專(zhuān)利名稱(chēng)：用于治療缺血性疾病的蛋白質(zhì)及藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及用于治療缺血性疾病的蛋白質(zhì)及藥物組合物。
背景技術(shù)：
缺血性疾病已成為人類(lèi)死亡的主要原因，其中，心肌缺血和下肢缺血病患者數(shù)呈現(xiàn)著不斷增加的趨勢(shì)。目前全世界每死亡3個(gè)人，就有I人死于心肌缺血類(lèi)疾病。在心血管疾病中，各種原因可導(dǎo)致心臟細(xì)胞死亡，主要因?yàn)槌墒煨募〖?xì)胞一個(gè)最大的特性就是在出生不久，這些細(xì)胞就失去了分裂增殖的能力。這樣，死亡的細(xì)胞最終就全部由沒(méi)有功能的疤痕組織所代替，最終導(dǎo)致心力衰竭。這類(lèi)心臟機(jī)能極其低下患者的預(yù)后也極其不良。在現(xiàn)階段，心臟移植是這些患者主要治療方式，然而，器官捐獻(xiàn)數(shù)量極少，也受到倫理等的限制；代替心臟移植的一個(gè)較有希望的治療辦法是近年來(lái)興起的干細(xì)胞治療，是通過(guò)干細(xì)胞替代壞死心肌細(xì)胞方式來(lái)達(dá)到細(xì)胞再生的目的，現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，移植細(xì)胞包括骨髓干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞可在心肌內(nèi)發(fā)育為成熟心肌細(xì)胞并與宿主細(xì)胞形成閏盤(pán)聯(lián)接，阻止心室擴(kuò)大，提高心臟功能，但由干細(xì)胞發(fā)育成的成熟心肌細(xì)胞數(shù)量有限，不能從根本上起到修復(fù)病變心肌的作用。本領(lǐng)域目前尚無(wú)有效的治療缺血性疾病的藥物，因此迫切需要開(kāi)發(fā)效果優(yōu)良、無(wú)毒副作用的、能夠替代器官移植和干細(xì)胞的新型藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于治療缺血性疾病的蛋白質(zhì)及藥物組合物。本發(fā)明的另一目的是提供 一種胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白或其基因的用途。本發(fā)明的另一目的是提供一種預(yù)防和/或治療缺血性疾病和體外非治療性地促進(jìn)血管增殖的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP)或其基因的用途，用于制備預(yù)防和/或治療缺血性疾病的藥物。在另一選例中，所述的缺血性疾病選自下組:心肌缺血和下肢缺血。在另一選例中，所述的胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白或其基因選自下組:IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-4 或 IGFBP-6。在另一優(yōu)選例中，所述的胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白或其基因?yàn)镮GFBP-4。在另一優(yōu)選例中，所述的IGFBP-4基因的核酸序列如SEQ ID N0.:1所示，所述IGFBP-4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.:2所示。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種制備胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白的方法，所述方法包括步驟:(I)構(gòu)建含有編碼胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白的核酸序列的表達(dá)載體；(2)將步驟(I)獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞；
(3)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)步驟(2)所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白；(4)分離步驟(3)中所表達(dá)的胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白。在另一優(yōu)選例中，步驟(I)所述的胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白為IGFBP-4。在另一優(yōu)選例中，編碼IGFBP-4的核酸序列如SEQ ID N0.:1所示，或IGFBP-4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.:2所示。在另一優(yōu)選例中，步驟(2)所述的宿主細(xì)胞為腎細(xì)胞，較佳地為為HEK293細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白為帶有His標(biāo)簽的融合蛋白。在另一優(yōu)選例中，在步驟(4)中，利用鎳柱純化帶有His標(biāo)簽的胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種預(yù)防和/或治療缺血性疾病的方法，包括步驟:給需要的對(duì)象施用胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白，或施用含胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白的藥物組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白選自下組:IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-4 或 IGFBP-6，較佳地為 IGFBP-4。