專利名稱：結(jié)合血小板生成素受體的肽和化合物的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為1995年6月7日的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)08/485,301和1995年6月7日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)08/478,128的部分延續(xù)，其每篇在本文中以其全文引用以供所有目的的參考。
本發(fā)明的背景本發(fā)明提供了結(jié)合并激活血小板生成素受體(c-mpl或TPO-R)或否則充當(dāng)TPO激動(dòng)劑(agonist)的肽和化合物。本發(fā)明應(yīng)用于生化和藥物化學(xué)領(lǐng)域且特別是提供用于治療人類疾病的TPO激動(dòng)劑。
巨核細(xì)胞是來(lái)自骨髓的細(xì)胞，它負(fù)責(zé)產(chǎn)生循環(huán)血小板。盡管在大多數(shù)種類中包括＜0.25％的骨髓細(xì)胞，但它們具有＞10倍的典型骨髓細(xì)胞的體積。見(jiàn)Kuter等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)9111104-11108(1994)。巨核細(xì)胞進(jìn)行稱為核內(nèi)有絲分裂的過(guò)程，經(jīng)過(guò)該過(guò)程它們復(fù)制其細(xì)胞核但不進(jìn)行細(xì)胞分裂，從而產(chǎn)生多倍體細(xì)胞。與血小板數(shù)減少反應(yīng)，核內(nèi)有絲分裂率增加，形成倍性更高的巨核細(xì)胞，巨核細(xì)胞數(shù)可增加達(dá)3倍。見(jiàn)Harker，臨床研究雜志47458-465(1968)。相反，與血小板數(shù)升高反應(yīng)，核內(nèi)有絲分裂率減小，形成倍性較低的巨核細(xì)胞，巨核細(xì)胞數(shù)可減少50％。
循環(huán)血小板數(shù)調(diào)節(jié)核內(nèi)有絲分裂速率和骨髓巨核細(xì)胞數(shù)的精確生理反饋機(jī)制還不清楚?，F(xiàn)在認(rèn)為涉及介導(dǎo)該反饋環(huán)的循環(huán)血小板生成因子是血小板生成素(TPO)。更具體地說(shuō)，已顯示在涉及血小板減少癥的情況中TPO是主要的體液調(diào)節(jié)物。例如，見(jiàn)Metcalf自然369519-520(1994)。在一些研究中已顯示TPO增加血小板數(shù)，增加血小板大小，并增加摻入受體動(dòng)物血小板的同位素。具體地說(shuō)，認(rèn)為T(mén)PO以幾種方式影響巨核細(xì)胞生成(1)它使巨核細(xì)胞大小和數(shù)目增加；(2)它使巨核細(xì)胞中以多倍性的形式產(chǎn)生DNA含量的增加；(3)它增加巨核細(xì)胞的核內(nèi)有絲分裂；(4)它使巨核細(xì)胞突變?cè)黾樱?5)它使骨髓中以小乙酰膽堿脂酶陽(yáng)性細(xì)胞形式的前體細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增加。
由于血小板(血小板細(xì)胞)對(duì)血液凝集是必需的且當(dāng)其數(shù)目很低時(shí)，病人有死于突變性出血的嚴(yán)重危險(xiǎn)，所以TPO在診斷和治療各種血液學(xué)紊亂，如，主要由血小板缺陷引起的疾病中具有潛在的有用應(yīng)用。用TPO進(jìn)行的臨床試驗(yàn)表明TPO可安全地給病人施用。另外，最近的研究提供了在治療血小板減小癥，特別是由作為癌癥或淋巴瘤治療的化療，放療或骨髓移植引起的血小板減少癥中TPO治療的效果設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)。參見(jiàn)，例如，McDonald(1992)，Am.J.Ped.Hematology/Oncology148-21(1992)。
已克隆和鑒定了編碼TPO的基因。見(jiàn)Kuter等，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)，9111104-11108(1994)；Barley等，細(xì)胞771117-1124(1994)；Kaushansky等，自然369568-571(1994)；Wendling等，自然369571-574(1994)；Sauvage等，自然369533-538(1994)。血小板生成素是具有至少兩種形式的糖蛋白，表觀分子量為25kDa和31kDa，具有共同的N端氨基酸序列。見(jiàn)Bartley等，細(xì)胞，771117-1124(1994)。血小板生成素似乎具有由潛在的Arg-Arg裂解位點(diǎn)分開(kāi)的兩個(gè)不同區(qū)域。氨基末端區(qū)域在人類和小鼠中高度保守，且與促紅細(xì)胞生成素和干擾素-a和干擾素-b具有一定的同源性。羧基末端區(qū)域顯示出廣泛的種類趨異性。
已描述了人類TPO-R(也稱為c-mpl)的DNA序列和編碼的肽序列。見(jiàn)Vigon等，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)895640-5644(1992)。TPO-R是血細(xì)胞生成素生長(zhǎng)因子受體家族的一個(gè)成員，該家族的特征在于有一個(gè)細(xì)胞外區(qū)的共同結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，包括在N端部分的4個(gè)保守的C殘基和靠近跨膜區(qū)的WSXWS基序。見(jiàn)Batan，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)；876934-6938(1990)。該受體在造血中發(fā)揮功能的證據(jù)包括其表達(dá)在小鼠中局限于脾，骨髓或胚胎肝臟(見(jiàn)Souyri等，細(xì)胞631137-1147(1990))且在人類中局限于巨核細(xì)胞，血小板，和CD34+細(xì)胞(見(jiàn)Methin等，血液，821395-1401(1993))的觀察結(jié)果。而且，CD34+細(xì)胞與針對(duì)mpl RNA的合成反義寡核苷酸的接觸明顯抑制巨核細(xì)胞群體的出現(xiàn)而不影響紅細(xì)胞或骨髓細(xì)胞集落形成。一些研究者假定該受體作為同型二聚體發(fā)揮功能，與G-CSF和促紅細(xì)胞生成素的受體的情況相似。
TPO-R克隆基因的獲得有利于尋找該重要受體的激動(dòng)劑。重組受體蛋白質(zhì)的獲得允許研究各種隨機(jī)和半隨機(jī)肽多樣性產(chǎn)生系統(tǒng)中受體-配體的相互作用。這些系統(tǒng)包括在美國(guó)專利號(hào)5,270,170和5,338,665中描述的“質(zhì)粒上的肽”系統(tǒng)；1991年6月20日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)07/718,577及在Cwirla等，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)，876378-6382(1990)，中描述的“噬菌體上的肽”系統(tǒng)；1994年9月2日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)08/300,262(它是以1993年10月29日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)08/144,775為基礎(chǔ)的部分延續(xù)申請(qǐng))和PCT WO 95/11,992中所述的“多核糖體”系統(tǒng)；1993年11月12日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)08/146,886，1992年9月16日申請(qǐng)的07/946,239及1991年9月18日申請(qǐng)的07/762,522中所述“編碼的合成文庫(kù)”系統(tǒng)和在美國(guó)專利號(hào)5,143,854；1990年12月13日公開(kāi)的PCT專利公開(kāi)號(hào)90/15,070；1990年12月6日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)07/624,120；Fodor等，科學(xué)251767-773(2/1991)；DOWer和Fodor Ann.Rep.Med.Chem，26271-180(1991)，1991年12月6日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)07/805,727中所述的“極大量固著的多體合成”系統(tǒng)；本文引用上述各專利申請(qǐng)和文獻(xiàn)以供參考。
在患有血小板減少癥的病人中血小板水平的緩慢恢復(fù)是一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題，因此迫切要求尋找能加速血小板再生的血液生長(zhǎng)因子激動(dòng)劑。本發(fā)明提供了該激動(dòng)劑。
本發(fā)明的概述本發(fā)明部分涉及一個(gè)新的且意想不到的發(fā)現(xiàn)限定的低分子量肽和肽模擬物具有與TPO-R的強(qiáng)烈結(jié)合特性且能激活TPO-R。因此，該肽和肽模擬物對(duì)于治療由TPO介導(dǎo)的癥狀(例如，由化療，放療或骨髓輸血引起的血小板減少癥)的治療目的及對(duì)于研究造血機(jī)制的診斷目的和對(duì)于巨核細(xì)胞和指定的祖先細(xì)胞(committed progenitor cell)的體外擴(kuò)展(expansion)有用。
以下面實(shí)施例3所述的結(jié)合親和試驗(yàn)測(cè)定的適于治療和/或診斷目的的肽和肽模擬物具有大約2mM或更小的IC50，其中IC50越低相應(yīng)于與TPO-R的結(jié)合親和力越強(qiáng)。為達(dá)到藥用目的，肽和肽模擬物優(yōu)選具有不超過(guò)大約100μm的IC50，更優(yōu)選不超過(guò)500nM。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，肽或肽模擬物的分子量從大約250到大約8000道爾頓。
當(dāng)用于診斷目的時(shí)，肽和肽模擬物優(yōu)選用可檢測(cè)的標(biāo)記物標(biāo)記，因此，沒(méi)有該標(biāo)記的肽和肽模擬物用作標(biāo)記的肽和肽模擬物的制備的中間產(chǎn)物。
滿足分子量和TPO-R結(jié)合親和力限定標(biāo)準(zhǔn)的肽包括9個(gè)或更多個(gè)氨基酸，其中的氨基酸是天然存在的或合成的(非天然存在的)氨基酸。肽模擬物包括具有一個(gè)或多個(gè)下列修飾的肽其中一個(gè)或多個(gè)肽基[-C(O)NR-]鍵(鍵)被諸如-CH2-氨基甲酸酯鍵[-CH2-OC(O)NR-]，膦酸酯鍵；-CH2-氨磺酰[-CH2S(O)2NR-]鍵；脲[-NHC(O)NH-]鍵；-CH2-仲胺鍵；或烷基化肽鍵[-C(O)NR6-其中R6是低級(jí)烷基]的非肽基鍵取代的肽；其中N端衍變成-NRR1基，-NRC(O)R基；-NRC(O)OR基；-NRS(O)2R基；-NHC(O)NHR基(其中R和R1是氫或低級(jí)烷基，前提是R和R1不能同時(shí)是氫)；琥珀酰亞胺基；芐氧羰基-NH-(CBZ-NH-)基；或在苯環(huán)上具有選自低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，氯和溴的1至3個(gè)取代的芐氧羰基-NH-基的肽；或其中C端衍變成-C(O)R2的肽；其中R2選自低級(jí)烷氧基和-NR3R4其中R3和R4分別獨(dú)立地選自氫和低級(jí)烷基。
因此，優(yōu)選的肽和肽模擬物包含的化合物具有(1)分子量不超過(guò)大約5000道爾頓，和(2)與TPO-R的結(jié)合親和力表達(dá)為IC50不超過(guò)大約100μm。
其中從0個(gè)到全部的肽的-C(O)NH-鍵被選自如下的鍵代替-CH2OC(O)NR-鍵；膦酸酯鍵；-CH2S(O)2NR-鍵；-CH2NR-鍵；-C(O)NR6-鍵；-NHC(O)NH-鍵，其中R是氫或低級(jí)烷基，R6是低級(jí)烷基。
而且其中所說(shuō)的肽或肽模擬物的N端是選自-NRR1基；-NRC(O)R基；-NRC(O)OR基；NRS(O)2R基；-NHC(O)NHR基；琥珀酰亞胺基；芐氧羰基-NH-基；和在苯環(huán)上具有選自低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，氯和溴的1至3個(gè)取代的芐氧羰基-NH-基，其中R和R1獨(dú)立地選自氫和低級(jí)烷基。
另外，其中所說(shuō)的肽或肽模擬物的C端具有通式-C(O)R2，(其中R2選自羥基，低級(jí)烷氧基)和-NR3R4(其中R3和R4獨(dú)立地選自氫和低級(jí)烷基)且其中-NR3R4基的N原子可任選是肽N端的胺以形成環(huán)肽，及其生理學(xué)上可接受的鹽。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及標(biāo)記的肽或肽模擬物，包含具有共價(jià)附著于其上的能檢測(cè)的標(biāo)記的上述肽或肽模擬物。
在本發(fā)明的有些實(shí)施方案中，使用的優(yōu)選肽包括具有包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6X7的核心結(jié)構(gòu)的肽，其中X1是C，L，M，P，Q，V；X2是F，K，L，N，Q，R，S，T或V；X3是C，F(xiàn)，I，L，M，R，S，V或W；X4是20個(gè)遺傳編碼的L-氨基酸中的任意一個(gè)；X5是A，D，E，G，K，M，Q，R，S，T，V或Y；X6是C，F(xiàn)，G，L，M，S，V，W或Y；X7是C，G，I，K，L，M，N，R或V。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，核心肽包含氨基酸序列X8G X1X2X3X4X5W X7，其中X1是L，M，P，Q或V；X2是F，R，S，或T；X3是F，L，V或W；X4是A，K，L，M，R，S，V，或T；X5是A，E，G，K，M，Q，R，S或T；X7是C，I，K，L，M或V；每個(gè)X8殘基獨(dú)立地選自20個(gè)遺傳編碼的L-氨基酸中的任意一個(gè)，其立體異構(gòu)體D-氨基酸；和非天然氨基酸。優(yōu)選的是，各X8殘基獨(dú)立地選自20個(gè)遺傳編碼的L-氨基酸及其立體異構(gòu)體D-氨基酸中的任意一個(gè)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，X1是P，X2是T；X3是L；X4是R；X5是E或Q；X7是I或L。
更優(yōu)選的是，核心肽包含氨基酸序列X9X8G X1X2X3X4X5W X7其中，X9是A，C，E，G，I，L，M，P，R，Q，S，T或V；X8是A，C，D，E，K，L，Q，R，S，T或V。更優(yōu)選的是X9是A或I；X8是D，E或K。
特別優(yōu)選的肽包括G G C A D G P T L R E W I S F C G G；G N AD G P T L R Q W L E G R R P K N；G G C A D G P T L R E W I S F C G GK；T I K G P T L R Q W L K S R E H T S；S I E G P T L R E W L T S R T PH S；L A I E G P T L R Q W L H G N G R D T；C A D G P T L R E W I S FC和I E G P T L R Q W L A A R A。
在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，優(yōu)選的用于本發(fā)明的肽包括具有包含下列氨基酸序列的核心結(jié)構(gòu)的肽C X2X3X4X5X6X7其中，X2是K，L，N，Q，R，S，T或V；X3是C，F(xiàn)，I，L，M，R，S或V；X4是20個(gè)遺傳編碼的L-氨基酸中的任意一個(gè)；X5是A，D，E，G，S，V或Y；X6是C，F(xiàn)，G，L，M，S，V，W或Y；X7是C，G，I，K，L，M，N，R或V。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，X4是A，E，G，H，K，L，M，P，Q，R，S，T或W。在另一實(shí)施方案中，X2是S或T；X3是L或R；X4是R；X5是D，E或G；X6是F，L或W；X7是I，K，L，R或V。特別優(yōu)選的肽包括GG C T L R E W L H G G F C G G。
