Pr，Bu，Cyp，hEt，Bzl或4-Pic，R2是H或Et。
上述阿片樣肽另一個優(yōu)選亞類具有如下通式H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q其中Xaa1是D-Phe，D-4Fpa，D-2Fpa，D-Acp或D-Ala(2Thi)；Xaa2是(A)D-Phe，D-1Nal，D-2Nal或D-Trp，A是4F或4Cl；Xaa3是D-Nle，D-Met或D-Leu；Xaa4是D-Arg，D-Har，D-nArg，D-Lys，D-Orn或D-Gmf；Q是NHR1，Mor，Tmo，Pip或Ppz，，R1是Et，Pr或4-Pic。
上述阿片樣肽另一個優(yōu)選亞類具有如下通式H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q其中Xaa1是D-Phe，D-4Fpa，D-2Fpa或D-Ala(2Thi)；Xaa2是(A)D-Phe，D-1Nal，D-2Nal或D-Trp，A是3，4Cl2或4Cl；Xaa3是D-Nle或D-Leu；Xaa3是D-Arg，D-Orn或D-Gmf；Q是NHR1，Mor，Tmo，Pcp，Ppz或N(Et)2，R1是Et，Pr，Cyp，4-Pic，Aeb或Hoh。
已經(jīng)證明，以上阿片樣肽類及其亞類因為4位氨基酸殘基的C末端具有取代酰胺，其體內(nèi)抗傷害感受活性得以延長。這一出人意料的特征使得這些肽特別有價值，因為其中某些的體內(nèi)活性可持續(xù)3小時以上。某些具有以上序列但只有單一C末端酰胺的四肽也表現(xiàn)出對KOR選擇性高于對MOR；然而，它們一般只有短期作用。完全可以預計，上述肽如果在合成時使其C末端具有取代酰胺例如酰嗎啉，則將表現(xiàn)出延長的作用期。與此一致的發(fā)現(xiàn)是，當四肽伯酰胺表現(xiàn)出與KOR的高親和力選擇性結(jié)合時，合成時被相應(yīng)取代的酰胺例如乙基酰胺和酰嗎啉，表現(xiàn)出以小時計的抗傷害感受活性延長，即至少1小時，但不明顯進入腦內(nèi)。
雖然以上以通式形式給出了優(yōu)選的氨基酸序列，但是肽化學領(lǐng)域一般技術(shù)人員都知道，其中的一個或多個氨基酸可以被保守氨基酸所取代，例如，堿性氨基酸之間相互取代，或疏水性氨基酸之間相互取代，例如，D-Ile取代D-Leu，各種殘基還可以如本領(lǐng)域所知進行修飾；例如，可如下修飾D-Phe(前文所述)在3位或4位或這兩個位置引入鹵原子或硝基，或者在α碳上甲基化。可認為上述修飾將產(chǎn)生等效的κ受體阿片樣肽。
肽可用各種合適的方法合成，例如完全固相技術(shù)，或經(jīng)典溶液加成，或部分固相技術(shù)，或片段縮合技術(shù)。例如，完全固相肽合成技術(shù)(SPPS)可參見教科書Stewart ＆ Young，Solid-Phase Peptide Synthesis，第2版，PierceChemical Company，Rockford，Illinois，1984，其實例參見美國專利4，105，603。片段縮合技術(shù)的實例是美國專利3，972，859，其他合成方法的實例則有美國專利3，842，067和3，862，925。經(jīng)典溶液加成技術(shù)的詳細描述可參見Bodanzsky等，Peptide Synthesis，第2版，John Wiley＆Sons，New York，1976。
與偶聯(lián)型肽化學合成一樣的是需保護待偶聯(lián)氨基酸的所有不穩(wěn)定側(cè)鏈，而且通常還需保護α氨基，這樣，加成就發(fā)生在加入的單個氨基酸或二肽或三肽的羧基。這樣的保護基是本領(lǐng)域所熟悉的，常用叔丁基氧基羰基(Boc)，芐基氧基羰基(Z)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)作為SPPS或經(jīng)典溶液合成法中的優(yōu)選α氨基保護基，雖然也可使用許多其他α氨基保護基。
