專利名稱：得到高純度HMG－CoA還原酶抑制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、美伐他汀、atorvastatin及其衍生物和類似物已知是HMG-CoA還原酶抑制劑，而且被用做抗高膽固醇血藥。它們中的大多數(shù)是通過不同物種的微生物發(fā)酵而生產(chǎn)的，這些物種屬于曲霉屬、紅曲屬、諾卡氏菌屬、擬無枝酸菌屬、毛霉菌屬或青霉屬，一些是通過使用化學合成的方法處理發(fā)酵產(chǎn)物而得到，或者它們是全化學合成的產(chǎn)物。
活性成分的純度是生產(chǎn)安全有效的藥物的重要因素，特別是如果該藥物產(chǎn)品必須在治療或預防高血漿膽固醇中長期使用。低純度藥物中的雜質(zhì)的累積在醫(yī)療中可能會引起許多副作用。
本發(fā)明涉及使用所謂“頂替色譜法”分離HMG-CoA還原酶抑制劑的一種新的工業(yè)方法。使用本發(fā)明可以得到高純度的HMG-CoA還原酶抑制劑，而且收率高，生產(chǎn)成本低，適合生態(tài)平衡。
已有技術(shù)在以前的專利中公開的抗高膽固醇血藥的分離和純化方法包括萃取、色譜、內(nèi)酯化和結(jié)晶方法的各種組合。經(jīng)過這些過程得到的終產(chǎn)物的純度遵守USP標準，但是期望的產(chǎn)物的收率相對較低。另外，它們不僅需要大量有機溶劑，還需要適合這些量級的巨大設(shè)備。
WO 92/16276中公開的分離方法提供了使用工業(yè)HPLC(高效液相色譜)設(shè)備得到純度高于99.5％的HMG-CoA還原酶抑制劑的方案。根據(jù)WO 92/16276，純度≥85％的粗HMG-CoA還原酶抑制劑被溶解在有機溶劑或有機溶劑和水的溶液中。然后將混合物緩沖至pH值在2-9之間，并置于HPLC柱上。收集所關(guān)心的HMG-CoA還原酶抑制劑峰后，除去部分溶劑并加入水，或者三分之二的溶劑混合物被除去，HMG-CoA還原酶抑制劑結(jié)晶。最后，通過該方法得到的產(chǎn)物的純度至少為99.5％，收率約90％。
WO 92/16276中公開的方法能得到高純度的HMG-CoA還原酶抑制劑，收率相對較高，該方法與常規(guī)色譜柱相比的缺點是相對小的每根HPLC柱的載樣量。加在柱子上的小量樣品也與為得到足夠量的期望的物質(zhì)而增加的分離操作的次數(shù)，以及導致更高生產(chǎn)成本的大量溶劑的使用有關(guān)。
本發(fā)明的基礎(chǔ)一頂替色譜法與以前所用的色譜方法沒有本質(zhì)區(qū)別。
頂替色譜法是基于加在柱上的樣品中的組分對固定相上活性位點的競爭。樣品中的各組分象火車(train)一樣相互頂替，與固定相有非常高親和性而在過柱時落在所加樣品的后面的頂替劑，驅(qū)動與頂替劑移動速度相同的樣品組分成為單室區(qū)帶(one-compartmentzones)。各組分的濃縮與純化同時進行。
頂替色譜法的原理相對比較古老，它從1943年開始就為人所知，但是由于缺少有效的柱子，它直到1981年才被引入實際應用(Cs.Horvath et al.,J.Chromatogr.,215(1981)295；J.Chromatogr.,330(1985)1；J.Chromatogr.440(1988)157)。這些文章引入本文作參考，它們描述了使用反相高效液相色譜柱，以頂替模式進行生物活性肽和多粘菌素抗生素(多肽)的分析的和制備的分離和純化。對于多粘菌素，使用250×4.6mm的十八烷基硅膠柱，粒徑5μm,10％乙腈在水中作為流動相，不同的鹵化四烷基季銨作為頂替劑。
在頂替色譜法領(lǐng)域的最近的研究(S.M.Cramer et al.,EnzymeMicrob.Technol.,11(1989)74；Prep.Chromatogr.,1(1988)29；J.Chromatogr.,394(1987)305；J.Chromatogr.,439(1988)341；J.Chromatogr.,454(1988)1(理論優(yōu)化)；A.Felinger et al.,J.Chromatogr.,609(1992)35(理論優(yōu)化)，所有文章引入本文作參考)中，使用了相似的柱子，流動相為甲醇在磷酸鹽緩沖液中，頂替劑為乙腈中的2-(2-叔丁氧乙氧基)乙醇(BEE)，蛋白質(zhì)和抗生素頭孢菌素C用作樣品。
