專利名稱：重組方法及其所用試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及重組至少兩個(gè)核酸序列的方法及其所用試劑。更具體地，本發(fā)明涉及在表達(dá)recBCD核酶或其功能衍生物的宿主細(xì)胞中重組環(huán)形核酸序列和線形核酸序列的方法。本發(fā)明的方法可特別地用于通過與線形DNA序列同源重組來修飾細(xì)菌人工染色體。
有必要更進(jìn)一步地了解高等真核生物基因組的結(jié)構(gòu)和組成?；蚪M序列經(jīng)常比編碼序列長很多。盡管仍不知道大多數(shù)非-編碼序列的功能，但它們顯然在調(diào)節(jié)基因表達(dá)，穩(wěn)定性和進(jìn)化方面起著重要作用。與非相關(guān)的或病毒啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的cDNA構(gòu)建體形成對照的是，大基因組片段的基因轉(zhuǎn)移顯示出正確的時(shí)間-和組織-特異性基因表達(dá)1-7。
酵母人工染色體(YAC)已提供了很多疾病基因的基因組克隆8-10。具有多種人基因座YAC的轉(zhuǎn)基因模型已闡明這種大的基因組片斷可用于產(chǎn)生多種疾病的準(zhǔn)確模型11-14。酵母中高效率的同源重組對于基因操作YAC以進(jìn)行功能分析3，8，15，將YAC環(huán)化成PAC或BAC16，17和由較小的重疊YAC產(chǎn)生較大的YAC具有重要的意義。
然而，YAC系統(tǒng)存在幾個(gè)嚴(yán)重妨礙其應(yīng)用的局限性。YAC具有高水平的克隆不穩(wěn)定性和嵌合狀態(tài)19，20。另外，盡管已研究出多種方法用于產(chǎn)生YAC轉(zhuǎn)基因?qū)W，但仍難以純化轉(zhuǎn)基因所用的完整的YAC DNA21。用于在YAC中導(dǎo)入修飾或者用于進(jìn)行TAR克隆的酵母同源重組系統(tǒng)的重要缺點(diǎn)22是難以調(diào)節(jié)同源重組的程度，并且需要篩選大量“重組”克隆以鑒定正確的產(chǎn)物。
大-插入物BAC/PAC克隆系統(tǒng)23，24已克服了YAC系統(tǒng)的很多難題。BAC/PAC已越來越多地用于長-范圍的物理圖譜繪制25，26，疾病基因的定位克隆27，整個(gè)基因組測序計(jì)劃28-30和功能研究31，32。由于細(xì)菌中的克隆效率更高，因此相對于YAC文庫而言，高質(zhì)量BAC/PAC基因組文庫的構(gòu)建更加容易。在已被詳盡-定義的重組-缺損的大腸桿菌菌株DH10B中，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)可維持1-2拷貝的BAC/PAC，在該菌株多代的繁殖過程中，BAC/PAC表現(xiàn)出較高的克隆穩(wěn)定性。盡管BAC/PAC攜有大小約為300kb的插入物，但仍可以通過常規(guī)的細(xì)菌質(zhì)粒分離方法大量純化BAC/PAC以進(jìn)行功能研究。這些克隆中的基因組插入物大得足以能維持大多數(shù)人基因座的完整性，因此對于功能研究來說較為理想。
盡管存在這些優(yōu)點(diǎn)，而且BAC/PAC作為在很多系統(tǒng)中進(jìn)行基因組研究所需的重要工具越來越受歡迎，但仍沒有簡單易行的技術(shù)能對這些克隆進(jìn)行基因操作。這些克隆中基因組插入物較大，這一點(diǎn)阻礙了在常規(guī)的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)合適的限制性位點(diǎn)。
1989年，人們首次使用大腸桿菌基于F-質(zhì)粒的載體中的同源重組來連接重疊的果蠅粘粒片斷以形成125kb片斷35。在rec+菌株中，具有溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒之間共-整合，而分辨共-整合需要rec-宿主中的第二個(gè)位點(diǎn)-特異性重組事件。Sternberg34描述了將真核生物的選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)座插入大的P1克隆的方法，盡管難以精確控制轉(zhuǎn)座位點(diǎn)，但該方法應(yīng)該也適用于PAC和BAC。已成功使用借助于RecA的限制性內(nèi)切核酸酶(RARE)裂解法在大量P1和BAC克隆中導(dǎo)入修飾35，但此方法在技術(shù)上很受限制。由于PAC和BAC克隆系統(tǒng)在每個(gè)載體的骨架上都包括loxP位點(diǎn)，很多研究人員用cre重組酶將真核選擇標(biāo)記和報(bào)道基因靶向插入此位點(diǎn)36，37。
Yang等38報(bào)道了使用具有溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒中的野生型recA基因靶向修飾131kb BAC，從而賦予DH10B細(xì)胞瞬時(shí)的精通重組的能力。然而，有證據(jù)表明使用此方法顯著重排克隆必需通過Southern印跡鑒定重組克隆以鑒定出正確的產(chǎn)物。另一種使用大腸桿菌CBTS菌株的方法也被用于在含有完整的小鼠CMV基因組的230kbBAC中導(dǎo)入修飾39，其中所述菌株的recA基因中攜有溫度-敏感型琥珀突變。然而，難以將BAC由DH10B直接轉(zhuǎn)移至條件recA菌株。最近，有人使用含有適當(dāng)定向的chi位點(diǎn)的靶向構(gòu)建體，將綠色熒光蛋白基因靶向至含有GATA-2基因座的斑馬魚BAC40。然而，這必需將BAC轉(zhuǎn)移至精通重組的菌株，這可能會導(dǎo)致具有重復(fù)序列的克隆的不穩(wěn)定性。
還有人描述了用噬菌體λ的Red-Gam系統(tǒng)替代大腸桿菌的RecBCD功能的方法41。這種替代使得宿主染色體和短的線性DNA片斷之間同源重組的發(fā)生率比recBCsbsBC或recD菌株所表現(xiàn)出的高至少70倍。然而，仍未闡明該系統(tǒng)修飾BAC/PAC的用途。
上述方法無一最適于對PAC和BAC進(jìn)行基因操作。它們不能在表達(dá)RecBCD的宿主細(xì)胞(如DH10B)中直接使用，或者還需要構(gòu)建復(fù)雜的穿梭載體。在大多數(shù)這些方法中，不能較好地控制同源重組的程度，因此會出現(xiàn)不必要的重排風(fēng)險(xiǎn)。所以，需要開發(fā)出以可控制的方式直接在宿主細(xì)胞中使兩個(gè)核酸序列，如BAC/PAC與線性DNA序列重組的方法。
在導(dǎo)致本發(fā)明的工作中，發(fā)明人探求開發(fā)一種在體內(nèi)使兩個(gè)核酸序列(如環(huán)形DNA序列)與線性DNA序列可控同源重組的方法。特別是，發(fā)明人通過在宿主細(xì)胞中表達(dá)可調(diào)制的recE/recT重組系統(tǒng)以及可調(diào)制水平的recBCD核酶抑制劑，使得DNA序列與BAC發(fā)生同源重組而對BAC進(jìn)行修飾。表達(dá)recBCD核酶抑制劑是為了抑制內(nèi)源性產(chǎn)生的recBCD核酶的功能活性。另外，調(diào)制和協(xié)同表達(dá)recE/recT同源重組系統(tǒng)和recBCD核酶抑制劑的能力便于控制同源重組事件，并使隨機(jī)的和不必要的重組事件最小化。調(diào)制和協(xié)同表達(dá)同源重組系統(tǒng)和recBCD核酶抑制劑的能力便于在以下兩種情況下在體內(nèi)誘導(dǎo)同源重組事件，所述情況是身為重組主體的至少一個(gè)核酸序列位于F-質(zhì)粒(如BAC)，或者宿主細(xì)胞對過量表達(dá)重組系統(tǒng)分子或recBCD抑制劑(如gam)敏感。
發(fā)明簡述在整個(gè)說明書和其后的權(quán)利要求書中，除非上下文需要，否則的話，術(shù)語“含有”應(yīng)被理解成包括所提及的一個(gè)整數(shù)或步驟或一組整數(shù)或步驟，但不排除任何其它整數(shù)或步驟或其它組整數(shù)或步驟。
說明書中所指的核苷酸和氨基酸序列的序列鑒定號(SEQ ID No.)將在文獻(xiàn)目錄之后定義。
因此，本發(fā)明提供了便于在至少兩個(gè)核苷酸序列之間進(jìn)行同源重組的方法，所述方法包括通過在足夠有利于同源重組至少兩個(gè)核苷酸序列的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，以在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)所述至少兩個(gè)核苷酸序列之間的重組，其中所述宿主細(xì)胞能表達(dá)recBCD和編碼外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑或其衍生物的核苷酸序列，外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑的表達(dá)是可調(diào)制的。
另一方面，本發(fā)明提供了便于在至少兩個(gè)核苷酸序列之間進(jìn)行同源重組的方法，所述方法包括通過在足夠有利于同源重組至少兩個(gè)核苷酸序列的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，以在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)所述至少兩個(gè)核苷酸序列之間的重組，其中所述宿主細(xì)胞能表達(dá)recBCD，recE，recT和編碼recBCD抑制劑或其功能衍生物的核苷酸序列，recE，recT和編碼recBCD抑制劑的核苷酸序列的表達(dá)是可調(diào)制的。
另一方面，本發(fā)明提供了便于在至少兩個(gè)核苷酸序列之間進(jìn)行同源重組的方法，所述方法包括通過在足夠有利于同源重組至少兩個(gè)核苷酸序列的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，以在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)所述至少兩個(gè)核苷酸序列之間的重組，其中所述宿主細(xì)胞能表達(dá)recBCD，recE，recT和gam或其功能衍生物，recE，recT和gam的表達(dá)是可調(diào)制的。
另一方面，本發(fā)明提供了便于在至少兩個(gè)核苷酸序列之間進(jìn)行同源重組的方法，所述方法包括通過在足夠有利于同源重組至少兩個(gè)核苷酸序列的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，以在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)所述至少兩個(gè)核苷酸序列之間的重組，其中所述宿主細(xì)胞能表達(dá)recBCD，recE，recT和gam或其功能衍生物，recE，recT和gam的表達(dá)是可調(diào)制的。
