專利名稱：缺血性疾病治療藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及牛痘病毒接種炎癥組織提取物的新藥理作用，具體地說就是涉及含有牛痘病毒接種炎癥組織提取物作為有效成分的缺血性疾病治療藥。
腦缺血會引起神經(jīng)細胞的障礙甚至導(dǎo)致壞死。這是因為缺血時腦內(nèi)的氧、能量供給中斷，其結(jié)果是每個細胞不能保持其穩(wěn)定性。腦組織因缺血性疾病而引起的不可逆壞死狀態(tài)稱之為腦梗塞，其原因有腦血栓和腦栓塞等。前者是腦灌流的動脈發(fā)生動脈硬化性病變所致血管狹窄并伴隨著血栓形成的血管堵塞，后者是心臟病所致的心臟內(nèi)壁血栓和大動脈、頸動脈粥樣病變所致的血栓脫落后進入腦內(nèi)引起的腦動脈栓塞。
即使在臨床上人們業(yè)已充分認(rèn)識到神經(jīng)細胞對缺血很脆弱這一點，有些種類的神經(jīng)細胞即使只是輕微的幾分鐘缺血也會發(fā)生障礙甚至細胞死亡。低氧模型可模擬臨床上的急性缺血狀態(tài)，應(yīng)用于腦神經(jīng)細胞時通用于腦卒中等模型。缺血狀態(tài)的海馬、錐體細胞在去極化所致的顯著神經(jīng)興奮后，發(fā)生傳導(dǎo)阻滯。在這之后，因伴隨著細胞外谷氨酸、細胞內(nèi)鈣離子和自由基等增加的細胞毒性，細胞發(fā)生障礙，甚至失去細胞機能，導(dǎo)致細胞死亡。因此，在此缺血狀態(tài)所致神經(jīng)障礙的過程中，抑制神經(jīng)細胞去極化的藥物作為治療、預(yù)防缺血性疾病的藥物很有用。
本發(fā)明者們對涉及牛痘病毒接種炎癥組織提取物的藥理活性進行了種種的實驗研究，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該物質(zhì)具有抑制缺血狀態(tài)時神經(jīng)細胞異常去極化的新作用。本發(fā)明物質(zhì)所確認(rèn)的這種新藥理作用具有在正常狀態(tài)時不出現(xiàn)而只在低氧所致病態(tài)時表現(xiàn)的優(yōu)良特征。
本發(fā)明的目的在于提供只在病態(tài)時出現(xiàn)藥效、副作用小能夠安全給藥的缺血性疾病治療藥。
已知對于病毒等外來的侵襲和內(nèi)部的疾病狀態(tài)，機體具有對過度反應(yīng)的抑制作用和對功能低下的增強作用的兩重性，為維持其穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)機體功能使之正?；軌虍a(chǎn)生各種機體功能調(diào)節(jié)物質(zhì)。例如關(guān)于在接種牛痘病毒的炎癥組織中產(chǎn)生的機體功能調(diào)節(jié)物質(zhì)，從病變組織提取該物質(zhì)的制造方法及其藥理活性已有各種報道(特公昭63-39572號公報、特公昭63-25600號公報、特公平3-43279號公報、特許第2594222號公報等)。
此外，作為實際的藥品有牛痘病毒接種家兔炎癥皮膚提取物制劑。此制劑例如有《醫(yī)療藥日本醫(yī)藥品集》(1994年8月版，日本醫(yī)藥情報中心編，藥業(yè)時報社發(fā)行)1434頁記載的含有從接種牛痘病毒家兔的炎癥皮膚組織提取分離的非蛋白性活性物質(zhì)的藥物，它有可作為適應(yīng)癥為腰痛癥、頸肩腕綜合癥、肩周炎、變形性關(guān)節(jié)炎、癥候性神經(jīng)痛、皮膚病(濕疹、皮炎、蕁麻疹)并發(fā)的搔癢、過敏性鼻炎、亞急性視神經(jīng)脊髓病后遺癥的冷感、疼痛、異常感覺等的，以皮下注射、肌肉注射、靜脈注射用的注射劑和片劑等劑型的醫(yī)療用藥品進行生產(chǎn)、銷售的許可。
本發(fā)明的缺血性疾病治療藥的有效成分為從如上述的牛痘病毒接種炎癥組織中提取的非蛋白性機體功能調(diào)節(jié)物質(zhì)，上述《醫(yī)療藥日本醫(yī)藥品集》中記載的牛痘病毒接種家兔炎癥皮膚提取物制劑已有生產(chǎn)許可，因而可以購買得到。此外，上述特許公報等文獻記載的各種牛痘病毒接種炎癥組織提取物可作為本發(fā)明的物質(zhì)利用，其制造方法和優(yōu)選給藥量等在文獻中也有說明。
