一種負(fù)載細(xì)胞三維支架的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞打印和生物材料技術(shù)領(lǐng)域，特別適用于生物醫(yī)學(xué)組織工程支架材料的制備，具體為一種制備負(fù)載細(xì)胞三維支架的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生命科學(xué)、信息科學(xué)與制造科學(xué)相結(jié)合，是二十一世紀(jì)科技發(fā)展的重要趨勢(shì)?；谙冗M(jìn)制造理論和組織工程理論的細(xì)胞三維打印技術(shù)，為組織工程學(xué)、病理模型構(gòu)建、藥物篩選與檢測(cè)、細(xì)胞生物學(xué)研究等領(lǐng)域拓展了新的理論和技術(shù)空間。
[0003]與傳統(tǒng)組織工程方法相比，細(xì)胞打印的優(yōu)勢(shì)主要有:(I)同時(shí)構(gòu)建有生物活性的二維或三維“細(xì)胞/材料”體系；(2)在時(shí)間和空間上準(zhǔn)確沉積不同種類的細(xì)胞；(3)構(gòu)建細(xì)胞所需的三維微環(huán)境。細(xì)胞打印輸出技術(shù)主要包括噴墨打印(壓電容積驅(qū)動(dòng)式和熱氣泡式)、激光直寫(xiě)、激光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移、靜電噴射、聚焦超聲波噴射、微擠出等，傳統(tǒng)細(xì)胞打印的可行性和可靠性方面均已得到驗(yàn)證，但在如何保持細(xì)胞活性方面還有局限性:打印時(shí)，大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞較為脆弱，易受到環(huán)境的影響，而在打印過(guò)程中噴嘴的最高溫度在300°C以上，且存在著較大的剪切應(yīng)力，在細(xì)胞打印過(guò)程中產(chǎn)生瞬間高溫、高壓或瞬間強(qiáng)靜電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞造成了傷害。因此制備具有合適孔隙結(jié)構(gòu)且厚度大于300 μ m的負(fù)載細(xì)胞三維支架時(shí)，在打印過(guò)程中保持細(xì)胞活性，減少對(duì)其生物學(xué)特性的不利影響是亟待解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于細(xì)胞打印輸出技術(shù)制備負(fù)載細(xì)胞三維支架的方法，具有保持細(xì)胞活性的特點(diǎn)。
[0005]一種負(fù)載細(xì)胞三維支架的制備方法，是將自體細(xì)胞與高溫間歇滅菌的水凝膠溶液混合均勻得到混合液，噴射到交聯(lián)劑溶液中，靜置，然后去除交聯(lián)劑溶液，漂洗后得到負(fù)載細(xì)胞微球體；將負(fù)載細(xì)胞微球體與基質(zhì)材料混合得到細(xì)胞共混物；采用生物打印機(jī)將細(xì)胞共混物擠出在三維微動(dòng)平臺(tái)上，層層疊加，形成負(fù)載細(xì)胞三維支架。
[0006]進(jìn)一步的，所述水凝膠溶液為水凝膠單體和水凝膠溶劑混合均勻配制而成，濃度為0.05-10 wt% ;所述水凝膠單體為膠原、明膠、透明質(zhì)酸、殼聚糖或海藻酸納中的一種或幾種的混合物；所述水凝膠溶劑為水或PH值為5.7-8.0的磷酸鹽緩沖溶液。
[0007]進(jìn)一步的，所述混合液中自體細(xì)胞的濃度為105_107/mL。
[0008]進(jìn)一步的，所述噴射的壓力為10-200 kPa，噴頭直徑為500-1000 μ m。
[0009]進(jìn)一步的，所述交聯(lián)劑溶液為CaCl2溶液，濃度為0.1-20 wt%0
[0010]進(jìn)一步的，所述的自體細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞中的一種或幾種組合。
[0011]進(jìn)一步的，所述漂洗是先用PBS溶液漂洗3遍，然后使用DMEM培養(yǎng)液漂洗3遍。