采用SPPS時，C末端氨基酸殘基與固相樹脂支持體例如O-CH2-聚苯乙烯支持體，0-CH2-芐基-聚酰胺樹脂支持體，-NH-二苯甲基胺(BHA)樹脂支持體，或-NH-對甲基二苯甲基胺(MBHA)樹脂支持體偶聯(lián)。在需要非取代酰胺時，一般優(yōu)選BHA或MBHA，因為剪切后將直接得到C末端酰胺。在需要N-甲基酰胺時，可用N-甲基BHA樹脂獲得。其他單取代酰胺的合成方法參見W.Kornreich等，Int.J.Peptide Protein Res.，25414-420，1985，和美國專利4，701，499。C末端為二取代酰胺的肽，例如N-嗎啉基或N-哌啶基，宜通過經(jīng)典溶液合成法或溶液內(nèi)的片段縮合來制備。
合成后，上述四肽易于用本領(lǐng)域熟悉的用于純化短肽的方法來純化，例如反相高效液相層析(RP-HPLC)或其他適合的方法。這樣的純化方法參見J.Rivier等，J.Chromatography，288303-328，1984，和C.Miller和J.Rivier，Peptide Science，Biopolymers，40265-317(1996)，固相合成或其他方法合成后的純化實例參見美國專利5，098，995。
可用許多試驗來測試四肽是否具有高KOR選擇性，強抗傷害感受活性，持久的體內(nèi)生物活性，而且不滲透入腦。受體試驗是本領(lǐng)域所熟悉的，目前已經(jīng)克隆了小鼠、大鼠、豚鼠和人的KOR。除gpKOR之外，克隆KOR十分相似，都含約380個氨基酸。hKOR的氨基酸序列與rKOR和mKOR的同源性分別為93.9％和93.4％。相比之下，hKOR與hMOR和人δ阿片樣物質(zhì)受體(hDOR)則明顯不同，氨基酸序列一致性分別是60.2％和59.1％。KOR及其他阿片樣物質(zhì)受體是經(jīng)典的、7-跨膜區(qū)、G蛋白結(jié)合受體(Gi)。這些克隆受體方便了對特定侯選肽的篩選；例如，為了確定選擇性，可用KOR和MOR進行篩選。人KOR，MOR和DOR已可在海馬神經(jīng)母細胞瘤衍生的小鼠癌細胞系(HN.9.10)中穩(wěn)定表達，并可得到和用于體外篩選。還有許多被廣泛認可的體內(nèi)試驗已成為普遍的標準試驗，用于測定某阿片樣化合物的抗傷害感受活性。這些試驗通常使用小鼠，包括擺尾試驗，夾抓試驗，乙酸扭體試驗，夾尾試驗和浸尾試驗。Vonvoigtlander，P.F.等，J.Pharm.Exper.Therapeutics，2247-12(1983)描述了許多用于阿片樣化合物的這類試驗。
結(jié)合親和力指配體與受體之間的相互作用力。為了測定與阿片樣物質(zhì)受體的結(jié)合親和力，采用競爭性結(jié)合試驗來評價本發(fā)明的肽。上述試驗是用穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細胞系(HN9.10，衍生自小鼠的海馬神經(jīng)母細胞瘤)中表達的克隆人κ(hKOR)和μ(hMOR)阿片樣物質(zhì)受體進行的。在這些研究中，不斷提高測試化合物的濃度，取代放射性標記的、對所研究受體具有高度親和力和選擇性的配體的特異性結(jié)合。3H-U-69，593和3H-DAMGO分別在hKOR和hMOR研究中用做配體。這兩種受體都有市售(HEN-Dupont)。DAMGO是[D-Ala2，MePhe4，Gly-ol5]-腦啡肽的首字母縮寫。放射性配體的親和力定義為飽和實驗中產(chǎn)生最大特異性結(jié)合值半數(shù)時的放射性陪體濃度(KD)。3H-U-69，593對hKOR的KD和3H-DAMGO對hMOR的KD分別是0.3nM和3.OnM。被測化合物(非標記即冷配體)的親和力在競爭性結(jié)合實驗中根據(jù)以下公式計算抑制常數(shù)Ki來測定Ki=IC501+(F/KD)]]>其中，IC50=對放射性配體的特異性結(jié)合產(chǎn)生50％抑制的非標記配體濃度F=游離放射性配體濃度KD=飽和實驗中測得的放射性配體的親和力。