在另一優(yōu)選例中，所述的缺血性疾病為心肌缺血或下肢缺血。在另一優(yōu)選例 中，所述的藥物組合物為液態(tài)劑型，如注射液。在另一優(yōu)選例中，所述的施用包括:靜脈注射、皮下注射、或肌內(nèi)注射等。在另一優(yōu)選例中，所述的對(duì)象為哺乳動(dòng)物。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種體外非治療性地促進(jìn)血管增殖的方法，包括步驟:將胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白與組織和/或細(xì)胞接觸，從而促進(jìn)血管增殖。在另一優(yōu)選例中，所述的接觸是在胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白存在下，培養(yǎng)所述組織和/或細(xì)胞。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


下列附圖用于說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書(shū)所界定的本發(fā)明范圍。圖1顯示了 IGFBP-4的蛋白結(jié)構(gòu)示意圖。圖2顯示了宿主細(xì)胞表達(dá)IGFBP-4蛋白的純化與檢測(cè)結(jié)果。圖3顯示了純化的IGFBP-4蛋白SDS-PAGE電泳圖。圖4顯示了 IGFBP-4蛋白用于動(dòng)物治療的結(jié)果，其中，圖4A為解剖直接觀察結(jié)果；圖4B為治療后O天的血管紅外成像圖；圖4(:為治療后6天的血管紅外成像圖，每組的左圖為IGFBP-4治療組，右側(cè)為對(duì)照組。圖5為冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后小鼠心臟橫切面，注射了 IGFBP-4以后的小鼠心臟心肌層(右)比對(duì)照組(左)要厚，顯示IGFBP-4蛋白在心肌缺血中具有保護(hù)作用。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-4(IGFBP-4)竟然具有優(yōu)異的治療缺血性疾病的作用，具體地，IGFBP-4蛋白能夠促進(jìn)血管增殖，從而有效改善缺血癥狀，因此對(duì)于缺血性疾病，尤其是心肌缺血、下肢缺血具有良好的治療和預(yù)防作用。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGFs)胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factors,簡(jiǎn)稱(chēng)IGFs)是一類(lèi)多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子。IGFs家族由兩種低分子多肽(IGF-1、IGF-1I)、兩類(lèi)特異性受體及六種結(jié)合蛋白組成。IGF-1是一個(gè)有70個(gè)氨基酸的單鏈堿性蛋白，分子量7649Da，耐熱；而IGF-1I則為一個(gè)含67個(gè)氨基酸的單鏈弱酸性蛋白，分子量為7471Da，對(duì)0.1 % SDS穩(wěn)定，兩者70%以上同源，與人類(lèi)胰島素原的結(jié)構(gòu)和功能約50%相似。IGFs的生物學(xué)功能是通過(guò)與特異性 的靶細(xì)胞表面的受體結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。IGFs與其它的生長(zhǎng)因子不同，不論在血清，細(xì)胞外液及細(xì)胞培養(yǎng)液中都與特異性的結(jié)合蛋白(Binding Proteins, BPs)結(jié)合以無(wú)活性的復(fù)合物形式存在。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)6種IGFBPjP IGFBP1、2、3、4、5和6，其特征性的結(jié)構(gòu)構(gòu)成了一個(gè)相關(guān)性分泌蛋白家族，均為低分子肽類(lèi)，50%結(jié)構(gòu)相似。它們與兩種IGF都具高親和力，而不與胰島素結(jié)合。IGFBP1、2，4和6的性質(zhì)較接近。胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-4(IGFBP_4)及其制備IGFBP-4是最小的IGFBP，也是極其重要的一類(lèi)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白。IGFBP-4存在于所有的生物體液中，不同類(lèi)型的細(xì)胞，包括纖維母細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞、前列腺細(xì)胞和骨細(xì)胞等均能生成IGFBP-4，肝臟是IGFBP-4mRNA表達(dá)最豐富的部位。人類(lèi)IGFBP-4基因位于17號(hào)染色體，跨距15.3kb，鼠的IGFBP-4基因位于11號(hào)染色體，跨距11.3kb。人與鼠的IGFBP-4基因都由被3個(gè)內(nèi)含子分別隔開(kāi)的4個(gè)外顯子組成，剪接位點(diǎn)高度保守，IGFBP-4的啟動(dòng)子具有典型的TATA盒與CART盒。