在另一實(shí)施方案中，優(yōu)選的用于本發(fā)明的肽包括具有包含氨基酸序列X8C X2X3X4X5X6X7的結(jié)構(gòu)的肽，其中X2是F，K，L，N，Q，R，S，T或V；X3是C，F(xiàn)，I，L，M，R，S，V或W；X4是20個(gè)遺傳編碼的L-氨基酸中的任意一個(gè)；X5是A，D，E，G，K，M，Q，R，S，T，V或Y；X6是C，F(xiàn)，G，L，M，S，V，W或Y；X7是C，G，I，K，L，M，N，R或V；X8是20個(gè)遺傳編碼的L-氨基酸中的任意一個(gè)。在一些實(shí)施方案中，X8優(yōu)選是G，S，Y或R。
本文所述的化合物對(duì)于預(yù)防和治療由TPO介導(dǎo)的疾病，特別是對(duì)于治療血液學(xué)疾病，包括但不限于由化療，放療或骨髓輸血引起的血小板減少癥有用。因此，本發(fā)明還提供了治療病人的方法，其中，該病人具有對(duì)TPO激動(dòng)劑的治療敏感失調(diào)，該病人接受或施用治療上有效劑量或量的本發(fā)明的化合物。
本發(fā)明還提供了包含一個(gè)或多個(gè)本文所述的化合物和生理學(xué)上可接受的載體的藥用組合物。這些藥用組合物可以是各種形式，包括口服劑量形式，以及可吸入的粉末和溶液和可注射及可輸注的溶液。
附圖的簡(jiǎn)要描述圖1A-B說(shuō)明了在各種肽存在下的功能性試驗(yàn)的結(jié)果；試驗(yàn)在實(shí)施例2中描述。圖1A是用于本發(fā)明選擇的肽的TPO-R轉(zhuǎn)染的Ba/F3細(xì)胞增殖試驗(yàn)的結(jié)果的圖示■指G G C A D G P T L R E W I S F C G G K(生物素)的結(jié)果；×指G G C A D G P T L R E W I S F C G G的結(jié)果；△指L A I E G P T L R Q W L H G N G R D T的結(jié)果；○指G N A D G P T L R Q W L E G R R P K N的結(jié)果；和+指T I K G P T L R Q W L K S R E H T S的結(jié)果。
圖1B是用相同的肽和親代細(xì)胞系的結(jié)果的圖示。
圖2A-C顯示了用TPO-R轉(zhuǎn)染的Ba/F3細(xì)胞增殖試驗(yàn)的肽寡聚化結(jié)果。圖2A顯示了對(duì)于轉(zhuǎn)染的和親代細(xì)胞系復(fù)合生物素標(biāo)記的肽(具有鏈霉抗生物素蛋白(SA)的AF12285)的試驗(yàn)結(jié)果。圖2B顯示了對(duì)于轉(zhuǎn)染的和親代細(xì)胞系游離生物素標(biāo)記的肽(A12285)的試驗(yàn)結(jié)果。圖2C顯示了對(duì)于轉(zhuǎn)染的和親代細(xì)胞系單獨(dú)的鏈霉抗生物素蛋白的測(cè)定結(jié)果。
圖3A-G顯示了一系列對(duì)照實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，顯示了使用TPO-R轉(zhuǎn)染的Ba/F3細(xì)胞系和其相應(yīng)的親代細(xì)胞系或EPO依賴型細(xì)胞系時(shí)TPO，本發(fā)明的肽，EPO，EPO-R結(jié)合肽在細(xì)胞增殖中的活性。圖3A描繪了使用TPO-R轉(zhuǎn)染的Ba/F3細(xì)胞系和其相應(yīng)的親代細(xì)胞系時(shí)TPO在細(xì)胞增殖試驗(yàn)中的結(jié)果。圖3B描繪了EPO在使用TPO-R轉(zhuǎn)染的Ba/F3細(xì)胞系和其相應(yīng)的親代細(xì)胞系的細(xì)胞增殖試驗(yàn)中的結(jié)果。圖3C描繪了在TPO-R轉(zhuǎn)染的Ba/F3細(xì)胞系中復(fù)合的生物素標(biāo)記的肽(具有鏈霉抗生物素蛋白(SA)的AF12285)和復(fù)合形式的生物素標(biāo)記的EPO-R結(jié)合肽(具有SA的AF11505)的結(jié)果。相應(yīng)的親代細(xì)胞系的結(jié)果在圖3D中顯示。圖3E描繪了TPO在使用EPO依賴型細(xì)胞系的細(xì)胞增殖試驗(yàn)中的結(jié)果。圖3F描繪了EPO在使用EPO-依賴型細(xì)胞系的細(xì)胞增殖試驗(yàn)中的結(jié)果。圖3G描繪了復(fù)合生物素標(biāo)記的肽(具有鏈霉抗生物素蛋白(SA)的AF12885)和復(fù)合形式的生物素標(biāo)記的EPO-R結(jié)合肽(具有SA的AF11505)在EPO-依賴型細(xì)胞系中的結(jié)果。
圖4A-C說(shuō)明了在載體pJS142中在質(zhì)粒上的肽文庫(kù)的構(gòu)建。同4A顯示了基因的限制性圖譜和位置。文庫(kù)質(zhì)粒包括rrnB轉(zhuǎn)錄終止子，允許在氨芐青霉素上選擇的bla基因，允許挽救單鏈DNA的M13噬菌體基因內(nèi)區(qū)域(M13 IG)，質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)(ori)，兩個(gè)laCO5序列，允許正調(diào)節(jié)和負(fù)調(diào)節(jié)促使lac融合基因表達(dá)的araB啟動(dòng)子的araC基因。圖4B顯示了在lacI基因3′端克隆區(qū)的序列，包括在文庫(kù)構(gòu)建期間使用的sfiI和EagI位點(diǎn)。圖4C顯示了退火文庫(kù)寡核苷酸ON-829和ON-830連接到pJS142的SfiI位點(diǎn)以產(chǎn)生一個(gè)文庫(kù)。序列中的單個(gè)間隔表示連接位點(diǎn)。
圖5A-B說(shuō)明了克隆進(jìn)pELM3和pELM15 MBP載體。圖5A顯示了在malE融合基因的3′端的序列，包括MBP編碼序列，多天冬酰胺連接子，因子X(jué)a蛋白酶裂解位點(diǎn)，和可用的克隆位點(diǎn)。載體的其它部分來(lái)自可從New England Biolabs獲得的pMALc2(pELM3)和pMALp2(pELM15)。圖5B顯示了將BspEII-ScaI文庫(kù)片段轉(zhuǎn)移進(jìn)AgeI-ScaI消化的pELM3/pELM15后的載體序列。轉(zhuǎn)移的序列包括編碼來(lái)自pJS142文庫(kù)的GGG肽連接子的序列。
圖6A描繪了用于在載體pCMG14中構(gòu)建頭狀二聚體文庫(kù)(headpiece dimer library)的基因的限制性圖譜和位置。文庫(kù)質(zhì)粒包括rrnB轉(zhuǎn)錄終止子，允許在氨芐青霉素上選擇的bla基因，允許挽救單鏈DNA的M13噬菌體基因內(nèi)區(qū)域(M13 IG)，質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)(ori)，一個(gè)lacOs序列，允許正調(diào)節(jié)和負(fù)調(diào)節(jié)促使頭狀二聚體融合基因表達(dá)的araB啟動(dòng)子的araC基因。圖6B描繪了在頭狀二聚體基因3′端克隆區(qū)域的序列，包括文庫(kù)構(gòu)建中使用的SfiI和EagI位點(diǎn)。圖6C顯示了退火的ON-1679，ON-829和ON-830連接到pCMG14的SfiI位點(diǎn)以產(chǎn)生文庫(kù)。序列中的單一間隔表示連接位點(diǎn)。
圖7到9顯示了評(píng)價(jià)本發(fā)明的肽和肽模擬物的活性的進(jìn)一步試驗(yàn)的結(jié)果。在這些試驗(yàn)中，小鼠用carboplatin使其血小板減少。圖7描述了在第0天用carboplatin(125mg/kg，腹膜內(nèi)注射)處理Balb/C小鼠時(shí)的典型結(jié)果。虛線代表三個(gè)實(shí)驗(yàn)中的未處理的動(dòng)物。實(shí)線代表三個(gè)實(shí)驗(yàn)中carboplatin處理的組。粗實(shí)線代表以前的數(shù)據(jù)。圖8描繪了carboplatin滴定對(duì)用所示量的carboplatin(mg/kg，在第0天腹膜內(nèi)(ip)注射)處理的小鼠中血小板計(jì)數(shù)的影響。圖9描繪了以肽AF12513(513)在第10天對(duì)carboplatin誘導(dǎo)的血小板減少癥的改善。carboplatin(CBP；50-125mg/kg，經(jīng)腹膜內(nèi))在第0天施用。AF12513(1mg/kg，ip)在第1-9天給藥。
具體實(shí)施方案的描述I.定義和一般參數(shù)下面闡述的定義用來(lái)說(shuō)明和限定本文用于描述本發(fā)明的各種術(shù)語(yǔ)的意義和范圍。
“激動(dòng)劑”指結(jié)合其互補(bǔ)的生物學(xué)活性受體并激活后者以引起受體的生物學(xué)反應(yīng)或增強(qiáng)受體已經(jīng)存在的生物學(xué)活性。
“藥用上可接受的鹽”指無(wú)毒性的堿金屬，堿土金屬和常用于制藥工業(yè)的銨鹽，包括鈉，鉀，鋰，鈣，鎂，鋇，銨，和魚(yú)精蛋白鋅鹽，它們用本領(lǐng)域熟知的方法制備。該術(shù)語(yǔ)也包括無(wú)毒性的加酸鹽，一般經(jīng)過(guò)將本發(fā)明的化合物與合適的有機(jī)或無(wú)機(jī)酸反應(yīng)來(lái)制備。有代表性的鹽包括鹽酸鹽，氫溴酸鹽，硫酸鹽，硫酸氫鹽，乙酸鹽，草酸鹽，戊酸鹽，油酸鹽，月桂酸鹽，錋酸鹽，苯甲酸鹽，乳酸鹽，磷酸鹽，苯甲磺酸鹽，檸檬酸鹽，馬來(lái)酸鹽，延胡索酸鹽，琥珀酸鹽，酒石酸鹽，napsylate等。
“藥用上可接受的加酸鹽”指保留生物學(xué)效力和自由基特征的且與諸如鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等的無(wú)機(jī)酸和諸如乙酸，丙酸，羥乙酸，丙酮酸，草酸，蘋(píng)果酸，丙二酸，琥珀酸，馬來(lái)酸，延胡索酸，酒石酸，檸檬酸，苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲烷磺酸，乙烷磺酸，對(duì)苯甲磺酸，水楊酸等的有機(jī)酸不是生物學(xué)或其他方面不合需要的，形成的那些鹽。對(duì)于作為前藥描述的藥用上可接受的加酸鹽見(jiàn)Bundgaard H.，出處同上。
“藥用上可接受的酯”所指的那些酯在水解酯鍵時(shí)保留生物學(xué)效力及羧酸或醇的特性且不是生物學(xué)或其他方面不合需要的。對(duì)于作為前藥描述的藥用上可接受的酯見(jiàn)Bundgaard H.編輯，前藥的設(shè)計(jì)，Elsevier科學(xué)出版社，Amsterdam(1985)。這些酯典型地從相應(yīng)的羧酸和醇形成。一般來(lái)說(shuō)，酯形成可經(jīng)常規(guī)合成技術(shù)實(shí)現(xiàn)。(見(jiàn)，例如，Mach，有機(jī)化學(xué)進(jìn)展，第3版，John wiley和Sons，紐約(1985)，p.1157及其中引用的參考文獻(xiàn)，Mark等，化學(xué)技術(shù)大全，John Wiley & Sons，紐約(1980))。酯的醇組成一般包括(i)C2-C12的脂肪族醇，可含有或不含一個(gè)或多個(gè)雙鍵且可含有或不含分枝的碳原子，或(ii)，C7-C12芳香族或雜環(huán)芳香族醇。本發(fā)明也包含使用是本文所述的酯，同時(shí)又是其藥用上可接受的加酸鹽的那些組合物。
“藥用上可接受的酰胺”指在水解酰胺鍵時(shí)保留生物學(xué)效力及羧酸或胺的特性，且不是生物學(xué)或其他方面不合需要的。關(guān)于作為前藥描述的藥用上可接受的酰胺見(jiàn)Bundgaard，H.編輯，前藥的設(shè)計(jì)，Elsevier科學(xué)出版社，Amsterdam(1985)。這些酰胺典型地從相應(yīng)的羧酸和胺形成。一般來(lái)說(shuō)，可經(jīng)過(guò)常規(guī)合成技術(shù)實(shí)現(xiàn)酰胺的形成。(見(jiàn)，例如，March.有機(jī)化學(xué)進(jìn)展，第三版，John Wiley & Sons，紐約(1985)p.1152和Mark等、化學(xué)技術(shù)大全，John Wiley & Sons，紐約(1980))。本發(fā)明也包含使用的組合物既是本文所述的酰胺，同時(shí)又是其藥用上可接受的加酸鹽。
“藥用上或治療上可接受的載體”指不干擾活性成份的生物學(xué)活性效力且對(duì)宿主或病人無(wú)毒性的載體介質(zhì)。
“立體異構(gòu)體”指與另一化合物具有相同分子量，化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)但具有不同原子排列的化合物。這就是說(shuō)，某些相同的化學(xué)基團(tuán)在空間上具有不同取向，因此，當(dāng)純化時(shí)，具有旋轉(zhuǎn)偏振光平面的能力。然而，有些純化的立體異構(gòu)體具有輕微的旋光性，用目前的儀器不可檢測(cè)出來(lái)。本發(fā)明的化合物可具有一個(gè)或更多個(gè)不對(duì)稱碳原子，因此包括各種立體異構(gòu)體。所有的立體異構(gòu)體都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
應(yīng)用于本發(fā)明的組合物的“治療上或藥用上有效的量”指足以誘導(dǎo)所需生物學(xué)結(jié)果的組合物的量。該結(jié)果可以是減輕疾病的瘧征，癥狀或病因，或任何其它所需的生物學(xué)系統(tǒng)的改變。在本發(fā)明中，該結(jié)果典型地包含對(duì)感染或組織損傷的免疫學(xué)和/或炎癥反應(yīng)的減輕。
肽中的氨基酸殘基縮寫(xiě)如下苯丙氨酸是Phe或F；亮氨酸是Leu或L；異亮氨酸是Ile或I；甲硫氨酸是Met或M；纈氨酸是Val或V；絲氨酸是Ser或S；脯氨酸是Pro或P；蘇氨酸是Thr或T；丙氨酸是Ala或A；酪氨酸是Tyr或Y；組氨酸是His或H；谷氨酰胺是Gln或Q；天冬酰胺是Asn或N；賴氨酸是Lys或K；天冬氨酸是Asp或D；谷氨酸是Glu或E；半胱氨酸是Cys或C；色氨酸是Trp或W；精氨酸是Arg或R；甘氨酸是Gly或G。另外，Bu是丁氧基，B21是芐基，CHA是環(huán)己胺，Ac是乙?；?，Me是甲基，Pen是青霉胺，Aib是氨基異丁酸，Nva是正纈氨酸，Abu是氨基丁酸，Thi是噻吩丙氨酸，OBn是鄰芐基，hyp是羥脯氨酸。
除了僅由天然存在的氨基酸組成的肽外，還提供了肽模擬物或肽類似物。常用于制藥工業(yè)的肽類似物是具有類似于模板肽的特征的非肽藥物。這類非肽化合物稱為“肽模擬物”或“肽的模擬物”(Fauchere，藥品研究進(jìn)展雜志1529(1986)；Veber和Freidinger TINS p.392(1985)；Evans等，醫(yī)用化學(xué)雜志，301229(1987)，本文作為參考文獻(xiàn)引用)。在結(jié)構(gòu)上相似于治療上有用的肽的肽模擬物可用于產(chǎn)生相當(dāng)?shù)幕蛟鰪?qiáng)的治療或預(yù)防效果。一般來(lái)說(shuō)，肽模擬物在結(jié)構(gòu)上相似于范例多肽(即，具有生物學(xué)或藥理活性的多肽)，如天然存在的結(jié)合受體的多肽，但任選一個(gè)或多個(gè)肽鍵被選自-CH2NH-，-CH2S-，-CH2-CH2-，-CH＝CH-(順式和反式)，-COCH2-，-CH(OH)CH2-和-CH2SO-的鍵經(jīng)本領(lǐng)域已知的方法取代，它在下列參考文獻(xiàn)中有進(jìn)一步的描述Spatola.A，F(xiàn).氨基酸，肽和蛋白質(zhì)的化學(xué)和生物化學(xué)，B.Weinstein編輯，MarcelDekker.紐約，p.267(1983)；Spatola，A.F.，Vega Data(1983年3月)，Vol.1，Issue 3.肽鏈修飾(綜述)；Morley，藥物科學(xué)動(dòng)態(tài)(1980)，pp.463-468(綜述)；Hudson.D.等，國(guó)際肽，蛋白質(zhì)研究雜志，14177-185(1979)(-CH2NH-，CH2CH2-)；Spatola等，生命科學(xué)381243-1249(1986)(-CH2-S-)；Hann.J.Chem.Soc.PerKin Trans.I 307-314(1982)(-CH-CH-，順式和反式)；Almquist等，醫(yī)用化學(xué)雜志，231392-1398(1980)(-COCH2-)；Jennings-White等，Tetrahedron Lett.232533(1982)(-COCH2-)；Szelke等，European Appln.EP 45665 CA(1982)；9739405(1982)(-CH(OH)CH2-)；Holladay等，Tetrahedron Lett.244401-4404(1983)(-CH(OH)CH2-)；和Hruby.生命科學(xué)，31189-199(1982)(-CH2-S-)；本文引用每一篇作為參考文獻(xiàn)。特別優(yōu)選的非肽鍵是-CH2NH-。該肽模擬物相對(duì)于多肽實(shí)施方案具有明顯的優(yōu)勢(shì)，包括，例如生產(chǎn)更經(jīng)濟(jì)，化學(xué)穩(wěn)定性更大，藥理特性增強(qiáng)(半壽期，吸附性，潛力，效力等)，特異性改變(例如，生物學(xué)活性的廣譜性)，抗原性減小，和其它。肽模擬物的標(biāo)記通常涉及將一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物直接或通過(guò)間隔子(例如，酰胺基)附著到經(jīng)定量結(jié)構(gòu)活性數(shù)據(jù)和/或分子模擬推測(cè)的肽模擬物的非干擾位置上。該非干擾性位置一般是與大分子(例如，免疫球蛋白超家族分子)不形成直接接觸的位置，肽模擬物與該大分子結(jié)合后產(chǎn)生治療效力。肽模擬物的衍變(例如，標(biāo)記)應(yīng)基本上不干擾該肽模擬物所需的生物學(xué)或藥理學(xué)活性。一般來(lái)說(shuō)，結(jié)合受體的肽的肽模擬物以高親和力結(jié)合受體且具有可檢測(cè)的生物學(xué)活性(即，是對(duì)于一個(gè)或更多個(gè)受體介導(dǎo)的表型改變的激動(dòng)劑或拮抗劑)。