在低濃度受體，特定條件下進行上述試驗時，被測化合物的算得Ki與其解離常數(shù)KD十分接近，代表了占據(jù)50％結(jié)合位點所需的配體濃度。在阿片樣物質(zhì)中，納摩爾或亞納摩爾級的低Ki值被認為說明是高親和力配體。優(yōu)選類似物具有約2納摩爾(nM)或更低的對KOR的Ki，Ki等于或低于1nM則更好。因為KOR受體在體內(nèi)廣泛存在，κ受體的阿片樣肽將在許多外周活動調(diào)節(jié)中具有重要作用，如果它們具有高度的KOR選擇性，它們的副作用將極小，因而在生理學上將是優(yōu)良的藥物。
上述適用KOR和MOR的結(jié)合試驗實施簡便，可方便地用已初步鑒定或合成的肽進行，以確定它們是否具有KOR選擇性和高親和力。所述結(jié)合試驗可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的多種方式進行，以上常用類型試驗的一個詳細例子參見Perrin，M.等，Endocrinology，1181171-1179。
以下實施例將進一步描述本發(fā)明。然而，不應(yīng)將這些實施例理解成是對本發(fā)明構(gòu)思或范圍的限定，本發(fā)明的構(gòu)思和范圍由權(quán)利要求書來限定。
實施例1以熟悉的肽合成法正確合成以下通式的肽H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NHEt。例如，先用經(jīng)典溶液化學法合成三肽(α-氨基保護基)-D-Phe-D-Phe-D-Nle(羧基保護基)。例如，可如下制備該三肽。將H-D-Nle-Ome溶于DMF，加入N-乙基嗎啉(NEM)之類調(diào)節(jié)pH。然后，該溶液與含NEM的Boc-保護的D-Phe-OH的DMF溶液混合。向該反應(yīng)混合物中加入活化劑或偶聯(lián)劑，例如六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧-三(二甲基氨基)-鏻(BOP)或N，N’-二異丙基碳二酰亞胺(DIC)和N-羥基苯并三唑(HOBt)的混合物。該反應(yīng)完成后，將介質(zhì)蒸干，然后適當純化產(chǎn)物并重結(jié)晶。然后用三氟乙酸(TFA)去除Boc保護基，將二肽重新溶于DMF。加入含NEM的Boc保護D-Phe的DMF溶液。用BOP重復以上反應(yīng)，生成三肽，蒸干溶液后純化并重結(jié)晶。所得產(chǎn)物為Boc-D-Phe-D-Phe-D-Nle-OCH3。然后用合適的方法將甲基酯轉(zhuǎn)化為游離酸，例如通過將其溶解在二噁烷或DMSO與水的混合物中并加入氫氧化鈉。反應(yīng)完全后，分離，純化和重結(jié)晶，得到三肽Boc-D-Phe-D-Phe-D-Nle-OH。
將該三肽溶于含NEM的DMF，與D-Arg(Tos)-NHEt反應(yīng)，仍以BOP作為偶聯(lián)劑?；蛘?，如果需要，用80％的水合肼溶液處理以生成酰肼，如此將三肽甲基酯轉(zhuǎn)化為疊氮化合物，然后分離，并用亞硝酸鈉和無機酸的DMF溶液處理。疊氮化合物立即在含三乙胺的DMF溶液中與D-Arg(Tos)-NHEt反應(yīng)。反應(yīng)完成后，將混合物蒸干，然后適當純化和重結(jié)晶。然后D-Arg的N末端和側(cè)鏈去保護，再次純化和重結(jié)晶，生成所需的四肽乙基酰胺(肽No.1)。
使用兩種移動相含0.1％三氟乙酸水中的乙腈梯度和pH7的三乙胺磷酸鹽緩沖液中的乙腈梯度，進行反相HPLC，和用pH2.5磷酸鹽緩沖液的毛細電泳，判斷該肽是否均一。據(jù)估計，所述方法所得肽的純度高于98％。電噴射離子化質(zhì)譜和離子阱分析顯示，假分子離子[MH]+的m/z為609.4，與該四肽算得m/z質(zhì)量609.5一致。假分子離子的片段分析顯示一系列離子的m/z比例與所制備結(jié)構(gòu)的預計氨基酸序列一致。