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，IGFBP-4蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，IGFBP-4的核苷酸序列如SEQ ID N0.: I 所示:aaagtccgggggagccggtcccgggcagccgctcagccccctgcccctcgccgcccgccgcctgcctgggccgggccgaggatgcggcgcagcgcctcggcggccaggcttgctcccctccggcacgcctgctaacttcccccgctacgtccccgttcgcccgccgggccgccccgtctccccgcgccctccgggtcgggtcctccaggagcgccaggcgctgccgccgtgtgccctccgccgctcgcccgcgcgcccgcgctccccgcctgcgcccagcgccccgcgcccgcgcccagtcctcgggcggtcatgctgcccctctgcctcgtggccgccctgctgctggccgccgggcccgggccgagcctgggcgacgaagccatccactgcccgccctgetccgaggagaagctggcgcgctgccgcccccccgtgggctgcgaggagctggtgcgagagccgggctgcggctgttgcgccacttgcgccctgggcttggggatgccctgcggggtgtacaccccccgttgcggctcgggcctgcgctgctacccgccccgaggggtggagaagcccctgcacacactgatgcccgggcaaggcgtgtgcatggagctggcggagatcgaggccatccaggaaagcctgcagccctctgacaaggacgagggtgaccaccccaacaacagcttcagcccctgtagcgcccatgaccgcaggtgcctgcagaagcacttcgccaaaattcgagaccggagcaccagtgggggcaagatgaaggtcaatggggcgccccgggaggatgcccggcctgtgccccagggctcctgccagagcgagctgcaccgggcgctggagcggctggccgcttcacagagccgcacccacgaggacctctacatcatccccatccccaactgcgaccgcaacggcaacttccaccccaagcagtgtcacccagctctggatgggcagcgtggcaagtgctggtgtgtggaccggaagacgggggtgaagcttccggggggcctggagccaaagggggagctggactgccaccagctggctgacagctttcgagagtgaggcctgccagcaggccagggactcagcgtcccctgctactcctgtgctctggaggctgcagagctgacccagagtggagtctgagtctgagtcctgtctctgcctgcggcccagaagtttccctcaaatgcgcgtgtgcacgtgtgcgtgtgcgtgcgtgtgtgtgtgtttgtgagcatgggtgtgcccttggggtaagccagagcctggggtgttctctttggtgttacacagcccaagaggactgagactggcacttagcccaagaggtctgagccctggtgtgtttccagatcgatcctggattcactcactcactcattccttcactcatccagccacctaaaaacatttactgaccatgtactacgtgccagctctagttttcagccttgggaggttttattctgacttcctctgattttggcatgtggagacactcctataaggagagttcaagcctgtgggagtagaaaaatctcattcccagagtcagaggagaagagacatgtaccttgaccatcgtccttcctctcaagctagccagagggtgggagcctaaggaagcgtggggtagcagatggagtaatggtcacgaggtccagacccactcccaaagctcagacttgccaggctccctttctcttcttccccaggtccttcctttaggtctggttgttgcaccatctgcttggttggctggcagctgagagccctgctgtgggagagcgaagggggtcaaaggaagacttgaagcacagagggctagggaggtggggtacatttctctgagcagtcagggtgggaagaaagaatgcaagagtggactgaatgtgcctaatggagaagacccacgtgctaggggatgaggggcttcctgggtcctgttccctaccccatttgtggtcacagccatgaagtcaccgggatgaacctatccttccagtggctcgctccctgtagctctgcctccctctccatatctccttcccctacacctccctccccacacctccctactcccctgggcatcttctggcttgactggatggaaggagacttaggaacctaccagttggccatgatgtcttttcttctttttcttttttttaacaaaacagaacaaaaccaaaaaatgtccagatgaaaaaaaaaaa(SEQ ID N0.:1)。