關(guān)于對患者的給藥方法，在市售藥劑中有注射劑的皮下、肌肉、靜脈注射給藥和片劑的口服給藥等，另外與疾病種類相適應(yīng)，其治療可按最適的上述以外的劑型進行給藥。給藥量可根據(jù)牛痘病毒接種炎癥組織提取物的種類不同而適當(dāng)?shù)卦O(shè)定，市售制劑采用的給藥量如前面的《醫(yī)療藥日本醫(yī)藥品集》記載的，基本量內(nèi)服為1天16紐洛托品(neurotropin)單位(NU)、注射劑為1天3.6至7.2NU，但根據(jù)疾病的種類、嚴(yán)重程度、患者的個體差異、給藥方法、給藥時間等可以適當(dāng)?shù)卦鰷p。
下面顯示了涉及牛痘病毒接種炎癥組織提取物的新藥理作用的藥理實驗結(jié)果。
實施例(1)使用海馬、錐體細胞的低氧模型實驗系統(tǒng)將從體重140～200克雄性Wistar大鼠取出的腦用95％氧+5％二氧化碳混和氣體通氣平衡的4℃人工腦脊液(124mM氯化鈉、5mM氯化鉀、2.6mM氯化鈣、1.3mM硫酸鎂、1.24mM磷酸二氫鈉、26mM碳酸氫鈉、10mM葡萄糖)冷卻15分鐘后，分離海馬，用微切片機切成約400μm的厚度。接著，用上述混合氣體平衡化切片標(biāo)本，保持室溫在人工腦脊液中孵育30分鐘以上后，移入細胞內(nèi)記錄用箱，用加溫34±0.2℃的人工腦脊液(pH7.4)以1.5ml/分的流量灌流。在經(jīng)過約30分鐘的孵育后，開始記錄海馬、錐體細胞的細胞內(nèi)記錄。
細胞內(nèi)記錄時使用充滿4M醋酸鉀溶液的、尖端電阻為40～90Ω的玻璃電極(尖端直徑1～2μm)。玻璃電極在實物顯微鏡下插入海馬、CA1區(qū)域的錐體細胞層。錐體細胞中刺入電極后，所得靜息膜電位用細胞內(nèi)記錄用放大器進行放大以行記錄。膜的輸入電阻通0.2nA的陰極電流(200ms幅度、0.2Hz間隔)來測定。實驗中使用靜息膜電位-55mv以上的特定錐體細胞。
(2)正常氧狀態(tài)下被測藥物的影響本實驗在正常氧狀態(tài)下實施。即，被測藥物對錐體細胞的膜電位和膜電阻的作用是以被測藥物處置5分鐘前和處置10～20分鐘后通以-0.1～-0.5nA陰極電流(200ms幅度、0.2Hz間隔)時的膜電位變化(輸入電流-膜電位的關(guān)系)為指標(biāo)，比較被測藥物處置前后的情況，以相應(yīng)數(shù)值的t-檢驗進行解析。
作為被測藥物，將本發(fā)明物質(zhì)(牛痘病毒接種炎癥皮膚提取物制劑商品名紐洛托品neurotropin)按人工腦脊液中最終濃度為0.03～0.3NU/mL的濃度稀釋使用。
上述被測藥物處置前后錐體細胞的輸入電流-膜電位關(guān)系如

圖1所示。圖中各點(測定值)表示4例的平均值，評價處置10～20分鐘后被測藥物的作用。本發(fā)明物質(zhì)0.03～0.3NU/mL的處置對膜電位(回歸直線的Y軸截距)未見顯著影響。另一方面，0.1NU/mL以上用量的膜電阻(回歸系數(shù))有增加的傾向。
(3)低氧狀態(tài)下被測藥物的作用首先對于正常的氧狀態(tài)，測定被測藥物處置前5分鐘至處置后10分鐘時的膜電位和膜電阻。在這之后將人工腦脊液中的氧用氮代替以進行低氧負(fù)荷(記錄用箱內(nèi)人工腦脊液的氧分壓在60mmHg以下)，與此同時用被測藥物處置，測定20分鐘間的膜電位和膜阻抗。此外作為對照組設(shè)定不加被測藥的組，進行相同的測定。被測藥物對低氧狀態(tài)下錐體細胞膜電位和膜電阻的作用是比較對照組和被測藥物組膜電位和膜電阻的漂移，按一元配置分散分析進行解析。
本發(fā)明物質(zhì)對正常(低氧負(fù)荷前)和低氧狀態(tài)下錐體細胞膜電位變化的作用如圖2所示，對膜電阻變化的作用如圖3所示。圖2的各測定值表示5或6例的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。對照組和各被測藥處置組膜電位的基礎(chǔ)值分別為-69.1±0.9、-67.9±1.5及-67.6±0.4mV。此外圖3的各測定值表示4或5例的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。對照組和各被測藥處置組膜電阻的基礎(chǔ)值分別為28.2±1.2、30.3±2.9及33.1±2.0MΩ。