另一方面，本發(fā)明提供了便于在至少兩個(gè)核苷酸序列之間進(jìn)行同源重組的方法，所述方法包括通過在足夠有利于同源重組至少兩個(gè)核苷酸序列的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，以在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)所述至少兩個(gè)核苷酸序列之間的重組，其中所述宿主細(xì)胞能表達(dá)recBCD和編碼外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑或其衍生物的核苷酸序列，外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑的表達(dá)是可調(diào)制的。
另一方面，本發(fā)明提供了便于在環(huán)形核苷酸序列和線性核苷酸序列之間進(jìn)行同源重組的方法，所述方法包括通過在足夠有利于同源重組環(huán)形核苷酸序列和線性核苷酸序列的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，以在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)所述環(huán)形核苷酸序列和所述線性核苷酸序列之間的重組，其中所述宿主細(xì)胞能表達(dá)recBCD和編碼外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑或其衍生物的核苷酸序列，外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑的表達(dá)是可調(diào)制的。
另一方面，本發(fā)明提供了便于在環(huán)形核苷酸序列和線性核苷酸序列之間進(jìn)行同源重組的方法，所述方法包括通過在足夠有利于同源重組環(huán)形核苷酸序列和線性核苷酸序列的條件下培養(yǎng)DH10B細(xì)胞或其同系物或其突變體，以在DH10B細(xì)胞或其同系物或其突變體中誘導(dǎo)所述環(huán)形核苷酸序列和所述線性核苷酸序列之間的重組，其中所述DH10B細(xì)胞或其同系物或其突變體能表達(dá)recBCD，recE，recT和gam或其功能衍生物，recE，reeT和gam的表達(dá)是可調(diào)制的。
另一方面，本發(fā)明提供了便于在至少兩個(gè)核苷酸序列之間進(jìn)行同源重組的方法，其中至少一個(gè)所述核苷酸序列含有F-質(zhì)粒部分，所述方法包括通過在足夠有利于同源重組至少兩個(gè)核苷酸序列的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，以在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)所述至少兩個(gè)核苷酸序列之間的重組，其中所述宿主細(xì)胞能表達(dá)recBCD和編碼外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑或其衍生物的核苷酸序列，外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑的表達(dá)是可調(diào)制的。
另一方面，本發(fā)明提供了便于在BAC和線性核苷酸序列之間進(jìn)行同源重組的方法，所述方法包括通過在足夠有利于同源重組BAC和線性核苷酸序列的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，以在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)所述BAC和所述線性核苷酸序列之間的重組，其中所述宿主細(xì)胞能表達(dá)recBCD和編碼外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑或其衍生物的核苷酸序列，外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑的表達(dá)是可調(diào)制的。
另一方面，本發(fā)明提供了便于在宿主細(xì)胞中同源重組至少兩個(gè)核苷酸序列的方法，所述方法包括步驟(i)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞含有第一個(gè)核苷酸序列和所述至少兩個(gè)核苷酸序列，其中第一個(gè)核苷酸序列編碼外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑或其功能衍生物，而外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和編碼recBCD抑制劑之基因的表達(dá)是可調(diào)制的；和(ii)在足以表達(dá)所述第一個(gè)核苷酸序列的條件下將所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間，其中所述第一個(gè)核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)物便于同源重組所述第二個(gè)核苷酸序列與所述第三個(gè)核苷酸序列。
另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生微生物的方法，所述微生物便于同源重組至少兩個(gè)核苷酸序列，所述方法包括對宿主細(xì)胞進(jìn)行基因操作，使其能表達(dá)recBCD，可調(diào)制水平的外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和編碼recBCD抑制劑的基因和所述至少兩個(gè)其它的核苷酸序列。
另一方面，本發(fā)明提供了便于同源重組至少兩個(gè)核苷酸序列的細(xì)胞，所述細(xì)胞含有編碼外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)的核苷酸序列和編碼recBCD抑制劑的基因，外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑的表達(dá)是可調(diào)制的，還含有編碼recBCD的核苷酸序列和所述至少兩個(gè)核苷酸序列。
另一方面，本發(fā)明提供了通過本發(fā)明方法同源重組的核酸分子。
另一方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其含有通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的經(jīng)修飾的核酸分子，以及一種或多種藥物可接受載體和/或稀釋劑。
另一方面，本發(fā)明涉及便于在宿主細(xì)胞中同源重組至少兩個(gè)核苷酸序列的試劑盒，所述試劑盒含有多個(gè)區(qū)室，其中適合包含任何一種或多種編碼外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)，recBCD抑制劑或其功能衍生物的核苷酸序列，和便于同源重組所用的試劑。還可包括其它區(qū)室，例如用于接受生物樣品，如任何一種或多種待重組的核苷酸序列，或已被一種或多種待重組的核苷酸序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明涉及便于在宿主細(xì)胞中同源重組至少兩個(gè)核苷酸序列的試劑盒，所述試劑盒含有多個(gè)區(qū)室，其中適合包含任何一種或多種外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)，recBCD抑制劑或其功能衍生物，和便于同源重組所用的試劑。還可包括其它區(qū)室，例如用于接受生物樣品，如任何一種或多種待重組的核苷酸序列，或已被一種或多種待重組的核苷酸序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
圖2圖示了pEBAC/148，該載體是通過將PAC克隆的185kb基因組片斷插入pEBAC140載體的NotI位點(diǎn)而產(chǎn)生的，其中所述克隆攜有完整的β-珠蛋白基因組區(qū)域。圖中示出了通過同源重組將卡那霉素抗性基因靶向整合至此克隆的位置和靶向整合至原始pEBAC140載體的位置。
圖3圖示了顯示出pGETrec質(zhì)粒主要特征的圖譜。將含有噬菌體λ的gam基因的PCR產(chǎn)物插入pBAD24-recET質(zhì)粒45，產(chǎn)生pGETrec。因此，gam基因與recE和recT基因一起處于阿拉伯糖啟動(dòng)子的控制之下。
圖4圖示了所用的寡核苷酸引物。通過用引物kan50F和kan50R擴(kuò)增pCYPAC2中的卡那霉素基因而產(chǎn)生PCRkan50(1262bp)。引物kan50F和kan50R還攜有50-聚體靶向區(qū)域，該區(qū)域與載體靶向序列上唯一的Bst1107I位點(diǎn)的側(cè)翼序列同源。將PCRkan50同源重組至pEBAC140載體之后，用引物KF和KR產(chǎn)生PCRkan140。在缺乏和存在卡那霉素基因時(shí)，用引物KF/KR得到的PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小分別為288bp和1450bp。用引物KA/KB得到的相應(yīng)PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小分別為393bp和1555bp。
圖5圖示了“GET重組”法，該方法可用于通過同源重組將PCR片斷整合至DH10B細(xì)胞內(nèi)的BAC/PAC中。PCR引物各被設(shè)計(jì)成攜有50-聚體區(qū)域，該區(qū)域與PAC或BAC中的靶向位點(diǎn)同源，所述引物的3’末端還含有特異性序列以擴(kuò)增具有選擇標(biāo)記的DNA片斷。也可包括其它序列或標(biāo)記。將通過這些引物產(chǎn)生的PCR片斷電穿孔至電感受態(tài)的DH10B細(xì)胞，所述細(xì)胞攜有所需的BAC或PAC克隆和pGETrec質(zhì)粒，在制備過程中用0.2％L-阿拉伯糖瞬時(shí)誘導(dǎo)所述細(xì)胞。PCR片斷的同源區(qū)域和BAC或PAC克隆之間的重組可以整合PCR片斷。通過分離微量DNA并電穿孔至DH10B細(xì)胞，或者通過在含抗生素的培養(yǎng)基上劃線，從pGETrec中純化經(jīng)修飾的BAC或PAC克隆。
圖6用照片顯示了對20個(gè)攜有pEBAC/148∷kan140的獨(dú)立CmrKmr菌落所作的PCR分析。將1微升各個(gè)CmrKmr菌落的過夜培養(yǎng)物加至用PCR引物KF和KR進(jìn)行的PCR反應(yīng)中。使用1.5％(w/v)瓊脂糖凝膠分辨PCR產(chǎn)物。泳道1和24，1-kb DNA梯標(biāo)準(zhǔn)；泳道2-21，20個(gè)獨(dú)立的CmrKmr菌落；泳道22，親代pEBAC/148克??；泳道23，陰性對照(無細(xì)胞)。
圖7用照片顯示了在通過同源重組將PCRkan140整合至pEBAC/148之后，對4個(gè)隨機(jī)挑選的CmrKmr菌落(A-D)所作的PFGE分析。將各個(gè)克隆的DNA重新電穿孔至DH10B細(xì)胞。使用雙份次生菌落微量提取DNA，用NotI或XhoI進(jìn)行限制性酶消化。
(a)NotI-消化M，低范圍PFG標(biāo)記；泳道1-8，雙份pEBAC/148∷kan140克??；P，親代pEBAC/148克隆。PFGE條件6V/cm，轉(zhuǎn)換時(shí)間為0.1-25.0秒，14℃，17小時(shí)。