如前所述用表達人KOR和MOR的細胞進行結(jié)合試驗。如前所述，通過競爭性取代hKOR的3H-U-69，593和hMOR的3H-DAMGO測定被測化合物與在小鼠海馬神經(jīng)母細胞瘤(HN．9．10)細胞內(nèi)穩(wěn)定表達的hKOR和hMOR的親和力。匯總至少3次實驗的數(shù)據(jù)，用合適的程序，例如Munson和Rodbard的LIGAND程序(Anal．Biochem，107220—230，1980)，計算抑制解離常數(shù)(Ki)(95％置信限)。根據(jù)競爭性置換結(jié)合放射性配體測得，克隆KOR以高親和力結(jié)合肽No．1，測得的Ki約為0．05±0．02nM。與表達人MOR的相同穩(wěn)定轉(zhuǎn)化癌細胞相比，親和力差異顯著，后者的Ki為1890±990nM。因此，肽No．1結(jié)合hKOR比結(jié)合hMOR強38，000倍。
在小鼠乙酸扭體實驗(見后文)中測試所述肽顯示ED50約O．09mg／kg，而且，該肽在3小時后仍持續(xù)表現(xiàn)出50％以上的抗傷害感受作用。因此認為肽N0．1具有持久的作用期。
實施例2如實施例1所述合成并測試以下通式的阿片樣肽H-D-Phe-D-Nle-D-Arg-Q，見表A。
肽2至15被認為具有持久的抗傷害感受活性。
實施例3
如實施例1所述合成并測試以下通式的阿片樣肽H-Xaa1-Xaa2-Xaa3Xaa4-Q，見表B。
肽16至39被認為具有持久的抗傷害感受活性。
實施例4如實施例1所述合成并測試以下通式的阿片樣肽H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q，見表C。
肽40至53被認為具有持久的抗傷害感受活性。
實施例5如實施例1所述合成并測試以下通式的阿片樣肽H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q，見表D。
肽54至58被認為具有持久的抗傷害感受活性。
實施例6如實施例1所述合成并測試以下通式的阿片樣肽H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-D-Arg-Q，見表E。
肽59至65被認為具有持久的抗傷害感受活性。
實施例7如實施例1所述合成并測試以下通式的阿片樣肽H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q，見表F。
表F中的阿片樣肽被認為，與MOR相比，具有高度的KOR選擇性，并具有體內(nèi)抗傷害感受活性。
實施例8如實施例1所述合成并測試以下通式的阿片樣肽H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q，見表G。
肽88至104被認為具有持久的抗傷害感受活性。
實施例9選擇表A-G中已鑒定的肽特別接受進一步的體內(nèi)試驗以確定起阿片樣物質(zhì)作用的持續(xù)期，試驗結(jié)果見后文表H。為了引用方便，沿用了前文諸表中的肽編號和K／u比數(shù)據(jù)。體內(nèi)試驗采用小鼠扭體試驗(WT)，該試驗非常適合測定抗傷害感受活性的持續(xù)時間。該試驗的詳細描述參見G．A．Bentley等，Br．J．Pharmac.，73∶325-332，1981，它選用購自Harlan的清醒的雄性ICR小鼠，體重在20-30g之間。實驗前，給小鼠禁食12-16小時。通過腹膜內(nèi)注射(i.p.)乙酸稀釋液誘導傷害感受行為，即扭體，進行監(jiān)測。每kg體重用10ml 0.6％乙酸水溶液。評估給予乙酸后15分鐘內(nèi)的扭體情況。第一步，3至4次增量給藥測試化合物，在統(tǒng)一的預處理時間(注射乙酸前5分鐘)通過靜脈途徑給予。通過這一步測定強度(WT-ED50)和次最大有效劑量(約80-90％抗傷害感受作用)。第二步，在不同的預處理時間(注射乙酸前5分鐘，60分鐘，120分鐘和180分鐘)給予各肽的次最大有效劑量，用于測定作用的持續(xù)期。整個試驗中，將只給予載體而不給予侯選肽的小鼠作為對照。計數(shù)注射乙酸起15分鐘內(nèi)的扭體次數(shù)，并如下計算，以百分比表示生物活性即抗傷害感受作用 因為各化合物的最大有效劑量很可能不同，所以不能直接比較，因此，如本領(lǐng)域所知，對結(jié)果進行了數(shù)學校正，得到表H中的可比數(shù)值。表H中，1，2和3小時后保留的抗傷害感受活性表示為注射前5分鐘該活性的百分比。數(shù)值高于100％說明抗傷害感受活性比實驗開始時更高。感覺上，阿片樣肽應(yīng)在1小時內(nèi)緩解扭體至少25％，才可被認為具有持久的體內(nèi)活性。