用相同類型的D-氨基酸系統(tǒng)取代一個(gè)或多個(gè)共有序列的氨基酸(例如，用D-賴氨酸代替L-賴氨酸)可用于產(chǎn)生更多穩(wěn)定的肽。另外，含有共有序列或基本上相同的共有序列變異的限定肽可以本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生(Rizo和Gierasch生化回顧年鑒，61387(1992)，本文引用作為參考文獻(xiàn))；例如，經(jīng)過(guò)加入能形成分子內(nèi)二硫鍵使肽環(huán)化的內(nèi)部半胱氨酸殘基可產(chǎn)生。
合成的或非天然存在的氨基酸指在天然狀態(tài)下不存在于體內(nèi)但可摻入本文所述的肽結(jié)構(gòu)中的氨基酸。優(yōu)選的合成氨基酸是天然存在的L-α-氨基酸的D-α-氨基酸以及由通式H2NCHR5COOH代表的非天然存在的D-和L-α-氨基酸，其中R5是1)低級(jí)烷基，2)從3到7個(gè)碳原子的環(huán)烷基，3)從3到7個(gè)碳原子的雜環(huán)且1至2個(gè)雜原子選自氧，硫和氮，4)從6到10個(gè)碳原子的芳香殘基，任選在芳香核上具有選自羥基，低級(jí)烷氧基，氨基，羧基的1到3個(gè)取代，5)亞烷基-Y，其中亞烷基是從1到7個(gè)碳原子的亞烷基，Y選自(a)羥基，(b)氨基，(c)從3到7個(gè)碳原子的環(huán)烷基和環(huán)亞烷基，(d)從6到10個(gè)碳原子的芳基，任選在芳核上具有選自羥基，低級(jí)烷氧基，氨基和羧基的1到3個(gè)取代，(e)從3到7個(gè)碳原子的雜環(huán)，且1至2個(gè)雜原子選自氧，硫和氮，(f)-C(O)R2，其中R2選自氫，羥基，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，和-NR3R4，其中R3和R4獨(dú)立地選自氫和低級(jí)烷基，(g)-S(O)nR6，其中n是從1到2的整數(shù)，R6是低級(jí)烷基，前提是R5不限制天然存在的氨基酸的側(cè)鏈。
其它優(yōu)選的合成氨基酸包括氨基被超過(guò)一個(gè)的碳原子與羧基分開(kāi)的氨基酸，如b-氨基丙酸，g-氨基丁酸，等。
作為舉例，特別優(yōu)選的合成氨基酸包括天然存在的L-氨基酸的D-氨基酸，L-1-萘基-丙氨酸，L-2-萘基丙氨酸，L-環(huán)己烷基丙氨酸，L-2-氨基異丁酸，甲硫氨酸的亞砜和砜衍生物)即，HOOC-(H2NCH)CH2CH2-S(O)nR6，其中n和R6限定如上所述，以及甲硫氨酸的低級(jí)烷氧衍生物，(即，HOOC-(H2NCH)CH2CH2-OR6，其中R6按上面限定)。
“可檢測(cè)的標(biāo)記”指當(dāng)共價(jià)附著于本發(fā)明的肽和肽模擬物上時(shí)，允許在已施用該肽或肽模擬物的病人體內(nèi)檢測(cè)該肽和肽模擬物的物質(zhì)。合適的可檢測(cè)的標(biāo)記是本領(lǐng)域中熟知的且作為舉例，它包括放射性同位素，熒光標(biāo)記(例如熒光素)等。具體采用的可檢測(cè)的標(biāo)記不是關(guān)鍵的，且其選擇涉及所采用的標(biāo)記物的量以及在所用的該標(biāo)記物的量下該標(biāo)記物的毒性。涉及這些因素的標(biāo)記物的選擇完全在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。
可檢測(cè)的標(biāo)記物共價(jià)附著于該肽或肽模擬物上經(jīng)過(guò)本領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法實(shí)現(xiàn)。例如，當(dāng)125I放射性同位素用作可檢測(cè)的標(biāo)記物時(shí)，125I共價(jià)附著于肽或肽模擬物上可經(jīng)過(guò)將氨基酸酪氨酸摻入肽或肽模擬物中然后碘化該肽來(lái)實(shí)現(xiàn)。如果酪氨酸不存在于肽或肽模擬物中，可用熟知的化學(xué)法實(shí)現(xiàn)將酪氨酸摻入肽或肽類似物的N或C末端。同樣，32P可作為磷酸基團(tuán)摻入到肽或肽模擬物中，例如，通過(guò)使用常規(guī)化學(xué)法摻入到肽或肽類似物的羥基上。
II.綜述本發(fā)明提供了結(jié)合并激活TPO-R或否則作為T(mén)PO激動(dòng)劑發(fā)揮作用的化合物。這些化合物包括“榜樣”(lead)肽化合物和“衍生”化合物，后者限定為與榜樣化合物具有相同或相似的分子結(jié)構(gòu)或形狀但與榜樣化合物的區(qū)別在于對(duì)水解或蛋白裂解的敏感性和/或其它的生物學(xué)特征，如，對(duì)受體的親和力增加。本發(fā)明也提供了包含有效量的TPO激動(dòng)劑的組合物，更具體地說(shuō)是一種對(duì)治療血液學(xué)紊亂，特別是與化療，放射或骨髓輸血相聯(lián)的血小板減少癥有用的化合物。
III.TPO-激動(dòng)劑的鑒定對(duì)TPO-R具有結(jié)合親和力的肽以與親和力富集過(guò)程偶聯(lián)的隨機(jī)肽多樣性產(chǎn)生系統(tǒng)能較容易地鑒定。
具體地說(shuō)，隨機(jī)肽多樣性產(chǎn)生系統(tǒng)包括在美國(guó)專利號(hào)5,270,170和5,338,665中描述的“在質(zhì)粒上的肽”系統(tǒng)1991年6月20日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)07/718,577(它是1990年6月20日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)07/541,108的部分延續(xù))和在Cwirla等，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)876378-6382(1980)中描述的“噬菌體上的肽”系統(tǒng)；在1994年9月2日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)08/300,262(它是以1993年10月29日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)08/144,775為基礎(chǔ)的部分連續(xù)申請(qǐng))和PCT WO 95/11,992中所述的“多核糖體系統(tǒng)”；1993年11月12日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)08/146,886(它是1992年9月16日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)07/946,239的部分連續(xù)申請(qǐng)，而后者又是1991年9月18日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)07/762,522的部分連續(xù)申請(qǐng))中所述的“編碼的合成文庫(kù)CESL”系統(tǒng)；及在美國(guó)專利號(hào)5,143,854；1990年12月13日公開(kāi)的PCT專利公開(kāi)號(hào)90/15,070；1990年12月6日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)07/624,120；Fodor等，科學(xué)251767-773(2/1991)；Dower和Fodor，Ann.Rep.Med.Chem.26271-180(1991)，1991年12月6日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)805,727中所述的“極大量固著多聚體合成”系統(tǒng)。
使用上面所述的程序，一般將隨機(jī)肽設(shè)計(jì)成在長(zhǎng)度上具有限定數(shù)目的氨基酸殘基(例如，12個(gè))。為了產(chǎn)生編碼隨機(jī)肽的寡核苷酸集合，使用密碼子基序(NNK)x限定從NNK基序產(chǎn)生的32個(gè)可能的密碼子中的任意一個(gè)，1代表12個(gè)氨基酸中的任意一個(gè)，2代表5個(gè)氨基酸中的任意一個(gè)，3代表3個(gè)氨基酸中的任一個(gè)，且只有3個(gè)終止密碼子中的一個(gè)，其中N是核苷酸A，C，G或T(等摩爾，根據(jù)所用的方法，可使用其它核苷酸)，K是G或T(等摩爾)，且x是相應(yīng)于肽中氨基酸數(shù)目的整數(shù)(例如12)。因此，NNK基序編碼了全部氨基酸，僅編碼一個(gè)終止密碼子，且減小了密碼子偏性(codon bias)。
在所用的系統(tǒng)中，隨機(jī)肽作為包含噬菌體fd衍生物的pIII或pVIII外膜蛋白的融合蛋白質(zhì)的一部分存在于噬菌體顆粒的表面(在噬菌體上的肽)或作為與LacI肽融合蛋白質(zhì)的融合蛋白結(jié)合于質(zhì)粒上(在質(zhì)粒上的肽)。
包含編碼該肽的DNA的噬菌體或質(zhì)粒使用固著TPO-R經(jīng)親和富集過(guò)程鑒定并分離。親和富集過(guò)程有時(shí)稱為“淘選”，包含多輪將噬菌體質(zhì)粒或多核糖體與固著受體溫育，收集結(jié)合于受體上的噬菌體，質(zhì)?；蚨嗪颂求w(以及所伴隨的DNA或RNA)并產(chǎn)生更多所收集的噬菌體或質(zhì)粒(以及所伴隨的LacI-肽融合蛋白)。TPO-R的細(xì)胞外區(qū)域(ECD)典型地在淘選期間使用。
經(jīng)過(guò)幾輪親和富集后，經(jīng)ELISA檢查噬菌體或質(zhì)粒及所附的肽以確定該肽是否特異性地結(jié)合TPO-R。以在親和富集過(guò)程中所用的程序相似的程序進(jìn)行該試驗(yàn)，除了去掉未結(jié)合的噬菌體后，先用兔抗噬菌體抗體，然后用堿性磷酸酶(AP)連接的羊抗兔抗體典型地處理孔。用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定各孔中堿性磷酸酶的量。用于在質(zhì)粒上的肽系統(tǒng)中的相似的ELISA程序在下面詳細(xì)描述。
經(jīng)過(guò)比較試驗(yàn)孔與對(duì)照孔(無(wú)受體)，可測(cè)定融合蛋白質(zhì)是否特異性地結(jié)合于受體上。使用放射性標(biāo)記的單價(jià)受體在以菌落轉(zhuǎn)移探測(cè)方式篩選所發(fā)現(xiàn)的結(jié)合于TPO-R上的噬菌體合并液。使用蛋白激酶A磷酸化融合到可溶性受體C末端的肯普肽序列可生產(chǎn)該探針。然后將TPO受體的“改造”形式在宿主細(xì)胞，典型地是CHO細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。經(jīng)PI-PLC收獲該受體后，測(cè)驗(yàn)該受體與TPO或TPO-R特異性的噬菌體克隆的結(jié)合。然后用32P將該受體標(biāo)記成高比活用作使用菌落轉(zhuǎn)移鑒定高親和力配體的單價(jià)探針。
然后作為游離肽(例如、無(wú)噬菌體)合成發(fā)現(xiàn)特異性地結(jié)合受體的肽并在抑制試驗(yàn)中測(cè)試。以與ELISA相似的方式進(jìn)行抑制試驗(yàn)，除了在融合蛋白前向孔中加入TPO或參考肽(對(duì)照孔有2類(1).無(wú)受體；(2).無(wú)TPO或參考肽)。與受體的結(jié)合受TPO或?qū)φ针囊种频娜诤系鞍踪|(zhì)含有在作為本發(fā)明優(yōu)選的、化合物的隨機(jī)肽部分中的肽。
TPO-R及其細(xì)胞外區(qū)域在重組宿主細(xì)胞中產(chǎn)生。TPO-R的一個(gè)有用的形式經(jīng)過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)方法在桿狀病毒轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中以可溶蛋白質(zhì)的形式表達(dá)該蛋白質(zhì)來(lái)構(gòu)建；另一個(gè)有用的形式以用于蛋白質(zhì)分泌和用于糖磷脂膜錨著附著的信號(hào)肽來(lái)構(gòu)建。該錨著附著的形式稱為“PIG-尾”。見(jiàn)Caras和Wendell，科學(xué)，2431196-1198(1989)，Lin等，科學(xué)，249677-679(1990)。
使用PIG尾系統(tǒng)，可用磷脂酶C以表達(dá)該受體的細(xì)胞表面(例如，用細(xì)胞分選儀選擇高水平表達(dá)受體的轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞)裂解該受體。裂解的受體仍包含來(lái)自用于膜附著的信號(hào)蛋白的羧基末端氨基酸序列，稱為“HPAP尾”且無(wú)需進(jìn)一步純化就可固著。重組受體蛋白質(zhì)可經(jīng)過(guò)用抗-HPAP尾抗體(Ab 179或Mab 179)覆蓋微滴度平板，用PBS中的牛血清白蛋白(BSA)封閉非特異性結(jié)合，然后將裂解的重組受體結(jié)合到抗體上來(lái)固著。使用該程序時(shí)，應(yīng)以不同濃度的受體進(jìn)行固著反應(yīng)以確定用于給定制品的最佳量，因?yàn)橹亟M蛋白的不同制品常含不同量的所需蛋白質(zhì)。另外，在親和富集過(guò)程中應(yīng)確保固著抗體完全被封閉(用PTO或一些其它的封閉化合物)。否則，未封閉的抗體在親和富集程序中可結(jié)合所需的噬菌體?？墒褂门c固著抗體結(jié)合的肽以封閉受體固著后剩余的未結(jié)合位點(diǎn)來(lái)避免該問(wèn)題或可簡(jiǎn)單地將受體直接固著于微滴度平板的孔中，無(wú)需借助于固著抗體。見(jiàn)1992年9月18日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)07/947,339，本文引用作為參考文獻(xiàn)。
當(dāng)使用允許多價(jià)配體-受體相互作用的隨機(jī)肽產(chǎn)生系統(tǒng)時(shí)，應(yīng)認(rèn)識(shí)到固著受體的密度在測(cè)定能結(jié)合固著受體的配體的親和力中是重要因素。受體密度越高(例如，用0.25至0.5mg受體處理每個(gè)用抗受體的抗體覆蓋的孔)，與較低的受體密度(例如，用0.5至1ng受體處理每個(gè)用抗受體的抗體覆蓋的孔)相比發(fā)生多價(jià)結(jié)合的可能性更大。如果發(fā)生多價(jià)結(jié)合，那么分離具有相對(duì)較低親和力的配體的可能性越大，否則將使用高密度的固著受體來(lái)鑒定榜樣化合物并使用較低的受體密度來(lái)分離更高親和力的衍生化合物。
為了辨別更高親和力的肽，常使用單價(jià)受體探針。使用蛋白激酶A磷酸化融合到可溶性受體C端的肯普肽序列可生產(chǎn)該探針。然后在宿主細(xì)胞，典型地是CHO細(xì)胞中表達(dá)TPO受體的“改造”形式。經(jīng)PI-PLC收獲受體后，試驗(yàn)該受體與TPO或TPO-R特異性的噬菌體克隆的結(jié)合。然后用32P將該受體標(biāo)記成高比活以用作單價(jià)探針來(lái)使用菌落轉(zhuǎn)移鑒定高親和力的配體。
幫助鑒定結(jié)合TPO-R的肽的優(yōu)選的篩選方法包含首先鑒定結(jié)合受體細(xì)胞外區(qū)域的榜樣肽，然后制備類似于榜樣肽的其它肽。具體地說(shuō)，使用在噬菌體上的基于pIII或pVIII的肽系統(tǒng)，可篩選隨機(jī)文庫(kù)以發(fā)現(xiàn)存在結(jié)合TPO-R的肽的噬菌體。測(cè)序噬菌體DNA以確定在噬菌體表面的肽。