IGFBP-4蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID N0.:2所示:MLPLCLVAALLLAAGPGPSLGDEAIHCPPCSEEKLARCRPPVGCEELVREPGCGCCATCALGLGMPCGVYTPRCGSGLRCYPPRGVEKPLHTLMPGQGVCMELAEIEAIQESLQPSDKDE⑶HPNNSFSPCSAHDRRCLQKHFAKIRDRSTSGGKMKVNGAPREDARPVPQGSCQSELHRALERLAASQSRTHEDLYIIPIPNCDRNGNFHPKQCHPALDGQRGKCWCVDRKTGVKLPGGLEPKGELDCHQLADSFRE(SEQ ID N0.:2)。根據(jù)本文所述的核苷酸序列，本技術(shù)領(lǐng)域人員可方便地用各種已知方法制得本發(fā)明的IGFBP-4基因的編碼核酸。這些方法例如但不限于:PCR，DNA人工合成等，具體的方法可參見(jiàn)J.薩姆布魯克，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，可通過(guò)分段合成核苷酸序列再進(jìn)行重疊延伸PCR的方法來(lái)構(gòu)建本發(fā)明的編碼核酸序列。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“引物”指的是在與模板配對(duì)，在DNA聚合酶的作用下能以其為起點(diǎn)進(jìn)行合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈的寡居核苷酸的總稱(chēng)。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸，引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基 本上”)與模板上一條鏈上的一個(gè)特殊的序列互補(bǔ)。引物必須與模板上的一條鏈充分互補(bǔ)才能開(kāi)始延伸，但引物的序列不必與模板的序列完全互補(bǔ)。比如，在一個(gè)3’端與模板互補(bǔ)的引物的5’端加上一段與模板不互補(bǔ)的序列，這樣的引物仍大致上與模板互補(bǔ)。只要有足夠長(zhǎng)的引物能與模板充分的結(jié)合，非完全互補(bǔ)的引物也可以與模板形成引物-模板復(fù)合物，從而進(jìn)行擴(kuò)增。包含基因編碼序列可以與表達(dá)調(diào)控序列操作性相連的。所述的“操作性相連”或“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線(xiàn)性DNA序列的某些部分能夠調(diào)節(jié)或控制同一線(xiàn)性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。
表達(dá)載體可采用市售的例如但不限于:pUCT、pIRES、pDR，pUC18等可用于真核細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)的載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)宿主細(xì)胞來(lái)選擇合適的表達(dá)載體。根據(jù)已知空載表達(dá)載體的酶切圖譜，本領(lǐng)域技術(shù)人員可按照常規(guī)方法通過(guò)限制性酶剪切與拼接，將本發(fā)明IGFBP-4基因的編碼核酸序列插入合適的限制性位點(diǎn)，制得重組表達(dá)載體。所述的宿主細(xì)胞優(yōu)選的是真核細(xì)胞，例如但不限于HEK293細(xì)胞，CHO細(xì)胞，COS細(xì)胞，293細(xì)胞，RSF細(xì)胞等。上述宿主細(xì)胞均可以市售獲得。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的細(xì)胞是HEK293細(xì)胞，其可良好地表達(dá)IGFBP-4蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，提供了一種制備IGFBP-4蛋白的方法，包括步驟:I)提供編碼IGFBP-4蛋白的核酸序列(如SEQ ID NO:1序列)；2)將I)的核酸序列插入到合適的表達(dá)載體，獲得重組表達(dá)載體；3)將 2)的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞HEK293中；4)在適合表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；5)收集上清液，His和鎳金屬純化蛋白產(chǎn)物。將所述編碼序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞可采用本領(lǐng)域的多種已知技術(shù)，例如但不限于:磷酸鈣沉淀，原生質(zhì)體融合，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，電穿孔，微注射，反轉(zhuǎn)錄法，噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)法，堿金屬離子法。有關(guān)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)和表達(dá)可參見(jiàn)Olander RM Dev Biol Standl996 ；86:338?？赏ㄟ^(guò)離心去除懸浮液中的細(xì)胞和殘?jiān)?，收集清液。可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行鑒定?？蓪⑸鲜鲋苽浍@得的蛋白純化為基本均一的性質(zhì)，例如在SDS-PAGE電泳上呈單一條帶。例如，當(dāng)重組蛋白為分泌表達(dá)時(shí)，可以采用商品化的超濾膜來(lái)分離所述蛋白，例如Millipore、Pellicon等公司產(chǎn)品，首先將表達(dá)上清濃縮。