(b)XhoI-消化M1，低范圍PFG標(biāo)記；泳道1-8，雙份pEBAC/148∷kan140克?。籔，親代pEBAC/148克隆；M2，中等范圍IPEG標(biāo)記。PFGE條件6V/cm，轉(zhuǎn)換時(shí)間為0.1-8.0秒，14℃，18小時(shí)。
因此，本發(fā)明提供了便于在至少兩個(gè)核苷酸序列之間進(jìn)行同源重組的方法，所述方法包括通過在足夠有利于同源重組至少兩個(gè)核苷酸序列的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，以在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)所述至少兩個(gè)核苷酸序列之間的重組，其中所述宿主細(xì)胞能表達(dá)recBCD和編碼外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑或其衍生物的核苷酸序列，外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑的表達(dá)是可調(diào)制的。
術(shù)語“外切核酸酶”應(yīng)被理解為指的是通過暴露雙鏈核酸序列上的單鏈區(qū)域而便于同源重組的分子，所述區(qū)域是實(shí)現(xiàn)此區(qū)域和另一個(gè)核酸序列的互補(bǔ)區(qū)域之間的重組所必需的。外切核酸酶適于與選定的重組蛋白質(zhì)一起使用。
適用于本發(fā)明的外切核酸酶的例子包括但不限于被稱為exo的Redλ重組系統(tǒng)外切核酸酶，和被稱為recE的recE/recT重組系統(tǒng)分子外切核酸酶，或其功能衍生物。優(yōu)選所述外切核酸酶是recE或其功能衍生物。術(shù)語“重組蛋白質(zhì)”應(yīng)被理解為指的是通過介導(dǎo)一個(gè)核酸序列的單鏈區(qū)域(如通過外切核酸酶產(chǎn)生的單鏈區(qū)域)和另一個(gè)核酸序列的互補(bǔ)區(qū)域之間的重組而便于同源重組的肽，多肽或蛋白質(zhì)。重組蛋白質(zhì)的例子包括但不限于Redλ重組蛋白質(zhì)bct和recE/recT重組蛋白質(zhì)recT或其功能衍生物。本文將編碼recE和recT的核苷酸序列分別稱為recE和recT。
因此，本發(fā)明更特別地提供了便于在至少兩個(gè)核苷酸序列之間進(jìn)行同源重組的方法，所述方法包括通過在足夠有利于同源重組至少兩個(gè)核苷酸序列的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，以在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)所述至少兩個(gè)核苷酸序列之間的重組，其中所述宿主細(xì)胞能表達(dá)recBCD，recE，recT和編碼recBCD抑制劑或其功能衍生物的核苷酸序列，recE，recT和編碼recBCD抑制劑的核苷酸序列的表達(dá)是可調(diào)制的。
術(shù)語“表達(dá)”指的是轉(zhuǎn)錄和翻譯核苷酸序列，導(dǎo)致肽，多肽或蛋白質(zhì)的合成。
術(shù)語“編碼recBCD抑制劑的基因”應(yīng)被理解為指的是一種核苷酸序列，其編碼的表達(dá)產(chǎn)物能抑制或充分下調(diào)recBCD核酶的活性，從而使線性DNA序列不會被此核酶降解，其同源重組得以發(fā)生。適用于本發(fā)明的recBCD抑制劑的例子包括但不限于gam，P22Aba蛋白質(zhì)或SSB蛋白質(zhì)或其功能衍生物。優(yōu)選所述recBCD抑制劑是gam。本文將編碼gam的核苷酸序列稱為gam。
根據(jù)此優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明提供了便于在至少兩個(gè)核苷酸序列之間進(jìn)行同源重組的方法，所述方法包括通過在足夠有利于同源重組至少兩個(gè)核苷酸序列的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，以在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)所述至少兩個(gè)核苷酸序列之間的重組，其中所述宿主細(xì)胞能表達(dá)recBCD，recE，recT和gam或其功能衍生物，recE，recT和gam的表達(dá)是可調(diào)制的。
術(shù)語“宿主細(xì)胞”應(yīng)被理解為指的是可被核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的任何原核或真核細(xì)胞。例如，本文希望的是適用于克隆和/或表達(dá)核苷酸序列的宿主細(xì)胞，例如可用于產(chǎn)生gDNA或cDNA文庫的宿主細(xì)胞，或者可用于克隆含有所需DNA序列插入物的載體的宿主細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，宿主細(xì)胞優(yōu)選為表達(dá)recBCD核酶(也稱之為“外切核酸酶V”)的細(xì)胞，所述核酶可特別地降解線性雙鏈DNA。宿主細(xì)胞可以因表達(dá)天然recBCD基因，或因用編碼recBCD的核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞而表達(dá)recBCD。
無需將本發(fā)明限制于任何一種理論或作用模式，本發(fā)明人已測定某些宿主細(xì)胞菌株對過量產(chǎn)生(如組成型產(chǎn)生)recBCD抑制劑和/或一種或多種同源重組系統(tǒng)分子敏感。“敏感”指的是宿主細(xì)胞以某種方式受損，例如降低其存活力或不合乎需要地調(diào)制其一個(gè)或多個(gè)功能活性。例如，已發(fā)現(xiàn)在DH10B宿主細(xì)胞中組成型產(chǎn)生recBCD抑制劑gam會產(chǎn)生毒性，即DH10B細(xì)胞的存活力降低。能調(diào)制和協(xié)同其中的重組系統(tǒng)分子和recBCD抑制劑表達(dá)的體內(nèi)重組系統(tǒng)的開發(fā)克服了此毒性問題。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是對組成型產(chǎn)生一種或多種recBCD抑制劑，外切核酸酶或重組蛋白質(zhì)敏感的宿主細(xì)胞。更優(yōu)選所述宿主細(xì)胞是DH10B或其突變體或其同系物。
本發(fā)明延及使用宿主細(xì)胞突變體和同系物。
根據(jù)此最優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明提供了便于在至少兩個(gè)核苷酸序列之間進(jìn)行同源重組的方法，所述方法包括通過在足夠有利于同源重組至少兩個(gè)核苷酸序列的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，以在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)所述至少兩個(gè)核苷酸序列之間的重組，其中所述宿主細(xì)胞能表達(dá)recBCD和編碼外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑或其衍生物的核苷酸序列，外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑的表達(dá)是可調(diào)制的。
更優(yōu)選所述外切核酸酶是recE，所述重組蛋白質(zhì)是recT，所述recBCD抑制劑是gam。
術(shù)語“至少兩個(gè)核苷酸序列”應(yīng)被理解為指的是欲通過本發(fā)明的方法進(jìn)行同源重組的任何兩個(gè)或多個(gè)核苷酸序列。所述核苷酸序列可以是獨(dú)立的核酸分子，如兩個(gè)環(huán)形載體(如兩個(gè)質(zhì)粒)，質(zhì)粒和線性DNA序列或染色體和線性DNA序列?；蛘?，核苷酸序列可以是單個(gè)核酸分子的兩個(gè)部分，例如在滾環(huán)復(fù)制過程中產(chǎn)生的單個(gè)核苷酸分子的線性和環(huán)形核苷酸序列部分。優(yōu)選核苷酸序列是環(huán)形核苷酸序列和線性核苷酸序列。在此上下文中，“環(huán)形”核苷酸序列應(yīng)被理解為指的是任何核苷酸分子的環(huán)形核苷酸序列部分。例如，環(huán)形核苷酸序列可以是完全環(huán)形，例如質(zhì)粒，或者也可以是部分環(huán)形，例如在滾環(huán)復(fù)制過程中產(chǎn)生的核苷酸分子的環(huán)形部分。在此上下文中，“環(huán)形”核苷酸序列相當(dāng)于該分子的環(huán)形部分。優(yōu)選環(huán)形核酸序列是BAC或PAC型人工染色體?！熬€性”核苷酸序列應(yīng)被理解為指的是基本上為線形的任何核苷酸序列。線性序列可以是線性核苷酸分子，或者是也含有非-線性部分(如環(huán)形部分)的核苷酸分子的線性部分。線性核苷酸序列的例子包括但不限于PCR產(chǎn)物，切割產(chǎn)物，合成的DNA或在滾環(huán)復(fù)制過程中產(chǎn)生的核苷酸分子的線性部分。線性核苷酸序列和環(huán)形核苷酸序列的重組可以在環(huán)形核苷酸序列中導(dǎo)入例如選擇標(biāo)記或特定的突變。應(yīng)理解本發(fā)明的同源重組可以在被導(dǎo)入細(xì)胞中的核苷酸序列之間發(fā)生，也可以在天然存在于細(xì)胞中的核苷酸序列與一個(gè)或多個(gè)導(dǎo)入的核苷酸序列之間發(fā)生。
因此，本發(fā)明提供了便于在環(huán)形核苷酸序列和線性核苷酸序列之間進(jìn)行同源重組的方法，所述方法包括通過在足夠有利于同源重組環(huán)形核苷酸序列和線性核苷酸序列的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，以在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)所述環(huán)形核苷酸序列和所述線性核苷酸序列之間的重組，其中所述宿主細(xì)胞能表達(dá)recBCD和編碼外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑或其衍生物的核苷酸序列，外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑的表達(dá)是可調(diào)制的。
優(yōu)選所述宿主細(xì)胞是DH10B細(xì)胞。更優(yōu)選所述外切核酸酶是recE，所述重組蛋白質(zhì)是recT，所述recBCD抑制劑是gam或其功能衍生物。
根據(jù)此優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明提供了便于在環(huán)形核苷酸序列和線性核苷酸序列之間進(jìn)行同源重組的方法，所述方法包括通過在足夠有利于同源重組環(huán)形核苷酸序列和線性核苷酸序列的條件下培養(yǎng)DH10B細(xì)胞或其同系物或其突變體，以在DH10B細(xì)胞或其同系物或其突變體中誘導(dǎo)所述環(huán)形核苷酸序列和所述線性核苷酸序列之間的重組，其中所述DH10B細(xì)胞或其同系物或其突變體能表達(dá)recBCD，recE，recT和gam或其功能衍生物，recE，recT和gam的表達(dá)是可調(diào)制的。