除用該試驗測定抗傷害感受活性持續(xù)時間之外，它還被用來測定肽的(短期)體內(nèi)生物效力。該數(shù)值列于WT-ED50欄，單位為mg/kg體重。該值反映小鼠15分鐘內(nèi)扭體次數(shù)減少50％(與對照相比)所需的劑量。
阿片樣肽作為鎮(zhèn)痛劑或被用于治療其他與KOR系統(tǒng)相關(guān)的疾病。它們優(yōu)于具有副作用(例如便秘、呼吸抑制和瘙癢)的嗎啡等μ活化劑。特別好的是，這些阿片樣肽基本上不透過血腦屏障，因而避免了可能產(chǎn)生的副作用。所述化合物在腦透過方面的安全性通過比較它們激發(fā)外周效應(yīng)的能力和激發(fā)中樞效應(yīng)的能力來評估。用前文所述小鼠扭體試驗(WT)來測定外周效應(yīng)。用擺尾試驗(TF)測定作用于腦內(nèi)κ受體而產(chǎn)生的中樞效應(yīng)。
擺尾試驗測定急性軀體痛感，用于評估中樞作用性鎮(zhèn)痛劑的作用強度和持續(xù)時間。將尾巴浸入52℃水中產(chǎn)生的傷害感受造成尾巴的迅速回撤，又稱擺尾。中樞作用性鎮(zhèn)痛化合物將以劑量相關(guān)方式延長尾巴回撤的滯后期。有關(guān)該試驗參見Vanderah，T.W.等，J.Pharm.Exper.Therapeutics，262190-197，1992。
用腦透過指數(shù)(BPI)來評價安全性BPI=TF-ED50WT-ED50]]>其中ED50分別是靜脈給藥時，在小鼠扭體試驗(WT-ED50)和小鼠擺尾試驗(FT-ED50)中產(chǎn)生最大效果半值的劑量。BPI越高，腦透過越低，化合物用于本申請前述用途時的安全限度愈寬(沒有腦副作用)。優(yōu)選阿片樣肽的BPI等于或高于100，更好的高于300。全身性非肽類κ活化劑(例如Enadolin和U-69，593)的BPI低于5，說明發(fā)生了明顯的腦透過，臨床使用時產(chǎn)生的副作用(多尿、嗜睡和煩躁)也證明了這一點。以下表I中的是一些代表性阿片樣肽的BPI
因為這些肽與KOR牢固結(jié)合，它們還可以在體外試驗中用于研究受體和檢測特定組織樣品中存在何種受體。因此，就此而言，它們可以用于診斷，并有可能用于體內(nèi)診斷。
通常，這些阿片樣肽可用于治療內(nèi)臟痛，獲得抗傷害感受作用，也可以用于治療類風濕關(guān)節(jié)炎。它們尤其適用于治療腹部術(shù)后癥狀，例如消化紊亂和疼痛。它們還被認為可有效治療IBS，尿意頻數(shù)，失禁，以及局部炎癥造成腸或其他內(nèi)臟疼痛等其他適應(yīng)癥，例如炎性腸病(IBD)和痛經(jīng)。阿片樣肽減輕免疫應(yīng)答的能力可能有利于抵抗IBD及其他適應(yīng)癥，例如自身免疫病。在急性和慢性炎癥情況下，給予所述肽將產(chǎn)生局部鎮(zhèn)痛活性。它們可用于治療具有疼痛相關(guān)性腹脹、噁心或暫時性腸抑制等癥狀的消化梗阻，例如可能由痙攣性收縮引起的腸梗阻。阿片樣肽還能夠產(chǎn)生外周鎮(zhèn)痛作用，并可定向緩解術(shù)后疼痛和諸如胃腸道及內(nèi)臟組織炎癥等引起的慢性疼痛，還可緩解戒除藥癮期間的疼痛。
本發(fā)明化合物可以藥學上認可的無毒鹽的形式給予，例如本領(lǐng)域熟悉的加酸鹽。所述加酸鹽例如鹽酸鹽，氫溴酸鹽，硫酸鹽，磷酸鹽，硝酸鹽，草酸鹽，延胡索酸鹽，葡糖酸鹽，鞣酸鹽，雙羥水楊酸鹽，馬來酸鹽，乙酸鹽，檸檬酸鹽，苯甲酸鹽，琥珀酸鹽，藻酸鹽，蘋果酸鹽，山梨酸鹽，酒石酸鹽等。如果要以片劑形式給予活性成分，該片劑可含藥學上認可的無毒稀釋劑，這包括黏合劑，例如西黃蓍膠，玉米淀粉或明膠。等滲鹽溶液、磷酸鹽緩沖液、甘露醇或葡萄糖溶液形式的靜脈注射也有效。