美國專利第5,043,432號(27.08.1991)和EP 416.416分別描述了用頂替離子交換色譜法純化某種低分子的(低于1000道爾頓)肽(特別是，促吞噬素及其合成的衍生物)的方法，使用陽離子交換樹脂做為固定相，遷移溶劑(transporter solvent)為水或各種強酸的稀溶液，所用的頂替劑為不同濃度的三亞乙基季銨鹽。在還未公開的美國專利申請第08/875,422號中，描述了使用頂替色譜法分離和純化萬古霉素。
技術(shù)方案有時得到大量高純度的活性物質(zhì)是困難的，因為很多適合于實驗室規(guī)模的技術(shù)從其使用而言在大規(guī)模生產(chǎn)操作中是不夠經(jīng)濟的，或者未達到環(huán)境標準。以上事實迫使工業(yè)上尋找新的技術(shù)，它提供既是高質(zhì)量又是經(jīng)濟和生態(tài)上可接受的產(chǎn)品。
本發(fā)明解決了從較早的專利和其它文獻中得到的方法的缺點，因為它能夠得到純HMG-CoA還原酶抑制劑，另外，該純化方法本身是省時的，提供高收率，使用小量溶劑。該方法是有利自然的，另外，它不需要大的空間和能量，因而能夠大規(guī)模經(jīng)濟生產(chǎn)。
要純化的HMG-CoA還原酶抑制劑是，例如，選自由美伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀、atorvastatin組成的組。選擇的用頂替色譜法進行純化的抑制劑可以是內(nèi)酯的形式或酸或其鹽的形式。
作為本發(fā)明特征的頂替色譜法優(yōu)選包括以下步驟a)用合適的流動相調(diào)節(jié)色譜柱，b)將溶解在流動相中的粗HMG-CoA還原酶抑制劑進樣，c)引入從柱子上頂替HMG-CoA還原酶抑制劑的頂替劑，以及d)得到純化的HMG-CoA還原酶抑制劑。
純化的HMG-CoA還原酶抑制劑優(yōu)選通過以下途徑得到d1)收集組分，以及d2)用分析HPLC分析組分以及根據(jù)純度質(zhì)量合并組分。
得到純化的HMG-CoA還原酶抑制劑以后，色譜柱可以通過用醇/水混合物沖洗以洗脫掉頂替劑而再生。
然后，用本文描述的方式得到的HMG-CoA還原酶抑制劑根據(jù)從已有技術(shù)的陳述中已知的方法從流動相中分離，例如通過冷凍干燥，或者優(yōu)選地，通過結(jié)晶得到內(nèi)酯的形式、酸的形式或鹽的形式(優(yōu)選是堿或堿土鹽)。
除了雜質(zhì)還含有很高百分比HMG-CoA還原酶抑制劑的組分可以用該方法再處理，使總收率超過95％。
所使用的固定相為反相固定相，天然的(帶有不同長度烷基鏈的硅膠)或合成的(C-8或C-18)有機的固定相是合適的。優(yōu)選地，使用苯乙烯和二乙烯基苯的合成交聯(lián)聚合物基質(zhì)。固定相的粒徑在3到20μm之間是合適的，優(yōu)選在7-15μm之間。
所用的流動相優(yōu)選選自水、乙腈/水溶液和低級(優(yōu)選是C1-C4)醇水溶液、有機酸、鹵代有機酸或無機酸的稀緩沖液如，蟻酸、醋酸、丙酸、鹽酸、硼酸、磷酸、碳酸或硫酸與堿金屬陽離子、氨或胺。水、乙腈的水溶液，特別是甲醇或乙醇的水溶液是特別優(yōu)選的，且水溶液中有機溶劑含量優(yōu)選是80％或更低，更優(yōu)選是45％或更低，特別是30％或更低。因為流動相中毒性的甲醇可以被毒性較低的乙醇代替，或者至少部分地被水代替，而結(jié)果較好，廢溶劑的除去更簡單，因而從生態(tài)方面而言，與已有技術(shù)相比，本發(fā)明是顯著進步的。
所用的流動相的pH值優(yōu)選在4.5到10.5之間，更優(yōu)選在6.5到8之間，特別是約7。流動相通過柱子的流速被適當?shù)卣{(diào)節(jié)在1.5到30ml/(min cm2)之間，優(yōu)選在3到15ml/(min cm2)之間。當頂替劑通過與流動相混合被引入色譜柱的同時，流速優(yōu)選調(diào)節(jié)在1.5到15ml/(min cm2)之間，特別是在3到10ml/(min cm2)之間，因為更高的流速會導致要收集的樣品的稀釋，而且分離也會變差。
合適的頂替劑是具有兩親結(jié)構(gòu)的化合物，如表面活性劑、洗滌劑等。頂替劑的例子是長鏈醇、長鏈羧酸、長鏈烷基銨鹽、芳香族二羧酸酯、羰基合成醇和二羰基合成醇(dioxo-alcohols)、聚亞烷基聚乙二醇醚如二亞乙基乙二醇單(或二)烷基醚、聚芳基醚或聚亞烷基聚芳基醚如TritonX-100等。前述的“長鏈”指含有至少C4-鏈，優(yōu)選是至少C10-鏈，更優(yōu)選是至少C14鏈或更長的烷基鏈。
