專利名稱：新型顆粒制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供可用于治療、診斷或其它用途含有高濃度化合物的顆粒。
背景技術(shù)：
有潛在效果的化合物的有效使用，需要能夠傳遞含有有效量化合物的組合物，而不產(chǎn)生過多的副作用。有多種可溶解有效量的親水性和親脂性化合物，然后有效地進(jìn)行給藥的載體。但是，目前還沒有可有效用于低親水性/低親脂性化合物，如各種紫杉類化合物、長春花屬生物堿類、頭孢菌素類和甾族化合物的傳遞載體。
所述其中的一種化合物是紫杉醇(paclitaxel)，該化合物是一種低親水性/低親脂性的分子，其在大部分常用的藥物載體中不能充分地溶解而制得治療用的組合物。目前，紫杉醇(Taxol)在cremophor/乙醇載體CremophorEL中使用。但是，該組合物在能夠提供治療有效量紫杉醇的給藥濃度下會產(chǎn)生某些不利的副作用，例如，使一些以該組合物給藥的患者出現(xiàn)急性毒性(例如參見Straubinger等人的美國專利5,415,869)。
例如，Straubinger等人(參見美國專利5,415,869)以紫杉醇對脂質(zhì)體脂類有限的比例在脂質(zhì)體中配制紫杉醇。此外，Straubinger的最大紫杉醇濃度(參見摘要)明顯低于本發(fā)明顆粒中所聚集的藥物水平。此外，Desai等人(美國專利5,439,686),Wheeler(美國專利5,478,860)和Alkan-Onyuksel等人(《藥物研究》(PharmaceuticalRes.)(1994),206～212頁)分別在其載體中以化合物載體成分低比例摻入化合物，其濃度也低于本發(fā)明所提供的載體中可以聚集的化合物濃度。
本發(fā)明提供了用于溶解低親水性/低親脂性化合物，例如紫杉醇的載體，從而使形成的組合物可安全地以高劑量化合物給藥而不產(chǎn)生過多的副作用。以高比例的化合物其它載體成分摻入化合物的本發(fā)明顆粒，既不是脂質(zhì)體，也不是乳液顆粒，以前從未有過記載。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種由用親水性/疏水性共軛物包裹的核所組成的顆粒。該核含有低親水性/低親脂性化合物，例如紫杉類(taxanes)、長春花屬生物堿類、薯司他丁、環(huán)狀多肽類，例如頭孢菌素類、甾族化合物、利福霉素類、絲裂霉素類、博萊霉素類、苯并萘并吡喃酮、雙嵌入抗生素、核苷抗生素、吡咯并[1,4]苯并二氮雜單類、大環(huán)內(nèi)酯類，包括大環(huán)內(nèi)酯的抗生素，如哈霉素、雙吲哚類生物堿、喜樹堿類、依托泊苷類、替尼泊苷類、DNA嵌入劑、抗雌激素類、雙(苯并咪唑)類和核苷類，如阿糖腺苷。所述化合物帶有生物相容性疏水結(jié)構(gòu)域，例如酰基鏈、疏水性肽或疏水性聚合物鏈，它們可以是天然存在于其中的，也可以是通過合成方法連接的?；蛘?，該核可以含有與疏水性結(jié)構(gòu)域共軛后的親水性化合物，從而使核的組成總體來說是低親水性的。
包裹核心的共軛物含有與生物相容性親水結(jié)構(gòu)域連接的生物相容性疏水性結(jié)構(gòu)域。共軛物可以是具有疏水性和親水性結(jié)構(gòu)域的天然或合成的分子，或者可以是疏水性和親水性結(jié)構(gòu)域的共軛物。適宜的共軛物疏水性結(jié)構(gòu)域包括，例如兩親脂類的?；渽^(qū)域，以及疏水性聚合物，例如硅聚合物和疏水性肽。適宜的親水性結(jié)構(gòu)域包括，例如聚乙二醇、纖維素、親水性肽、多糖、聚氧化乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮和聚甲基丙烯酸酯。適宜的親水性結(jié)構(gòu)域還包括兩親脂類的極性端基；它們通常是帶正電荷或帶負(fù)電荷的，包括磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油和磷脂酸，以及其它脂類，例如磷脂酰乙醇胺，其上連接有有機(jī)二元羧酸，例如戊二酸。
優(yōu)選的核化合物是其上連接了10-24個碳的直鏈飽和?；湹淖仙碱惢衔?，共軛物疏水性結(jié)構(gòu)域是磷脂酰乙醇胺，共軛物親水性結(jié)構(gòu)域是親水性聚合物，如分子量為50～5000的聚乙二醇。首選的核化合物是與12、14或16個碳的直鏈飽和α碳溴化酰基鏈連接的紫杉醇，共軛物親水性結(jié)構(gòu)域是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(“DSPE”)，而共軛物親水性結(jié)構(gòu)域為分子量2000的聚乙二醇(“PEG2000”)。
本發(fā)明還提供含有懸浮在可藥用載體中的所述顆粒的組合物。這些組合物可用于高效率地向動物傳遞化合物，即以高比例化合物顆粒中其它成分的方式傳遞化合物。所述傳遞法的毒性也低于目前可以獲得的同種化合物的制劑。所述高效/低毒的制劑可用于向動物，例如人給藥，用于治療、診斷或其它目的，例如，用于治療各種癌癥。
從如下的詳細(xì)描述可以清楚地看出本發(fā)明的其它特點(diǎn)、目的和優(yōu)點(diǎn)及其優(yōu)選的實施方案。
附圖簡述

圖1．含有DOPC、DOPE-PEG2000和BrC16-紫杉醇(摩爾比30∶50∶20)的制劑的蔗糖-梯度餾份。X-軸餾份號；Y-軸其中A為樣品中存在的總紫杉醇％；B為磷脂濃度(mM)。
圖2．在不同等滲溶液中稀釋的含有DOPC∶DOPE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇(10∶10∶80)制劑的濁度。X-軸時間(秒)；Y軸吸收值(800納米)?？招娜切蜨2O；細(xì)線75mM NaCl；實心方框150mM NaCl；粗線300mM NaCl。
圖3．制劑在室溫下存放的穩(wěn)定性。X-軸時間(天)；Y-軸評分標(biāo)準(zhǔn)0為+++結(jié)晶；1為++結(jié)晶；2為+結(jié)晶；3為無結(jié)晶，但規(guī)則形狀的顆粒；4為無結(jié)晶。A為DOPC∶DOPE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇(10∶10∶80)；B為DSPE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇，20∶80(實心菱形)或10∶90(方框)；C為DOPC-PEG2000-BrC16-紫杉醇，20∶80(實心菱形)，15∶85(方框)或10∶90(星形)；D:PE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇和PE-PEG5000∶BrC16-紫杉醇均為15∶85:DPPE-PEG2000-實心菱形；DOPE-PEG5000-方框；DPPE-PEG5000-x；DMPE-PEG5000-三角形圖4．制劑(15∶85)在4℃下于黑暗中存放的穩(wěn)定性。X-軸制劑陳化時間(天)；Y-軸主觀評分(參見上圖3中的圖標(biāo))。A為DOPE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇；B為DOPE-PEG5000∶BrC16-紫杉醇；C為DSPE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇；D為DMPE-PEG5000∶BrC16紫杉醇；制劑的制備時間X-5天(▲)；X天(◆)；X+15天(□)；X+22天(◇)；E為含BrC16-紫杉醇的制劑(15∶85):DPPE-PEG2000(◆)；DMPE-PEG2000(□)；DSPE-PEG5000(△)；DPPE-PEG5000(x)。
圖5．制劑在大鼠血漿中保溫的穩(wěn)定性。X-軸時間(小時)。Y軸保留的溴化紫杉醇的百分比。PE-PEG制劑(摩爾比均為15∶85)-■:DSPE-PEG2000；▲:DPPE-PEG2000；:DMPE-PEG2000；◆:DOPEPEG2000；◇:DOPE-PEG5000；□:DSPE-PEG5000；△:DPPE-PEG5000；:DMPE-PEG5000。