藥物組合物一般含有效量的肽和藥學上認可的常規(guī)載體或稀釋劑。通常，組合物含抗傷害感受量，即有效抑制痛感的量。靜脈給藥時，劑量一般為1-10mg肽/kg體重。組合物可在需要時給予；例如，可每隔3-6小時重復給予一次。本發(fā)明化合物的性質(zhì)允許口服生效，然而，口服劑量可能較高。如果需要長期傳遞所述阿片樣肽，例如一次給藥后1周或更長時間，可采用緩釋、貯庫或植入體劑型。例如美國專利3，773，919所述，一種適合的緩釋貯庫型注射制劑含分散于或包含于降解緩慢、無毒或非抗原性聚合物(例如聚乳酸/聚乙醇酸聚合物)中的所述肽或其鹽。還已知，可通過硅膠植入體實現(xiàn)緩釋給藥。
以上化合物可通過靜脈、皮下、肌內(nèi)、透皮、鼻內(nèi)、肺內(nèi)、口服、局部、直腸內(nèi)、陰道內(nèi)或脊髓給藥給予包括人在內(nèi)的哺乳動物，以獲得抗傷害感受作用，例如逆轉(zhuǎn)腹膜刺激引起的暫時性胃腸抑制。它們可用于緩解術(shù)后疼痛。有效劑量隨給予形式和所治哺乳動物具體種類而異。一例典型劑型是pH3-8，例如pH6的含肽抑菌水溶液，連續(xù)胃腸外給予該溶液，使劑量約在每日每公斤體重0.3μg至3mg之間。以上化合物被認為具有良好的體內(nèi)耐受性，它們尤其適合以抑菌水溶液等形式通過皮下注射來給予。
雖然，以上描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施例，顯然，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可在權(quán)利要求所界定的范圍內(nèi)進行多種修改。例如，在本發(fā)明肽中可采用不顯著減損肽效果的、本領(lǐng)域已知的其他取代。2位可采用其他取代的D-Phe，例如(4Br)D-Phe或(2，4-Cl2)D-Phe。D-Ily(Bu)和D-Lys(Et2)都是D-Ily和D-Arg(Et2)的等價物。如果需要，可將四肽N末端預先甲基化。可用二氨基化合物作為接頭形成2個四肽酰胺的二聚體。已被成功應(yīng)用的接頭有1，6-二氨基己烷，1，5-二氨基-3-噁戊烷和1，8-二氨基-3，6-二氧辛環(huán)。所得二聚體被認為與對應(yīng)單體等效。
權(quán)利要求
1．一種合成阿片樣肽酰胺或其藥學上認可的鹽，它與κ阿片樣物質(zhì)受體的親和力是與μ阿片樣物質(zhì)受體親和力的至少1，000倍，并在體內(nèi)給予后具有持久的作用，所述肽的通式為H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q其中，Xaa1是(A)D-Phe，(CαMe)D-Phe，D-Tyr，D-Tic或D-Ala(環(huán)戊基或噻吩基)，A是H，NO2，F(xiàn)，Cl或CH3；Xaa2是(A’)D-Phe，D-1Nal，D-2Nal，D-Tyr或D-Trp，A’是A或3，4Cl2；Xaa3是D-Nle，(B)D-Leu，D-Hle，D-Met，D-Val，D-Phe或D-Ala(環(huán)戊基)，B是H或CαMe；Xaa4是D-Arg，D-Har，D-nArg，D-Lys，D-Ily，D-Arg(Et2)，D-Har(Et2)，D-Amf，D-Gmf，D-Dbu，D-Orn或D-Ior；Q是NR1R2，嗎啉基，硫代嗎啉基，(C)哌啶基，哌嗪基，4-單取代或4，4-雙取代哌嗪基或ε-賴氨酰基，R1是低級烷基，取代低級烷基，芐基，取代芐基，氨基環(huán)己基，2-噻唑基，2-吡啶甲基，3-吡啶甲基，4-吡啶甲基，ω-(酰氨基)-聚亞甲基或聚(氧亞乙基)，R2是H或低級烷基；C是H，4-羥基或4-氧基。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述合成肽，其中Xaa2是D-Phe，Xaa3是D-Leu或D-Nle，Xaa4是D-Arg或D-Orn。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述合成肽，其中Q是NHR1，R1是乙基，丙基，丁基，環(huán)丙基或環(huán)丁基。