濃縮液可采用凝膠層析的方法進(jìn)一步加以純化，或采用離子交換層析的方法純化。例如陰離子交換層析(DEAE等)或陽(yáng)離子交換層析。凝膠基質(zhì)可為瓊脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白純化的基質(zhì)。Q-或SP-基團(tuán)是較為理想的離子交換基團(tuán)。最后，還可用羥基磷灰石吸附層析，金屬螯合層析，疏水相互作用層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)等方法對(duì)上述純化產(chǎn)物進(jìn)一步精制純化。上述所有純化步驟可利用不同的組合，最終使蛋白純度達(dá)到基本均一?？衫煤兴龅鞍椎奶禺愋钥贵w、受體或配體的親和層析柱對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化。根據(jù)所使用的親和柱的特性，可利用常規(guī)的方法，如高鹽緩沖液、改變PH等方法洗脫結(jié)合在親和柱上的融合性多肽?？蛇x擇地，所述的蛋白的氨基端或羧基端還可含有一個(gè)或多個(gè)多肽片段，作為蛋白標(biāo)簽。任何合適的標(biāo)簽都可以用于本發(fā)明。例如，所述的標(biāo)簽可以是FLAG，HA, HAl，c_Myc，6_His或8_His等。這些標(biāo)簽可用于對(duì)蛋白進(jìn)行純化。IGFBP-4 的用途本發(fā)明還提供了一種胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(特別是IGFBP-4)的用途，所述蛋白用于制備預(yù)防和/或治療缺血性疾病的藥物。所述的缺血性疾病選自下組:心肌缺血、下肢缺血、腦缺血、腸道缺血、或腎缺血，較佳地為心肌缺血或下肢缺血。本發(fā)明還提供了一種預(yù)防和/或治療缺血性疾病的方法，包括步驟:給需要的對(duì)象施用胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白，或施用含胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白的藥物組合物。所述的胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白選自下組:IGFBP-1、IGFBP-3、或IGFBP-4，較佳地為IGFBP-4 ο所述的缺血性疾病包括選自下組:心肌缺血、下肢缺血、腦缺血、腸道缺血、或腎缺血；較佳地為心肌缺血或下肢缺血。所述的施用包括:靜脈注射、口服片劑、瘤內(nèi)、腹腔注射等；所述的對(duì)象為哺乳動(dòng)物。藥物組合物本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有有效量(如0.000001-90wt% ;較佳的
0.l-50wt% ;更佳的，5-40wt% )的IGFBP蛋白(尤其是IGFBP-4蛋白)，以及藥學(xué)上可接受的載體。通常，可將IGFBP蛋白配制于無(wú)毒、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“有效量”或“有效劑量”是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所接受的量。如本文所用 ，“藥學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動(dòng)物而無(wú)過(guò)度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。本發(fā)明的藥物組合物含有安全有效量的IGFBP-4蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。這類(lèi)載體包括(但并不限于):鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物制劑應(yīng)與給藥的方式相匹配，本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。所述的藥物組合物宜在無(wú)菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量。本發(fā)明的藥物制劑還可制成緩釋制劑。本發(fā)明所述蛋白的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來(lái)確定(例如通過(guò)臨床試驗(yàn))。所述的因素包括但不限于:所述的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴(yán)重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。通常，當(dāng)IGFBP-4蛋白每天以約0.0001mg-50mg/kg動(dòng)物體重(較佳的0.001mg-10mg/kg動(dòng)物體重)的劑量給予，能得到令人滿(mǎn)意的效果。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開(kāi)的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。以IGFBP-4蛋白為例，本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括，I) IGFBP-4蛋白能促進(jìn)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，是一個(gè)與IGF信號(hào)通路無(wú)關(guān)的細(xì)胞分化誘導(dǎo)因子；2) IGFBP-4蛋白可促進(jìn)血管增殖；3) IGFBP-4蛋白具有優(yōu)異的治療缺血性疾病的效果；4) IGFBP-4蛋白在治療中無(wú)毒副作用。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。術(shù)語(yǔ)說(shuō)明°C =攝氏度；min =分鐘；sec =秒；M =摩爾；mM =毫摩爾；mL =毫升；μ L =微升；μ g =微克。