本發(fā)明的核酸序列優(yōu)選得自人類基因組，但本發(fā)明中也包括非人動(dòng)物和植物的基因組和核苷酸序列。本發(fā)明中包括的非人動(dòng)物包括靈長類動(dòng)物，家畜(如綿羊，奶牛，豬，山羊，馬，驢)，實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)動(dòng)物(如小鼠，大鼠，豚鼠，倉鼠，兔)，寵物(如狗，貓)，鳥類(如雞，鵝，鴨和其它家禽，可捕獵的鳥，鴯鹋，鴕鳥)和看養(yǎng)的野生或馴化動(dòng)物(如狐貍，大袋鼠，澳州野狗)。
本發(fā)明人已測定本發(fā)明的同源重組系統(tǒng)適于重組至少兩個(gè)核苷酸序列，其中至少一個(gè)所述核苷酸序列含有F-質(zhì)粒部分。“含有”F-質(zhì)粒部分的核苷酸序列應(yīng)被理解為指的是與全部或部分F-質(zhì)粒融合，結(jié)合或要不然相連接的核苷酸序列。例如，所需核苷酸序列可位于載體內(nèi)，所述載體的骨架含有對應(yīng)于全部或部分F-質(zhì)粒的序列。例如，基于F-質(zhì)粒的BAC含有所需基因組序列，該序列位于表達(dá)野生型F-質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)和編碼parA，parB和parC的核苷酸序列的載體中。
因此，在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了便于在至少兩個(gè)核苷酸序列之間進(jìn)行同源重組的方法，其中至少一個(gè)所述核苷酸序列含有F-質(zhì)粒部分，所述方法包括通過在足夠有利于同源重組至少兩個(gè)核苷酸序列的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，以在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)所述至少兩個(gè)核苷酸序列之間的重組，其中所述宿主細(xì)胞能表達(dá)recBCD和編碼外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑或其衍生物的核苷酸序列，外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑的表達(dá)是可調(diào)制的。
優(yōu)選含有F-質(zhì)粒部分的所述核苷酸序列是BAC。
更優(yōu)選所述宿主細(xì)胞是DH10B或其突變體或其同系物。
BAC/PAC克隆系統(tǒng)便于經(jīng)由大基因組片斷的基因轉(zhuǎn)移來研究哺乳動(dòng)物基因組，所述片斷顯示出正確的時(shí)間和組織-特異性基因表達(dá)。因此，大-插入物BAC/PAC克隆系統(tǒng)已被廣泛用于長-范圍的物理圖譜繪制，疾病基因的定位克隆，整個(gè)基因組測序計(jì)劃和功能研究。因此，已產(chǎn)生了人基因組DNA以及其它動(dòng)物和植物(包括狒狒，犬，牛，綿羊，山羊和水稻)基因組DNA的BAC/PAC大腸桿菌文庫。在已被詳盡-定義的重組-缺損的大腸桿菌菌株DH10B中，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)一般可維持1-2拷貝的BAC/PAC。由于人們對通過導(dǎo)入線性DNA區(qū)段來修飾BAC和PAC很感興趣，因此，本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案涉及經(jīng)由將線性DNA區(qū)段同源重組至BAC或PAC來修飾BAC或PAC。
根據(jù)此最優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明提供了便于在BAC和線性核苷酸序列之間進(jìn)行同源重組的方法，所述方法包括通過在足夠有利于同源重組BAC和線性核苷酸序列的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，以在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)所述BAC和所述線性核苷酸序列之間的重組，其中所述宿主細(xì)胞能表達(dá)recBCD和編碼外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑或其衍生物的核苷酸序列，外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑的表達(dá)是可調(diào)制的。
優(yōu)選所述宿主細(xì)胞是DH10B細(xì)胞或其突變體或其同系物。更優(yōu)選所述外切核酸酶是recE，所述重組蛋白質(zhì)是recT，所述recBCD抑制劑是gam。
在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了便于在PAC和線性核苷酸序列之間進(jìn)行同源重組的方法，所述方法包括通過在足夠有利于同源重組PAC和線性核苷酸序列的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，以在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)所述PAC和所述線性核苷酸序列之間的重組，其中所述宿主細(xì)胞能表達(dá)recBCD和編碼外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑或其衍生物的核苷酸序列，外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑的表達(dá)是可調(diào)制的。
優(yōu)選所述宿主細(xì)胞是DH10B細(xì)胞或其突變體或其同系物。更優(yōu)選所述外切核酸酶是recE，所述重組蛋白質(zhì)是recT，所述recBCD抑制劑是gam。
本發(fā)明的方法包括用任何一種或多種recBCD，編碼外切核酸酶和重組蛋白質(zhì)的核苷酸序列，編碼recBCD抑制劑的核苷酸序列和至少兩個(gè)核苷酸序列轉(zhuǎn)化本發(fā)明的宿主細(xì)胞。至于需要將多少上述分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞以便于操作本發(fā)明的方法，這取決于所涉及的特定用途。例如，關(guān)于例舉的recE/recT重組系統(tǒng)，需要使用得自商購BAC或PACDH10B文庫的宿主細(xì)胞群體。通過將BAC或PAC分子與線性核苷酸序列重組，可以修飾BAC或PAC分子，所述核苷酸序列是用編碼recE，recT和gam的核酸分子轉(zhuǎn)化之后而導(dǎo)入商購DH10B文庫克隆的。DH10B細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)recBCD。或者，當(dāng)使用已經(jīng)表達(dá)recBCD，recE，recT和編碼recBCD抑制劑的核苷酸序列的宿主細(xì)胞時(shí)，僅需要用待同源重組的核苷酸序列和宿主細(xì)胞中不存在的核苷酸序列轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。這些宿主細(xì)胞可表達(dá)recBCD，recE，recT和編碼recBCD抑制劑的核苷酸序列，其原因是細(xì)胞經(jīng)改造后能表達(dá)任何一種或多種這些分子，或者細(xì)胞能內(nèi)源性表達(dá)這些分子。
根據(jù)本發(fā)明的方法，外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑的表達(dá)是可調(diào)制的。這樣就可以瞬時(shí)和協(xié)同表達(dá)這些蛋白質(zhì)?！翱烧{(diào)制的”指的是編碼這些蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)可以在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平上被上調(diào)或下調(diào)。通過多種技術(shù)中的任何一種可以實(shí)現(xiàn)調(diào)制，所述技術(shù)包括但不限于調(diào)節(jié)啟動(dòng)子表達(dá)或調(diào)節(jié)甲基化。例如，如本文所例舉，用可誘導(dǎo)的表達(dá)質(zhì)粒pGETrec轉(zhuǎn)染被BAC核酸分子轉(zhuǎn)化的DH10B細(xì)胞，pGETrec含有處于可誘導(dǎo)的L-阿拉伯糖啟動(dòng)子控制之下的，編碼recE，recT和gam的核酸分子。通過在L-阿拉伯糖的存在下培養(yǎng)這些細(xì)胞，可以誘導(dǎo)pGETrec質(zhì)粒的表達(dá)。隨后，將雙鏈線性DNA(如PCRkan140)電穿孔至這些細(xì)胞，導(dǎo)致PCRkan140和pEBAC140的同源重組，之所以能發(fā)生同源重組是因?yàn)檫\(yùn)行了recE/recT同源重組系統(tǒng)，同時(shí)還通過gam表達(dá)產(chǎn)物抑制了recBCD核酶活性。一旦完成了同源重組，可從富含L-阿拉伯糖的培養(yǎng)基中提取受試的DH10B細(xì)胞，籍此下調(diào)pGETrec質(zhì)粒的表達(dá)。這樣就可以關(guān)閉recE/recT同源重組途徑的活性。
盡管本發(fā)明所舉的例子是將單個(gè)質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞，所述質(zhì)粒含有處于可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制之下的核酸序列recE，recT和gam(即編碼recE，recT和gam的核酸分子與共有的啟動(dòng)子可操作相連)，但應(yīng)理解本發(fā)明的方法可以延伸為使用兩個(gè)或多個(gè)獨(dú)立含有recE，recT和gam的載體。然而，為了協(xié)同地同時(shí)表達(dá)recE，recT和gam，需要通過例如，利用對recE，recT和gam中的每一個(gè)而言都相同的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，來確保同時(shí)誘導(dǎo)recE，recT和gam的表達(dá)。因此，recE/recT同源重組系統(tǒng)具有功能活性，同時(shí)recBCD核酶活性受到gam的抑制。
術(shù)語“便于”同源重組應(yīng)被理解為指的是誘導(dǎo)，增強(qiáng)或要不然作用于同源重組系統(tǒng)的功能操作。例如，recE和recT表達(dá)產(chǎn)物誘導(dǎo)基于recE/recT的重組，而gam表達(dá)產(chǎn)物抑制recBCD核酶活性，所述核酶能降解線性DNA，從而防止其重組。