4．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述合成肽，其中Q是嗎啉基或硫代嗎啉基。
5．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述合成肽，其中Q是NHR1，R1是4-吡啶甲基。
6．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述合成肽，其中Q是N(Et)2，NH(Aeb)，Ppz或Pcp。
7．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述合成肽，其中Q是NHR1，R1是Aao，Aoo，Hoh，Ghx或Gao。
8．根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述合成肽，其中的Xaa1是D-Phe，D-Ala(2-噻吩基)或D-4Fpa。
9．根據(jù)權(quán)利要求1所述合成肽，其中Xaa4是D-Gmf。
10．根據(jù)權(quán)利要求1所述合成肽，其中Xaa2是D-4Cpa或D-3，4Cpa。
11．一種藥物組合物，含抗傷害感受量的權(quán)利要求1-10中任一項所述的合成肽和藥學上認可的液體或固體載體。
12．一種治療方法，包括給予一定量的權(quán)利要求11所述藥物組合物，所述量的組合物能夠(a)在發(fā)生內(nèi)臟痛、類風濕關(guān)節(jié)炎、腹部術(shù)后癥狀或急慢性疼痛時獲得抗傷害感受作用，或(b)抵抗尿意頻數(shù)、失禁或消化道梗阻，或(c)抵抗IBD或自身免疫病。
13．根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成阿片樣肽，具有等于或低于0.5mg/kg的WT-ED50，所述肽的通式為H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q其中Xaa1是D-Phe(非取代或被CαMe，2F，4F或4Cl取代)，或D-Ala(環(huán)戊基或噻吩基)；Xaa2是(A’)D-Phe，D-1Nal，D-2Nal或D-Trp，A’是H，4F，4Cl，4NO2或3，4Cl2；Xaa3是D-Nle，D-Leu，D-CML，D-Met或D-Acp；Xaa4是D-Arg，D-Arg(Et2)，D-Lys，D-Ily，D-Har，D-Har(Et2)，D-nArg，D-Orn，D-Ior，D-Dbu，D-Amf和D-Gmf；Q是NR1R2，Mor，Tmo，Pip，4-Hyp，Oxp或Ppz，，R1是Me，Et，Pr，Bu，hEt，Cyp，Bzl或4-吡啶甲基，R2是H或Et。
14．根據(jù)權(quán)利要求13所述合成肽，其中Xaa2是D-Phe，D-4Cpa或D-3，4Cpa，Xaa3是D-Leu或是D-Nle，Xaa4是D-Arg，D-Orn或D-Gmf。
15．根據(jù)權(quán)利要求13或14所述合成肽，其中Q是NHR1，R1是Et，hEt。Pr或4-吡啶甲基。
16．根據(jù)權(quán)利要求13或14所述合成肽，其中Q是N(Et2)或NH(Aeb)。
17．根據(jù)權(quán)利要求13或14所述合成肽，其中Q是嗎啉基或硫代嗎啉基。
18．根據(jù)權(quán)利要求13或14所述合成肽，其中Q是NHR1，R1是乙基或4-吡啶甲基。
19．根據(jù)權(quán)利要求13或14所述合成肽，其中Q是Ppz，Pcp或NH(Hoh)。
20．根據(jù)權(quán)利要求13-19中任一項所述合成肽，其中的Xaa1是D-Phe，D-Ala(2-噻吩基)或D-Fpa。