圖6．各種含紫杉醇制劑的光學(xué)顯微照片，A為DSPE-PEG2000∶紫杉醇(摩爾比80∶20)；B為DSPE-PEG2000∶紫杉醇(80∶20)；C為DOPE-PEG2000∶BrC8-紫杉醇(20∶80)；D為DOPE-PEG2000∶BrC6-紫杉醇(20∶80)；E為DOPE-PEG2000∶BrC14-紫杉醇(20∶80)；F為DOPE-PEG2000∶BrC12-紫杉醇(20∶80)；G為DSPE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇(10∶90)；H為DOPE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇(20∶80)。
圖7．DOPC∶DOPE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇(摩爾比30∶50∶20)制劑的冷凍破碎電子顯微照片(A和B)。
圖8．DSPE-PEG2000∶C16-長春堿(摩爾比40∶60)制劑的顯微照片。A,B為光學(xué)顯微鏡；C,D為電子顯微鏡。
圖9．由DSPE-PEG2000和BrC16-紫杉醇(摩爾比15∶85)組成的顆粒的低溫電子顯微照片(A-D)。
圖10．含有DSPE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇(15∶85)的顆粒與Taxol(紫杉酚)相比對SCID小鼠產(chǎn)生的Ovcar3腫瘤的影響。治療在接種后的第20、22、24、26和28天腹膜內(nèi)給藥，其中對照(*)；Taxol,12.5mg紫杉醇/kg(■)；Taxol,25mg紫杉醇/kg(□)；BrC16-紫杉醇，12.5mg/kg(▲)；25mg BrC16-紫杉醇/kg(ω)；BrC16-紫杉醇，50mg/kg(◇)；BrC16-紫杉醇，100mg/kg(◆)。X-軸接種后的天數(shù)；Y-軸存活百分比。
圖11．含DSPE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇(15∶85)的顆粒對SCID小鼠中產(chǎn)生的A549人非小細(xì)胞肺癌肺腫瘤的影響。治療在接種后的第1、3、5、7和9天靜脈內(nèi)給藥，其中對照(■)；BrC16-紫杉醇，12.5mg/kg(▲)；25mg BrC16-紫杉醇/kg(△)；BrC16-紫杉醇，50mg/kg(◇)；BrC16-紫杉醇，100mg/kg(◆)。X-軸接種后的天數(shù)；Y-軸腫瘤體積(mm3)。
圖12．DSPE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇(15∶85)與Taxol相比對CDF1小鼠中的L1210鼠白血病的影響。治療在接種L1210細(xì)胞后的第1-5天口服給藥，其中對照(*)；Taxol,12.5mg/kg(■)；Taxol,25mg/kg(□)；12.5mg BrC16-紫杉醇/kg(▲)；BrC16-紫杉醇，25mg/kg(△)；BrC16-紫杉醇，50mg/kg(○)；BrC16-紫杉醇，100mg/kg(◆)。X-軸接種后(L1210細(xì)胞)的天數(shù)；Y-軸存活百分比。
圖13．含BrC16-紫杉醇/CremophorEL的顆粒的光學(xué)顯微照片。
圖14．使用Nomarski光學(xué)的含哈霉素的顆粒的光學(xué)顯微照片，(A)1cm=27μm；(B)1cm=13.6μm。
圖15．使用相襯顯微鏡的含哈霉素的顆粒的光學(xué)顯微照片。1cm=27μm。
發(fā)明詳述在整個申請中使用如下首字母組合詞和縮寫以及相應(yīng)的詞、短語或分子式Br溴；BrC6:-C(O)CHBr(CH2)3CH3；BrC8:-C(O)CHBr(CH2)5CH3；BrC12:-C(O)CHBr(CH2)9CH3；BrC14:-C(O)CHBr(CH2)11CH3；BrC16:-C(O)CHBr(CH2)13CH3；HTD疏水性紫杉(例如紫杉醇)衍生物；BrC16HTD與16碳直鏈飽和α碳溴化的?；湽矁r連接的紫杉醇；DOPC二油酰磷脂酰膽堿；DMPE二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺；DOPE二油酰磷脂酰乙醇胺；DPPE二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺；DSPE二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；PEG聚乙二醇；PEG2000分子量約2000的PEG；PEG5000分子量約5000的PEG。此外，本發(fā)明顆粒中的化合物濃度用顆粒中各成分的摩爾百分比表示(例如，BrC16-紫杉醇/DSPE-PEG2000(85∶15)是含有與16碳的α碳溴化的酰基鏈共價連接的紫杉醇和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-2000分子量聚乙二醇的顆粒，其比例為85摩爾％紫杉醇/酰基鏈比15摩爾％DSPE-PEG2000)。
本發(fā)明提供用生物相容性疏水性結(jié)構(gòu)域/生物相容性親水性結(jié)構(gòu)域共軛物包裹的低親水性核組成的顆粒。本發(fā)明的疏水性核化合物是低親水性的，當(dāng)置于含水環(huán)境中時會自身締合。核疏水性化合物可以是天然的疏水性化合物或合成的疏水性化合物。此外，核疏水性化合物還可以是任何化合物的疏水性或低親脂性的衍生物。例如，可將親水性化合物用疏水性結(jié)構(gòu)域衍生以形成低親水性的化合物。在一個實施方案中，疏水性化合物可以包括用疏水性結(jié)構(gòu)域衍生的親水性化合物阿糖胞苷(Ara C)以形成疏水性的核化合物。在顆粒核中所含的所需化合物的濃度明顯高于以前的載體顆粒中所含的同種化合物的濃度。所述核化合物包括(但不僅限于)，例如紫杉類，例如紫杉醇；長春花屬生物堿類，例如長春堿；薯司他??；環(huán)狀多肽類，例如頭孢菌素類；其它疏水性多肽、甾體化合物，例如潑尼松和可的松；利福霉素類，例如利福布丁和利福米特；絲裂霉素類；博萊霉素類；苯并萘并吡喃酮；雙嵌入抗生素，例如醌霉素；核苷抗生素，例如ara-a；吡咯并[1,4]苯并二氮雜類，例如安曲霉素和偏端霉素；大環(huán)內(nèi)酯類，例如美坦素和哈霉素；雙吲哚類生物堿，例如長春堿和navelbine；喜樹堿和喜樹堿類似物；依托泊苷類和替尼泊苷類；DNA嵌入劑，例如安吖啶；抗雌激素類，例如他莫昔芬；雙(苯并咪唑)類，例如Hoechst33258和疏水性肽類，特別是與?；溸B接的疏水性肽類(例如，表面活性劑肽)。
所述化合物具有生物相容性疏水性結(jié)構(gòu)域；所述結(jié)構(gòu)域以治療水平安全地為動物給藥，并使化合物的疏水性增加至足以使其以高濃度(即約20摩爾％或更高)聚集在顆粒內(nèi)。該結(jié)構(gòu)域可以是化合物中天然存在的，例如薯司他丁，也可以是其合成共軛的，例如紫杉醇等紫杉類。優(yōu)選核化合物帶有共軛的生物相容性疏水性結(jié)構(gòu)域?！肮曹椀摹笔侵附Y(jié)構(gòu)域與化合物上的活潑部分通過合成化學(xué)反應(yīng)共價連接。
優(yōu)選核化合物是紫杉類，例如紫杉醇、taxotere、cephalomannine、19-羥基漿果赤霉素Ⅲ、漿果赤霉素Ⅲ、10-脫乙酰基cephalomannine、10-脫乙?；仙即?7α-OH)、表-10-脫乙?；仙即?7β-OH)、7-表-10-脫乙?；鵦ephalomannine(7β-OH)和10-脫乙酰基漿果赤霉素Ⅲ。首選核化合物是紫杉醇。
生物相容性疏水性結(jié)構(gòu)域與所述化合物的連接，通過酰基鏈、疏水性肽和硅聚合物等部分與其它化合物連接的已知方法來完成。例如，當(dāng)疏水性結(jié)構(gòu)域是?；湑r，優(yōu)選的連接方法是在?；湹孽；妥仙即肌⑾矘鋲A或長春堿等化合物上的羥基之間建立鍵。