從隨機(jī)線型10聚體pVIII文庫(kù)和隨機(jī)環(huán)狀10聚體和12聚體pVIII文庫(kù)鑒定能特異性結(jié)合TPO-R的克隆。這些肽的序列用作構(gòu)建其它肽文庫(kù)的基礎(chǔ)該文庫(kù)設(shè)計(jì)成含高頻率的開(kāi)始鑒定的肽的衍生物?？珊铣蛇@些文庫(kù)以幫助生產(chǎn)與結(jié)合肽僅有幾個(gè)殘基區(qū)別的肽。這一方案包括合成具有結(jié)合肽編碼序列的寡核苷酸，除了在合成中不使用四種核苷三磷酸中的每一種的純制品，而使用四種核苷三磷酸的混合物(即，55％的“正確”核苷酸及其它三種核苷酸各15％是用于該目的的優(yōu)選的混合物，70％的“正確”核苷酸及其它三種核苷酸各10％是用于該目的的另一種優(yōu)選的混合物)以產(chǎn)生編碼該結(jié)合肽的序列的衍生物。
使用各種方法經(jīng)過(guò)制備“基序誘變”文庫(kù)來(lái)衍變榜樣肽。這些包括pVIII噬菌粒誘變文庫(kù)，該文庫(kù)以70∶10∶10∶10頻率誘變的共有序列為基礎(chǔ)，用隨機(jī)殘基在各末端延伸以產(chǎn)生包括序列XXXX(C，S，P或R)TLREWL XXXXX X(C或S)的克隆。使用在質(zhì)粒上的肽系統(tǒng)構(gòu)建相似的延伸/誘變文庫(kù)以產(chǎn)生包括序列XXXXX(C，S，P或R)TLREWLXXXXXXX的克隆。使用多核糖體演示系統(tǒng)構(gòu)建另一延伸/誘變文庫(kù)，XXXX(C，S，P或R)TLREWL XXXXXX(C或S)。用肽洗脫篩選所有這三個(gè)文庫(kù)并用放射性標(biāo)記的單價(jià)受體探測(cè)。
“在質(zhì)粒上的肽”技術(shù)也用于肽篩選和誘變研究并在美國(guó)專利號(hào)5,338,665中有更詳細(xì)的描述，本文引用該文獻(xiàn)作為參考文獻(xiàn)用于各種目的。根據(jù)本方法，通過(guò)從攜帶融合基因的質(zhì)粒載體進(jìn)行表達(dá)將隨機(jī)肽融合到LacI的C末端。LacI-肽融合物與其編碼的DNA的連接經(jīng)過(guò)在質(zhì)粒上的LacO序列進(jìn)行，形成穩(wěn)定的肽-LacI-質(zhì)粒復(fù)合物，它能在固著受體上經(jīng)親和純化(淘選)進(jìn)行篩選。然后以電穿孔將由此分離的質(zhì)粒重新導(dǎo)入大腸桿菌中以擴(kuò)增用于另一輪篩選或用于單個(gè)克隆檢查的選定群體。
另外，使用修飾的C-端Lac-I演示系統(tǒng)進(jìn)行篩選和誘變研究，其中演示效價(jià)減小(“頭狀二聚體”演示系統(tǒng))。篩選該文庫(kù)，并將所得的DNA插入片段作為一個(gè)集合克隆進(jìn)麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)載體中使其作為C端融合蛋白表達(dá)。然后按上面所討論的，以ELISA方式分析隨機(jī)挑選的單個(gè)MBP融合克隆的粗制細(xì)胞裂解產(chǎn)物的TPO-R結(jié)合。
使用多核糖體顯示系統(tǒng)也進(jìn)行了肽誘變研究，如在1994年9月2日申請(qǐng)的共同未決申請(qǐng)美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)08/300,262(它是以1993年10月29日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)08/144,775為基礎(chǔ)的部分連續(xù)申請(qǐng))和PCT WO 95/11,992中所述，本文引用其每一篇作為參考文獻(xiàn)用于各種目的。根據(jù)序列XXX X(C，P，R或S)tlrefl XXXXXX(C或S)構(gòu)建誘變文庫(kù)，其中X代表隨機(jī)NNH密碼子，小寫(xiě)字母代表在位置1和2含70∶10∶10∶10誘變，在密碼子位置3是K(G或T)的氨基酸密碼子。用固著在磁珠上的TPO受體淘選該文庫(kù)5輪。第5輪后，將PCR擴(kuò)增庫(kù)克隆進(jìn)pAFF6且測(cè)序ELISA陽(yáng)性克隆。將該序列亞克隆進(jìn)MBP載體，經(jīng)MBP ELISA測(cè)定其結(jié)合親和力。
為了固著用于多核糖體篩選的TPO-R，按廠家所述首先將Ab 179化學(xué)連接到甲苯磺酰激活的磁珠(可從Dynal Corporation獲得)。用在0.5M硼酸緩沖液(pH9.5)中的抗體在室溫下保溫磁珠過(guò)夜。洗滌磁珠并與含TPO-R的“HPAP”尾結(jié)合。將抗體覆蓋的磁珠和受體在4℃培養(yǎng)1小時(shí)，在加入多核糖體文庫(kù)前再次洗滌磁珠。
按上面所述篩選各文庫(kù)產(chǎn)生的TPO受體結(jié)合肽在下面表1和2中顯示，其它未在本文中列出。
為了再創(chuàng)造在噬菌體上出現(xiàn)的精確序列，在合成肽的N端和C端氨基酸前常加上一個(gè)或兩個(gè)甘氨酸殘基。據(jù)信這些甘氨酸對(duì)結(jié)合或活性不是必須的。同樣，為模擬在多核糖體上出現(xiàn)的肽的精確序列，常在合成肽的C端氨基酸之前加上序列MAS。據(jù)信該序列對(duì)結(jié)合或活性也不是必須的。
IC50值用符號(hào)“-”，“+”和“+ +”來(lái)表示。例如，顯示IC50值超過(guò)200μM的那些肽表示為“-”。IC50值小于或等于200μM的那些肽表示為“+”，產(chǎn)生IC50值為500nm或更小的那些肽表示為“++”。產(chǎn)生的IC50值位于或靠近特定符號(hào)的臨界點(diǎn)的那些肽用雜合標(biāo)記、例如“+/-”表示。IC50值檢測(cè)不到的那些肽列為“N.D”。具有結(jié)構(gòu)GGCTLREWLHGGFCGG的肽的IC50值為500nm或更小。(注意在N端和C端氨基酸前加兩個(gè)甘氨酸以再產(chǎn)生由噬菌體顯示的精確序列。據(jù)信這些甘氨酸對(duì)結(jié)合或活性不是必須的)。
表3
上述表格，特別是在表3中說(shuō)明了優(yōu)選的核心肽包含氨基酸序列X1X2X3X4X5X6X7，其中，X1是C，L，M，P，Q，V；X2是F，K，L，N，Q，R，S，T或V；X3是C，F(xiàn)，I，L，M，R，S，V或W；X4是20個(gè)遺傳編碼的L-氨基酸中的任意一個(gè)；X5是A，D，E，G，K，M，Q，R，S，T，V或Y；X6是C，F(xiàn)，G，L，M，S，V，W或Y；X7是C，G，I，K，L，M，N，R或V。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，核心肽包含氨基酸序列X8G X1X2X3X4X5W X7，其中，X1是L，M，P，Q或V；X2是F，R，S或T；X3是F，L，V，或W；X4是A，K，L，M，R，S，V或T；X5是A，E，G，K，M，Q，R，S或T；X7是C，I，K，L，M或V；且每個(gè)X8殘基獨(dú)立地選自20個(gè)遺傳編碼的L-氨基酸中的任意一個(gè)，其立體異構(gòu)體D-氨基酸和非天然氨基酸。優(yōu)選的是，各X8殘基獨(dú)立地選自20個(gè)遺傳編碼的L-氨基酸中的任意一個(gè)及其立體異構(gòu)體D-氨基酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，X1是P，X2是T；X3是L；X4是R；X5是E或Q；X7是I或L。
更優(yōu)選的是，核心肽包含氨基酸序列X9X8G X1X2X3X4X5WX7，其中X9是A，C，E，G，I，L，M，P，R，Q，S，T或V；X8是A，C，D，E，K，L，Q，R，S，T或V。更優(yōu)選的是，X9是A或I；X8是D，E或K。
特別優(yōu)選的肽包括G G C A D G P T L R E W I S F C G G；G N AD G P T L R Q W L E G R R P K N；G G C A D G P T L R E W I S F C G GK；T I K G P T L R Q W L K S R E H T S；S I E G P T L R E W L T S R T PH S；L A I E G P T L R Q W L H G N G R D T；C A D G P T L R E W I S FC；和I E G P T L R Q W L A A R A。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的優(yōu)選的肽包括具有包含氨基酸序列C X2X3X4X5X6X7的核心結(jié)構(gòu)的肽；其中X2是K，L，N，Q，R，S，T或V；X3是C，F(xiàn)，I，L，M，R，S或V；X4是20個(gè)遺傳編碼的L-氨基酸中的任意一個(gè)；X5是A，D，E，G，S，V或Y；X6是C，F(xiàn)，G，L，M，S，V，W或Y；X7是C，G，I，K，L，M，N，R或V。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，X4是A，E，G，H，K，L，M，P，Q，R，S，T或W。在另一實(shí)施方案中，X2是S或T；X3是L或R；X4是R；X5是D，E或G；X6是F，L，或W；X7是I，K，L，R或V。特別優(yōu)選的肽包括G G C T L R E W L H GG F C G G。
在另一實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的優(yōu)選的肽包括具有包含氨基酸序列X8C X2X3X4X5X6X7的結(jié)構(gòu)的肽，其中X2是F，K，L，N，Q，R，S，T或V；X3是C，F(xiàn)，I，L，M，R，S，V或W；X4是20個(gè)遺傳編碼的L-氨基酸中的任意一個(gè)；X5是A，D，E，G，K，M，Q，R，S，T，V或Y；X6是C，F(xiàn)，G，L，M，S，V，W或Y；X7是C，G，I，K，L，M，N，R或V；X8是20個(gè)遺傳編碼的L-氨基酸中的任意一個(gè)。在一些實(shí)施方案中，X8優(yōu)選是G，S，Y或R。
具有IC50大于大約100μM的肽和肽模擬物缺乏允許用于本發(fā)明的診斷或治療方面的足夠結(jié)合力。優(yōu)選的是，對(duì)于診斷目的，肽和肽模擬物IC50大約為2mM或更少，對(duì)于藥用目的，肽和肽模擬物IC50為大約100μM或更少。
結(jié)合的肽序列也提供了測(cè)定本發(fā)明的結(jié)合TPOR的化合物的最小大小。使用“編碼的合成文庫(kù)”(ESL)系統(tǒng)或“極大量固著多聚體合成”系統(tǒng)不僅可測(cè)定具有該活性的肽的最小大小，也可制備所有形成與優(yōu)選的基序(或該基序的最小大小)有一個(gè)，2個(gè)或多個(gè)殘基區(qū)別的肽組中的肽。然后可篩選該肽的集合與TPO-受體結(jié)合的能力。這些固著多聚體合成系統(tǒng)或其它肽合成方法也可用于合成截短的類似物，缺失類似物，取代類似物及本發(fā)明的所有肽化合物的組合。
本發(fā)明的肽和肽模擬物也在血小板生成素依賴型細(xì)胞增殖試驗(yàn)中進(jìn)行了評(píng)價(jià)，如在下面實(shí)施例2中進(jìn)行了更詳細(xì)的描述。用本領(lǐng)域已知的技術(shù)測(cè)量細(xì)胞增殖，如與3H-胸苷摻入作細(xì)胞增殖指示相關(guān)的MTT試驗(yàn)(見(jiàn)Mossmann，免疫學(xué)方法雜志，6555(1983))。試驗(yàn)的肽以劑量依賴性方式刺激TPO-R轉(zhuǎn)染的Ba/F3細(xì)胞的增殖，如圖1A所示。這些肽對(duì)親代細(xì)胞系無(wú)影響，如圖1B所示。
圖7至9顯示了評(píng)價(jià)本發(fā)明的肽和肽模擬物的活性的進(jìn)一步試驗(yàn)的結(jié)果。在該試驗(yàn)中，用carboplatin制備血小板減少癥的小鼠。圖7描繪了在第0天用carboplatin(125mg/kg，腹膜內(nèi))處理Balb/C小鼠時(shí)的典型結(jié)果。虛線代表三個(gè)實(shí)驗(yàn)中未處理的動(dòng)物。實(shí)線代表在三個(gè)實(shí)驗(yàn)中carboplatin處理的組。粗實(shí)線代表以前的數(shù)據(jù)。圖8描繪了用所示量的carboplatin(mg/kg，在第0天腹膜內(nèi)(ip)注射)處理的小鼠中carboplatin滴定對(duì)血小板計(jì)數(shù)的影響。圖9描繪了用肽AF12513(513)在第10天對(duì)carboplatin誘導(dǎo)的血小板減少癥的改善。在第0天施用carboplatin(CBP；50-125mg/kg，腹膜內(nèi)注射)。在第1-9天施用AF 12513(1mg/kg，ip)。這些結(jié)果顯示了本發(fā)明的肽能改善小鼠模型中的血小板減少癥。
另外，本發(fā)明的某些肽可二聚體化或寡聚體化，從而增加該化合物的親和力和/或活性。為了研究肽二聚體化/寡聚化對(duì)細(xì)胞增殖試驗(yàn)中TPO模擬潛力的影響，合成了肽G G C A D G P T L R E W I S F C G G的C端生物素化類似物(G G C A D G P T L R E W I S F C G G K(生物素))。用在無(wú)血清的HEPES緩沖的RPMI中的鏈霉抗生素蛋白以4∶1的摩爾比預(yù)培養(yǎng)該肽。試驗(yàn)該復(fù)合物對(duì)TPO-R轉(zhuǎn)染的Ba/F3細(xì)胞的細(xì)胞增殖的刺激，如上所述，對(duì)游離的生物素標(biāo)記的肽和未用生物素標(biāo)記的親本肽進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。圖2A顯示了對(duì)轉(zhuǎn)染的和親本細(xì)胞系，復(fù)合的生物素標(biāo)記的肽(具有鏈霉抗生物素蛋白(SA)的AF12885)的試驗(yàn)結(jié)果。圖2B顯示了對(duì)轉(zhuǎn)染的和親本細(xì)胞系，游離的生物素標(biāo)記的肽(AF12285)的試驗(yàn)結(jié)果。圖2C顯示了對(duì)轉(zhuǎn)染的和親本細(xì)胞系，鏈霉抗生物素蛋白單獨(dú)試驗(yàn)的結(jié)果。這些


了預(yù)先形成的復(fù)合物的效力大約是自由肽的10倍。
經(jīng)過(guò)研究肽對(duì)促紅細(xì)胞生成素受體(EPO-R)的交叉反應(yīng)性也檢查了本發(fā)明的肽的結(jié)合特異性和活性。EPO-R與TPO-R一樣，也是血細(xì)胞生成素生長(zhǎng)因子受體家族的一個(gè)成員。在使用EPO-依賴型細(xì)胞系的細(xì)胞增殖試驗(yàn)中檢查了本發(fā)明的肽，以及TPO，EPO和已知的EPO結(jié)合肽。該試驗(yàn)利用了FDCP-1，一種生長(zhǎng)因子依賴型鼠多潛能原始造血祖先細(xì)胞系(見(jiàn)，例如，Dexter等，實(shí)驗(yàn)方法雜志，1521036-1047(1981))作為親代細(xì)胞系。當(dāng)補(bǔ)充WEHI-3-條件培養(yǎng)基(含IL-3，ATCC號(hào)T1B68的培養(yǎng)基)時(shí)，該細(xì)胞系能增殖，但不能分化。用人或鼠EPO-R轉(zhuǎn)染親代細(xì)胞系以產(chǎn)生FDCP-1-EPO-R細(xì)胞系。在人或鼠EPO存在的條件下，這些轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系能增殖，但不能分化。
在必需生長(zhǎng)因子存在下細(xì)胞生長(zhǎng)到半靜止期密度。然后將細(xì)胞在PBS中洗滌，并在無(wú)生長(zhǎng)因子的全培養(yǎng)基中饑餓16-24小時(shí)。測(cè)定細(xì)胞的存活力后，制備貯液(在無(wú)生長(zhǎng)因子的全培養(yǎng)基中)以產(chǎn)生每50微升105個(gè)細(xì)胞的溶液。在96孔組織培養(yǎng)平板中以每孔50μl的終體積制備待測(cè)化合物的系列稀釋液(典型地是，相對(duì)于結(jié)合相或其它結(jié)合或固著肽的游離溶液相肽)。向各孔中加入細(xì)胞(50μl)，細(xì)胞培養(yǎng)24-48小時(shí)，此時(shí)陰性對(duì)照死亡或休眠。然后用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，如MTT試驗(yàn)測(cè)量細(xì)胞增殖。