21．根據(jù)權(quán)利要求1所述合成肽，具有通式之一H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NHEt，H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-嗎啉基，H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NH-4-吡啶甲基，H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NHPr，H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-硫代嗎啉基，H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NEt2，H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NHMe，H-D-Phe-D-Phe-D-Leu-D-Orn-嗎啉基，H-D-4Fpa-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NH-4-吡啶甲基，H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NH-環(huán)丙基，H-D-Ala(2Thi)-D-3，4Cpa-D-Leu-D-Arg-嗎啉基，H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Gmf-嗎啉基，H-D-Phe-D-Phe-D-Leu-D-Orn-NH(Aeb)，H-D-Phe-D-Phe-D-Leu-D-Lys-嗎啉基，H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-哌嗪基，和H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NH(Hoh)。
22．根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成阿片樣肽，具有等于或低于0.5mg/kg的ED50，所述肽的通式為H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q其中Xaa1是D-Phe，D-4Fpa，D-2Fpa，D-Acp或D-Ala(2Thi)；Xaa2是(A)D-Phe，D-1Nal，D-2Nal或D-Trp，A是4F或4Cl；Xaa3是D-Nle，D-Met或D-Leu；Xaa4是D-Arg，D-Har，D-nArg，D-Lys，D-Orn或D-Gmf；Q是NHR1，Mor，Tmo，Pip或Ppz，R1是Et，Pr或4-Pic。
23．根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成阿片樣肽，具有等于或低于0.5mg/kg的ED50，所述肽的通式為H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q其中Xaa1是D-Phe，D-4Fpa，D-2Fpa或D-Ala(2Thi)；Xaa2是(A)D-Phe，D-1Nal，D-2Nal或D-Trp，A是3，4Cl2或4Cl；Xaa3是D-Nle或D-Leu；Xaa4是D-Arg，D-Orn或D-Gmf；Q是NHR1，Mor，Tmo，Pcp，Ppz或N(Et)2，R1是Et，Pr，Cyp，4Pic，Aeb或Hoh。
全文摘要
本發(fā)明提供了一類對κ阿片樣物質(zhì)受體(KOR)具有高選擇性,具有持久的外周作用,而且基本上不進入腦內(nèi)的肽,它具有4個D型氨基酸殘基構(gòu)成的序列,其C末端是單取代或二取代的酰胺。代表性化合物與KOR的親和力是與μ阿片樣物質(zhì)受體(MOR)親和力的至少1000倍,ED
文檔編號A61P1/04GK1283201SQ98812582
公開日2001年2月7日 申請日期1998年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月23日
發(fā)明者J·L·朱尼英, P·J·M·里弗, C·D·施泰英阿特, J·S·迪亞斯, J·A·特羅內(nèi)爾, T·W·范德阿 申請人:凡林有限公司