例如，如紫杉醇等紫杉類含有羥基(例如2’和7OH)，可以在該羥基上連接疏水性結(jié)構(gòu)域。一般認(rèn)為這些基團(tuán)活潑程度的相對順序(從最活潑的至最不活潑的)為2’＞7，因此，可以用化學(xué)計量的?；湹幕顫娦问?，例如酰氯或酸酐在紫杉醇的2’連接酰基鏈。或者，可以同時在2’和7OH上連接?；?，然后選擇性地除去2’酰基鏈，從而僅保持與紫杉7位的連接。選擇性除去2’?；溈梢杂没瘜W(xué)計量的弱堿，例如碳酸氫鈉來完成。此外，可以通過先將2’OH用三苯甲基、甲氧基三苯甲基、三氟乙?；蚑rOC(三氯甲氧基氯甲酸酯)等基團(tuán)用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的方法“保護(hù)”，然后將保護(hù)的紫杉與?；湹幕顫娦问?，例如酸酐或酰氯在無水有機(jī)溶劑中與堿，例如DMAP和吡啶反應(yīng)，而對7OH進(jìn)行修飾，隨后通過熟知的方法從2’位除去保護(hù)基。所述反應(yīng)通常在堿，例如吡啶、二甲基氨基吡啶(“DMAP”)、三乙胺等存在下，在常用的極性非質(zhì)子溶劑如二氯甲烷、甲酰胺、氯仿、THF(四氫呋喃)、二甲基甲酰胺和二甲亞砜(DMSO)中進(jìn)行。
適于和所述化合物連接的疏水性結(jié)構(gòu)域包括(但不僅限于)，例如?；湣⑹杷噪?、硅鏈和其它疏水性聚合物。優(yōu)選疏水性結(jié)構(gòu)域是?；?，其可以是直鏈或支鏈的、飽和或不飽和的以及α碳溴化或未溴化的。更優(yōu)選共軛的疏水性結(jié)構(gòu)域是下式的?；?C(O)CHX1(CH2)n1(CH=CH)n2(CH2)n3(CH=CH)n4(CH2)n5(CH=CH)n6(CH2)n7(CH=CH)n8(CH2)n9CH3，其中n1等于0或是1至21的整數(shù)，n3等于0或是1至18的整數(shù)；n5等于0或是1至15的整數(shù)；n7等于0或是1至12的整數(shù)；n9等于0或是1至9的整數(shù)；而n2、n4、n6和n8彼此獨(dú)立地等于0或1。n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9的總和是等于3至21的整數(shù)。更優(yōu)選?；?zhǔn)侵辨滐柡偷?、長度為12、14或16個碳的?；湥?C(O)CHX1(CH)9CH3、-C(O)CHX1(CH)11CH3或-C(O)CHX1(CH)13CH3。
所述?；湹腦1是H，或者更優(yōu)選是“促進(jìn)水解的基團(tuán)”(“HPG”)，即可以在體內(nèi)促進(jìn)其母體鏈從其所連接的化合物上水解的原子或原子團(tuán)。HPG相對于氫是電負(fù)性的，也就是說，當(dāng)其在相同的分子中占據(jù)與氫相同的位置時，可以比氫更強(qiáng)烈地將電子拉向自己。因此，在?；湹摩撂加肏PG取代氫原子時，會導(dǎo)致鏈上電子密度的重新分布，從而引起鏈中的誘導(dǎo)效應(yīng)。此外，用含有芳香族基團(tuán)的HPG取代?；湨撂忌系臍洌梢砸痣娮用芏戎匦路植嫉墓舱裥?yīng)。這種由HPG引起的誘導(dǎo)效應(yīng)和共振效應(yīng)可以穩(wěn)定酸的共軛堿形式而不是酸的形式。因此，當(dāng)用HPG代替?；溕螲時，該酸將會是更強(qiáng)的酸。因此，用HPG修飾的酰基鏈通常比其原來的形式、即在α位存在CH2基團(tuán)而不是HPG取代基的形式具有更低的pKa值。因此，HPG取代的?；湵绕湓瓉淼男问礁菀自隗w內(nèi)從母體化合物上水解。
促進(jìn)水解的基團(tuán)X1是具有如下特性的任何原子或基團(tuán)(1)電負(fù)性大于氫；和(2)可以連接在酰基鏈的α位上。所述基團(tuán)包括(但不僅限于)，例如F、Cl、Br、I、NH3+、-OC6H4X2或-C(O)X2，其中X2是例如F、Cl、Br、I、NH3+、NO2或CN。優(yōu)選X1是F、Cl、Br或I，首先是Br。因此，首選的與化合物連接的?；?zhǔn)?C(O)CHBr(CH2)9CH3、-C(O)CHBr(CH2)11CH3或-C(O)CHBr(CH2)13CH3。HPG-取代的?；溈梢再徺I到，或者可以通過本領(lǐng)域公知的在?；湹摩撂忌线M(jìn)行取代的方法來制備。
核周圍的共軛物由連接的親水性和疏水性結(jié)構(gòu)域組成。所述共軛物可以是天然或合成的帶有疏水性和親水性結(jié)構(gòu)域的脂類?；蛘?，共軛物可以是帶有與疏水性結(jié)構(gòu)域通過化學(xué)方法連接的親水性結(jié)構(gòu)域的化合物。適宜的共軛物中親水性結(jié)構(gòu)域是1)生物相容性的，即可以向動物給藥而沒有過多的副反應(yīng)；2)總的說來，親水性要大于疏水性；和3)能夠與疏水性結(jié)構(gòu)域相連接。其包括(但不僅限于)例如纖維素；聚乙二醇；聚氨基酸，例如聚甘氨酸；多糖；聚(氧化乙烯)；聚(丙烯酸)；聚(丙烯酰胺)；聚(乙烯吡咯烷酮)；和聚(甲基丙烯酸酯)。當(dāng)親水性結(jié)構(gòu)域是親水性聚合物時，聚合物優(yōu)選是聚乙二醇(“PEG”)或聚氧乙烯，更優(yōu)選分子量為約50至約5000的PEG或首選分子量約為2000的PEG(“PEG2000”)。親水性結(jié)構(gòu)域還可以是兩親脂類的極性端基區(qū)域。所述端基可以帶有正電荷或負(fù)電荷；電荷可以是端基上天然存在的，也可以是通過在端基的活潑基團(tuán)上連接帶電荷的分子加入的。帶電荷的分子包括(但不僅限于)例如磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸和連接有有機(jī)二元羧酸如戊二酸、草酸和琥珀酸的磷脂酰乙醇胺。
適宜的共軛物疏水性結(jié)構(gòu)域是1)生物相容性的；2，帶有能夠與親水性結(jié)構(gòu)域相連接的部分；和3)總的說來，疏水性要大于親水性。所述結(jié)構(gòu)域包括(但不僅限于)兩親脂類的?；渽^(qū)域、各種疏水性聚合物，例如硅聚合物和疏水性肽。
兩親脂類的端基是親水性的，因此，脂類本身便是疏水性/親水性的共軛物。這些脂類共軛物通常在端基上帶有正電荷或負(fù)電荷，其包括磷脂酰絲氨酸(PS’s)、磷脂酰甘油(PGs)和磷脂酸(PAs)?；蛘撸嘶鶐в锌蛇B接親水性結(jié)構(gòu)域的活潑部分。所述脂類優(yōu)選磷脂酰乙醇胺類(“PEs”)，例如二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(“DPPE”)、棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺(“POPE”)、二油酰磷脂酰乙醇胺(“DOPE”)或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(“DSPE”)；更優(yōu)選的磷脂酰乙醇胺是DSPE。
因此，含有兩親性脂類的共軛物包括PEs和PEG的共軛物；其中優(yōu)選DSPE和分子量為50-5000的PEG的共軛物，首選DSPE-PEG2000。含有兩親性脂類的共軛物還包括各種帶電荷的脂類，例如磷脂酰乙醇胺-二羧酸DOPE-GA和POPE-GA(“GA”=戊二酸)。
生物相容性親水性/疏水性共軛物還可以是親水性/疏水性共聚物，例如分子式為HO(CH2CH2O)a(CH(CH3)CH2O)b(CH2CH2O)cH的共聚物。更優(yōu)選在所述聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物中，a和b彼此獨(dú)立地等于約10至約100的整數(shù)，c等于0或是約1至約100的整數(shù)。首選a和c分別等于75,b等于30。