實(shí)施例1IGFBP-4蛋白的制備1.克隆 IGFBP-4 基因:用常規(guī)方法抽提的人mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。將所述cDNA作為模板，用對(duì)應(yīng)于IGFBP-4基因(SEQ ID N0.:1) ORF框兩側(cè)的引物，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增獲得人IGFBP-4擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物長(zhǎng)度與預(yù)測(cè)值一致。2.構(gòu)建IGFBP-4真核表達(dá)載體:將上述獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)TA亞克隆到pcDNA3.l-T0P0_6XHis真核細(xì)胞表達(dá)載體(購(gòu)自Invitrogen公司)中。3.轉(zhuǎn)染:用常規(guī)方法轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞為HEK293細(xì)胞，并在含500 μ g/ml G418的條件下培養(yǎng)，獲得了多株生長(zhǎng)的HEK293細(xì)胞株，即為轉(zhuǎn)化子。挑選表達(dá)量高的轉(zhuǎn)化子，用常規(guī)方法培養(yǎng)，使其表達(dá)IGFBP-4蛋白質(zhì)，宿主細(xì)胞表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖2。4.1GFBP-4蛋白質(zhì)的純化和檢測(cè):利用His和鎳金屬相結(jié)合的方法，使用鎳柱純化IGFBP-4蛋白，純化結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，已經(jīng)成功地純化了 IGFBP-4蛋白質(zhì)。實(shí)施例2 動(dòng)物下肢缺血缺血模型的制備1.模型建立和標(biāo)本收集8周雄性C57BL/6小鼠10只(The Jackson Laboratory,美國(guó))，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只。分幾點(diǎn)直接注射IGFBP-4(5μg/50μl)到缺血下肢部位，給對(duì)照組小鼠注射相同容量的生理鹽水。激光多普勒影像顯示缺血部分為藍(lán)色，而有血流部分為紅色。2.于小鼠12周齡時(shí)，行左側(cè)股動(dòng)脈結(jié)扎和切除術(shù)，建立小鼠下肢缺血模型。分別于術(shù)前、術(shù)后即刻，和術(shù)后7、14、21、28d以激光多普勒超聲掃描儀監(jiān)測(cè)小鼠下肢血流灌注情況。實(shí)施例3 藥物治療動(dòng)物下肢缺血模型小鼠下肢缺血模型建立(實(shí)施例2)后，以激光多普勒超聲掃描儀監(jiān)測(cè)小鼠下肢血流灌注情況；利用小鼠尾靜脈一次性注射重組IGFBP-4蛋白(5μ g/25g)或安慰劑(PBS)作為對(duì)照；6天后同樣以激光多普勒超聲掃描儀監(jiān)測(cè)小鼠下肢血流灌注情況。治療效果的觀察與評(píng)價(jià):結(jié)果表明，一次性注射重組IGFBP-4蛋白組小鼠下肢缺血明顯有改善，圖4顯示了 IGFBP-4蛋白用于動(dòng)物治療的結(jié)果，其中，圖4A為解剖直接觀察結(jié)果；圖4B為治療后O天的血管紅外成像圖；圖4C為治療后6天的血管紅外成像圖，每一組的左圖為IGFBP-4治療組，右側(cè)為對(duì)照組。實(shí)施例4動(dòng)物心肌缺血模型的制備1.模型建立和標(biāo)本收集8周雄性C57BL/6小鼠4只(The Jackson Laboratory,美國(guó))，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組2只，一次性直接尾靜脈注射IGFBP-4 (5 μ g/50 μ I)，給對(duì)照組小鼠注射相同容量的生理鹽水，進(jìn)行組織切片后觀察。2.選用C57BL/6雄性小鼠，腹腔注射阿托品(0.04mg/kg)，5min后腹腔麻醉(戊巴比妥鈉，60mg/kg)，觀測(cè)小鼠的呼吸頻率(90次/min以上)及動(dòng)度，接呼吸機(jī)(潮氣量lml，頻率90-105次/min)，小鼠呼吸頻率與呼吸機(jī)節(jié)律相同，無(wú)呼吸抵抗，可以開(kāi)胸。在胸骨左緣2_3mm，第2、3、4肋間處做一縱切口，結(jié)扎肋間動(dòng)脈，分離胸腺、心包，暴露心臟，冠狀動(dòng)脈前降支從左心耳前端和肺動(dòng)脈圓錐間下行，在左心耳下緣打活結(jié)結(jié)扎該冠脈，從心電圖判斷其缺血情況。30min后，解開(kāi)活結(jié)，恢復(fù)冠脈血流；再灌注15min，觀測(cè)小鼠心律平穩(wěn)后，開(kāi)始關(guān)胸。由于小鼠胸壁較薄，不宜單層縫合，將肋間肌和胸肌分別縫合，針距在1.5mm左右?？p合完畢后，用注射針抽取胸腔內(nèi)殘余氣體，減小氣量，小鼠出現(xiàn)輕微的自主呼吸，此時(shí)可以撤下呼吸機(jī)，小鼠恢復(fù)自主呼吸。若不能及時(shí)恢復(fù)，用左手輕按小鼠胸骨助其呼吸。小鼠自主呼吸頻率在90次/分鐘以上，觀察20min，待其呼吸動(dòng)度和頻率沒(méi)有減弱時(shí)，縫合皮膚，腹腔注射0.5ml溫生理鹽水，將其放置在25°C的環(huán)境中。實(shí)施例5藥物治療動(dòng)物心肌缺血模型