圖3A-G顯示了一系列對(duì)照實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；顯示了TPO，本發(fā)明的肽，EPO和EPO-R結(jié)合肽在使用TPO-R轉(zhuǎn)染的Ba/F3細(xì)胞系及其相應(yīng)的親代細(xì)胞系，或EPO依賴型細(xì)胞系及其相應(yīng)的親代細(xì)胞系的細(xì)胞增殖試驗(yàn)中的活性。圖3A描述了TPO在使用TPO-R轉(zhuǎn)染的Ba/F3細(xì)胞系及其相應(yīng)的親代細(xì)胞系的細(xì)胞增殖試驗(yàn)中的結(jié)果。圖3B描述了EPO在使用TPO-R轉(zhuǎn)染的Ba/F3細(xì)胞系及其相應(yīng)的親代細(xì)胞系的細(xì)胞增殖試驗(yàn)中的結(jié)果。圖3C描述了復(fù)合的生物素標(biāo)記的肽(具有鏈霉抗生物素蛋白(SA)的AF12285)和生物素標(biāo)記的EPO-R結(jié)合的肽的復(fù)合形式(具有SA的AF11505)在TPO-R轉(zhuǎn)染的Ba/F3細(xì)胞系中的結(jié)果。相應(yīng)的親代細(xì)胞系的結(jié)果在圖3D中顯示。圖3E描述了TPO在使用EPO依賴型細(xì)胞系的細(xì)胞增殖試驗(yàn)中的結(jié)果。圖3F描述了EPO在使用EPO依賴性細(xì)胞系的細(xì)胞增殖試驗(yàn)中的結(jié)果。圖3G描述了復(fù)合的生物素標(biāo)記的肽(具有鏈霉抗生物素蛋白(SA)的AF12285)和生物素標(biāo)記的EPO-R結(jié)合肽的復(fù)合形式(具有SA的AF11505)在EPO-依賴性細(xì)胞系中的結(jié)果。這些結(jié)果表明本發(fā)明的肽以高度特異性結(jié)合并激活TPO-R。
IV.肽和肽模擬物的制備A.固相合成本發(fā)明的肽可用本領(lǐng)域已知的經(jīng)典方法，例如，經(jīng)過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)固相技術(shù)來(lái)制備。標(biāo)準(zhǔn)方法包括專一固相合成，部分固相合成方法，片段濃縮，經(jīng)典溶液合成，甚至使用重組DNA技術(shù)。見(jiàn)，例如，Merrifield，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志，852149(1963)，本文作為參考文獻(xiàn)引用。在固相上，使用α-氨基保護(hù)的樹(shù)脂典型地從肽的C末端開(kāi)始合成?？芍苽浜线m的起始物質(zhì)，例如，經(jīng)過(guò)將所需的α-氨基附著到氯甲基化的樹(shù)脂，羥甲基樹(shù)脂或二苯甲基胺樹(shù)脂上。一種這類氯甲基化樹(shù)脂是由Bio Rad實(shí)驗(yàn)室，Richmond，CA以商品名BIO-BEAPS SX-1提供的固體，羥甲基樹(shù)脂的制備由Bodonszky等，Chem.Ind.(倫敦)381597(1966)所述。二苯甲基胺(BHA)樹(shù)脂由Pietta和Marshall Chem.Commn.650(1970)描述且可從Beckman Instrument，Inc.，Palo Alto，CA以鹽酸形式買(mǎi)到。
因此，根據(jù)Gisin Helv.Chim.Acta561467(1973)所述的方法借助于，例如碳酸氫銫催化劑將α-氨基保護(hù)的氨基酸偶聯(lián)到氯甲基化樹(shù)脂上可制備本發(fā)明的化合物。開(kāi)始偶聯(lián)后，經(jīng)過(guò)選擇在有機(jī)溶劑中的包括三氟乙酸(TFA)或鹽酸(HCl)溶液的試劑在室溫下去掉α-氨基保護(hù)的基團(tuán)。
α氨基保護(hù)基團(tuán)是已知在肽的合成步驟領(lǐng)域中有用的那些基團(tuán)。包括?；惐Ｗo(hù)基團(tuán)(例如，甲?；阴；阴；?，芳香族尿烷類保護(hù)基團(tuán)(例如，芐氧羧基(cbz)和取代的cbz)，脂肪族尿烷保護(hù)基團(tuán)(例如，t-丁烷氧基羰基(Boc)，異丙烷氧基羰基，環(huán)己烷氧基羰基)和烷基型保護(hù)基團(tuán)(例如，芐基，三苯基甲基)。Boc和Fmoc是優(yōu)選的保護(hù)基團(tuán)。側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)在偶聯(lián)期間保持完整，且在氨基末端保護(hù)基團(tuán)去保護(hù)期間或偶聯(lián)期間不被裂解。在完成最終肽合成時(shí)，在不改變靶肽的反應(yīng)條件下側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)應(yīng)可去掉。
Tyr的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)包括四氫吡喃基，叔丁基，三苯甲游基，芐基，Cbz，Z-Br-Cbz，和2，5-二氯芐基。Asp的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)包括芐基2，6-二氯芐基，甲基，乙基和環(huán)己烷基。Thr和Ser的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)包括乙?；?，苯甲?；郊子位?，四氫吡喃基，芐基，2，6-二氯芐基和Cbz。Thr和Ser的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)是芐基。Arg的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)包括硝基，甲苯磺酰基(Tos)，Cbz，金剛烷氧基羰基，菜?；酋；?Mts)或Boc。Lys的側(cè)鏈保護(hù)基包括Cbz，2-氯芐氧基羰基(2-Cl-Cbz)，2-溴芐氧基羰基(2-BrCbz)，Tos或Boc。
去掉α-氨基保護(hù)基后，剩余的保護(hù)氨基以所需的順序分步偶聯(lián)。過(guò)量的各種保護(hù)的氨基酸一般在溶液，例如，在二氯甲烷(CH2Cl2)，二甲基甲酰胺(DMF)的混合物中與合適的羧基激活劑，如二環(huán)己烷基碳化二亞胺(DCC)使用。
完成所需的氨基酸序列后，經(jīng)過(guò)用諸如三氟乙酸或氟化氫(HF)的試劑處理從樹(shù)脂支持物上裂解下所需的肽，所用的試劑不僅從樹(shù)脂上裂解下肽，而且還裂解所有剩余的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。當(dāng)使用氯甲基化的樹(shù)脂時(shí)，氟化氫處理導(dǎo)致形成游離的肽酸。當(dāng)使用二苯甲基胺樹(shù)脂時(shí)，氟化氫處理直接產(chǎn)生游離的肽酰胺。另外，當(dāng)使用氟甲基化樹(shù)脂是，經(jīng)過(guò)用氯處理肽樹(shù)脂可裂解側(cè)鏈保護(hù)的肽以產(chǎn)生所需側(cè)鏈保護(hù)的酰胺或用烷基胺處理產(chǎn)生側(cè)鏈保護(hù)的烷基酰胺或二烷基酰胺。然后經(jīng)過(guò)用氟化氫處理以通常的方式去掉側(cè)鏈保護(hù)以產(chǎn)生自由酰胺，烷基酰胺或二烷基酰胺。
這些固相肽合成程序在本領(lǐng)域中是熟知的且在Stewart的固相肽合成(Freeman和Co.，San Francisco，(1969))中有進(jìn)一步的描述。
使用在1990年3月7日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)07/492,462；1990年12月6日申請(qǐng)的07/624,120；和1991年12月6日申請(qǐng)的07/805,727中描述的“編碼的合成文庫(kù)”或極大量固著多聚體合成”系統(tǒng)；不僅可測(cè)定具有該活性的肽的最小大小，還能制備形成與優(yōu)選的基序(或該基序的最小大小)具有一個(gè)，二個(gè)或多個(gè)殘基區(qū)別的肽組的所有肽。然后可篩選該肽的集合中結(jié)合TPO-R的能力。也可使用固著多聚體合成系統(tǒng)或其它的肽合成方法以合成本發(fā)明的所有肽化合物的截短類似物，缺失類似物和截短及缺失組合的類似物。
B.合成的氨基酸也可使用這些程序合成這樣一類肽，其中在本發(fā)明的任一化合物的一個(gè)，二個(gè)或多個(gè)位置被不同于20個(gè)天然存在的，遺傳編碼的氨基酸的其它氨基酸取代。例如，萘基丙氨酸可取代色氨酸，有利于合成?？扇〈M(jìn)本發(fā)明的肽中的其它合成氨基酸包括L-羥丙基，L-3，4-二羥基苯丙氨酰基，d氨基酸，如L-d-羥基賴氨?；虳-d-甲基丙氨?；?，L-α-甲基丙氨?；?，b氨基酸和異喹啉基。D氨基酸和非天然存在的合成氨基酸也可摻入本發(fā)明的肽中。
可用其它側(cè)鏈取代20種遺傳編碼的氨基酸(或D氨基酸)的天然存在的側(cè)鏈，例如，所用的基團(tuán)有烷基，低級(jí)烷基，環(huán)狀4-，5-，6-至7數(shù)的烷基，酰胺，酰胺低級(jí)烷基，酰胺二(低級(jí)烷基)，低級(jí)烷氧基，羥基，羧基及其低級(jí)酯衍生物，和具有4-，5-，6-，到7個(gè)原子數(shù)的雜環(huán)。特別是可使用脯氨酸類似物，其中脯氨酸殘基的環(huán)大小從5個(gè)變成4，6或7個(gè)原子數(shù)。環(huán)狀基團(tuán)可以是飽和的或不飽和的，且如果是不飽和的，可以是芳香族或非芳香族的。
環(huán)狀基團(tuán)可以是飽和的或非飽和的，且如果是非飽和的，可以是芳香族的或非芳香族的。雜環(huán)基團(tuán)優(yōu)選含有一個(gè)或多個(gè)氮，氧和/或硫雜原子。該基團(tuán)的例子包括furazanyl，呋喃基，咪唑烷基，咪唑基，咪唑啉基，異噻唑基，異噁唑基，嗎啉基(例如，嗎啉代)，噁唑基，哌嗪基(例如，1-哌嗪基)，哌啶基(例如，1-哌啶基，哌啶子基)，吡喃基，吡嗪基，吡唑烷基，吡啶啉基，吡唑基，噠嗪基，吡啶基，嘧啶基，吡咯烷基(例如1-吡咯烷基)，吡咯啉基，吡咯基，噻二唑基，噻唑基，噻吩基，硫嗎啉基(例如，硫嗎啉代)，和三唑基。這些雜環(huán)基團(tuán)可以是取代的或未取代的。如果該基團(tuán)是取代的，取代基可以是烷基，烷氧基，鹵素，氧或取代的或未取代的苯基。
經(jīng)磷酸化也可較容易地修飾本發(fā)明的肽，制備本發(fā)明的化合物的肽衍生物的其它方法在Hruby等中描述。因此，本發(fā)明的肽化合物也用作制備具有相似生物學(xué)活性的肽模擬物的基礎(chǔ)。
包括太模擬物的本發(fā)明的肽化合物可共價(jià)修飾到一個(gè)或多個(gè)各種非蛋白質(zhì)類多聚體上，例如，聚乙二醇，聚丙二醇或聚氧鏈烯烴上，修飾方式在美國(guó)專利號(hào)4,640,835；美國(guó)專利號(hào)4,496,689；美國(guó)專利號(hào)4,301,144；美國(guó)專利號(hào)4,670,417；美國(guó)專利號(hào)4,791,192，或美國(guó)專利號(hào)4,179,337中闡述，本文以參考文獻(xiàn)引用這些文獻(xiàn)的全文。
C.末端修飾本領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到可獲得各種技術(shù)用于構(gòu)建與相應(yīng)的肽化合物具有相同或相似的所需生物學(xué)活性但在可溶性，穩(wěn)定性和對(duì)水解及蛋白裂解的敏感性方面具有更合適的活性的肽模擬物。例如，見(jiàn)Morgan和Gainor，Ann.Rep.Med Chem.24243-252(1989)。下面描述了用于制備在N端氨基，C端羧基修飾的，和/或?qū)㈦闹械囊粋€(gè)或多個(gè)酰胺鍵改變成非酰胺鍵的肽模擬物的方法。應(yīng)明白2個(gè)或多個(gè)這類修飾可偶聯(lián)于一個(gè)肽模擬結(jié)構(gòu)中(例如，在C端羧基的修飾且包含在該肽的兩個(gè)氨基酸之間有一個(gè)-CH2-氨基甲酸酯鍵。
1.N端修飾典型地是，以游離酸的形式合成肽，但如上所述以酰胺或酯的形式也能較容易地制備肽。也可修飾本發(fā)明的肽化合物的氨基和/或羧基末端以生產(chǎn)本發(fā)明的其它化合物。氨基末端修飾包括甲基化(即，-NHCH3或-NH(CH3)2。乙?；?，加入芐氧羧基，或用含RCOO-限定的羧基化官能團(tuán)的封閉基團(tuán)封閉氨基末端，其中R選自萘基，吖啶基，甾族基和相似基團(tuán)。羧基末端修飾包括用羧酰胺基取代游離酸或在羧基末端形成環(huán)內(nèi)酰胺以導(dǎo)入結(jié)構(gòu)限制。
氨基末端修飾如上所述且包括烷基化，乙酰基化，加上芐氧羰基，形成琥珀酰亞胺等。具體地說(shuō)，N-端氨基可按如下反應(yīng)(a).為了形式通式RC(O)NH-的酰胺基，其中R限定如上，經(jīng)過(guò)與?；u[例如，RC(O)Cl]或酸酐進(jìn)行反應(yīng)。典型的是，經(jīng)過(guò)將大約等摩爾或過(guò)量(例如，大約5當(dāng)量)的酸酐與惰性稀釋劑(例如，二氯甲烷)中的肽接觸進(jìn)行反應(yīng)，優(yōu)選含過(guò)量(例如，大約10當(dāng)量)的叔胺，如二異丙基乙胺以清除反應(yīng)期間產(chǎn)生的酸。另外，反應(yīng)條件是常規(guī)的(例如，室溫30分鐘)。將末端氨基烷基化以提供低級(jí)烷基N-取代，接著與上面所述的酸酐反應(yīng)，以提供通式RC(O)NR-的N-烷基酰胺基。
(b).與琥珀酸酐反應(yīng)形成琥珀酰亞胺。與前面一樣，可使用大約等摩爾量或過(guò)量的琥珀酸酐(例如，大約5當(dāng)量)，用本領(lǐng)域熟知的方法將氨基轉(zhuǎn)變成琥珀酰亞胺，包括使用過(guò)量(如，10當(dāng)量)的叔胺，如在合適的惰性溶劑(例如，二氯甲烷)中的二異丙基乙胺。例如，見(jiàn)Wollenberg等，美國(guó)專利號(hào)4,612,132，本文引用其全文作為參考文獻(xiàn)。應(yīng)明白可用例如，以常規(guī)方式制備的C2-C6烷或-SR取代基取代琥珀酸基以提供在肽的N端的取代的琥珀酰亞胺。以Wollenberg等，出處同上，所述的方式經(jīng)過(guò)將低級(jí)烯烴(C2-C6)與馬來(lái)酸酐反應(yīng)制備該烷基取代，經(jīng)過(guò)將RSH與馬來(lái)酸酐反應(yīng)制備-SR取代基，其中R限定如上；(c).經(jīng)過(guò)與存在于合適的惰性稀釋劑(例如，二氯甲烷)中的大約等當(dāng)量或過(guò)量的CBZ-Cl(即芐氧羰基氯)或取代的CBZ-Cl反應(yīng)形成芐氧羰基-NH-或取代的芐氧羰基-NH-，優(yōu)選含有叔胺以清除反應(yīng)中產(chǎn)生的酸；(d).經(jīng)過(guò)與在合適的惰性稀釋劑(二氯甲烷)中的等量或過(guò)量(例如，5當(dāng)量)的R-S(O)2Cl反應(yīng)形成氨磺?；?，將末端胺轉(zhuǎn)變成氨磺酰，其中R如上面所限定。優(yōu)選的是，惰性稀釋劑含過(guò)量叔胺(例如，10當(dāng)量)如二異丙基乙胺以清除反應(yīng)期間產(chǎn)生的酸。另外，反應(yīng)條件是常規(guī)的(例如，室溫下30分鐘)；(e).經(jīng)過(guò)與在合適的惰性稀釋劑(例如，二氯甲烷)中的等量或過(guò)量(例如，5當(dāng)量)的R-OC(O)Cl或R-OC(O)OC6H4-P-NO2反應(yīng)形成氨基甲酸酯，將末端胺轉(zhuǎn)變成氨基甲酸酯，其中R限定如上。優(yōu)選的是，惰性稀釋劑含過(guò)量(例如，大約10當(dāng)量)叔胺，如二異丙基乙胺，以清除反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的酸。另外，反應(yīng)條件是常規(guī)的(例如，室溫30分鐘)；(f).經(jīng)過(guò)與在合適的惰性稀釋劑(例如，二氯甲烷)中的等量或過(guò)量(例如，5當(dāng)量)的R-N＝C＝O反應(yīng)形成脲基，將末端胺轉(zhuǎn)變成脲(即，RNHC(O)NH-)基，其中R限定如上。優(yōu)選的是，惰性稀釋劑含過(guò)量(例如，大約10當(dāng)量)的叔胺，如二異丙基乙胺。另外，反應(yīng)條件是常規(guī)的(例如，室溫下大約30分鐘)。
2.C端修飾在制備C端羧基被酯(即-C(O)OR，其中R限定如上)取代的肽模擬物時(shí)，采用用于制備肽酸的樹(shù)脂，側(cè)鏈保護(hù)的肽用堿和合適的醇，如甲醇裂解。然后經(jīng)過(guò)用氟化氫處理以常規(guī)方式去掉側(cè)鏈保護(hù)的基團(tuán)以獲得所需的酯。
在制備C端羧基被酰胺-C(O)NR3R4取代的肽模擬物時(shí)，使用二苯甲基胺樹(shù)脂作為肽合成的固相支持物，合成完成時(shí)，氟化氫處理從支持物上釋放該肽直接產(chǎn)生游離的肽酰胺(即，C端是-C(O)NH2)。另外，在肽合成過(guò)程中使用氯甲基化的樹(shù)脂，結(jié)合與氨反應(yīng)以便從支持物上裂解下側(cè)鏈?zhǔn)鼙Ｗo(hù)的肽產(chǎn)生游離肽酰胺，與烷基胺或二烷基胺反應(yīng)產(chǎn)生側(cè)鏈?zhǔn)鼙Ｗo(hù)的烷基酰胺或二烷基酰胺(即，C端是-C(O)NRR1，其中R和R1限定如上)。然后經(jīng)過(guò)用氟化氫處理以常規(guī)方式去掉側(cè)鏈保護(hù)以產(chǎn)生游離酰胺，烷基酰胺或二烷基酰胺。