含疏水性結(jié)構(gòu)域的核化合物占所述顆粒的約20摩爾％至約99摩爾％，并且可以含有此范圍內(nèi)的任何含量，例如至少約25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95摩爾％至約99摩爾％。疏水性結(jié)構(gòu)域-親水性結(jié)構(gòu)域共軛物占所述顆粒的約1摩爾％至約80摩爾％，并且可以含有此范圍內(nèi)的任何含量，例如約80摩爾％至約75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5或1摩爾％。首選核化合物占所述顆粒的約80-99摩爾％，共軛物占所述顆粒的約1-20摩爾％。
由于它們的疏水性結(jié)構(gòu)域，核化合物可以和周圍的共軛物一起以高濃度聚集在本發(fā)明所提供的顆粒內(nèi)。所述高濃度的聚集，無需在核中存在油或水等其它成分，因此，本發(fā)明顆粒的核基本上不含水或添加的油。如果沒有疏水性結(jié)構(gòu)域，當(dāng)不存在油或水時，化合物就不能在載體，例如脂質(zhì)體或乳液內(nèi)聚集，或者不能以本發(fā)明顆粒的核中所含的化合物的濃度聚集。
因此，本發(fā)明的顆粒既不是脂質(zhì)體(其在脂質(zhì)雙層內(nèi)包裹有大量的水)，也不是乳液(其為水包油或油包水的組成，即一種液體在另一種液體內(nèi)的小球)。事實上，本發(fā)明的顆粒與這些結(jié)構(gòu)完全不同，這種差異很容易由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過已知的方法證實。所述方法包括例如按照下文實施例3中所給出的沉降研究來評定載體顆粒內(nèi)核化合物的濃度；例如通過NMR譜、顆粒內(nèi)包埋的可溶性標(biāo)記物的百分比、測定含氚水的分布、通過測定外部加入的溶質(zhì)測定體積分布以及根據(jù)脂質(zhì)體在低滲環(huán)境中的膨脹測定濁度等來證實是否存在水或添加的油；以及通過冷凍碎裂和低溫電子顯微鏡及NMR譜檢測脂類分子結(jié)構(gòu)來證實是否存在脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明所提供的顆粒近似于球形，其直徑(或粒度)至少為約15nm，優(yōu)選不大于約10,000nm，太大的顆粒不能用于靜脈內(nèi)注射。顆?？梢詾榇朔秶鷥?nèi)任何大小，但首選約15-200nm。粒度受多種因素的影響，這些因素是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定的，包括顆粒中衍生物與共軛物的相對比例，并且可以根據(jù)如下等式確定(1)低親水性化合物摩爾數(shù)/顆粒的摩爾數(shù)(X)=[密度×(4/3π)(d/2-t)3]/低親水性化合物的分子量；(2)共軛物摩爾數(shù)/顆粒的摩爾數(shù)(Y)=(πd2)/(a)×6.0225×1023；和(3)低親水性化合物的摩爾％=[X/(X+Y)]·100，其中“d”是顆粒的直徑，“t”是共軛物層的厚度，“a”是共軛物成分每個分子的表面積，“密度”的單位是g/cm3。粒度可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的各種方法來測定(包括以下實施例5中所列的方法)。
本發(fā)明的顆粒通常通過乙醇注射或反相蒸發(fā)(REV)來制備，還可以通過透析法來制備。簡單地說，在乙醇注射法(參見以下的實施例1)中，將適宜量的顆粒成分溶解在適宜量的有機(jī)溶劑，例如乙醇中。然后將形成的乙醇溶液緩慢注射到適宜量的適宜含水溶液(例如緩沖液HEPES/NaCl pH7.5)中而在緩沖液中形成顆粒，離心然后收集顆粒。根據(jù)反相蒸發(fā)法(參見以下的實施例1)，將適宜量的顆粒成分混合，然后溶解在適宜量的含水緩沖液/可混溶有機(jī)溶劑的混合物中，然后在惰性氣體氣流下真空蒸除有機(jī)溶劑。
本發(fā)明的顆?？膳c可藥用載體混合，因此，本發(fā)明還提供含有顆粒和載體的藥物組合物形式?！翱伤幱幂d體”是指可用于和治療或診斷試劑一起對哺乳動物給藥的常用介質(zhì)。所述介質(zhì)根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以確定的多種因素進(jìn)行選擇，所述因素包括但(不僅限于)所給藥的具體試劑及其濃度、穩(wěn)定性和期望的生物利用度；用組合物進(jìn)行治療或診斷的的疾病或病癥；使用者的年齡、體重和一般狀況；組合物的給藥途徑，例如經(jīng)鼻、口服、眼用、局部、經(jīng)皮、陰道、直腸、鞘內(nèi)、皮下、乳房內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、腫瘤內(nèi)、腔內(nèi)或肌肉內(nèi)?？伤幱幂d體還包括其它成分，例如可以增強(qiáng)活性成分穩(wěn)定性的物質(zhì)，包括例如防腐劑和抗氧化劑。
藥物組合物可以通過本領(lǐng)域公認(rèn)的各種常規(guī)方法對動物，如人等哺乳動物進(jìn)行給藥。給藥途徑例如口服、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥等，可根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以確定的多種因素進(jìn)行選擇。這些因素包括(但不限于)所治療個體的年齡、體重和一般健康狀況；所期望的藥物生物利用度；所治療疾病的具體形式；所用的載體以及施用的治療劑的劑量?？诜挽o脈內(nèi)給藥是本發(fā)明所提供的藥物組合物的優(yōu)選給藥方法。本發(fā)明還優(yōu)選以含有固體、半固體或液體形式顆粒的藥物組合物進(jìn)行腹膜內(nèi)給藥。
本發(fā)明提供用于口服給藥的固體形式(例如片劑或膠囊)及液體形式(例如糖漿和混懸劑)的含顆粒藥物組合物。含顆粒的片劑可以是藥物領(lǐng)域常用的任何常規(guī)類型的片劑，例如圓形、橢圓形或長橢圓形的、包衣或未包衣的大小或重量不同的片劑，并且除了本發(fā)明的顆粒外，還可以含有本領(lǐng)域常用的各種成分。膠囊是顆粒包含在明膠殼之內(nèi)的固體劑量形式；所述膠囊可以以各種顆粒劑量水平進(jìn)行制備。本發(fā)明同時提供硬和軟膠囊。將顆粒配制到所述片劑、膠囊或其它固體劑量形式中是制藥領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。
與本發(fā)明的顆粒一起配制成藥物組合物的靜脈內(nèi)用液體是糖、氨基酸和電解質(zhì)等化學(xué)物質(zhì)的無菌水溶液，這些化學(xué)物質(zhì)很容易在哺乳動物體內(nèi)運(yùn)送然后吸收；除用作載體來進(jìn)行活性成分給藥外，這些液體還經(jīng)常用于營養(yǎng)和電解質(zhì)補(bǔ)充。適于和本發(fā)明的顆粒一起配制的常用靜脈內(nèi)液體包括(但不限于)，生理鹽水和5(重量)％葡萄糖水溶液。
本發(fā)明還提供對動物施用化合物的方法，該方法包括，向動物施用本發(fā)明所提供的含有顆粒的藥物組合物。所述方法是高效率的，即以化合物對顆粒中其它成分的高比例傳遞該化合物，并且該方法是低毒性的。具體地講，該方法可用于對動物傳遞治療有效量化合物，以治療可以用所述化合物進(jìn)行治療的疾病或病癥，這種治療沒有過多副作用。其中，化合物的“治療有效量”是可以有效改善、減輕或預(yù)防疾病或病癥的化合物的任何量，通常為至少約0.01mg化合物/kg施用化合物的動物體重。更優(yōu)選化合物的治療有效量為約0.01mg化合物/kg至約1000mg/kg?？捎帽景l(fā)明的組合物治療的病癥包括(但不限于)例如各種癌癥，例如腦癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、白血病、淋巴瘤、黑瘤、癌和肉瘤；寄生蟲病、各種炎性和自身免疫疾病，例如關(guān)節(jié)炎和青少年糖尿??；以及各種微生物感染。術(shù)語“微生物感染”包括由病毒、細(xì)菌、立克次氏體、真菌、prions等引起的病癥。此外，本發(fā)明所提供的組合物還可用于對動物施用非治療性試劑，例如診斷劑或營養(yǎng)物質(zhì)。