無需將本發(fā)明限制于任何一種理論或作用模式，pGETrec可以在大腸桿菌DH10B細(xì)胞中與BAC/PAC穩(wěn)定共存。利用pGETrec，可以在線性核酸片段和靶環(huán)形核酸分子之間進(jìn)行高效同源重組。當(dāng)同源長度由50bp增長為140bp時(shí)，同源重組的效力得以改善。另外，據(jù)認(rèn)為通過使用靶同源區(qū)域中的非-鄰接序列可以使與BAC/PAC同源重組的效力顯著增加。
本發(fā)明應(yīng)被理解為可以延伸至通過將便于同源重組的蛋白質(zhì)或其功能衍生物導(dǎo)入宿主細(xì)胞，而不是將誘導(dǎo)表達(dá)這些蛋白質(zhì)的核酸分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞，而在體內(nèi)誘導(dǎo)同源重組。例如，設(shè)想將recE，recT和gam蛋白或其功能衍生物與身為重組主體的核苷酸序列一起協(xié)同導(dǎo)入宿主細(xì)胞。還設(shè)想了實(shí)施本發(fā)明的方法，其中在宿主細(xì)胞中表達(dá)一些同源重組系統(tǒng)蛋白質(zhì)，而將其余的以蛋白質(zhì)的形式導(dǎo)入細(xì)胞。例如，設(shè)想在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)recE和recT或其功能衍生物，并且同時(shí)協(xié)同導(dǎo)入gam蛋白。本發(fā)明的此方面應(yīng)被理解為延伸至傳遞任何一種或多種外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)或recBCD抑制劑或其功能衍生物。
“衍生物”包括天然，合成或重組來源的片段，部分，化學(xué)等同物，突變體，同系物，類似物，模擬物，包括融合蛋白?？梢杂砂被岵迦?，缺失或取代得到衍生物。氨基酸插入衍生物包括氨基和/或羧基末端融合物，以及序列內(nèi)插入單個(gè)或多個(gè)氨基酸。插入氨基酸序列變體是在蛋白質(zhì)的預(yù)定位點(diǎn)導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而獲得的，但隨機(jī)插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，并且適當(dāng)篩選所得產(chǎn)物也是可以的。缺失變體的特征在于從序列中除去了一個(gè)或多個(gè)氨基酸。取代氨基酸變體是除去序列中的至少一個(gè)殘基，并在該位置插入不同殘基而獲得的。氨基酸序列的添加包括與其它肽，多肽或蛋白質(zhì)融合。
所述核苷酸序列和表達(dá)產(chǎn)物(被稱為“組分”)的衍生物包括具有特定表位的片段，或與肽，多肽或其它蛋白質(zhì)或非-蛋白質(zhì)分子融合的完整組分的部分。例如，所述組分或其衍生物可以與便于其進(jìn)入細(xì)胞的分子融合。本文期望所述組分的類似物包括但不限于對側(cè)鏈的修飾，在合成肽，多肽或蛋白質(zhì)的過程中摻入非天然氨基酸和/或其衍生物，使用交聯(lián)劑和其它對蛋白質(zhì)分子或其類似物施加構(gòu)象限制的方法。類似地，核酸序列的衍生物可得自單個(gè)或多個(gè)核苷酸取代，缺失和/或添加，包括與其它核酸分子融合。本發(fā)明的核酸分子的衍生物包括寡核苷酸，PCR引物，反義分子，適用于共抑制和融合核酸分子的分子。
本發(fā)明所期望的側(cè)鏈修飾的例子包括通過例如與醛反應(yīng)，接著用NaBH4還原以進(jìn)行還原烷基化來修飾氨基；用甲基乙酰亞胺(methylacetimidate)脒化；用乙酸酐酰化；用氰酸鹽甲氨?；被?；用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)使氨基三硝基苯化；用琥珀酸酐和四氫化鄰苯二甲酸酐使氨基?；?；和用吡哆醛-5-磷酸吡哆醛化賴氨酸，接著用NaBH4還原。
可通過與諸如2，3-丁二酮，苯基乙二醛和乙二醛的試劑形成雜環(huán)縮合物來修飾精氨酸殘基的胍基。
經(jīng)過形成O-酰基異脲激活碳二亞胺，接著衍生化為例如相應(yīng)的酰胺即可修飾羧基。
通過下列方法可修飾sulphydryl基團(tuán)，所述方法如用碘乙酸或碘乙酰胺羧甲基化；將過甲酸氧化為磺基丙氨酸；與其它硫醇類化合物形成混合disulphide；與馬來酰亞胺，馬來酐或其它取代的馬來酰亞胺反應(yīng)；使用4-氯汞苯甲酸，4-氯汞苯磺酸，苯基氯化汞，2-氯汞-4-硝基苯酚和其它汞化合物形成汞化合物的衍生物；在堿性pH下用用氰酸鹽甲氨?；?br> 通過例如用N-溴琥珀酰亞胺氧化或用2-羥基-5-硝基芐基溴或sulphenyl鹵化物烷基化吲哚環(huán)即可修飾色氨酸殘基。另一方面，可通過用四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生物來改變酪氨酸殘基。
通過用碘乙酸衍生物烷基化或用二乙基焦碳酸N-碳乙氧化即可修飾組氨酸殘基的咪唑環(huán)。
在合成蛋白質(zhì)的過程中摻入的非天然氨基酸和衍生物的例子包括但不限于使用正亮氨酸，4-氨基丁酸，4-氨基-3-羥基-5-苯基戊酸，6-氨基己酸，t-丁基甘氨酸，正纈氨酸，苯基甘氨酸，鳥氨酸，肌氨酸，4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸，2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-異構(gòu)體。表1示出了本文所希望的非天然氨基酸。表1非常規(guī)氨基酸 代碼 非常規(guī)氨基酸 代碼α-氨基丁酸Abu L-N-甲基丙氨酸Nmalaα-氨基-α-甲基Mgabu L-N-甲基精氨酸Nmarg丁酸氨基環(huán)丙烷甲 Cpro L-N-甲基精氨酸Nmasn酸L-N-甲基天冬氨酸 Nmasp氨基異丁酸 Aib L-N-甲基半胱氨酸 Nmcys氨基正冰片基 Norb L-N-甲基谷氨酰胺 Nmgln羧酸L-N-甲基谷氨酸Nmglu環(huán)己基丙氨酸 Chexa L-N-甲基組氨酸Nmhis環(huán)戊基丙氨酸 Cpen L-N-甲基異亮氨酸 NmileD-丙氨酸 Dal L-N-甲基亮氨酸NmleuD-精氨酸 Darg L-N-甲基賴氨酸NmlysD-天冬氨酸 Dasp L-N-甲基甲硫氨酸 NmmetD-半胱氨酸 Dcys L-N-甲基正亮氨酸 NmnleD-谷氨酰胺 Dgln L-N-甲基正纈氨酸 NmnvaD-谷氨酸 Dglu L-N-甲基鳥氨酸NmornD-組氨酸 Dhis L-N-甲基苯丙氨酸 NmpheD-異亮氨酸 Dile L-N-甲基脯氨酸NmproD-亮氨酸 Dleu L-N-甲基絲氨酸NmserD-賴氨酸 Dlys L-N-甲基蘇氨酸NmthrD-甲硫氨酸 Dmet L-N-甲基色氨酸NmtrpD-鳥氨酸 Dorn L-N-甲基酪氨酸NmtyrD-苯丙氨酸 Dphe L-N-甲基纈氨酸NmvalD-脯氨酸 Dpro L-N-甲基乙基甘氨 Nmetg
酸D-絲氨酸 Dser L-N-甲基-t-丁基 Nmtbug甘氨酸D-蘇氨酸 Dthr L-正亮氨酸NleD-色氨酸 Dtrp L-正纈氨酸NvaD-酪氨酸 Dtyr α-甲基-氨基異丁 Maib酸D-纈氨酸 Dval α-甲基-γ-氨基丁 Mgabu酸D-α-甲基丙氨 Dmalaα-甲基環(huán)己基丙氨 Mchexa酸 酸D-α-甲基精氨 Dmargα-甲基環(huán)戊基丙氨 Mcpen酸 酸D-α-甲基天冬 Dmasnα-甲基-α-萘基丙 Manap酰胺 氨酸D-α-甲基天冬 Dmaspα-甲基青霉胺 Mpen氨酸D-α-甲基半胱 DmcysN-(4-氨基丁基)甘Nglu氨酸 氨酸D-α-甲基谷氨 DmglnN-(2-氨基乙基)甘Naeg酰胺 氨酸D-α-甲基組氨 DmhisN-(3-氨基丙基)甘 Norn酸 氨酸D-α-甲基異亮 DmileN-氨基-α-甲基丁 Nmaabu氨酸酸D-α-甲基亮氨 Dmleuα-萘基丙氨酸 Anap酸D-α-甲基賴氨Dmlys N-芐基甘氨酸 Nphe酸D-α-甲基甲硫DmmetN-(2-氨甲?；? Ngln氨酸 基)甘氨酸D-α-甲基鳥氨DmornN-(氨甲酰基甲基) Nasn酸甘氨酸D-α-甲基苯丙DmpheN-(2-羧乙基)甘氨 Nglu氨酸 酸D-α-甲基脯氨DmproN-(羧甲基)甘氨酸 Nasp酸D-α-甲基絲氨DmserN-環(huán)丁基甘氨酸 Ncbut酸D-α-甲基蘇氨DmthrN-環(huán)庚基甘氨酸 Nchep酸D-α-甲基色氨DmtrpN-環(huán)己基甘氨酸 Nchex酸D-α-甲基酪氨Dmty N-環(huán)癸基甘氨酸 Ncdec酸D-α-甲基纈氨DmvalN-環(huán)十二烷基甘氨 Ncdod酸酸D-N-甲基丙氨 DnmalaN-環(huán)辛基甘氨酸 Ncoct酸D-N-甲基精氨 DnmargN-環(huán)丙基甘氨酸 Ncpro酸D-N-甲基天冬 DnmasnN-環(huán)十一烷基甘氨Ncund酰胺 酸D-N-甲基天冬 DnmaspN-(2，2-二苯基乙Nbhm氨酸 基)甘氨酸D-N-甲基半胱 DnmcysN-(3，3-二苯基丙Nbhe氨酸 基)甘氨酸D-N-甲基谷氨 DnmglnN-(3-胍基丙基)甘Narg酰胺 氨酸D-N-甲基谷氨DnmgluN-(1-羥基乙基)甘 Nthr酸氨酸D-N-甲基組氨DnmhisN-(羥基乙基)甘氨 Nser酸酸D-N-甲基異亮DnmileN-(咪唑基乙基)甘 Nhis氨酸 氨酸D-N-甲基亮氨DnmleuN-(3-吲哚基乙基) Nhtrp酸甘氨酸D-N-甲基賴氨DnmlysN-甲基-γ-氨基丁 Nmgabu酸酸N-甲基環(huán)己基Nmchexa D-N-甲基甲硫氨酸 Dnmmet丙氨酸D-N-甲基鳥氨DnmornN-甲基環(huán)戊基甘氨 Nmcpen酸酸N-甲基甘氨酸Nala D-N-甲基苯丙氨酸 DnmpheN-甲基氨基異Nmaib D-N-甲基脯氨酸Dnmpro丁酸N-(1-甲基丙 Nile D-N-甲基絲氨酸 Dnmser基)甘氨酸N-(2-甲基丙 Nleu D-N-甲基蘇氨酸 Dnmthr基)甘氨酸D-N-甲基色氨DnmtrpN-(1-甲基乙基)甘 Nval酸氨酸D-N-甲基酪氨DnmtyrN-甲基-萘基甘氨 Nmanap酸酸D-N-甲基纈氨DnmvalN-甲基青霉胺 Nmpen酸γ-氨基丁酸 GabuN-(p-羥基苯基)甘Nhtyr氨酸L-t-丁基甘氨 Tbug N-(硫代甲基)甘氨 Ncys酸 酸L-乙基甘氨酸 Etg青霉胺PenL-同苯丙氨酸 Hphe L-α-甲基丙氨酸 MalaL-α-甲基精氨Marg L-α-甲基天冬酰胺 Masn酸L-α-甲基天冬Masp L-α-甲基-t-丁基 Mtbug氨酸甘氨酸L-α-甲基半胱Mcys L-甲基乙基甘氨酸 Metg氨酸L-α-甲基谷氨Mgln L-α-甲基谷氨酸 Mglu酰胺L-α-甲基組氨Mhis L-α-甲基同苯丙氨 Mhphe酸 酸L-α-甲基異亮Mile N-(2-甲基硫代 Nmet氨酸基)甘氨酸L-α-甲基亮氨Mleu L-α-甲基賴氨酸 Mlys酸L-α-甲基甲硫Mmet L-α-甲基正亮氨酸 Mnle氨酸L-α-甲基正纈Mnva L-α-甲基鳥氨酸 Morn氨酸L-α-甲基苯丙Mphe L-α-甲基脯氨酸 Mpro氨酸L-α-甲基絲氨Mser L-α-甲基蘇氨酸 Mthr酸L-α-甲基色氨Mtrp L-α-甲基酪氨酸 Mtyr酸L-α-甲基纈氨Mval L-N-甲基同苯丙氨 Nmhphe酸酸N-(N-(2，2-二NnbhmN-(N-(3，3-二苯基Nnbhe苯基乙基)氨甲 丙基)氨甲?；柞；谆?甘氨 基)甘氨酸酸1-羧基-1-Nmbc(2，2-二苯基乙基氨基)環(huán)丙烷可以使用交聯(lián)劑來穩(wěn)定化3D構(gòu)象，例如可使用同-雙功能交聯(lián)劑，如具有(CH2)n(n＝1至n＝6)間隔基的雙功能亞氨酸酯，戊二醛，N-羥基琥珀酰亞胺酯和異-雙功能試劑，所述試劑通常含有氨基-反應(yīng)性組成成分，如N-羥基琥珀酰亞胺和另一個(gè)基團(tuán)特異性-反應(yīng)性組成成分，如馬來酰亞胺或二硫代組成成分(SH)或碳二亞胺(COOH)。另外，可以通過以下方法限制肽的構(gòu)象，例如摻入Cα和Nα-甲基氨基酸，在氨基酸的Cα和Cβ原子之間導(dǎo)入雙鍵，通過導(dǎo)入共價(jià)鍵，例如在N和C末端之間，兩個(gè)側(cè)鏈之間或側(cè)鏈和N或C末端之間形成酰胺鍵，而形成環(huán)形肽或類似物。