在另一任選的實(shí)施方案中，經(jīng)過(guò)分別用N端氨基內(nèi)部取代羧基或酯上的-Oh或酯(-OR)誘導(dǎo)C端羧基或C端酯環(huán)化形成環(huán)狀肽。例如，合成并裂解產(chǎn)生肽酸后，用合適的羧基激活物，如在二氯甲烷(CH2Cl2)，二甲基酰胺(DMF)混合物的溶液中的二環(huán)己烷基碳化二亞胺(DCC)將游離酸轉(zhuǎn)變成激活的酯。然后經(jīng)過(guò)用N端胺內(nèi)部取代激活的酸形成環(huán)狀肽。與聚合相反，經(jīng)過(guò)使用極稀的溶液可增強(qiáng)內(nèi)部環(huán)化。該方法在本領(lǐng)域中是熟知的。
也可環(huán)化本發(fā)明的肽或在肽末端摻入脫氨基或脫羧基的殘基，以便沒(méi)有末端氨基或羧基，以減小對(duì)蛋白酶的敏感性或限制該肽的構(gòu)象。本發(fā)明的化合物的C端官能團(tuán)包括酰胺，酰胺低級(jí)烷基，酰胺二(低級(jí)烷基)，低級(jí)烷氧基，羥基和羧基，及其低級(jí)酯衍生物和其藥用上可接受的鹽。
D.主鏈修飾制備本發(fā)明的化合物的肽衍生物的其它方法在Hruby等，生化雜志，268(2)249-262(1990)中描述，本文引用作為參考文獻(xiàn)。因此，本發(fā)明的肽化合物也用作具有相似生物學(xué)活性的非肽類化合物的結(jié)構(gòu)模型。本領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到可使用各種技術(shù)來(lái)構(gòu)建與榜樣肽化合物具有相同或相似的所需生物學(xué)活性但在可溶性，穩(wěn)定性和對(duì)水解和蛋白裂解的敏感性方面比榜樣肽具有更合適的活性的化合物。見(jiàn)Morgan和Gainor，Ann.Rep.Med.Chem.24243-252(1989)，本文以參考文獻(xiàn)引用。這些技術(shù)包括用由磷酸化物，酰胺化物，氨基甲酸酯，氨磺酰，仲胺，和N-甲基氨基酸。
一個(gè)或多個(gè)肽基鍵[-C(O)NH-]被諸如-CH2-氨基甲酸酯鍵，磷酸酯鍵，-CH2-氨磺酰鍵，脲鍵，仲胺(-CH2NH-)鍵和烷基化肽酰鍵[-C(O)NR6-其中R6是低級(jí)烷基]的鍵取代的肽模擬物在常規(guī)肽合成期間制備，這經(jīng)過(guò)在合成期間的適當(dāng)時(shí)間點(diǎn)僅僅用適當(dāng)保護(hù)的氨基酸類似物取代氨基酸試劑。
合適的試劑包括，例如，氨基酸類似物，其中氨基酸的羧基用適于形成一個(gè)上述鍵的基團(tuán)取代。例如，如果需要用-CH2-氨基甲酸酯鍵(-CH2OC(O)NR-)取代肽中的-C(O)NR-鍵，那么將適當(dāng)保護(hù)的氨基酸的羧基(-COOH)首先還原成-CH2OH基，然后用常規(guī)方法轉(zhuǎn)變成-OC(O)Cl官能團(tuán)或?qū)?硝基羰基-OC(O)O-C6H4-P-NO2官能團(tuán)。將任一這類官能團(tuán)與在固相支持物上發(fā)現(xiàn)的部分裝配的肽N端的游離胺或烷基化胺反應(yīng)導(dǎo)致形成-CH2OC(O)NR-鍵。對(duì)該-CH2-氨基甲酸酯鍵形成的更詳細(xì)的描述見(jiàn)Cho等，科學(xué)，2611303-1305(1993)。
同樣，以膦酸酯鍵取代肽中的氨基鍵可用在美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)07/943,805，08/081,577和08/119,700(本文以參考文獻(xiàn)引用其說(shuō)明書(shū)的全文)中所述的方式實(shí)現(xiàn)。
用-CH2-氨磺酰鍵取代肽中的酰胺鍵可經(jīng)過(guò)將適當(dāng)保護(hù)的氨基酸的羧基(-COOH)還原成-CH2OH基，然后用常規(guī)方法將羥基轉(zhuǎn)變成諸如甲苯磺?；暮线m的離去基團(tuán)來(lái)實(shí)現(xiàn)。甲苯磺?；难苌锱c諸如硫代乙酸反應(yīng)后水解并經(jīng)氯化來(lái)氧化可提供取代其它適當(dāng)保護(hù)的氨基酸的羧基的-CH2-S-(O)2Cl官能團(tuán)。肽合成中該適當(dāng)保護(hù)的氨基酸類似物的使用提供了包含取代肽中酰胺鍵的-CH2S(O)2NR-鍵，從而提供了一種肽模擬物。關(guān)于氨基酸的羧基轉(zhuǎn)變成-CH2S(O)2Cl基的更完全的描述見(jiàn)例如，Weinstein，Boris，氨基酸，肽和蛋白質(zhì)的化學(xué)和生物化學(xué)，Vol.7，pp.267-357，Marcel Dekker，Inc.，紐約(1983)，本文以參考文獻(xiàn)引用。
用脲鍵取代肽中的酰胺鍵可以美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)No.08/147,805中描述的方式(本文以參考文獻(xiàn)引用該申請(qǐng)的全文)實(shí)現(xiàn)。
其中-CH2NH-鍵取代肽中的酰胺鍵的仲胺鍵可經(jīng)過(guò)采用，例如，合適的保護(hù)的二肽類似物來(lái)制備，其中酰胺鍵的羰基鍵用常規(guī)方法還原成CH2基。例如，如果是二甘氨酸，去保護(hù)H2NCH2CH2NHCH2COOH后，產(chǎn)生酰胺還原成胺，然后在下一步偶聯(lián)反應(yīng)中以N-保護(hù)形式使用。經(jīng)過(guò)還原二肽中酰胺鍵的羰基來(lái)制備該類似物在本領(lǐng)域中是熟知的。
適當(dāng)保護(hù)的氨基酸類似物按與相應(yīng)的氨基酸相同的方式在常規(guī)肽合成中使用。例如，典型地是大約3當(dāng)量的保護(hù)的氨基酸類似物用于該反應(yīng)。使用諸如二氯甲烷或DMF的惰性有機(jī)稀釋劑，當(dāng)酸作為反應(yīng)副產(chǎn)物產(chǎn)生時(shí)，反應(yīng)溶劑典型地含有過(guò)量的叔胺以清除反應(yīng)期間產(chǎn)生的酸。一個(gè)特別優(yōu)選的叔胺是二異丙基乙胺，它典型地以大約過(guò)量10倍使用。反應(yīng)導(dǎo)致將具有非肽酰鍵的氨基酸類似物摻入肽模擬物中。該取代可按需要進(jìn)行重復(fù)，使肽中從0個(gè)到全部的酰胺鍵被非酰胺鍵取代。
也可環(huán)化本發(fā)明的肽，或在肽末端摻入脫氨基或脫羧基的殘基，使沒(méi)有末端氨基或羧基以減小對(duì)蛋白酶的敏感性或限制肽構(gòu)象。本發(fā)明的化合物的C端官能團(tuán)包括酰胺，酰胺低級(jí)烷基，酰胺二(低級(jí)烷基)，低級(jí)烷氧基，羥基，和羧基，及其低級(jí)酯衍生物和其藥用上可接受的鹽。環(huán)化化合物的例子在表4，5，6，8和9中提供。
E.二硫鍵形成本發(fā)明的化合物可以在半胱氨酸的硫醇基之間具有分子內(nèi)二硫鍵的環(huán)化形式存在。另外，可產(chǎn)生半胱氨酸的硫醇基之間的分子間二硫鍵以產(chǎn)生二聚體(或更高寡聚體)化合物。也可用高半胱氨酸取代一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基。這些分子內(nèi)或分子間二硫鍵衍生物可用如下所示的圖解來(lái)代表
其中m和n獨(dú)立地是1或2。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案提供了這些二硫鍵衍生物的類似物，其中一個(gè)硫被CH2基團(tuán)或硫的其它同型空間配位體取代。這些類似物使用下面所示的本領(lǐng)域已知的方法經(jīng)分子內(nèi)或分子間取代來(lái)制備
其中p是1或2。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易預(yù)料到使用上面所示的α-氨基-g-丁酸衍生物的其它類似物和高半胱氨酸也能進(jìn)行取代。
另外，可用α-取代的乙酸在該肽的氨基末端加上一個(gè)帽，其中α取代基是離去基團(tuán)，如α-鹵代乙酸，例如α-氯乙酸，α-溴乙醚、或α-碘乙酸。本發(fā)明的化合物也可經(jīng)過(guò)用半胱氨酸或高半胱氨酸殘基的硫取代離去基團(tuán)來(lái)環(huán)化或二聚體化。例如，見(jiàn)Barker等，化學(xué)方法雜志，352040-2048(1992)和Or等，有機(jī)化學(xué)雜志，563146-3149(1991)，本文引用其每一篇作為參考文獻(xiàn)。二聚體化化合物的例子在表7，9和10中提供。
V.應(yīng)用本發(fā)明的化合物在體外用作了解TPO生物學(xué)作用的專一性工具，包括評(píng)價(jià)認(rèn)為影響TPO生產(chǎn)和受體結(jié)合過(guò)程的及受其影響的許多因子。該化合物也在形成結(jié)合并激活TPO-R的其它化合物中有用，因?yàn)樵摶衔锾峁┝藨?yīng)利于其形成的關(guān)于結(jié)構(gòu)和活性間關(guān)系的重要信息。
該化合物也在篩選新TPO受體激動(dòng)劑的試驗(yàn)中用作競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合劑。在該試驗(yàn)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物可不經(jīng)修飾被使用或可用各種方式進(jìn)行修飾；例如，經(jīng)過(guò)標(biāo)記，如共價(jià)或非共價(jià)連接到直接或間接提供可檢測(cè)信號(hào)的基團(tuán)上。在任一這類試驗(yàn)中，該物質(zhì)可直接或間接標(biāo)記。直接標(biāo)記的可能性包括的標(biāo)記基團(tuán)有例如，諸如125I的放射性標(biāo)記，諸如過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶的酶(美國(guó)專利3,645,090)，能監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度，波長(zhǎng)變化或熒光極化改變的熒光標(biāo)記(美國(guó)專利號(hào)3940475)。間接標(biāo)記的可能性包括對(duì)一種結(jié)構(gòu)進(jìn)行的生物素標(biāo)記，然后結(jié)合偶聯(lián)有一個(gè)上述標(biāo)記基團(tuán)的抗生物素蛋白上。如果化合物附著于固相支持物上，該化合物也可包括間隔子或連接子。
而且，基于其結(jié)合TPO受體的能力，本發(fā)明的肽可用作在活細(xì)胞，固定細(xì)胞，生物學(xué)液體，組織勻漿，純化的，天然生物學(xué)物質(zhì)等中檢測(cè)TPO受體的試劑。例如，經(jīng)過(guò)標(biāo)記該肽，可鑒定其表面具有TPO-R的細(xì)胞。另外，基于其結(jié)合TPO受體的能力，本發(fā)明的肽可用于原位染色，F(xiàn)ACS(熒光激活的細(xì)胞分選)，Western印跡，ELISA等。另外，基于其結(jié)合TPO受體的能力，本發(fā)明的肽可用于受體純化，或純化在細(xì)胞表面(或內(nèi)部透化的細(xì)胞)上表達(dá)TPO受體的細(xì)胞。
本發(fā)明的化合物也可用作各種醫(yī)學(xué)研究和診斷用途的商用試劑。該用途包括但不限于(1)在各種功能性試驗(yàn)中用作定量候選TPO激動(dòng)劑的活性的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品；(2)用于維持TPO-依賴性細(xì)胞系的增殖和生長(zhǎng)；(3)用于通過(guò)共同結(jié)晶對(duì)TPO受體進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析；(4)用于研究TPO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)/受體激活的機(jī)制；(5)優(yōu)選TPO-受體被激活或該激活對(duì)已知量的TPO激動(dòng)劑等進(jìn)行常規(guī)校準(zhǔn)的其它研究和診斷應(yīng)用。
本發(fā)明的化合物可用于與其它細(xì)胞因子結(jié)合或獨(dú)自在體外擴(kuò)展巨核細(xì)胞及其指定的祖先細(xì)胞。例如，見(jiàn)GiGiusto等，PCT公開(kāi)號(hào)，95/05843，本文作為參考文獻(xiàn)引用?；熀头暖熃?jīng)殺死快速分裂，更成熟的巨核細(xì)胞群體而引起血小板減少癥。然而，這些治療處理也減少了未成熟的，分裂活性較小的巨核細(xì)胞前體細(xì)胞的數(shù)目和活力。因此，由TPO或本發(fā)明的化合物對(duì)血小板減少癥的改善可在化療或放療后用體外培養(yǎng)富集巨核細(xì)胞和未成熟前體細(xì)胞的其自身細(xì)胞的群體輸注病人來(lái)促進(jìn)。
本發(fā)明的化合物也可施用給溫血?jiǎng)游铮ㄈ祟愐约せ铙w內(nèi)的TPO-R，因此，本發(fā)明包含治療處理TPO相關(guān)性疾病的方法，包含施用足以模擬體內(nèi)TPO對(duì)TPO-R的效力的量的本發(fā)明的化合物。例如，可施用本發(fā)明的肽和化合物以治療各種血液學(xué)疾病，包括但不限于血小板疾病和血小板減少癥，特別是與骨髓輸血，放療和化療相關(guān)的疾病。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，優(yōu)選首先給進(jìn)行化療或放療的病人施用TPO拮抗劑，隨后施用本發(fā)明的TPO激動(dòng)劑。
本發(fā)明的化合物的活性在McDonald.美國(guó)兒科血液學(xué)/癌癥學(xué)雜志148-21(1992)(本文以參考文獻(xiàn)引用)所述的眾多模型的一個(gè)中在體外或體內(nèi)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的組合物對(duì)于治療與骨髓輸血，放療或化療相聯(lián)的血小板減少癥有用。典型地是在化療，放療或骨髓移植前或其后以預(yù)防性施用該化合物。
因此，本發(fā)明也提供了藥用組合物，包含作為一種活性成分的至少一種本發(fā)明的肽或肽模擬物與一種藥用載體或稀釋劑相聯(lián)。本發(fā)明的化合物可經(jīng)口服，肺內(nèi)，腸胃外(肌肉內(nèi)，腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)(IV)或皮下注射)，吸入(以細(xì)粉末組合物)，經(jīng)皮膚，鼻內(nèi)，陰道，直腸或舌下途徑用藥，且可配制成適于各種用藥途徑的劑量形式。例如，見(jiàn)Bernstein等，PCT專利公開(kāi)號(hào)WO93/25221；Pitt等，PCT專利公開(kāi)號(hào)WO94/17784；和Pitt等，歐洲專利申請(qǐng)613,683，本文引用其中每一篇作為參考文獻(xiàn)。
口服的固體劑量形式包括膠囊，片劑，藥丸，粉末，和顆粒體。在這類固體劑量形式中，活性化合物與至少一種惰性藥用上可接受的載體，如蔗糖，乳糖或淀粉混合。該劑量形式與正常實(shí)踐一樣也可包含非惰性稀釋劑的其它物質(zhì)，例如，諸如硬脂酸鎂的潤(rùn)滑劑。如果是膠囊，片劑和藥丸，劑量形式也可包含緩沖劑。另外片劑和藥丸可腸衣制備。
用于口服的液體劑量形式包括具有含常用于本領(lǐng)域的惰性稀釋劑如水的配劑的藥用上可接受的乳劑，溶液，懸液，糖漿。除了這些惰性稀釋劑外，組合物也可包括佐劑，如加濕劑，乳化劑和懸浮劑，增甜，調(diào)味和加香劑。
用于腸胃外用藥的根據(jù)本發(fā)明的制品包括無(wú)菌含水或不含水的溶液，懸液或乳劑。不含水的溶劑或載體的例子有丙二醇，聚乙二醇，植物油，如橄欖油和玉米油，明膠和可注射的有機(jī)酯，如油酸乙酯。這些劑量形式還可含有佐劑，如保護(hù)劑，加濕劑，乳化劑和分散劑。它們可經(jīng)過(guò)例如，通過(guò)滯留細(xì)菌的濾器過(guò)濾，經(jīng)過(guò)向組合物中摻入滅菌劑，經(jīng)過(guò)輻射組合物，或經(jīng)過(guò)加熱組合物來(lái)滅菌。它們也可使用無(wú)菌水或一些其它的無(wú)菌可注射介質(zhì)在用前立即生產(chǎn)。
用于直腸或陰道用藥的組合物優(yōu)選是栓劑，除活性物質(zhì)外，它可含有賦形劑，如椰子油或栓劑蠟。用于鼻內(nèi)或舌下用藥的組合物也可用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)賦形式來(lái)制備。
含有該化合物的組合物可用于預(yù)防性和/或治療性處理而用藥。在治療應(yīng)用中，按上面所述給已患有疾病的病人施用足以治愈或至少部分控制該疾病及其并發(fā)癥的癥狀的量的化合物。足以達(dá)到該目的量定義為“治療上有效的劑量”。對(duì)該用途有效的量取決于該疾病的嚴(yán)重性和病人的體重和一般狀態(tài)。
本發(fā)明的組合物也可用例如Tice和Bibi的方法(關(guān)于控制藥物傳遞的論文，A.Kydonieus，Marcel Dekker.N.Y.(1992)，pp.315-339)進(jìn)行微粒包裝。