小鼠心肌缺血模型建立后(實(shí)施例4)進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)，利用小鼠尾靜脈一次性注射重組IGFBP-4蛋白(5yg/25g)或安慰劑(PBS)，6天后根據(jù)圖示進(jìn)行組織切片后觀察。治療效果的觀察與評(píng)價(jià):一次性注射重組IGFBP-4蛋白組小鼠對(duì)心肌缺血小鼠心臟明顯有保護(hù)作用，圖5為冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后小鼠心臟橫切面，注射了 IGFBP-4以后的小鼠心臟心肌層(右)比對(duì)照組(左)要厚，顯示IGFBP-4蛋白在心肌缺血中具有保護(hù)作用。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP)或其基因的用途，其特征在于，用于制備預(yù)防和/或治療缺血性疾病的藥物。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的缺血性疾病選自下組:心肌缺血和下肢缺血。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白或其基因選自下組:IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-4 或 IGFBP-6。
4.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的IGFBP-4基因的核酸序列如SEQIDN0.:1所示，所述IGFBP-4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.:2所示。
5.一種制備胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白的方法，其特征在于，包括步驟: (1)構(gòu)建含有編碼胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白的核酸序列的表達(dá)載體； (2)將步驟(I)獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞； (3)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)步驟(2)所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白； (4)分離步驟(3)中所表達(dá)的胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(I)所述的胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白為 IGFBP-4。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述的宿主細(xì)胞為腎細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白為帶有His標(biāo)簽的融合蛋白。`
9.一種預(yù)防和/或治療缺血性疾病的方法，其特征在于，包括步驟:給需要的對(duì)象施用胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白，或施用含胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白的藥物組合物。
10.一種體外非治療性地促進(jìn)血管增殖的方法，其特征在于，包括步驟:將胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白與組織和/或細(xì)胞接觸，從而促進(jìn)血管增殖。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療缺血性疾病的蛋白質(zhì)及藥物組合物，具體地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白，特別是胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-4(IGFBP-4)具有優(yōu)異的治療缺血性疾病的作用，IGFBP-4蛋白能夠促進(jìn)血管增殖、促進(jìn)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞，對(duì)于缺血性疾病，尤其是心肌缺血和下肢缺血具有良好的治療和預(yù)防作用，無(wú)毒副作用。
文檔編號(hào)A61P9/10GK103239714SQ201210029340
公開(kāi)日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2012年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月9日
發(fā)明者朱偉東 申請(qǐng)人:同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院