本發(fā)明的方法可用作簡單而有效的技術(shù)，在諸如BAC或PAC的環(huán)形DNA克隆的任何位置處導(dǎo)入任何所需的修飾，而不會引起不必要的重排。例如，可使用該方法進(jìn)行修飾，如導(dǎo)入選擇標(biāo)記或能導(dǎo)致人病理學(xué)的特定突變。本發(fā)明的方法使得將克隆的環(huán)形DNA分子(如BAC/PAC)轉(zhuǎn)移至其它大腸桿菌菌株以進(jìn)行同源重組的需要減少。同時(shí)也減少了產(chǎn)生特定穿梭載體的需要。該方法足夠簡單，使得可以對任何單個(gè)克隆重復(fù)使用該方法以形成復(fù)雜的變化?？梢詫υ摲椒ㄟM(jìn)行修飾以將報(bào)道基因或任何其它所需序列包括在環(huán)形核酸分子中。
產(chǎn)生特異性突變的準(zhǔn)確細(xì)胞和動(dòng)物模型必需最小程度地干擾正常的基因結(jié)構(gòu)?？梢允褂帽景l(fā)明的重組方法，以兩-步法導(dǎo)入對基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行改變的特異性突變。首先，在靶位點(diǎn)導(dǎo)入攜有四環(huán)素的PCR產(chǎn)物，或?qū)牒信c第二個(gè)反-選擇標(biāo)記(如ccdB，sacB)相連接的抗生素選擇標(biāo)記的盒，隨后，在第二步中，用僅攜有所需修飾的基因組片斷精確敲除第一步的導(dǎo)入物。通過反選擇已失去四環(huán)素基因或第二個(gè)選擇標(biāo)記的克隆，可以容易地獲得正確的產(chǎn)物33，39，43。根據(jù)環(huán)形DNA分子中整合的靶位點(diǎn)，這些方法可以使很敏感的檢測系統(tǒng)能監(jiān)測多種序列元件和突變對基因轉(zhuǎn)錄，剪接和由完整功能性基因座表達(dá)的組織和發(fā)育特異性的影響。這些技術(shù)便于開發(fā)目的在于以增加的組織和基因座特異性改變基因表達(dá)的藥學(xué)方法，以及將人類人工染色體開發(fā)成為緩解或治愈多種人類遺傳疾病的工具。產(chǎn)生具有正常和突變功能性基因座的精確動(dòng)物模型也有利于基因治療方法，所述基因治療方法包括基因補(bǔ)加或校正突變基因座。
本發(fā)明的另一方面提供了便于在宿主細(xì)胞中同源重組至少兩個(gè)核苷酸序列的方法，所述方法包括步驟(i)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞含有第一個(gè)核苷酸序列和所述至少兩個(gè)核苷酸序列，其中第一個(gè)核苷酸序列編碼外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑或其功能衍生物，而外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和編碼recBCD抑制劑之基因的表達(dá)是可調(diào)制的；和(ii)在足以表達(dá)所述第一個(gè)核苷酸序列的條件下將所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間，其中所述第一個(gè)核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)物便于同源重組所述第二個(gè)核苷酸序列與所述第三個(gè)核苷酸序列。
優(yōu)選所述外切核酸酶是recE，所述重組蛋白質(zhì)是recT，所述編碼recBCD抑制劑的基因是gam。
更優(yōu)選所述至少兩個(gè)核苷酸序列是含有F-質(zhì)粒部分的核苷酸序列和線性核苷酸序列。更優(yōu)選所述含有F-質(zhì)粒部分的核苷酸序列是BAC。
最優(yōu)選所述宿主細(xì)胞是DH10B或其突變體或其同系物。
另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生微生物的方法，所述微生物便于同源重組至少兩個(gè)核苷酸序列，所述方法包括對宿主細(xì)胞進(jìn)行基因操作，使其能表達(dá)recBCD，可調(diào)制水平的外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和編碼recBCD抑制劑的基因和所述至少兩個(gè)其它的核苷酸序列。
優(yōu)選所述外切核酸酶是recE，所述重組蛋白質(zhì)是recT，所述編碼recBCD抑制劑的基因是gam。
更優(yōu)選所述至少兩個(gè)核苷酸序列是含有F-質(zhì)粒部分的核苷酸序列和線性核苷酸序列。更優(yōu)選所述含有F-質(zhì)粒部分的環(huán)形核苷酸序列是BAC。
更優(yōu)選所述宿主細(xì)胞是DH10B或其突變體或其同系物。
另一方面，本發(fā)明提供了便于同源重組至少兩個(gè)核苷酸序列的細(xì)胞，所述細(xì)胞含有編碼外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)的核苷酸序列和編碼recBCD抑制劑的基因，其中外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑的表達(dá)是可調(diào)制的，所述細(xì)胞還含有編碼recBCD的核苷酸序列和所述至少兩個(gè)核苷酸序列。
優(yōu)選所述外切核酸酶是recE，所述重組蛋白質(zhì)是recT，所述編碼recBCD抑制劑的基因是gam。
更優(yōu)選所述至少兩個(gè)核苷酸序列是含有F-質(zhì)粒部分的核苷酸序列和線性核苷酸序列。更優(yōu)選所述含有F-質(zhì)粒部分的核苷酸序列是BAC。
更優(yōu)選所述宿主細(xì)胞是DH10B或其突變體或其同系物。
另一方面，本發(fā)明提供了通過本發(fā)明方法同源重組的核酸分子。
優(yōu)選所述經(jīng)修飾的核酸分子是經(jīng)修飾的BAC或經(jīng)修飾的PAC。
本發(fā)明還延伸至所述經(jīng)修飾的核酸分子用于治療和/或診斷患者的用途。治療方法包括基因治療方案。本發(fā)明還延伸至必需所述經(jīng)修飾的核酸分子的篩選方法。
因此，另一方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其含有通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的經(jīng)修飾的核酸分子，以及一種或多種藥物可接受載體和/或稀釋劑。
在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了表達(dá)載體，其含有基本上如圖3所示的基因構(gòu)建體或其功能衍生物。
另一方面，本發(fā)明涉及便于在宿主細(xì)胞中同源重組至少兩個(gè)核苷酸序列的試劑盒，所述試劑盒含有多個(gè)區(qū)室，其中適合包含任何一種或多種編碼外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)，recBCD抑制劑或其功能衍生物的核苷酸序列，和便于同源重組所用的試劑。還可包括其它區(qū)室，例如用于接受生物樣品，如任何一種或多種待重組的核苷酸序列，或已被一種或多種待重組的核苷酸序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明涉及便于在宿主細(xì)胞中同源重組至少兩個(gè)核苷酸序列的試劑盒，所述試劑盒含有多個(gè)區(qū)室，其中適合包含任何一種或多種外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)，recBCD抑制劑或其功能衍生物，和便于同源重組所用的試劑。還可包括其它區(qū)室，例如用于接受生物樣品，如任何一種或多種待重組的核苷酸序列，或已被一種或多種待重組的核苷酸序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明此方面的試劑盒應(yīng)被理解為延伸至含有編碼一種或多種重組系統(tǒng)蛋白質(zhì)的核苷酸序列組合或重組系統(tǒng)蛋白質(zhì)自身組合的試劑盒。
在下列非-限制性的圖和/或?qū)嵤├懈暾孛枋隽吮景l(fā)明的其它特征。然而，應(yīng)理解包括這種詳細(xì)的描述僅是為了舉例說明本發(fā)明。
將pBAD24-recET質(zhì)粒電穿孔至DH10B(pEBAC140)細(xì)胞，所述質(zhì)粒攜有處于誘導(dǎo)型阿拉伯糖啟動(dòng)子控制之下的recE和recT基因，在氨芐青霉素和氯霉素培養(yǎng)基上選擇攜有兩種質(zhì)粒的克隆。使用攜有兩種質(zhì)粒的單個(gè)菌落DH10B(pBAD24-recET，pEBAC140)在培養(yǎng)細(xì)胞的過程中用L-阿拉伯糖誘導(dǎo)來制備電感受態(tài)細(xì)胞。將PCRkan50電穿孔至這些細(xì)胞之后仍未得到CmrKmr重組克隆。
將攜有g(shù)am基因的PCR片段插入pBAD24-recET質(zhì)粒，產(chǎn)生質(zhì)粒pGETrec(圖3)。將gam基因置于與recE和recT基因相同的L-阿拉伯糖-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制之下，以協(xié)同誘導(dǎo)recE途徑和抑制正在產(chǎn)生的線性dsDNA上的recBCD核酶活性。將可誘導(dǎo)的表達(dá)質(zhì)粒pGETrec導(dǎo)入已攜有pEBAC140的電感受態(tài)DH10B細(xì)胞。除了在開始接種細(xì)胞時(shí)在生長培養(yǎng)基中加入L-阿拉伯糖以外，用標(biāo)準(zhǔn)方法制備攜有兩種質(zhì)粒的電感受態(tài)細(xì)胞DH10B(pGETrec，pEBAC140)。將PCRkan140電穿孔至這些細(xì)胞，從兩次獨(dú)立的電穿孔中，各得到將近300個(gè)重組子(表1，實(shí)驗(yàn)1，2)。用XhoI或HindIII進(jìn)行限制性酶消化，對12個(gè)隨機(jī)挑選的重組子進(jìn)行PCR分析，結(jié)果表明每一個(gè)CmrKmr重組子都已將PCRkan140同源重組至pEBAC140上的正確靶位點(diǎn)，而沒有任何不必要重排的跡象。對側(cè)翼于卡那霉素基因的同源區(qū)域進(jìn)行的DNA測序證實(shí)了這一點(diǎn)。盡管在氯霉素/卡那霉素培養(yǎng)基上培養(yǎng)這些重組子的過程中，沒有對pGETrec質(zhì)粒進(jìn)行選擇，但在不同的克隆中，可變量的此多拷貝質(zhì)粒與單個(gè)拷貝的pEBAC140∷kan140質(zhì)粒共存。