通過以下實施例可以更好地理解本發(fā)明。但是，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很容易理解，這些實施例僅僅是用來說明所附權(quán)利要求中所定義的本發(fā)明內(nèi)容的。
實施例實施例1顆粒的制備通過乙醇注射法制備BrC16-紫杉醇/DSPE-PEG2000為了通過乙醇注射法進(jìn)行制備，稱重20mg BrC16-紫杉醇和8.3mg DSPE-PEG2000，將其混合然后注射到0.1ml乙醇中進(jìn)行溶解。然后將形成的乙醇溶液緩慢加入到含有2ml10mM HEPES,150mM NaCl緩沖液，pH7.5(HEPES緩沖液)的玻璃小瓶中，形成顆粒在緩沖液中的懸浮液。通過反相蒸發(fā)法制備BrC16-紫杉醇/DSPE-PEG2000為了通過反相蒸發(fā)法進(jìn)行制備，將20mg BrC16-紫杉醇和118mgDSPE-PEG2000混合，然后溶于6ml乙醇和2ml HEPES緩沖液中，然后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇形成顆粒。通過反相蒸發(fā)(REV)法制備哈霉素/DSPE-PEG2000為了通過改進(jìn)的REV方法進(jìn)行制備，將20mg大環(huán)內(nèi)酯類抗生素哈霉素和80mg DSPE-PEG2000一起溶于40ml氯仿和甲醇(1/1,v/v)。向混合物中加入10ml生理鹽水(約0.9％)然后將懸浮液在水浴超聲儀中，在室溫下短時間的超聲(約10秒)以得到相對均勻的分散體。然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在約45℃下蒸除溶劑。剩余的鹽水溶液含有重量比為20∶80的哈霉素/DSPE-PEG2000顆粒的制劑。通過透析法制備哈霉素/DSPE-PEG2000哈霉素顆粒還可以通過透析的方法制備。將80mg哈霉素和20mgDSPE-PEG2000一起溶于4ml DMSO。將1ml含有大環(huán)內(nèi)酯哈霉素和脂類的溶液滴到9ml生理鹽水(約0.9％)中，并同時在室溫下渦漩振蕩。將3ml含有哈霉素和脂類的鹽水/DMSO溶液加到Slide-A-Lyzer(10k分子量截留值)中，并在室溫下于2升鹽水中透析過夜。透析結(jié)束時，基本上所有的DMSO均被除去。對顆粒的分析證實它們含有比例為80∶20的哈霉素和DSPE-PEG2000。實施例2蔗糖梯度離心將200μl按照反相蒸發(fā)法(參見以上的實施例1)制備的含有6.9mg聚乙二醇化的脂類-疏水性藥物衍生物組合物(例如30∶50∶20摩爾比的DOPC、DOPE-PEG2000和BrC16-紫杉醇的組合)加入到12ml用Biocomp Gradient Master Model 106(Biocomp.Instruments,Inc.,(操作參數(shù)時間2分鐘，角度81.5°，速度19))制備的0-50％蔗糖梯度液的頂部。將梯度液以208,000g在Beckman L5-50超速離心機(jī)中離心過夜，然后從各頂部分出1ml。
通過改進(jìn)的Chen等的方法(該文獻(xiàn)的內(nèi)容引入本文作為參考)確定各餾份中的磷脂濃度。通過將樣品溶于乙醇，用UV2101PC UV掃描分光光度計(Shimadzu Scientific Instruments,Inc.)讀出吸收值，然后將吸收值與標(biāo)準(zhǔn)物比較可確定化合物的濃度。結(jié)果示于圖1A和1B，并通過光學(xué)顯微鏡檢測梯度餾份證實結(jié)果(參見下文實施例6所述)?？捎蔑@微鏡檢測到的顆粒存在于較高密度的餾份中(#12)。在餾份12中，BrC16-紫杉醇與磷脂的摩爾比為94∶6。實施例3沉降研究將按實施例1所述的乙醇注射法制備的1ml顆粒樣品(10mg/mlBTC16-紫杉醇)在Beckman L5-60超離心機(jī)上以30,000g離心30分鐘；除去上清液后，將沉淀重懸在水中達(dá)到與樣品大約相同的體積。通過改進(jìn)的Chen等的方法(該文獻(xiàn)的內(nèi)容引入本文作為參考)確定各餾份中的磷酸鹽濃度。通過將樣品溶于乙醇，用UV2101PC UV掃描分光光度計(Shimadzu Scientific Instruments,Inc.)讀出吸收值，然后將吸收值與標(biāo)準(zhǔn)物比較可確定化合物的濃度。這些試驗的結(jié)果列于表1。通常，沉淀中的BrC16-紫杉醇的摩爾百分比為約98。
表1沉降研究
*1上清液；2全部；3沉淀。實施例4濁度測定由于含有被包裹的含水溶液，因此當(dāng)放在滲透壓與該溶液不同的介質(zhì)中時，脂質(zhì)體會縮小或膨脹。這種由于滲透壓的差異而引起的脂質(zhì)體大小的改變會導(dǎo)致脂質(zhì)體懸浮液濁度的改變?；静缓w積的顆粒，例如本發(fā)明的顆粒，則不存在滲透壓的差異，因此顆粒的懸浮液不會出現(xiàn)濁度的明顯改變。
因此，在具有不同滲透壓的介質(zhì)中測量顆粒懸浮液的濁度，可以表明顆粒是否包裹有含水體積。因此，將0.1ml通過乙醇注射法(參見上文實施例1的描述)制備的含有3.45mg DOPC∶DOPE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇(1∶1∶8摩爾比)顆粒的樣品在各3ml的如下溶液中稀釋(最終的紫杉醇濃度0.66mg/ml):H2O、75、150和300mM NaCl。用UV-2101PC UV掃描分光光度計(Shimadzu Scientific Instruments,Inc)檢測樣品濁度隨時間的改變(λ=800nm)。結(jié)果示于圖2中。未觀察到吸收值的變化，表明該顆粒與脂質(zhì)體不同，不受滲透壓的影響。實施例5粒度分析用DSPE-PEG2000和BrC16-紫杉醇(15∶85摩爾比)通過乙醇注射法(參見上文實施例1的描述)制備顆粒；將顆粒樣品(約1-3μl)通過370型亞微米粒度測量儀(Submicron Particle Sizer)(來自NICOMPParticle Sizing Systems,Inc)進(jìn)行粒度測量；在整個過程中使用“固體顆?！蹦Ｊ?。下表2中列出了通過數(shù)量、強(qiáng)度或體積加權(quán)測得的各種組合物的顆粒懸浮液中的平均顆粒直徑(nm)。
表2Nicomp粒度分析(nm)
實施例6存放將按照乙醇注射法(參見上文實施例1的描述)制備的含有摩爾比為85∶15的BrC16-紫杉醇和DOPE-PEG2000、DPPE-PEG2000、DMPE-PEG2000、DOPE-PEG5000、DSPE-PEG5000、DPPE-PEG5000或DMPE-PEG5000之一的顆粒懸浮在HEPES緩沖液中然后以未稀釋的形式存放。通過上文實施例1中描述的REV法制備摩爾比為20∶80的BrC16-紫杉醇和DSPE-PEG2000樣品。將樣品在室溫或4℃下存放，然后在光學(xué)顯微鏡(Olympus BH-2,New York/New Jersey Scientific)下觀察。將觀察的樣品就疏水性化合物的顆粒和結(jié)晶的存在進(jìn)行主觀評分，結(jié)果示于圖3和4。
將懸浮在HEPES緩沖液中的顆粒加入到新鮮的雄性大鼠血漿中(Fisher大鼠，品系f344，年齡約60天，重量175-200克，同系繁殖的，最終的衍生物化合物濃度0.2mg/ml)；將血漿樣品于37℃保溫0、2、6、24或72小時。保溫后，立即將樣品通過液氮冷凍并存放在-70℃下，然后在室溫融化并加入到等體積的含有0.04mg/ml(終濃度)C12-紫杉醇作為內(nèi)標(biāo)物的乙腈中。將混合物用Eppendorf Centrifuge5402于1000rpm離心10分鐘，然后通過HPLC分析BrC16-紫杉醇的濃度。結(jié)果如圖5所示。
