一種產(chǎn)耐高溫阿魏酸酯酶和耐高溫纖維素酶的深綠木霉及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)耐高溫阿魏酸酯酶和耐高溫纖維素 酶的深綠木霉及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿魏酸醋酶（E. C. 3. I. 1. 73，ferulicacid esterase，F(xiàn)AE)又稱肉桂酸醋酶，是 一種新型酶制劑，它主要以阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯、多糖阿魏酸酯和木質(zhì)素阿魏酸酯 為底物，破壞阿魏酸與多糖相連的酯鍵，從植物細(xì)胞壁中釋放阿魏酸，讓余下的多糖主鏈易 被降解，有效提高了含有大量木質(zhì)纖維素和阿魏酸的副產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。阿魏酸具有多種 生理功能如清除自由基、抗紫外線輻射、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抗菌消炎、止痛、抗突 變、防癌、增強(qiáng)精子活力以及調(diào)節(jié)人體免疫等。因此，在食品工業(yè)中可利用該酶打斷阿魏酸 與細(xì)胞壁材料如麩皮、秸桿中多糖的交聯(lián)，高效降解多糖并獲得反式阿魏酸，獲得功能性食 品基料。阿魏酸酯酶在食品工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0003] 在飼料工業(yè)中，農(nóng)作物植物性的纖維原材料經(jīng)過阿魏酸酯酶處理后，阿魏酸從植 物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)中游離出來，植物材料致密的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)受到破壞，打破了木質(zhì)素、半纖 維素及纖維素之間的連接，這種疏松的植物性原料更容易被牲畜消化吸收利用，可顯著提 高飼料的利用率。
[0004] 纖維素酶是一類能降解纖維素中β -1，4糖苷鍵的O-糖基化水解酶。在飼料業(yè)生 產(chǎn)中，纖維素酶作為一種新型的飼料添加劑，添加劑量一般在〇. 1% -〇. 3%。由于植物細(xì)胞 壁主要由纖維素、半纖維素和果膠組成的，阻止了動(dòng)物對(duì)植物細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收， 纖維素酶能在動(dòng)物體內(nèi)分解結(jié)構(gòu)復(fù)雜的纖維素，摧毀植物細(xì)胞壁并釋放營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，生成易 于消化的葡萄糖，使飼料的利用率增大，同時(shí)增進(jìn)酸度，激活胃蛋白酶，促進(jìn)消化吸收；纖維 素酶還能顯著減少動(dòng)物腸道內(nèi)大腸桿菌的數(shù)量并促進(jìn)有益微生物的生長(zhǎng)，改善腸道內(nèi)菌群 平衡。
[0005] 目前已經(jīng)篩選到多種分泌阿魏酸酯酶和纖維素酶的微生物菌株，包括真菌、 細(xì)菌和酵母。發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)阿魏酸醋酶微生物主要有黑曲霉（Aaspergillusniger)、鏈霉 菌（如 Streptomycesavermitilis)、梭菌（如 Clostridiumthermocellum)、桿菌（如 Bacillussp.)、乳酸桿菌（Lactobacilli)、假單胞菌（如 Pseudomonasfluorescens) 等。但絕大多數(shù)阿魏酸醋酶從真菌中分離得到，如米曲霉（Aspergi I Iusoryzae)、 黑曲霉（Aspergillusniger)、構(gòu)巢曲霉（Aspergillusnidulans)、尖孢鐮刀 菌（Fusariumoxysporum)、嗜熱側(cè)抱霉（Sporotrichumthermophile)、黃柄 曲霉（Aspergillusflavipes)、泡盛曲霉（Aspergillusawamori)、塔賓曲霉 (Aspergillustubingensis)、青霉類（Penicillium) 〇
[0006] 目前，阿魏酸酯酶在飼料工業(yè)中的需求很大，而應(yīng)用于工業(yè)的阿魏酸酯酶主要來 源于黑曲霉，由于黑曲霉阿魏酸酯酶對(duì)高溫、酸或堿等條件耐受性不足，在工業(yè)生產(chǎn)使用過 程中，阿魏酸酯酶酶活損失嚴(yán)重，很大程度上限制了阿魏酸酯酶在工業(yè)上的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種產(chǎn)耐高溫阿魏酸酯酶和耐高溫 纖維素酶的深綠木霉及其應(yīng)用，該菌株具有營(yíng)養(yǎng)要求低、繁殖快、發(fā)酵產(chǎn)物易于提取分離、 發(fā)酵周期短的優(yōu)點(diǎn)，且其發(fā)酵能夠得到阿魏酸酯酶與纖維素酶復(fù)合酶，該復(fù)合酶耐高溫、酸 堿穩(wěn)定性好。
[0008] -種產(chǎn)耐高溫阿魏酸酯酶和耐高溫纖維素酶的深綠木霉（Trichoderma atroviride)AWS26,已于2014年1月2日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生 物中心CGMCC(地址為：中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編100101)，保藏編號(hào)： CGMCC No. 8673。
[0009] 本發(fā)明所述的深綠木霉菌AWS26的篩選方法包括以下步驟：
[0010] 步驟1，采樣及樣品處理