通過對過夜培養(yǎng)基直接進(jìn)行PCR來分析20個(gè)獨(dú)立的CmrKmr菌落。設(shè)計(jì)引物140KA和140KB以由pEBAC/148∷kan140產(chǎn)生1555bp產(chǎn)物。所分析的所有20個(gè)CmrKmr菌落都產(chǎn)生了預(yù)期的PCR產(chǎn)物(圖6)。將親代pEBAC/148克隆用作對照。對照PCR由pEBAC/148產(chǎn)生預(yù)期的393bp片段。重組克隆無一產(chǎn)生此片段，如果PCRkan140的整合發(fā)生在細(xì)菌染色體的任何其它位置，應(yīng)該也能檢測到此片段。因此，PCR分析表明重組事件精確發(fā)生在20個(gè)獨(dú)立克隆的每一個(gè)中。
從6個(gè)這些CmrKmr菌落中分離DNA。同時(shí)回收大的和可變量的多拷貝pGETrec質(zhì)粒以及單拷貝的pEBAC/148∷kan140 BAC，BAC的限制性消化妨礙了該過程。將得自4個(gè)克隆的1微升DNA重新-電穿孔至DH10B細(xì)胞，導(dǎo)致每個(gè)克隆產(chǎn)生很多獨(dú)立的次生CmrKmr菌落。從每個(gè)原始克隆的2個(gè)獨(dú)立次生克隆中分離DNA，用NotI或XhoI消化之后通過脈沖場凝膠電泳進(jìn)行分析(圖7)。所有8個(gè)次生克隆僅含有大BAC，這表明在這些克隆中，卡那霉素抗性標(biāo)記已是pEBAC/148的整合部分。NotI消化(圖7a)顯示出所有8個(gè)次生克隆釋放出預(yù)期的185kb β-珠蛋白插入物，不會產(chǎn)生任何顯著的重排。相對于親代克隆pEBAC/148經(jīng)NotI-消化的載體帶而言，所有8個(gè)克隆經(jīng)NotI-消化的載體帶的大小也有微弱但明顯的增加，相當(dāng)于PCRkan140整合至其靶位點(diǎn)之后，載體帶大小的預(yù)期改變。用XhoI限制性消化之后，進(jìn)一步分析這8個(gè)克隆(圖7b)。除了僅在親代pEBAC/148克隆中觀察到的約70kb片段外，所有克隆都顯示出與對照親代pEBAC/148克隆相同的限制性片段。在8個(gè)次生克隆中，70kb的片段似乎被切割成分別為30和40kb的兩個(gè)片段。40kb的片段與另一個(gè)存在于親代pEBAC/148克隆中的，長度約為40kb的片段共-遷移，因此，相對于親代pEBAC/148克隆所產(chǎn)生的40kb帶來說，CmrKmr克隆在此位置產(chǎn)生了顯著更強(qiáng)的帶。由于親代載體的骨架上不含XhoI位點(diǎn)，70kb片段必須得自載體骨架并與珠蛋白序列相比鄰。通過同源重組將PCRkan140整合至載體骨架之后，在卡那霉素基因中存在的單個(gè)XhoI位點(diǎn)處將70kb片段切割成兩個(gè)較小的片段。
這些結(jié)果證實(shí)在所有4個(gè)原始CmrKmr克隆中，通過同源重組整合PCRkan140已正確發(fā)生在載體骨架上的靶位點(diǎn)。另外，顯然，在此方法的過程中，無一克隆顯示出任何不穩(wěn)定性，這表明在DH10B細(xì)胞中，用pGETrec質(zhì)粒瞬時(shí)誘導(dǎo)同源重組使得大小至少約為200kb的BAC克隆中的不必要重排的風(fēng)險(xiǎn)最小化。對通過同源重組整合所用的同源區(qū)域進(jìn)行更詳細(xì)的分析。在pEBAC/148∷kan140克隆和pEBAC140∷kan50克隆中，跨越側(cè)翼于卡那霉素基因的同源區(qū)域進(jìn)行測序，結(jié)果未揭示出任何不同于預(yù)期序列之處。
已證實(shí)摻入短至50bp的同源區(qū)域的PCR產(chǎn)物以良好的效率重組至JC8679或JC9604大腸桿菌菌株42，43。這使得可以通過合成70-80-聚體擴(kuò)增任何所需片段，并通過電穿孔將所述片段直接導(dǎo)入靶位點(diǎn)，其中所述70-80-聚體攜有50bp與靶位點(diǎn)(位于引物5’末端)同源的區(qū)域。通過將PCRkan50電穿孔至DH10B(pGETrec，pEBAC/148)細(xì)胞，在現(xiàn)行的系統(tǒng)中試驗(yàn)此方法，在制備過程中僅用L-阿拉伯糖誘導(dǎo)細(xì)胞40分鐘。從每次電穿孔中得到超過100個(gè)CmrKmr菌落(表1，實(shí)驗(yàn)5，6)。使用引物140KF和140KR，直接通過PCR篩選20個(gè)獨(dú)立的CmrKmr菌落的過夜培養(yǎng)物，產(chǎn)生正確的1450bp產(chǎn)物。
盡管相對于140-聚體靶位點(diǎn)而言，使用50-聚體靶位點(diǎn)的重組頻率降低了約10倍，但通過同源重組整合的準(zhǔn)確性沒有改變。
盡管缺乏L-阿拉伯糖誘導(dǎo)時(shí)，在DH10B細(xì)胞中用pGETrec質(zhì)粒未得到重組子，但延長L-阿拉伯糖誘導(dǎo)時(shí)間顯然對細(xì)胞有毒。在制備電感受態(tài)細(xì)胞的過程中，和在電穿孔之后回收的過程中誘導(dǎo)4小時(shí)以上似乎大大降低了細(xì)胞的存活力，并且不會產(chǎn)生任何重組子。另一方面，將PCRkan50電穿孔至僅用L-阿拉伯糖誘導(dǎo)了10分鐘的DH10B(pGETrec，pEBAC/148)細(xì)胞所產(chǎn)生的CmrKmr菌落比誘導(dǎo)40分鐘的細(xì)胞少10倍。盡管誘導(dǎo)40分鐘高效產(chǎn)生了重組克隆，但可將參數(shù)的調(diào)制用作調(diào)制重組效力的工具。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解本文所述的發(fā)明并不僅是具體描述的那樣，可以對其進(jìn)行改動(dòng)和修飾。應(yīng)理解本發(fā)明包括所有這種改動(dòng)和修飾。本發(fā)明還包括本說明書中單獨(dú)或集中所指或所述的所有步驟，特征，組合物和化合物，以及任何兩個(gè)或多個(gè)所述步驟或特征的任何和所有組合。
文獻(xiàn)目錄1.Jaenisch R.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物.科學(xué)1988；2401468-1474.2.Brinster RL等，內(nèi)含子增加轉(zhuǎn)基因小鼠的轉(zhuǎn)錄效力，Proc NatlAcad Sci USA 1988；85836-840.3.Lamb BT等，在轉(zhuǎn)基因小鼠中導(dǎo)入并表達(dá)400kb的淀粉樣前體蛋白基因[校正稿][公開的勘誤出現(xiàn)在Nat Genet 1993 Nov；5(3)312].Nat Genet，1993；522-30.4.Porcu S等，在轉(zhuǎn)基因小鼠中通過YAC轉(zhuǎn)移導(dǎo)入的人β-珠蛋白基因座表現(xiàn)出特異性的和可再現(xiàn)的發(fā)育調(diào)節(jié)模式，血液，1997；904602-4609.5.Peterson KR等，在β-珠蛋白基因座酵母人工染色體轉(zhuǎn)基因小鼠中缺失人β-珠蛋白基因座5’HS3或5’HS2控制區(qū)域?qū)χ榈鞍谆虮磉_(dá)的發(fā)育調(diào)節(jié)的影響，Proc Natl Acad Sci USA 1996；936605-6609.6.Raguz S等，與人結(jié)蛋白基因相關(guān)的肌-特異性基因座控制區(qū)域的活性，發(fā)育生物學(xué)，1998；2012642.7.Choi T，Huang M，Gorman C和Jaenjsch R.一般的內(nèi)含子增加轉(zhuǎn)基因小鼠中的基因表達(dá)，分子細(xì)胞生物學(xué)，1991；113070-3074.8.Vassaux G，Manson AL和Huxley C.人上皮細(xì)胞系中YAC-克隆的人CFTR基因依賴于拷貝數(shù)的表達(dá)，基因治療，1997；4618-623.9.Gaensler KM，Kitamura M和Kan YW，轉(zhuǎn)基因小鼠中含有人β-珠蛋白基因座的150-kb酵母人工染色體的種系傳遞和發(fā)育調(diào)節(jié)，ProcNatl Acad Sci USA 1993；9011381-11385.10.Maas 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aaac 34<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探針/引物<400>2actgaggatc ctcgttttat acctctgaat caatat 36<210>3<211>70<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探針/引物<400>3accacatacg ttccgccatt cctatgcgat gcacatgctg tatgccggta caagaaatca 60cagccgaagc70<210>4<211>71<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探針/引物<400>4tgaactgatg gacttatgtc ccatcaggct ttgcagaact ttcagcggta gcgtgatctg 60atccttcaact 71<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探針/引物<400>5atctgggaag tgacggacag 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探針/引物<400>6cagcatcgca accgcatcag 20<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探針/引物<400>7ataagctcat ggagcggcgt aac 23<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探針/引物<400>8gttccacatt tccatataaa ggcca2權(quán)利要求