在4℃下長時間存放后，還將BrC16-紫杉醇/DSPE-PEG2000(85∶15)顆粒樣品進(jìn)行了粒度分析(參見上文的實施例5)，結(jié)果如表3所示。每種樣品分別制備，結(jié)果表示的是開始時的粒度測量值和存放后的粒度測量值。很明顯，在4℃下長時間存放后，粒度仍保持不變。
表3
實施例7光學(xué)顯微鏡檢查將DSPE-PEG2000和紫杉醇(80∶20，摩爾比)通過反相蒸發(fā)法(參見上文實施例1的描述)混合；該紫杉醇未與疏水性結(jié)構(gòu)域連接。在放大200倍(參見圖6，圖6A和6B最終放大了277倍)下拍攝這些顆粒的光學(xué)顯微照片(Olympus BH-2,New York/New JerseyScientific)。觀察到結(jié)晶是主要的結(jié)構(gòu)。
通過乙醇注射法(參見上文實施例1的描述)制備DOPE-PEG2000∶Br-紫杉醇(80∶20)顆粒，其中，與紫杉醇共價連接的酰基鏈具有不同的長度；這些顆粒的光學(xué)顯微照片如圖6C-6H所示(550倍)。
通過改進(jìn)的美國專利5,580,899和5,703,117(引入本文作為參考)中公開的方法將長春堿在20位羥基上與?；湽矁r連接。概括地講，將長春堿(25mg)溶于二氯甲烷和吡啶(5∶1)并與過量的棕櫚酰氯(60μl)一起在4mg DMAP的存在下于41℃加熱回流過夜。用氯仿∶甲醇(95∶5)進(jìn)行的薄層色譜(TLC)表明幾乎所有的(＞95％)原料均已反應(yīng)生成了C16-產(chǎn)物。蒸除溶劑并將產(chǎn)物通過制備型TLC，以氯仿∶甲醇(95∶5)純化。最后，將產(chǎn)物從環(huán)己烷中冷凍干燥得到15mg(54％)白色固體粉末，將其通過1H和13C NMR進(jìn)行鑒定。
通過REV法(參見上文實施例1的描述)用懸浮在1.1ml HEPES緩沖液中的18mg DSPE-PEG2000和11mg C16-長春堿制備DSPE-PEG2000∶C16-長春堿顆粒(40∶60，摩爾比)，所形成顆粒的光學(xué)顯微照片(277倍)如圖8A和8B所示。
通過改進(jìn)的美國專利5,580,899和5,703,117(引入本文作為參考)中公開的方法將喜樹堿在20位羥基上與?；湽矁r連接。概括地講，將喜樹堿(20mg)在室溫下溶于4ml無水吡啶，然后與56mg棕櫚酸酐一起攪拌48小時。用氯仿∶甲醇(96∶4)進(jìn)行的薄層色譜(TLC)表明了反應(yīng)的進(jìn)程。減壓蒸除吡啶并將得到的殘余物通過制備型TLC用氯仿∶甲醇(96∶4)純化。得到30.1mg(90％)乳白色薄片粉末狀產(chǎn)物，將其通過1H和13C NMR進(jìn)行鑒定。
通過REV法(參見上文實施例1的描述)用懸浮在1.5ml HEPES緩沖液中的50mg DSPE-PEG2000和15mg C16-喜樹堿制備DSPE-PEG2000∶C16-喜樹堿(喜樹堿通過其20位的羥基與16碳的飽和酰基鏈偶)顆粒(40∶60，摩爾比)。實施例8冷凍碎裂電子顯微照片通過REV法(參見上文實施例1的描述)用懸浮在1ml HEPES緩沖液中的4.7mg DOPC、27.4mg DOPE-PEG2000和5.85mg BrC16-紫杉醇制備DOPC∶DOPE-PEG2000∶BrC16-紫杉醇(30∶50∶20)顆粒。將1-3μl樣品置于一對Balzers銅雙復(fù)制支架之間，然后從室溫轉(zhuǎn)移至液態(tài)丙烷中冷凍，由此制得放大約91000倍(參見圖7A)和約31000倍(參見圖7B)的冷凍碎裂電子復(fù)制物。將冷凍樣品碎裂(-100℃和10-6-10-7毫巴)，然后在Balzers BAF400冷凍碎裂裝置中用鉑(∠45°)和碳遮蔽。將復(fù)制物在5％次氯酸鹽(市售漂白劑)中清洗過夜，用蒸餾水洗滌，安裝到300目網(wǎng)格上并用Philips300TEM觀察。圖像表明顆粒的內(nèi)部為固體，沒有可見的薄層。
通過REV法(參見上文實施例1的描述)用懸浮在1.1ml HEPES緩沖液中的18mg DSPE-PEG2000和11mg C16-長春堿制備DSPE-PEG2000∶C16-長春堿(40∶60摩爾比)顆粒。將形成的顆粒通過前述方法加工進(jìn)行電子顯微鏡檢查；電子顯微照片(55000倍)如圖8C和8D所示。通過低溫EM獲得影像的再次表明顆粒具有固體的核并且沒有內(nèi)部分層。實施例9低溫電子顯微鏡檢查根據(jù)乙醇注射法(參見上文實施例1的描述)用DSPE-PEG2000和BrC16-紫杉醇(15∶85)制備顆粒，使之含有約10mg/ml BrC16-紫杉醇；將樣品(1ml體積)保持在室溫下并同時制備網(wǎng)格。將未稀釋的樣品通過如下方法冷凍將一滴樣品置于EM網(wǎng)格上，使該液滴滲開呈薄膜狀，然后將染樣品的網(wǎng)格浸入液體乙烷中。在低電子劑量條件下拍攝懸在帶狀碳載體孔內(nèi)的冷凍水合樣品的照相底片。將鏡頭為60K調(diào)焦在1.8μm，為100K調(diào)焦至1.5μm。結(jié)果如圖9所示(圖A和B放大110000倍，圖C和D放大184000倍)。實施例10截留體積測量按照以上實施例1的描述制備顆粒，得到BrC16HTD濃度為10mg/ml,DSPE-PEG2000濃度為4mg/ml的顆粒懸浮液。按照乙醇注射法用DSPC制備脂質(zhì)體懸浮液，以得到14mg/ml的脂類濃度。按照Perkins等的方法(《脂類化學(xué)和物理學(xué)》(Chemistry and Physics ofLipids),64(1993)197-217；其內(nèi)容引入本文作為參考)用自旋標(biāo)記探針tempone測定這些顆粒和脂質(zhì)體(參見表4)的截留體積，所述自旋標(biāo)記的探針引入乙醇溶液制劑中(方法1)或者引入HEPES緩沖液制劑中(方法2)。
為了通過離心濃縮顆粒，在冷卻至室溫后，通過將懸浮液樣品(1.5ml)用Beckman L5-50型超速離心機(jī)以50,000g離心收集顆粒。將沉淀重新懸浮在約0.4ml相同的緩沖液中。將含有Tempone的樣品分成兩個100μl的等分試樣，向其中的一份加入HEPES緩沖液，向另一份中加入100μl 100mM增寬劑(“BA”)草酸鉻溶液。
不合增寬劑的ESR(電子自旋共振；i=-1共振)與總水體積的關(guān)系如等式Atot=Vin+Vout=Vtot-Vlipid(Vin=內(nèi)體積；Vtot=懸浮液體積；Vlipid=水合脂類的體積(從脂類的比體積和稀釋后的內(nèi)部脂類濃度計算))。然后用(1)與增寬劑混合的樣品等分試樣的信號幅度(ABA)和(2)脂類體積的校正因子的乘積來計算內(nèi)體積，即根據(jù)如下等式計算Vin=ABA×[(Vtot-Vlipid)/Atot]。兩次測量(Atot和ABA)均使用稀釋至相同濃度的樣品。用內(nèi)體積(Vin，微升)和脂類濃度(微摩爾/ml)計算截留體積。
表4脂質(zhì)體 顆粒顆粒(小丸)方法1方法2方法1方法2方法1方法2相對信號幅度62 51 62 54 63 59(w/BA)相對信號幅度13 12 00 0 0(w/o BA)截留體積(微 2.7 3.0 00 0 0升/微摩爾脂類)實施例11急性毒性研究將按照上文所述制備的含有DSPE-PEG2000/BrC16-紫杉醇的顆粒和Taxol(Bristol Myers-Squibb)以12.5至400mg/kg顆粒中BrC16-紫杉醇或Taxol中的紫杉醇五種日劑量(在相同的mg/kg劑量下，BrC16-紫杉醇的摩爾劑量比Taxol中的紫杉醇的摩爾劑量低27％；BrC16-紫杉醇的分子量1169；紫杉醇的分子量853)通過腹膜內(nèi)(i.p.)或靜脈內(nèi)(i.v.)對每組5-10只的CDF1雌性小鼠給藥。
將儲備液制劑在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中稀釋至所需的濃度，然后以25ml/kg的量給藥；將PBS用作對照。每天檢查小鼠，確定各組中各小鼠的存活時間。表5和6分別給出了腹膜內(nèi)(i.p.)和靜脈內(nèi)(i.v.)給藥后的急性毒性結(jié)果。這些結(jié)果是對每個制劑在每個劑量水平下進(jìn)行1-4次實驗的混合數(shù)據(jù)。