在預(yù)防應(yīng)用中，含有本發(fā)明的化合物的組合物施用給對(duì)特定疾病敏感或有感染該疾病危險(xiǎn)的病人。這樣一種量定義為“預(yù)防上有效的劑量”。在該用途中，準(zhǔn)確的量也取決于病人的健康狀態(tài)和體重。
有效治療所必需的TPO激動(dòng)劑的量取決于許多不同的因素，包括用藥方式，靶位點(diǎn)，病人的生理狀態(tài)，和施用的其它藥物。因此，治療劑量應(yīng)定量以優(yōu)選安全和有效。典型地是，用于體外的劑量可對(duì)于體內(nèi)施用這些試劑有用的量提供有用的指導(dǎo)。用于治療特定疾病的有效劑量的動(dòng)物試驗(yàn)可為人類劑量提供進(jìn)一步的預(yù)示。諸多方面的考慮在下列文獻(xiàn)中進(jìn)行了描述例如，在Gilman等(編輯)，Goodman和Gilman’s治療的藥理學(xué)基礎(chǔ)，第8版，Pergamon出版社(1990)；和Remington的藥品科學(xué)，第7版，Mack出版公司，Easton，Penn.(1985)；本文引用各篇作為參考文獻(xiàn)。
本發(fā)明的肽和肽模擬物以每天大約0.001mg至大約10mg/kg體重的劑量范圍用藥時(shí)在治療TPO介導(dǎo)的癥狀中有效。使用的具體劑量受所治療的具體癥狀，用藥途經(jīng)及臨床醫(yī)師根據(jù)諸如癥狀嚴(yán)重性，病人的年齡和一般狀況等的因素作出的判斷來(lái)調(diào)節(jié)。
僅管上文只具體描述了本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，但可預(yù)料到在不背離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和所要求的范圍的前提下對(duì)本發(fā)明作出修改或變化是可能的。
實(shí)施例1固相肽合成使用Merrifield固相合成技術(shù)(見(jiàn)Steward和Young，固相肽合成，第二版，Pierce Chemical，Rockford，IL(1984)和Merrifield，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志，852149(1963))在Milligen/Bio search 9600自動(dòng)儀器或應(yīng)用生物系統(tǒng)公司431A型肽合成儀合成本發(fā)明的各種肽。使用應(yīng)用生物系統(tǒng)公司系統(tǒng)軟件1.01版的標(biāo)準(zhǔn)方法裝配該肽。每次偶聯(lián)用BOP(苯并三唑基N-oxtris二甲基胺膦六氟磷酸酯)和HOBt(1-羥苯并三唑)進(jìn)行1-2小時(shí)。
使用的樹(shù)脂是HMP樹(shù)脂或PAL(Millgen/Bioserch)，它是以5-(4′-Fmoc-氨甲基-3，5′-二甲氧基苯氧基)戊酸作銜接物的交聯(lián)的聚苯乙烯。使用PAL樹(shù)脂導(dǎo)致從樹(shù)脂上裂解肽時(shí)產(chǎn)生羧基端酰胺官能團(tuán)。裂解時(shí)，HMP樹(shù)脂在終產(chǎn)物的C端產(chǎn)生羧酸基團(tuán)。大多數(shù)試劑，樹(shù)脂和保護(hù)的氨基酸(游離的或在樹(shù)脂上的)從Millipore或應(yīng)用生物系統(tǒng)公司購(gòu)買(mǎi)。
在偶聯(lián)程序中Fmoc基團(tuán)用于氨基保護(hù)。氨基酸的伯胺保護(hù)用Fmoc實(shí)現(xiàn)，側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)對(duì)于絲氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酸和蘇氨酸是t-丁基，對(duì)于谷氨酰胺是三苯甲基；對(duì)于精氨酸是Pmc(2，2，5，7，8-pentamethylchroma sulfonate)；對(duì)于色氨酸是N-t-丁氧基羰基；對(duì)于組氨酸和谷氨酰胺是N-三苯甲基，對(duì)于半胱氨酸是S-三苯甲基。
用試劑K或?qū)ζ渎宰餍揎椷M(jìn)行處理實(shí)現(xiàn)從樹(shù)脂上取下肽并同時(shí)對(duì)側(cè)鏈官能團(tuán)去保護(hù)。另外，在這些肽的合成中，用90％三氟乙酸，5％的乙二硫醇，和5％的水的混合物起始4℃并逐漸增加到室溫裂解具有酰胺化羧基末端的完全裝配的肽。用二乙基醚沉淀去保護(hù)的肽。在所有情況下，在C18結(jié)合的硅膠柱中用在0.1％三氟乙酸中的乙腈/水梯度經(jīng)預(yù)制，反相，高效液相色譜進(jìn)行純化。以快速原子轟擊質(zhì)譜儀或電子噴射質(zhì)譜儀及氨基酸分析(如果可能的話)鑒定勻質(zhì)肽。
實(shí)施例2生物學(xué)試驗(yàn)使用血小板生成素依賴型細(xì)胞增殖試驗(yàn)可測(cè)量該肽的生物活性。用全長(zhǎng)的人TPO-R轉(zhuǎn)染鼠IL-3依賴性Ba/F3細(xì)胞。缺乏IL-3時(shí)(WEHI-3條件培養(yǎng)基)，這些細(xì)胞的增殖依賴于TPO。親代末轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系不與人TPO反應(yīng)，但保持IL-3依賴性。
使用來(lái)自文庫(kù)篩選的合成肽對(duì)上述兩種細(xì)胞系進(jìn)行生物測(cè)定。在含10％WEHI-3條件培養(yǎng)基的完全RPMI-10培養(yǎng)基中生長(zhǎng)細(xì)胞，然后在PBS中洗滌2次，并以2×104個(gè)細(xì)胞/孔加入含肽或TPO稀釋液的孔中。細(xì)胞在加濕的5％CO2空氣中37℃培養(yǎng)48小時(shí)，經(jīng)過(guò)將MTT還原成甲，在ELISA平板閱讀器上測(cè)量570nm下的吸光率測(cè)定代謝活性。試驗(yàn)的肽以劑量依賴性方式刺激TPO-R轉(zhuǎn)染的Ba/F3細(xì)胞的增殖。這些肽對(duì)親代細(xì)胞系無(wú)影響。
實(shí)施例3結(jié)合親和力在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)中測(cè)定了化學(xué)合成的肽對(duì)TPO-R的結(jié)合親和力。微滴度平板的孔用1mg鏈霉抗生物素蛋白覆蓋，用PBS/1％BSA封閉，接著加入50ng生物素標(biāo)記的抗-受體固著抗體(Ab179)。然后用1∶10稀釋的可溶性TPO-R產(chǎn)物處理各孔。將各種濃度的肽或肽類似物與恒量的融合到麥芽糖結(jié)合蛋白上的由殘基1-156組成的TPO的截短形式(MBP-TPO156)混合。將肽MBP-TPO156混合物加入TPO-R覆蓋的孔中，4℃培養(yǎng)2小時(shí)，然后用PBS洗滌。經(jīng)過(guò)加入針對(duì)MBP的兔抗血清，接著加入堿性磷酸酶連接的羊抗兔IgG測(cè)量平衡時(shí)結(jié)合的MBP-TPO156的量。然后使用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定各孔中堿性磷酸酶的量。
在一定范圍的肽濃度內(nèi)進(jìn)行該試驗(yàn)，對(duì)結(jié)果繪圖，y軸代表結(jié)合的MBP-TPO156的量，x軸代表肽或肽模擬物的濃度?？蓽y(cè)量肽或肽模擬物減少結(jié)合于固著TPO-R上的MBP-TPO15650％(IC50)的量時(shí)的濃度。肽的解離常數(shù)(kd)應(yīng)相似于使用上述試驗(yàn)條件測(cè)定的IC50。
實(shí)施例4在質(zhì)粒上的肽pJS142載體用于文庫(kù)構(gòu)建且在圖4中顯示。構(gòu)建文庫(kù)需要3個(gè)寡核苷酸序列ON-829(5′ACC ACC TCC GG)；ON-830(5′TTA CTT AGTTA)和感興趣的文庫(kù)特異性寡核苷酸(5′GA GGT GGT{NNK}nTAACTA AGT AAA GC)，其中{NNK}n代表所需長(zhǎng)度和序列的隨機(jī)區(qū)域。在合成期間或用多核苷酸激酶純化后可將寡核苷酸的5′端經(jīng)化學(xué)法磷酸化。然后將它們以1∶1∶1的摩爾比退火并連接到載體上。
優(yōu)選用于淘選的大腸桿菌菌株具有基因型Δ(srl-recA)endA1 nupGlon-11 sulA1 hsdR17Δ(ompT-fepC)266 ΔclpA319∷kanΔlacI lac ZU118，它可從具有基因型lon-11 sulA1的來(lái)自耶魯大學(xué)大腸桿菌遺傳保藏中心的大腸桿菌菌株(E.colib/r，保藏中心登記號(hào)CGSC6573)制備。除了10％的甘油用于所有洗滌步驟外，按Dower等，核酸研究，166127(1988)所述制備上述大腸桿菌用于電穿孔。使用1pg Bluescript質(zhì)粒(Stratagene)試驗(yàn)該細(xì)胞的效力。將這些細(xì)胞用于生成原始文庫(kù)和用于每輪淘選后擴(kuò)增富集的群體。
經(jīng)過(guò)使用溶菌酶輕微消化細(xì)胞壁從細(xì)胞釋放質(zhì)粒上的肽用于淘選。沉淀細(xì)胞碎片后，可直接在大多數(shù)受體上使用粗制裂解產(chǎn)物。如果需要對(duì)質(zhì)粒復(fù)合物進(jìn)行一些其它的純化，可使用凝膠過(guò)濾柱去掉粗制裂解產(chǎn)物中的許多低分子量污染物。
在鹽濃度比大多數(shù)生理緩沖液更低的緩沖液(HEKL)中進(jìn)行淘選?？稍诰哂泄讨诜欠忾]性單克隆抗體(MAb)上的受體的微滴度孔中進(jìn)行淘選或經(jīng)過(guò)在珠或柱上進(jìn)行淘選。更具體地說(shuō)，在首輪淘選中，可使用分別用受體覆蓋的24孔。在第二輪中，典型地使用用受體(PAN樣品)覆蓋的6個(gè)孔和無(wú)受體(NC樣品)的6個(gè)孔。比較這兩個(gè)樣品中的質(zhì)粒數(shù)可得到是否經(jīng)淘選富集了受體特異性克隆的征兆?！案患倍x為PAN轉(zhuǎn)化子對(duì)從NC樣品中所回收的克隆的比率。富集10倍通常表示存在受體特異性克隆。
在隨后輪的淘選中，減小加入孔中的裂解產(chǎn)物對(duì)于降低質(zhì)粒復(fù)合物的非特異性背景結(jié)合是有用的。在第2輪中，通常使用每孔100μl的裂解產(chǎn)物。在第3輪中，使用在HEKL/BSA中以1/10稀釋的每孔100μl的裂解產(chǎn)物。對(duì)于隨后各輪的淘選，典型地使用超過(guò)所估計(jì)的殘余多樣性至少1000倍的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化單位的加入量。
典型地是，經(jīng)過(guò)3，4或5輪淘選后，根據(jù)獲得的富集倍數(shù)檢查由單個(gè)克隆所編碼的肽的結(jié)合特征。典型地使用檢測(cè)LacI肽融合蛋白的受體特異性結(jié)合的ELISA。正常情況下，LacI是四聚體，最小功能性DNA結(jié)合種類是二聚體。因此，該肽在融合蛋白上表現(xiàn)為多價(jià)。假定在孔中固著了足夠密度的受體，融合到LacI上的肽以協(xié)同的多價(jià)方式結(jié)合到表面。這一協(xié)同結(jié)合允許檢測(cè)低內(nèi)部親和力的結(jié)合事件。該試驗(yàn)的靈敏性的優(yōu)點(diǎn)在于易于鑒定低親和力的起始靶。缺點(diǎn)在于ELISA中的信號(hào)與肽的內(nèi)部親和力不相關(guān)。如下所述融合到麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)上的肽允許以ELISA方式進(jìn)行檢測(cè)，其中信號(hào)強(qiáng)度與親和力較好地相關(guān)。見(jiàn)圖5A-B。
使用任意標(biāo)準(zhǔn)小量制備程序以雙鏈形式制備來(lái)自感興趣的克隆的DNA。感興趣的單個(gè)克隆或克隆群體的編碼序列可轉(zhuǎn)移到載體上，該載體將這些序列與編碼MBP(在溶液中一般以單體出現(xiàn)的一種蛋白質(zhì))的基因融合到框架中。文庫(kù)克隆進(jìn)pJS142在靠近該文庫(kù)隨機(jī)編碼區(qū)域的起始處產(chǎn)生一個(gè)BspEI限制性位點(diǎn)。用BspEI和ScaI消化允許純化一個(gè)～900bp的DNA片段，該片段可亞克隆進(jìn)兩個(gè)載體，pELM3(細(xì)胞質(zhì)的)或PELM15(固質(zhì)的)中的一個(gè)中，這兩個(gè)載體分別是對(duì)從新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室買(mǎi)到的pMALc2和pMALp2載體的簡(jiǎn)單修飾。見(jiàn)圖5A-B。用AgeI和ScaI消化pELM3和pELM15允許從pJS142文庫(kù)有效地克隆BspEI-ScaI片段。BspEI和AgeI末端適合于連接。另外，ScaI位點(diǎn)的正確連接對(duì)于再創(chuàng)造功能性bla(Amp抗性)基因，從而降低來(lái)自不需要的連接事件的背景克隆的水平是必需的。然后可用IPTG誘導(dǎo)tac啟動(dòng)子控制的MBP肽融合物的表達(dá)。
經(jīng)過(guò)使用溶菌酶裂解細(xì)胞并經(jīng)離心去掉不溶性細(xì)胞碎片從單個(gè)克隆制備用于LacI或MBP ELISA的裂解產(chǎn)物。然后將溶膠產(chǎn)物加入含固著的受體板孔中及加入不含受體的對(duì)照孔中。經(jīng)過(guò)與針對(duì)LacI或MBP的兔多克隆抗血清培養(yǎng)，然后與堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔第二抗體培養(yǎng)檢測(cè)LacI或MBP肽融合物的結(jié)合。用對(duì)硝基苯磷酸酯生色底物檢測(cè)結(jié)合的堿性磷酸酶。
實(shí)施例5“頭狀二聚體”系統(tǒng)在質(zhì)粒上的LacI肽技術(shù)的一個(gè)變化利用稱為“頭狀二聚體”的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)。由大腸桿菌lac阻遏物進(jìn)行的DNA結(jié)合受大約60個(gè)氨基酸的“頭狀”區(qū)域的介導(dǎo)。結(jié)合lac操縱子的頭狀區(qū)域的二聚體正常情況下經(jīng)過(guò)與更大型的大約300個(gè)氨基酸的C-端區(qū)域相聯(lián)形成。“頭狀二聚體”系統(tǒng)利用含有經(jīng)短肽銜接子連接的兩個(gè)頭狀塊的頭狀二聚體分子。這些蛋白質(zhì)以足夠的穩(wěn)定性結(jié)合DNA以允許在頭狀二聚體C端出現(xiàn)的肽抗原決定基與編碼該肽的質(zhì)粒相聯(lián)。
隨機(jī)肽融合到頭狀二聚體的C端，該二聚體結(jié)合編碼它的質(zhì)粒，以制備能經(jīng)淘選篩選的肽-頭狀二聚體-質(zhì)粒復(fù)合物。在質(zhì)粒上的頭狀二聚體肽系統(tǒng)允許對(duì)高親和力的配體具有比LacI系統(tǒng)更大的選擇性。因此，頭狀二聚體系統(tǒng)對(duì)于制備基于起始低親和力的靶的誘變文庫(kù)并選擇這些起始序列的更高親和力的變異體有用。
與在質(zhì)粒上的肽一樣使用頭狀二聚體載體pCMG14構(gòu)建文庫(kù)(見(jiàn)圖6A-C)。lac操縱子的存在不是頭狀二聚體蛋白結(jié)合質(zhì)粒所需要的。將該文庫(kù)導(dǎo)入包含大腸桿菌(lon-11 sulA1 hsd R17(ompT-fepc)ΔclpA319∷KanΔlacI lac ZU118Δ(Srl-recA)306∷Tn10)的細(xì)菌菌株中并在基礎(chǔ)(A)啟動(dòng)子誘導(dǎo)條件下進(jìn)行擴(kuò)增。除了使用HEK緩沖液代替HEKL緩沖液，用含水酚代替IPTG從孔中洗脫質(zhì)粒外，按與lacI文庫(kù)所用相似的方法進(jìn)行頭狀二聚體文庫(kù)的淘選。頭狀二聚體淘選的序列常在轉(zhuǎn)移進(jìn)MBP載體中后進(jìn)行鑒定以使它們能在親和敏感性MBP ELISA中進(jìn)行檢測(cè)且也使克隆群體能用標(biāo)記的受體經(jīng)集落轉(zhuǎn)移進(jìn)行篩選。
實(shí)施例6在本實(shí)施例中，對(duì)環(huán)狀化合物進(jìn)行三個(gè)試驗(yàn)。首先，按上面所述獲得IC50值。另外，按上面所述進(jìn)行MTT細(xì)胞增殖試驗(yàn)以計(jì)算EC50值最后，進(jìn)行顯微生理測(cè)量?jī)x(分子裝置公司)試驗(yàn)?；旧?，在這一試驗(yàn)中測(cè)定了與本發(fā)明的化合物刺激的TPO受體反應(yīng)的細(xì)胞外介質(zhì)酸化率。EC50的范圍以上述IC50所示的符號(hào)表示。結(jié)果在表4中概括。