[0011] 從江蘇省徐州市云龍區(qū)大韓村正處于高溫發(fā)酵的堆肥中取土樣10份。稱取固體 土樣5g，放入裝有玻璃珠及50mL已滅菌的生理鹽水的三角瓶中，以160r/min的轉(zhuǎn)速室溫振 蕩30min，制成懸液，然后將此三角瓶放入60-70°C恒溫震蕩水浴鍋中，lOOr/min震蕩處理 20-30min，得土樣渾濁液。
[0012] 步驟2,富集培養(yǎng)
[0013] 吸取2-4mL經(jīng)高溫處理后的土樣渾濁液，加入至裝有30-60mL富集培養(yǎng)基一的三 角瓶中，置于45-50°C、轉(zhuǎn)速160-200r/min下恒溫?fù)u床中培養(yǎng)5-7d。然后無菌操作量取 30-50mL富集培養(yǎng)液至離心管中，4000-6000r/min離心5-10min，倒掉上清，以富集培養(yǎng)基 二將離心后的沉淀洗至裝有30-60mL富集培養(yǎng)基二的三角瓶中，再次置于45-50°C、轉(zhuǎn)速 160-200r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)5-7d。
[0014] 富集培養(yǎng)基一：阿魏酸乙酯0. 2g、羧甲基纖維素鈉 0. 5g，無機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液lmL，補(bǔ)充 水至100mL，pH4. 5。121°C 15min滅菌，自然冷卻后，加入過濾除菌的氨芐青霉素至終濃度 50mg/L〇
[0015] 富集培養(yǎng)基二：麩皮粉lg、玉米秸桿粉lg，阿魏酸乙酯0. 2g、無機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液lmL，補(bǔ) 充水至100mL，pH4. 5。121°C 15min滅菌，自然冷卻后，加入過濾除菌的氨芐青霉素至終濃 度 50mg/L。
[0016] 無機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液：NaN03 2. 0g，K2PO4 I. 5g，CaCl2 I. 5g，MgSO4 0· 3g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0· lg，MnSO4 · H2O I. 6mg，ZnSO4 · H2O 0· 05g，CoCl2 0· 5mg，（NH4) 2S04 5g，去離子水 1000mL。
[0017] 步驟3,初篩
[0018] 將第二次富集后的培養(yǎng)液逐級(jí)稀釋到ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟΛ取各級(jí)稀釋的培養(yǎng)液 0. 2mL分別涂布于霉菌篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)皿晾至表面沒有流動(dòng)液體時(shí)，用保鮮膜將培養(yǎng)皿 口封好，并置于37-40°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18-24h，然后將平板置于40-45°C恒溫培養(yǎng) 箱中繼續(xù)倒置培養(yǎng)2-4d。
[0019] 將平板上長(zhǎng)出的菌落點(diǎn)種到兩個(gè)初篩選擇培養(yǎng)基的相同位置，兩個(gè)初篩培養(yǎng)基分 別為阿魏酸酯酶初篩培養(yǎng)基和纖維素酶初篩培養(yǎng)基。接種好的培養(yǎng)皿40-45°C恒溫培養(yǎng)箱 中倒置培養(yǎng)2-4d。待有明顯菌落形成，觀察阿魏酸酯酶初篩培養(yǎng)基上有無明顯透明圈出現(xiàn)。 將纖維素酶初篩平板上加入一定量0.1 %的剛果紅染液，染色l-10min，倒掉染色液，觀察 菌落周圍剛果紅顏色是否明顯變淺。將在兩種初篩平板上均出現(xiàn)水解圈的菌株從阿魏酸酯 酶初篩平板上接種出來，進(jìn)一步復(fù)篩。
[0020] 霉菌篩選培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基800mL，孟加拉紅0. 02g，氯霉素0. lg，無機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液 lmL，補(bǔ)水至1000mL，瓊脂粉15g。121°C，15min滅菌。孟加拉紅和氯霉素滅菌后加入。
[0021] PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，蔗糖20g，蒸餾水定容至1000mL。
[0022] 阿魏酸酯酶初篩培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基100mL，無機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液lmL，阿魏酸乙酯溶液 lmL，瓊脂粉1.5g，pH4. 5。121°C，滅菌20min。培養(yǎng)基滅菌后充分搖勻，隨著搖動(dòng)，培養(yǎng)基逐 漸變得不透明，在60-70 °C下倒入平板中。
[0023] 阿魏酸乙酯溶液配制：稱取0. 22g阿魏酸乙酯于離心管中，加入500 yLN、N_二甲 基酰胺溶液，震蕩溶解后再加入500 μ L無菌水，充分搖勻。
[0024] 纖維素酶初篩培養(yǎng)基：纖維素粉lg，蛋白胨0. lg，酵母粉0. lg，無機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)液lmL， 瓊脂1. 5,加蒸餾水定容至100mL，pH值4. 5。121°C滅菌15min。
[0025] 步驟4,復(fù)篩
[0026] 將初篩得到的菌株于PDA培養(yǎng)基平板上劃線，置于40-45?恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2-3d，重復(fù)劃線培養(yǎng)三次以上，如連續(xù)多次觀察到菌落形態(tài)