流動相中頂替劑的濃度適當?shù)卣{(diào)節(jié)在1％到35％之間，優(yōu)選是2-20％，特別是7-14％。
在控制從色譜柱洗脫下來地的各組分的純度質(zhì)量的優(yōu)選的實施方案中，用于要分析的HMG-CoA還原酶抑制劑的分析HPLC方法可以如下進行。
要分析的樣品用含有20mM NH4HCO3溶液和乙腈(乙腈的比例調(diào)節(jié)到使分析物的保留因子在5到10之間)的流動相稀釋100倍。10μl該樣品被加到Hypersil ODS柱(Hypersil，英國，粒徑3μm，柱尺寸50×4.6mm)進行高效液相色譜分析。柱子用流動相在2ml/min的流速下沖洗。在235nm測定吸光度。樣品的HPLC純度用色譜圖上各峰面積的比來計算。
完成色譜后，固定相優(yōu)選進行再生，例如用20-100％低級醇的水溶液做流動相。
本方法用以下實施例說明，但不限于這些實施例。
純度≥99.5％的組分被合并。合并的組分的HPLC純度為99.7％。
純度≥99.5％的組分被合并。合并后的組分的HPLC純度為99.8％。
純度≥99.5％的組分被合并。合并的組分的HPLC純度為99.8％。
純度≥99.5％的組分被合并。合并的組分的HPLC純度為99.8％。
純度≥99.5％的組分被合并。合并的組分的HPLC純度為99.8％。
純度≥99.5％的組分被合并。合并的組分的HPLC純度為99.8％。
純度≥99.5％的組分被合并。合并的組分的HPLC純度為99.9％。
得到的組分用實施例9中描述的方法分析。純度≥99.5％的組分被合并。合并的組分的HPLC純度為99.8％。
得到的組分用上述HPLC分析方法分析。
純度≥99.5％的組分被合并。合并的組分的HPLC純度為99.8％。
權(quán)利要求
1．得到HMG-CoA還原酶抑制劑的方法，特征在于該純化粗HMG-CoA還原酶抑制劑的方法中的一個步驟包括頂替色譜法。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，特征在于HMG-CoA還原酶抑制劑選自由美伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀和atorvastatin組成的組。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，特征在于HMG-CoA還原酶抑制劑是內(nèi)酯的形式或其酸或鹽的形式。
4．根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項權(quán)利要求的方法，特征在于頂替色譜法包括以下步驟a)用流動相調(diào)節(jié)色譜柱，b)將溶解在流動相中的HMG-CoA還原酶抑制劑進樣，c)引入從柱子上頂替HMG-CoA還原酶抑制劑的頂替劑，以及d)得到純化的HMG-CoA還原酶抑制劑。
5．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，特征在于純化的HMG-CoA還原酶抑制劑通過以下途徑得到d1)收集組分，以及d2)用分析HPLC分析組分并根據(jù)純度質(zhì)量合并組分。
6．根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法，特征在于頂替色譜法另外包括接著的步驟e)通過用醇/水混合物沖洗柱子洗脫掉頂替劑而再生色譜柱。
7．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，特征在于流動相選自由水、乙腈/水溶液或低級醇水溶液，以及有機酸、鹵代有機酸或無機酸與堿金屬陽離子、氨或胺的稀緩沖液組成的溶劑組。
8．根據(jù)權(quán)利要求7的方法，特征在于流動相是水、乙腈/水溶液或低級醇水溶液中的任一種。
9．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，特征在于所用流動相的pH值在4.5到10.5之間。
10．根據(jù)權(quán)利要求9的方法，特征在于所用流動相的pH值在6.5到8之間。
11．根據(jù)權(quán)利要求10的方法，特征在于所用流動相的pH值為7。