表4EC50(nM) EC50(nM) IC50(nM)結(jié)構(gòu) 增生 顯微生理測(cè)量
++ ++ ++
++ ++ ++
++ ++ ND
+ ++-
+ +ND
+- +++
EC50(nM)EC50(nM)IC50(nM)結(jié)構(gòu) 增生 顯微生理測(cè)量
+ + ++
+ + ++
+ + ++
+ + +-
++ + ++
+ + ND
EC50(nM)EC50(nM) IC50(nM)結(jié)構(gòu) 增生顯微生理測(cè)量
+ + ND
++ + ND
++ +- ND
+- +- +-
+- +- ND
實(shí)施例7在本實(shí)施例中按上面所述測(cè)定了在環(huán)狀化合物
中D，E，I，S或F位置氨基酸取代的EC50和IC50值。顯微生理測(cè)量結(jié)果在括號(hào)中給出。結(jié)果在下面表5中概括。
表5
實(shí)施例8在本實(shí)施例中，評(píng)價(jià)了在化合物
中D，S，或F位置的氨基酸取代，如下表6所示。EC50和IC50值按上面所述計(jì)算。顯微生理測(cè)量結(jié)果在括號(hào)中表示。
表6
實(shí)施例9在本實(shí)施例中，對(duì)下面表7所裂的二聚體化合物按上面所述計(jì)算EC50和IC50值。包括作為比較的環(huán)狀單體。
在所測(cè)試的最大濃度10μM時(shí)表8的化合物無(wú)活性。
在表9中，比較了按上面所述測(cè)定的I E G P T L R Q W L A A R A的環(huán)化和二聚體化的變異體的EC50和IC50。
在表10中，比較了二聚體
的載短形式。EC50和IC50值按上面所述計(jì)算。顯微生理測(cè)量結(jié)果在括號(hào)中給出。
表7EC50(nM) IC50(nM)顯微生理測(cè)量 增生
++ ++++
++ ++++
++ ++++
++ ++++
++ ++++
ND +-+-
EC50(nM) IC50(nM)顯微生理測(cè)量增生
++ ++ ++
ND ++ ++
++ ++ ++
++ ++ ++
ND ++ ++
++ ++ +
ND ++ ++
++ ++ +-
+- +- +-
++ +- +-
表8 -REGPTLRQWM-[NH2][H]-REGPTLRQWLMSRS-[NH2]表9EC50(nM) IC50(nM)顯微生理測(cè)量增生(H)-IEGPTLRQWLAARA-[NH2] N.D. ++++
N.D. ++++
++ ++++
++ ++++
表10
實(shí)施例10在本實(shí)施例中，在環(huán)狀化合物
的G，P和W位置導(dǎo)入各種取代。
表11列出了顯示TPO激動(dòng)劑活性的取代化合物的例子。表中縮寫(xiě)的取代如下表11
脯氨酸取代
L-Pro D-Pro L-4-Hvp(OBn)
L-六氫吡啶羧酸 D-六氫吡啶羧酸 L-三甲叉亞胺甲酸
L-Tic D-Tic L-Oic
L-Tiq
色氨酸取代
L-Trp D-Trp L-l-Nal
D-1-NalL-2-Nal D-2-Nal
L-(苯并噻吩)丙氨酸DL-5-Me-TrpDL-1-Me-Trp
DL-6-F-TrpDL-5-F-TrpDL-5-Br-TrP
甘氨酸取代
甘氨酸 肌氨酸
β-丙氨酸 γ-氨基丁酸
N-戊基甘氨酸 N-環(huán)丙烷基甘氨酸實(shí)施例11為了評(píng)價(jià)小鼠作為方便的試驗(yàn)種類的可行性，進(jìn)行了一些體外實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)測(cè)量試驗(yàn)化合物對(duì)小鼠受體的活性。首先從8至9周齡Balb/C小鼠股骨收集的骨髓細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中用rhu TPO或各種濃度的試驗(yàn)肽培養(yǎng)。在培養(yǎng)期間末期，用Cytospin濃縮培養(yǎng)物，染色乙酰膽堿酯酶(AChE，小鼠巨核細(xì)胞的鑒定劑)并以顯微鏡分析計(jì)數(shù)。1nM的rhu TPO產(chǎn)生過(guò)度生長(zhǎng)的非常大(＞40μm)的染色了AChE的非貼壁細(xì)胞。這些細(xì)胞似乎是成熟的巨核細(xì)胞。從起始接種的106個(gè)總骨髓細(xì)胞/ml(在50ml培養(yǎng)物中)中，估計(jì)形成了1到2×106個(gè)巨核細(xì)胞。這種對(duì)TPO的反應(yīng)指定為“最大”。含有未加入生長(zhǎng)因子的對(duì)照培養(yǎng)物產(chǎn)生非常少的AChE-陽(yáng)性細(xì)胞。在該實(shí)驗(yàn)中以高濃度測(cè)定了一些肽化合物，結(jié)果在表12中概括。10μM的肽產(chǎn)生最大的小鼠骨髓應(yīng)答。這些發(fā)現(xiàn)是該肽家族對(duì)鼠受體具有活性的首要證據(jù)。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，收獲骨髓細(xì)胞并在含有無(wú)生長(zhǎng)因子，1nM rhu TPO或10μM肽A的半固態(tài)培養(yǎng)基(甲基纖維素)中培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后，計(jì)數(shù)大型細(xì)胞(假定是巨核細(xì)胞)的集落并分組成小集落(3-5個(gè)細(xì)胞)或大集落(大于6個(gè)細(xì)胞)。結(jié)果在表13中顯示。TPO和試驗(yàn)肽都產(chǎn)生比陰性對(duì)照培養(yǎng)物基本上更多的兩種大小的集落。這表明該肽模擬TPO刺激Mk前體細(xì)胞群體伸展的能力。
為了獲得試驗(yàn)化合物對(duì)鼠和人受體活性更定量的比較，克隆于muTPO受體并轉(zhuǎn)染進(jìn)BaF3細(xì)胞。分離TPO依賴型細(xì)胞群體。
表12
*與生物素標(biāo)記的肽復(fù)合的鏈霉抗生物素蛋白-推斷1∶4復(fù)合物的濃度**與重組人TPO相比。***.在Cytopspin上有25-30％染色ACE的細(xì)胞。無(wú)因子培養(yǎng)物-ca，5％染色AChE的細(xì)胞(較低的細(xì)胞形成之)表13
在本申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)中的所有論文和參考文獻(xiàn)，包括專利文獻(xiàn)在本文中以參考文獻(xiàn)引用其全文用于各種目的。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合血小板生成素受體的化合物，所說(shuō)的化合物具有(1)小于大于8000道爾頓的分子量，(2)與血小板生成素受體的結(jié)合親和力表達(dá)為IC50不超過(guò)大約100μm。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中所說(shuō)的化合物是一種肽，且其中從0個(gè)到全部的該肽的-C(O)NH-鍵已被選自下列基團(tuán)的鍵取代-CH2OC(O)NR-鍵；膦酸酯鍵；-CH2S(O)2NR-鍵；-CH2NR-鍵；-C(O)NR6-鍵；-NHC(O)NH-鍵，其中R是氫或低級(jí)烷基，R6是低級(jí)烷基，另外，其中所說(shuō)的肽或肽模擬物的N端選自-NRR1基；-NRC(O)R基；-NRC(O)OR基；NRS(O)2R基-NHC(O)NHR基；琥珀酰亞胺基；芐氧羰基-NH-基；在苯環(huán)上具有選自低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，氯，和溴的1至3個(gè)取代基的芐氧羰基-NH-基團(tuán)，其中R和R1獨(dú)立地選自氫和低級(jí)烷基，而且其中所說(shuō)的肽或肽模擬物的C端具有通式-C(O)R2，其中R2選自羥基，低級(jí)烷氧基，和-NR3R4，其中R3和R4獨(dú)立地選自氫和低級(jí)烷基且其中-NR3R4的N原子任選可以是肽N端的胺基以形成環(huán)狀肽，以及其生理上可接受的鹽。
3.一種藥用組合物，包含與藥用上可接受的載體結(jié)合的權(quán)利要求1的化合物。
4.一種治療患有對(duì)用血小板生成素激動(dòng)劑治療敏感的疾病的病人的方法，包含給病人施用治療上有效劑量或量的權(quán)利要求1的化合物。
5.權(quán)利要求4的方法，其中給病人施用的化合物是一種肽，且其中從0個(gè)到全部的肽的-C(O)NH-鍵被選自下列基團(tuán)的鍵取代-CH2OC(O)NR-鍵；膦酸酯鍵；-CH2S(O)2NR-鍵，-CH2NR鍵；-C(O)NR6-鍵；-NHC(O)NH-鍵，其中R是氫或低級(jí)烷基，R6是低級(jí)烷基，另外，其中所說(shuō)的肽或肽模擬物的N端選自-NRR1基；-NRC(O)R基；-NRC(O)OR基；-NRS(O)2R基；-NHC(O)NHR基；琥珀酰亞胺基；芐氧羰基-NH-基；在苯環(huán)上具有選自烷基，低級(jí)烷氧基，氯和溴的1至3個(gè)取代基的芐氧羰基-NH-，其中R和R1獨(dú)立地選自氫和低級(jí)烷基，而且其中所說(shuō)的肽或肽模擬物的C端具有通式-C(O)R2，其中R2選自羥基，低級(jí)烷氧基，和通式-NR3R4，其中R3和R4獨(dú)立地選自氫和低級(jí)烷基，且其中-NR3R4基團(tuán)的氮原子可任選是該肽N端的胺基以形成一個(gè)環(huán)狀肽，以及其生理上可接受的鹽。
6.權(quán)利要求2的化合物，其中所說(shuō)的化合物包括氨基酸序列X1X2X3X4X5X6X7，其中X1是C，L，M，P，Q，V；X2是F，K，L，N，Q，R，S，T或V；X3是C，F(xiàn)，I，L，M，R，S，V或W；X4是20種遺傳編碼的L-氨基酸中的任意一種；X5是A，D，E，G，K，M，Q，R，S，T，V或Y；X6是C，F(xiàn)，G，L，M，S，V，W或Y；X7是C，G，I，K，L，M，N，R或V。
7.權(quán)利要求6的化合物，其中所說(shuō)的氨基酸序列是環(huán)化的。
8.權(quán)利要求6的化合物，其中所說(shuō)的氨基酸序列是二聚體化的。
9.權(quán)利要求6的化合物，其中該化合物包含氨基酸序列CX2X3X4X5X6X7，其中X2是K，L，N，Q，R，S，T或V；X3是C，F(xiàn)，I，L，M，R，S或V；X4是20個(gè)遺傳編碼的L-氨基酸中的任意一個(gè)；X5是A，D，E，G，S，V或Y；X6是C，F(xiàn)，G，L，M，S，V，W或Y；X7是C，G，I，K，L，M，N，R或V。
10.權(quán)利要求8的化合物，其中X4是A，E，G，H，K，L，M，P，Q，R，S，T或W。
11.權(quán)利要求10的化合物，其中X2是S或T；X3是L或R；X6是R；X5是D，E或G；X6是F，L，或W；X7是I，K，L，R或V。
12.權(quán)利要求9的化合物，其中所說(shuō)的化合物包含氨基酸序列X8CX2X3X4X5X6X7，其中X2是F，K，L，N，Q，R，S，T或V；X3是C，F(xiàn)，I，L，M，R，S，V或W；X4是20個(gè)遺傳編碼的L-氨基酸中的任意一個(gè)；X5是A，D，E，G，K，M，Q，R，S，T，V或Y；X6是C，F(xiàn)，G，L，M，S，V，W或Y；X7是C，G，I，K，L，M，N，R或V；X8是20個(gè)遺傳編碼的L-氨基酸中的任意一個(gè)。
13.權(quán)利要求12的化合物，其中X8是G，S，Y或R。
14.權(quán)利要求12的化合物，其中所說(shuō)的化合物包含氨基酸序列G G C T L R E W L H G G F C G G。
15.權(quán)利要求6的化合物，其中所說(shuō)的化合物包含氨基酸序列X8GX1X2X3X4X5W X7，其中X1是L，M，P，Q或V；X2是F，R，S或T；X3是F，L，V或W；X4是A，K，L，M，R，S，V或T；X5是A，E，G，K，M，Q，R，S，或T；X7是C，I，K，L，M或V；X8是20種遺傳編碼的L-氨基酸中的任意一個(gè)。
16.權(quán)利要求15的化合物；其中X1是P，X2是T；X3是L，X4是R；X5是E或Q；X7是I或L。
17.權(quán)利要求16的化合物，其中所說(shuō)的化合物包含氨基酸序列X9X8G X1X2X3X4X5W X7，其中X8是A，C，D，E，K，L，Q，R，S，T或V；X9是A，C，E，G，I，L，M，P，R，Q，S，T或V。
18.權(quán)利要求17的化合物，其中X8是D，E或K；X9是A或I。
19.權(quán)利要求18的化合物，其中所說(shuō)的化合物選自G G C A D G PT L R E W I S F C G G；G N A D G P T L R Q W L E G R R P K N；G G CA D G P T L R E W I S F C G G K；T I K G P T L R Q W L K S R E H T S；S I E G P T L R E W L T S R T P H S；L A I E G P T L R Q W L H G N G RD T；C A D G P T L R E W I S F C和I E G P T L R Q W L A A R A。
20.權(quán)利要求4的方法，其中給病人施用的所說(shuō)的化合物包含氨基酸序列C X2X3X4X5X6X7，其中，X2是K，L，N，Q，R，S，T或V；X3是C，F(xiàn)，I，L，M，R，S或V；X4是20個(gè)遺傳編碼的L-氨基酸中的任意一個(gè)；X5是A，D，E，G，S，V或Y；X6是C，F(xiàn)，G，L，M，S，V，W或Y；X7是C，G，I，K，L，M，N，R或V。
21.權(quán)利要求20的方法，其中X4是A，E，G，H，K，L，M，P，Q，R，S，T或W。
22.權(quán)利要求21的方法，其中X2是S或T；X3是L或R；X4是R；X5是D，E或G；X6是F，L或W；X7是I，K，L，R或V。
23.權(quán)利要求22的方法，其中施用給病人的所說(shuō)的化合物包含氨基酸序列G G C T L R E W L H G G F C G G。
24.權(quán)利要求4的方法，其中對(duì)用血小板生成素激動(dòng)劑治療敏感的疾病選自血液學(xué)疾病和由化療，放療，或骨髓輸血(marrowtransfusion)引起的血小板減少癥。
25.權(quán)利要求4的方法，其中施用給病人的所說(shuō)的化合物包含氨基酸序列X8G X1X2X3X4X5W X7，其中X1是L，M，P，Q或V；X2是F，R，S或T；X3是F，L，V或W；X4是A，K，L，M，R，S，V或T；X5是A，E，G，K，M，Q，R，S，或T；X7是C，I，K，L，M或V；X8殘基是20個(gè)遺傳編碼的L-氨基酸中的任意一個(gè)。
26.權(quán)利要求25的方法，其中X1是P；X2是T；X3是L；X4是R；X5是E或Q；X7是I或L。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所說(shuō)的化合物包含氨基酸序列X9X8G X1X2X3X4X5W X7，其中X8是A，C，D，E，K，L，Q，R，S，T或V；X9是A，C，E，G，I，L，M，P，R，Q，S，T或V。
28.權(quán)利要求27的方法，其中X8是D，E或K；X9是A或I。
29.權(quán)利要求28的方法，其中施用給病人的化合物選自G G C A DG P T L R E W I S F C G G；G N A D G P T L R Q W L E G R R P K N；GG C A D G P T L R E W I S F C G G K；T I K G P T L R Q W L K S R E HT S；S I E G P T LR E W L T S R T P H S；L A I E G P T L R Q W L H G NG R D T；C A D G P T L R E W I S F C和I E G P T L R Q W L A A R A。
30.與血小板生成素受體結(jié)合的化合物，其中所說(shuō)的化合物選自
和
31.用于治療患有對(duì)用血小板生成素激動(dòng)劑治療敏感的疾病的病人的方法，包含給病人施用選自下列物質(zhì)的化合物
和
全文摘要
本發(fā)明的受體是結(jié)合并激活血小板生成素的受體的肽和肽模擬物。該肽和肽模擬物在用于治療血液學(xué)紊亂,特別是由化療,放療或骨髓輸血引起的血小板減少癥的方法以及采用標(biāo)記的肽和肽模擬物的診斷方法中有用。
文檔編號(hào)C07K7/06GK1192749SQ96196142
公開(kāi)日1998年9月9日 申請(qǐng)日期1996年6月7日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日
發(fā)明者W·J·道爾, R·W·巴蕾特, S·E·維爾拉, D·J·杜芬, C·M·加特斯, S·S·哈瑟登, L·C·馬特基斯, P·J·斯查茨, C·R·瓦斯特羅姆, N·C·賴頓 申請(qǐng)人:葛蘭素集團(tuán)有限公司