表5BrC16-紫杉醇與Taxol相比在CDF1小鼠中的急性毒性(i.p.x5)
*注射后存活30天表6BrC16-紫杉醇與Taxol相比在CDF1小鼠中的急性毒性(i.v.x5)
*注射后存活30天實施例12抗癌治療研究將六周大的CB17雌性SCID小鼠用5×106Ovcar3(人卵巢癌)細(xì)胞接種(i.p.)(第0天)；然后在腫瘤接種后的第20、22、24、26和28天給小鼠施用(i.p.)BrC16-紫杉醇(12.5、25、50或100mg/kg)或Taxol(12.5或25mg/kg)(10小鼠/組)。將儲備液藥物制劑在PBS中稀釋，以達(dá)到所需的劑量水平；將稀釋的制劑以25ml/kg的量給藥。PBS也用作對照。每天檢查小鼠，確定各組中各小鼠的存活時間。結(jié)果如圖10所示。實施例13抗癌治療研究將六周大的CB17雌性SCID小鼠用5×106A549(人非小細(xì)胞肺癌)細(xì)胞接種(皮下)(第0天)；然后在腫瘤接種后的第1、3、5、7和9天對小鼠給藥(i.v.)BrC16-紫杉醇(12.5、25、50或100mg/kg)(5小鼠/組)。將儲備液藥物制劑在PBS中稀釋以達(dá)到所需的劑量水平；將稀釋的制劑以10ml/kg的量給藥。PBS還用作對照。從接種后的第9天開始，每周兩次測量腫瘤的體積(mm3)，該體積通過(寬/2)2×長×π計算。當(dāng)其腫瘤體積達(dá)到1500mm3時，處死小鼠。結(jié)果如圖11所示。實施例14將六周大的CB17雌性SCID小鼠用5×104L1210(鼠白血病)細(xì)胞接種(i.v.)(第0天)；然后在接種后的第1-5天對小鼠口服給藥BrC16-紫杉醇(12.5、25、50或100mg/kg)或Taxol(12.5或25mg/kg)(9-10小鼠/組)。將儲備液藥物制劑在PBS中稀釋以達(dá)到所需的劑量水平。每天檢查小鼠，確定各組中各小鼠的存活時間。結(jié)果如圖12所示。實施例15含BrC16-紫杉醇/Pluronic顆粒的粒度分析通過上文所述的方法制備含有BrC16-紫杉醇和Pluronic F68(泊咯沙姆188,HO(CH2CH2O)75(CH(CH3)CH2O)30(CH2CH2O)75H)，比例為90摩爾％/10摩爾％的顆粒。概括地講，將48mg紫杉醇衍生物和40mgPluronic溶于0.2ml乙醇；然后將形成的溶液的0.1ml等分試樣緩慢加入到含有2ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS,10mM磷酸鹽/150mM鹽水，pH7)的試管中。然后將形成的2ml懸浮液合并成4ml體積的單一懸浮液。
將該懸浮液通過5微米的濾器，然后將得到的濾液用Nicomp370型亞微米粒度分析儀進(jìn)行粒度分析。通過Gaussian分析的結(jié)果為(nm,±標(biāo)準(zhǔn)偏差)44±17(數(shù)量加權(quán))；70±27(體積加權(quán))和105±40(強(qiáng)度加權(quán))。這表明用Pluronics作為共軛物可以形成穩(wěn)定的顆粒。實施例16含BrC16-紫杉醇/CremophorEL顆粒的粒度分析按照上文實施例1的描述制備含有BrC16-紫杉醇和CremophorEL(甘油聚乙二醇蓖麻油酸酯)的顆粒。概括地講，將48mg紫杉醇衍生物和44mg甘油聚乙二醇蓖麻油酸酯一起溶于0.2ml乙醇；然后將形成的溶液的0.1ml等分試樣緩慢加入到含有2ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS,10mM磷酸鹽/150mM鹽水，pH7)的試管中。然后將形成的2ml懸浮液合并成4ml體積的單一懸浮液。
將該懸浮液通過Nomarski光學(xué)顯微鏡(700倍)進(jìn)行檢查。結(jié)果如圖13所示。這表明用甘油聚乙二醇蓖麻油酸酯作為共軛物可以形成穩(wěn)定的顆粒。實施例17含BrC16-紫杉醇/DOPE-GA的顆粒的粒度分析DOPE-GA，也稱為N-戊二酰基-PE,18∶1，它是一種與戊二酸通過酰胺鍵共軛的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺組成的磷脂。按照上文實施例1中的描述制備含有50摩爾％/50摩爾％的BrC16-紫杉醇和DOPE-GA的顆粒。概括地講，將48mg BrC16HTD和約33mgDOPE-GA溶于0.26ml乙醇；然后將該乙醇溶液的0.13ml等分試樣緩慢加入到含有2ml HBS(20mM HEPES,150mM鹽水，pH7.5)的試管中。然后將形成的2ml懸浮液合并成4ml體積的單一懸浮液。
該懸浮液為藍(lán)白色并且是透明的。將4ml懸浮液通過標(biāo)稱孔徑為5微米的注射濾器。濾液用Nicomp370型亞微米粒度分析儀進(jìn)行粒度分析。通過Gaussian分析的結(jié)果為(nm，±標(biāo)準(zhǔn)偏差)40±16nm(數(shù)量加權(quán))；67±27nm(體積加權(quán))和106±43nm(強(qiáng)度加權(quán))。實施例18含哈霉素/DSPE-PEG2000的顆粒將按照實施例1的描述通過改進(jìn)的REV法制備的哈霉素/DSPE-PEG2000(20∶80)(wt/wt)顆粒用Nomarski光學(xué)儀器進(jìn)行光學(xué)顯微鏡檢查。懸浮液含有分布不均勻的直徑小于6μm的顆粒。懸浮液為黃色，略微不透明。圖14是哈霉素/DSPE-PEG2000顆粒的光學(xué)顯微照片。照片上的1cm在圖14A中相當(dāng)于27μm，在圖14B中相當(dāng)于13.6μm。
將按照實施例1的描述通過透析法制備的哈霉素/DSPE-PEG2000(80∶20)(wt/wt)顆粒通過相襯光學(xué)顯微鏡進(jìn)行檢查。圖15是哈霉素/DSPE-PEG2000(80∶20)顆粒的光學(xué)顯微照片。照片上的1cm相當(dāng)于27μm。該懸浮液為黃色并且是透明的。
按照實施例1的描述通過透析法制備顆粒。將懸浮液(4ml)通過標(biāo)稱孔徑為5微米的注射濾器。濾液用Nicomp370型亞微米粒度分析儀進(jìn)行粒度分析。這些顆粒的粒度是相對不均勻的。因此，Nicomp分析的結(jié)果表明有多種粒度的群體。粒度通過Gaussian分析或分布分析進(jìn)行測定。Gaussian分析的結(jié)果為(nm，±標(biāo)準(zhǔn)偏差)382±196nm(數(shù)量加權(quán))；205±105nm(體積加權(quán))和495±253nm(強(qiáng)度加權(quán))。通過分布分析，66％的顆粒為105nm和34％為398nm(數(shù)量加權(quán))；7％的顆粒為111nm和93％為412nm(強(qiáng)度加權(quán))和3％的顆粒為111nm和97％為419nm(體積加權(quán))。用分布分析測得的雙峰分布表明有較大的顆粒(大于300nm)存在。無論如何，粒度研究表明哈霉素/DSPE-PEG2000的確形成了顆粒。
應(yīng)當(dāng)理解，以上描述只是用來說明而非限制性的。在閱讀了上述介紹后，許多實施方案對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。因此，本發(fā)明的范圍并不僅限于上述的描述，而應(yīng)當(dāng)由所附的權(quán)利要求以及與之等同的全部范圍來確定。所有文章和參考文獻(xiàn)、包括專利申請和出版物均引入本文作為參考。
權(quán)利要求
1．一種顆粒，其包含(a)含低親水性化合物的核；(b)生物相容性親水結(jié)構(gòu)域和生物相容性疏水結(jié)構(gòu)域的共軛物，所述共軛物包裹在核周圍，其中低親水性化合物占所述顆粒的約20摩爾％至約99摩爾％；共軛物占所述顆粒的約1摩爾％至約80摩爾％；并且顆粒的直徑至少為約15nm。