12．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，特征在于流動相通過色譜柱的流速在1.5到30ml/(min cm2)之間。
13．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，特征在于所用流動相/頂替劑混合物通過色譜柱的流速在3到15ml/(min cm2)之間。
14．根據(jù)權(quán)利要求6的方法，特征在于色譜結(jié)束后，用20-100％的低級醇水溶液再生固定相。
15．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，特征在于固定相為反相。
16．根據(jù)權(quán)利要求15的方法，特征在于固定相為天然的反相，如帶有不同長度烷基鏈的硅膠。
17．根據(jù)權(quán)利要求15的方法，特征在于固定相為C-8或C-18。
18．根據(jù)權(quán)利要求15的方法，特征在于固定相為合成交聯(lián)聚合物基質(zhì)。
19．根據(jù)權(quán)利要求18的方法，特征在于交聯(lián)聚合物基質(zhì)為苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物。
20．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，特征在于固定相粒徑在3到20μm之間。
21．根據(jù)權(quán)利要求20的方法，特征在于固定相粒徑在7-15μm之間。
22．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，特征在于頂替劑選自由長鏈醇、長鏈羧酸、長鏈烷基銨鹽、芳香族二羧酸酯、羰基合成醇和二羰基合成醇、聚亞烷基聚乙二醇醚和聚芳基醚或聚亞烷基聚芳基醚組成的組。
23．根據(jù)權(quán)利要求4的方法，特征在于流動相中頂替劑的濃度在1％到35％之間。
24．根據(jù)權(quán)利要求23的方法，特征在于流動相中頂替劑的濃度在2-20％之間。
25．根據(jù)權(quán)利要求1到24中任一項的方法，用以生產(chǎn)HPLC純度超過99.7％的HMG-CoA還原酶抑制劑的用途。
26．通過包括頂替色譜法的純化方法純化粗HMG-CoA還原酶抑制劑而得到的HPLC純度超過99.7％的HMG-CoA還原酶抑制劑。
27．根據(jù)權(quán)利要求26的物質(zhì)，特征在于HMG-CoA還原酶抑制劑選自由洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、atorvastatin、美伐他汀和氟伐他汀組成的組。
28．根據(jù)權(quán)利要求27的物質(zhì)，特征在于所選擇的HMG-CoA還原酶抑制劑為洛伐他汀、辛伐他汀或普伐他汀。
29．根據(jù)權(quán)利要求26的物質(zhì)，特征在于所選擇的HMG-CoA還原酶抑制劑是內(nèi)酯的形式或酸或其鹽的形式。
全文摘要
洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、美伐他汀、atorvastatin及其衍生物和類似物已知是HMG－CoA還原酶抑制劑，而且被用做抗高膽固醇血藥。它們中的大多數(shù)是通過不同物種的微生物發(fā)酵而生產(chǎn)的，這些物種屬于曲霉屬、紅曲屬、諾卡氏菌屬、擬無枝酸菌屬、毛霉菌屬或青霉屬，一些是通過使用化學合成的方法處理發(fā)酵產(chǎn)物而得到，或者它們是全化學合成的產(chǎn)物?；钚猿煞值募兌仁巧a(chǎn)安全有效的藥物的重要因素，特別是如果該藥物產(chǎn)品必須在治療或預防高血漿膽固醇中長期使用。低純度藥物中的雜質(zhì)的累積在醫(yī)療中可能會引起許多副作用。本發(fā)明涉及使用所謂“頂替色譜法”分離HMG－CoA還原酶抑制劑的一種新的工業(yè)方法。使用本發(fā)明能夠得到高純度的HMG－CoA還原酶抑制劑，而且收率高，生產(chǎn)成本低，適合生態(tài)平衡。
文檔編號A61K31/22GK1318063SQ99811076
公開日2001年10月17日 申請日期1999年9月17日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月18日
發(fā)明者羅克·格拉海克, 杜尚·米利沃耶維奇, 安德烈·巴斯塔達 申請人:萊克制藥與化學公司