錐體細胞從低氧負(fù)荷6分鐘前后顯示出顯著的去極化，20分鐘后為-10mV以下，達到平臺(圖2)。另一方面，膜電阻在低氧負(fù)荷的1～2分鐘以內(nèi)減少，在這之后基本保持一定的值(圖3)。本發(fā)明物質(zhì)0.1NU/mL處置有抑制低氧負(fù)荷所致的去極化，0.3NU/mL處置可見對去極化顯著的抑制作用(圖2)。此外，對于任一用量的本發(fā)明物質(zhì)處置，有維持、增大膜電阻的傾向(圖3)。同樣地，使用按特許第2594222號公報實施例1記載的制造方法所得的本發(fā)明物質(zhì)進行實驗的結(jié)果顯示出和市售的牛痘病毒接種炎癥皮膚提取物制劑相同的、對低氧負(fù)荷所致去極化的劑量依賴性抑制作用。
如上述藥理實驗結(jié)果闡明的，本發(fā)明物質(zhì)具有抑制低氧所致的海馬、錐體細胞異常去極化、防御細胞障礙、延遲細胞死亡的優(yōu)良作用。此作用具有未見于正常的錐體細胞、只見于低氧負(fù)荷所致病態(tài)時的特征。
作為抑制缺血狀態(tài)所致神經(jīng)細胞異常去極化的機制，顯示在電生理學(xué)上表現(xiàn)為Na+-K+泵的活化、Na+或Ca2+通道的阻斷、K+或Cl-通道的活化。這種抑制缺血狀態(tài)所致神經(jīng)障礙過程中神經(jīng)細胞去極化的藥物不僅能夠治療作為缺血直接誘導(dǎo)疾病的腦梗塞并預(yù)防其惡化，更能改善、防御基于缺血所致海馬障礙的腦血管性癡呆等的記憶、意識障礙，考慮到對異常去極化抑制作用的上述作用機制，也可能改善缺血所致中樞及末梢的神經(jīng)障礙、特別是運動神經(jīng)及感覺神經(jīng)系統(tǒng)異常興奮引起的并發(fā)癥。本發(fā)明物質(zhì)作為治療、預(yù)防各種缺血性疾病的藥物很有用。
附圖的簡單說明圖1圖1表示海馬CA1區(qū)域錐體細胞輸入電流-膜電位(I-V)的關(guān)系及本發(fā)明物質(zhì)對它的影響。圖中的白圈為對照組，黑圈為被測藥物組，被測藥物(本發(fā)明物質(zhì))的用量如圖中所示。
圖2圖2表示低氧負(fù)荷時海馬CA1區(qū)域錐體細胞的膜電位變化及本發(fā)明物質(zhì)的作用。圖中的白圈為對照組(只有人工腦脊液)，白三角為本發(fā)明物質(zhì)處置組(0.1NU/mL)、黑圈為本發(fā)明物質(zhì)處置組(0.3NU/mL)，按Bonferroni多重檢驗與對照組相比p＜0.05顯著差異的標(biāo)*號。
圖3圖3表示低氧負(fù)荷時海馬CA1區(qū)域錐體細胞的膜電阻變化及本發(fā)明物質(zhì)的作用。圖中的白圈、白三角和黑圈和圖2相同。
權(quán)利要求
1．含有牛痘病毒接種炎癥組織提取物作為有效成分的缺血性疾病治療藥。
2．根據(jù)權(quán)利要求1記載的缺血性疾病治療藥，為缺血性腦疾病治療藥。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2記載的藥物，其中炎癥組織為皮膚組織。
4．根據(jù)權(quán)利要求3記載的藥物，為家兔的炎癥皮膚組織。
5．根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項記載的藥物，為注射劑。
6．根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項記載的藥物，為口服制劑。
全文摘要
提供副作用小可以安全給藥的缺血性疾病治療藥。本發(fā)明缺血性疾病治療藥的有效成分為牛痘病毒接種炎癥提取物。牛痘病毒接種炎癥組織提取物具有抑制低氧狀態(tài)時海馬、錐體細胞的異常去極化、防御細胞障礙、延遲細胞死亡的優(yōu)良作用。此作用具有未見于正常的錐體細胞、只見于低氧負(fù)荷所致病態(tài)時的特征。因此,本發(fā)明物質(zhì)作為治療、預(yù)防腦梗塞等缺血性疾病及缺血所致神經(jīng)障礙引起的并發(fā)癥的藥物很有用。
文檔編號A61K35/36GK1235054SQ99105179
公開日1999年11月17日 申請日期1999年4月27日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月27日
發(fā)明者小西甚右衛(wèi)門, 福原弘紀(jì) 申請人:日本臟器制藥株式會社