2．權(quán)利要求1所述的顆粒，其中的化合物選自紫杉類(taxanes)、長春花屬生物堿類、薯司他丁、頭孢菌素類、甾族化合物、利福霉素類、絲裂霉素類、博萊霉素類、苯并萘并吡喃酮、雙嵌入抗生素、核苷抗生素、吡咯并[1,4]苯并二氮雜類、大環(huán)內(nèi)酯類、雙吲哚類生物堿、喜樹堿類、依托泊苷類、替尼泊苷類、DNA嵌入劑、抗雌激素類、雙(苯并咪唑)類和阿糖腺苷。
3．權(quán)利要求2所述的顆粒，其中的化合物是紫杉類化合物。
4．權(quán)利要求3所述的顆粒，其中的紫杉化合物是紫杉醇。
5．權(quán)利要求1所述的顆粒，其中的低親水性化合物包括與疏水性結(jié)構(gòu)域共價連接的化合物，所述疏水性結(jié)構(gòu)域選自?；?、疏水性肽和疏水性聚合物鏈。
6．權(quán)利要求5所述的顆粒，其中的疏水性結(jié)構(gòu)域是?；湣?br> 7．權(quán)利要求6所述的顆粒，其中的?；湠槿缦陆Y(jié)構(gòu)式C(O)CHX1(CH2)n1(CH=CH)n2(CH2)n3(CH=CH)n4(CH2)n5(CH=CH)n6(CH2)n7(CH=CH)n8(CH2)n9CH3，其中n1等于0或是1至21的整數(shù)，n3等于0或是1至18的整數(shù)，n5等于0或是1至15的整數(shù)，n7等于0或是1至12的整數(shù)，n9等于0或是1至9的整數(shù)，n2、n4、n6和n8彼此獨(dú)立地等于0或1；n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9的總和是等于3至21的整數(shù)；并且X1是H或促進(jìn)水解的基團(tuán)。
8．權(quán)利要求7所述的顆粒，其中的酰基鏈為如下結(jié)構(gòu)式C(O)CHX1(CH2)n1CH3。
9．權(quán)利要求8所述的顆粒，其中的酰基鏈?zhǔn)?C(O)CHX1(CH2)9CH3、-C(O)CHX1(CH2)11CH3或-C(O)CHX1(CH2)13CH3-。
10．權(quán)利要求9所述的顆粒，其中的X1是促進(jìn)水解的基團(tuán)。
11．權(quán)利要求10所述的顆粒，其中，促進(jìn)水解的基團(tuán)選自F、Cl、Br、I、-OC6H4X2和-C(O)X2，其中X2是F、Cl、Br、I、CN、NO2或NH3+。
12．權(quán)利要求11所述的顆粒，其中，促進(jìn)水解的基團(tuán)是Br。
13．權(quán)利要求1所述的顆粒，其中的低親水性化合物含有與紫杉醇連接的選自-C(O)CHBr(CH2)9CH3、-C(O)CHBr(CH2)11CH3或-C(O)CHBr(CH2)13CH3的?；?。
14．權(quán)利要求1所述的顆粒，其中的共軛物疏水性結(jié)構(gòu)域包括兩親性脂類的酰基鏈區(qū)域。
15．權(quán)利要求14所述的顆粒，其中的兩親性脂類是磷脂酰乙醇胺。
16．權(quán)利要求15所述的顆粒，其中的磷脂酰乙醇胺是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
17．權(quán)利要求1所述的顆粒，其中的共軛物疏水性結(jié)構(gòu)域是疏水性聚合物。
18．權(quán)利要求17的化合物，其中的疏水性聚合物是硅聚合物或聚(氧化丙烯)。
19．權(quán)利要求1所述的顆粒，其中的共軛物親水性結(jié)構(gòu)域是親水性聚合物。
20．權(quán)利要求19所述的顆粒，其中的親水性聚合物選自聚乙二醇、纖維素、親水性肽、多糖、聚氧化乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮和聚甲基丙烯酸酯。
21．權(quán)利要求20所述的顆粒，其中的親水性結(jié)構(gòu)域是分子量為約50至約5000的聚乙二醇(PEG)或聚氧化乙烯。
22．權(quán)利要求1所述的顆粒，其中的共軛物是DSPE-PEG2000。
23．權(quán)利要求1所述的顆粒，其中的共軛物含有至少一種帶電荷的脂類。
24．權(quán)利要求23所述的顆粒，其中，帶電荷的脂類帶有凈負(fù)電荷。
25．權(quán)利要求24所述的顆粒，其中，帶負(fù)電荷的脂類是DOPE-GA。
26．權(quán)利要求23所述的顆粒，其中，帶電荷的脂類帶有凈正電荷。
27．權(quán)利要求1所述的顆粒，其中的共軛物是共聚物，其結(jié)構(gòu)式如下HO(CH2CH2O)a(CH(CH3)CH2O)b(CH2CH2O)cH,a和b彼此獨(dú)立地等于約10至約100的整數(shù)，c等于0或是約1至約100的整數(shù)。
28．權(quán)利要求27所述的顆粒，其中的a和c分別等于約75的整數(shù)，b等于約30的整數(shù)。
29．權(quán)利要求1所述的顆粒，其中的共軛物是甘油聚乙二醇蓖麻油酸酯。
30．權(quán)利要求1所述的顆粒，其粒徑最大為約10,000nm。
31．權(quán)利要求30所述的顆粒，其粒徑為約15nm至約200nm。
32．權(quán)利要求1所述的顆粒，其中的疏水性化合物占顆粒的約50摩爾％以上，而共軛物占顆粒的約50摩爾％以下。
33．權(quán)利要求32所述的顆粒，其中的疏水性化合物占顆粒的約80摩爾％至約99摩爾％，而共軛物占顆粒的約1摩爾％至約20摩爾％。
34．權(quán)利要求1所述的顆粒，其含有(a)約80摩爾％至約99摩爾％與-C(O)CHBr(CH2)9CH3、-C(O)CHBr(CH2)11CH3或-C(O)CHBr(CH2)13CH3共價連接的紫杉醇；和(b)約1摩爾％至約20摩爾％選自DSPE-PEG2000、DOPE-GA、HO(CH2CH2O)75(CH(CH3)CH2O)30(CH2CH2O)75H和甘油聚乙二醇蓖麻油酸酯的共軛物，其中，顆粒粒徑為約15nm至約200nm。
35．權(quán)利要求34所述的顆粒，其含有DSPE-PEG2000和與-C(O)CHBr(CH2)13CH3共軛的紫杉醇。
36．含有權(quán)利要求1所述的顆粒以及可藥用載體的組合物。
37．對動物施用化合物的方法，該方法包括給動物施用權(quán)利要求36的組合物。
38．權(quán)利要求37的方法，其中所述動物是人。
39．權(quán)利要求37的方法，其中的給藥包括口服、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥。
40．權(quán)利要求37的方法，其中的哺乳動物患有選自癌癥、炎性疾病和微生物感染的疾病，其中的化合物可以有效地治療所述疾病，并能以治療有效量的化合物給藥。
41．權(quán)利要求40的方法，其中所述疾病是癌癥，低親水性化合物是BrC16-紫杉醇，而共軛物是DSPE-PEG2000。
42．權(quán)利要求41的方法，其中顆粒的粒度為至少約15nm至約200nm，所述顆粒含有約80摩爾％至約99摩爾％的BrC16-紫杉醇和約1摩爾％至約20摩爾％的DSPE-PEG2000。
43．權(quán)利要求1所述的顆粒，其中的核疏水性化合物是非疏水性化合物的衍生物，所述衍生化合物包括與生物相容性疏水結(jié)構(gòu)域連接的化合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了可以對動物傳遞高濃度低親水性/低親脂性化合物的載體,其包括以帶有生物相容性疏水結(jié)構(gòu)域的化合物與同時具有疏水性和親水性區(qū)域的共軛物混合。所述制劑適于動物的多種應(yīng)用,特別是可對其施用高濃度的治療用化合物而沒有過多的副作用。
文檔編號A61K31/439GK1310612SQ99808935
公開日2001年8月29日 申請日期1999年5月19日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月20日
發(fā)明者W·佩爾金斯, X·李, D·希爾施, E·梅休, I·阿馬德, S·阿利, A·雅諾夫 申請人:利普索姆公司