1.便于在至少兩個(gè)核苷酸序列之間進(jìn)行同源重組的方法，所述方法包括通過在足夠有利于同源重組至少兩個(gè)核苷酸序列的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，以在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)所述至少兩個(gè)核苷酸序列之間的重組，其中所述宿主細(xì)胞能表達(dá)recBCD和編碼外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑或其衍生物的核苷酸序列，外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑的表達(dá)是可調(diào)制的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述兩個(gè)核苷酸序列是環(huán)形核苷酸序列和線性核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述環(huán)形核苷酸序列含有F-質(zhì)粒部分。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述F-質(zhì)粒部分是BAC。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述F-質(zhì)粒部分是PAC。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，所述外切核酸酶是recE或其功能衍生物，所述重組蛋白質(zhì)是recT或其功能衍生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述recBCD抑制劑是gam，P22Aba或SSB或其功能衍生物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述recBCD抑制劑是gam或其功能衍生物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中編碼所述recE，recT和gam的核酸分子與可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子可操作相連。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中編碼所述recE，recT和gam的核酸分子與共有的啟動(dòng)子可操作相連。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10的方法，其中所述啟動(dòng)子是L-阿拉伯糖啟動(dòng)子。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述與共有L-阿拉伯糖啟動(dòng)子可操作相連的核酸分子相當(dāng)于表達(dá)質(zhì)粒pGETrec。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述大腸桿菌表達(dá)recBCD。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述大腸桿菌是菌株RR1，DM1或DH10B。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述菌株是DH10B。
17.便于在宿主細(xì)胞中同源重組至少兩個(gè)核苷酸序列的方法，所述方法包括步驟(i)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞含有第一個(gè)核苷酸序列和所述至少兩個(gè)核苷酸序列，其中第一個(gè)核苷酸序列編碼外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑或其功能衍生物，而外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和編碼recBCD抑制劑之基因的表達(dá)是可調(diào)制的；和(ii)在足以表達(dá)所述第一個(gè)核苷酸序列的條件下將所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間，其中所述第一個(gè)核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)物便于同源重組所述第二個(gè)核苷酸序列與所述第三個(gè)核苷酸序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述兩個(gè)核苷酸序列是環(huán)形核苷酸序列和線性核苷酸序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述環(huán)形核苷酸序列含有F-質(zhì)粒部分。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述F-質(zhì)粒部分是BAC。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述F-質(zhì)粒部分是PAC。
22.根據(jù)權(quán)利要求17至21中任一項(xiàng)的方法，所述外切核酸酶是recE或其功能衍生物，所述重組蛋白質(zhì)是recT或其功能衍生物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述recBCD抑制劑是gam，P22Aba或SSB或其功能衍生物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述recBCD抑制劑是gam或其功能衍生物。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中編碼所述recE，recT和gam的核酸分子與可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子可操作相連。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中編碼所述recE，recT和gam的核酸分子與共有的啟動(dòng)子可操作相連。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26的方法，其中所述啟動(dòng)子是L-阿拉伯糖啟動(dòng)子。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述與共有L-阿拉伯糖啟動(dòng)子可操作相連的核酸分子相當(dāng)于表達(dá)質(zhì)粒pGETrec。
29.根據(jù)權(quán)利要求17至28中任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述大腸桿菌表達(dá)recBCD。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述大腸桿菌是菌株RR1，DM1或DH10B。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述菌株是DH10B。
33.產(chǎn)生微生物的方法，所述微生物便于同源重組至少兩個(gè)核苷酸序列，所述方法包括對宿主細(xì)胞進(jìn)行基因操作，使其能表達(dá)recBCD，可調(diào)制水平的外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和編碼recBCD抑制劑的基因和所述至少兩個(gè)其它的核苷酸序列。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述兩個(gè)核苷酸序列是環(huán)形核苷酸序列和線性核苷酸序列。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述環(huán)形核苷酸序列含有F-質(zhì)粒部分。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述F-質(zhì)粒部分是BAC。
37.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述F-質(zhì)粒部分是PAC。
38.根據(jù)權(quán)利要求33至37中任一項(xiàng)的方法，所述外切核酸酶是recE或其功能衍生物，所述重組蛋白質(zhì)是recT或其功能衍生物。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述recBCD抑制劑是gam，P22Aba或SSB或其功能衍生物。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中所述recBCD抑制劑是gam或其功能衍生物。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中編碼所述recE，recT和gam的核酸分子與可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子可操作相連。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中編碼所述recE，recT和gam的核酸分子與共有的啟動(dòng)子可操作相連。
43.根據(jù)權(quán)利要求41或42的方法，其中所述啟動(dòng)子是L-阿拉伯糖啟動(dòng)子。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的方法，其中所述與共有L-阿拉伯糖啟動(dòng)子可操作相連的核酸分子相當(dāng)于表達(dá)質(zhì)粒pGETrec。
45.根據(jù)權(quán)利要求33至44中任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述大腸桿菌表達(dá)recBCD。
47.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述大腸桿菌是菌株RR1，DM1或DH10B。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中所述菌株是DH10B。
49.便于同源重組至少兩個(gè)核苷酸序列的細(xì)胞，所述細(xì)胞含有編碼外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)的核苷酸序列和編碼recBCD抑制劑的基因，其中外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)和recBCD抑制劑的表達(dá)是可調(diào)制的，還含有所述至少兩個(gè)核苷酸序列。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的細(xì)胞，其中根據(jù)權(quán)利要求1至32中任一項(xiàng)所定義的方法進(jìn)行所述同源重組。
51.通過權(quán)利要求1至32中任一項(xiàng)所述的方法同源重組的核酸分子。
52.權(quán)利要求51的核酸分子在制備治療哺乳動(dòng)物疾病之藥物中的用途。
53.權(quán)利要求51的核酸分子在診斷哺乳動(dòng)物疾病中的用途。
54.藥物組合物，其含有權(quán)利要求51的核酸分子以及一種或多種藥物可接受載體和/或稀釋劑。
55.便于在宿主細(xì)胞中同源重組至少兩個(gè)核苷酸序列的試劑盒，所述試劑盒含有多個(gè)區(qū)室，其中適合包含任何一種或多種編碼外切核酸酶，重組蛋白質(zhì)，recBCD抑制劑或其功能衍生物的核苷酸序列，和便于同源重組所用的試劑。
全文摘要
本發(fā)明一般涉及重組至少兩個(gè)核酸序列的方法及其所用試劑。更具體地,本發(fā)明涉及在表達(dá)recBCD核酶或其功能衍生物的宿主細(xì)胞中重組環(huán)形核酸序列和線形核酸序列的方法。本發(fā)明的方法可特別地用于通過與線形DNA序列同源重組來修飾細(xì)菌人工染色體。
文檔編號A61K48/00GK1331748SQ99814800
公開日2002年1月16日 申請日期1999年9月29日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月30日
發(fā)明者P·艾歐安諾, K·納拉亞南 申請人:默多克研究所