[0012]進(jìn)一步的，所述基質(zhì)材料的制備方法為:分別配制重組膠原溶液和海藻酸鈉溶液，按質(zhì)量比1:1-5混合，高溫間歇滅菌，所述重組膠原溶液的濃度為2-10 wt %，所述海藻酸鈉溶液的濃度為2-10 wt %;配置濃度為0.05- 2 wt %的CaCl2溶液，將重組膠原-海藻酸鈉混合液與CaCl2溶液按體積比7:3混合均勻，得到基質(zhì)材料。
[0013]進(jìn)一步的，所述細(xì)胞共混物中負(fù)載細(xì)胞微球體的濃度為105-107/mL。
[0014]所述負(fù)載細(xì)胞三維支架用于制備組織工程支架。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:本發(fā)明通過(guò)采用與細(xì)胞外基質(zhì)成分類似的水凝膠材料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行包裹，能夠有效減少打印過(guò)程中的機(jī)械和熱環(huán)境對(duì)細(xì)胞造成的損傷。本發(fā)明通過(guò)將細(xì)胞與水凝膠混合溶液噴射到CaCl2溶液中的方法，制備得到負(fù)載細(xì)胞的微球體，水凝膠材料的包裹可對(duì)細(xì)胞形成保護(hù)，減輕細(xì)胞打印過(guò)程對(duì)細(xì)胞活性及生物活性造成的損害，保證高活性的細(xì)胞打印。本發(fā)明所用的種子細(xì)胞為自體細(xì)胞，無(wú)免疫排斥。本發(fā)明能根據(jù)人體組織或器官的不同需要，調(diào)整打印參數(shù)，能直接制備具有各種結(jié)構(gòu)(多孔、管狀)和力學(xué)性能的三維支架，用于組織工程和再生醫(yī)學(xué)研究。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，易于操作，成本低，能三維成型具有復(fù)雜形態(tài)的支架，能滿足臨床需要，適合于工程支架的制備。
【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1.本發(fā)明負(fù)載細(xì)胞三維支架的制備方法流程圖；
圖2.本發(fā)明的負(fù)載細(xì)胞微球體的顯微觀察圖；
圖3.本發(fā)明的負(fù)載細(xì)胞三維支架結(jié)構(gòu)圖；
圖4.本發(fā)明中實(shí)施例1所述支架細(xì)胞活性檢測(cè)染色結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0017]一種負(fù)載細(xì)胞三維支架，是利用自身細(xì)胞制備含有細(xì)胞的微球載體，與基質(zhì)材料混合得到細(xì)胞共混物，利用細(xì)胞打印輸出技術(shù)將細(xì)胞共混物層層疊加，形成負(fù)載細(xì)胞三維支架，具體步驟如下:
I)制備負(fù)載細(xì)胞微球體:將自體細(xì)胞與高溫間歇滅菌的水凝膠溶液混合均勻得到混合液，所述混合液中自體細(xì)胞濃度為15-1OVmL ;按照壓力10-200 kPa，噴頭直徑500-1000μ m的噴射條件將混合液噴射到交聯(lián)劑溶液中，使噴射出的含有細(xì)胞的微液滴在交聯(lián)劑中交聯(lián)，形成負(fù)載細(xì)胞微球體，所述交聯(lián)劑溶液為CaCl2溶液，濃度為0.1-20 wt%,靜置2_60min，用移液器吸除交聯(lián)劑溶液，然后使用PBS緩沖溶液漂洗3遍，使用DMEN(DulbeCC0’ sModified Eagle Media)細(xì)胞培養(yǎng)液漂洗3遍,得到負(fù)載細(xì)胞微球體,如圖2所示。
[0018]所述的自體細(xì)胞可以為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞中的一種或幾種組合。
[0019]所述水凝膠溶膠為水凝膠單體和水凝膠溶劑混合均勻配制成的，質(zhì)量濃度為
0.05-10 wt% ;所述水凝膠單體為膠原、明膠、透明質(zhì)酸、殼聚糖或海藻酸納中的一種或幾種的混合物；所述水凝膠溶劑為水或PH值為5.7-8.0的磷酸鹽(PBS)緩沖溶液。水凝膠材料的包裹可對(duì)細(xì)胞形成保護(hù)，減輕細(xì)胞打印過(guò)程對(duì)細(xì)胞活性及生物活性造成的損害，保證高活性的細(xì)胞打印。
[0020]2)制備基質(zhì)材料:分別配制重組膠原溶液和海藻酸鈉溶液，按質(zhì)量比1:1-5混合，高溫間歇滅菌，所述重組膠原溶液的濃度為2-10 wt %，所述海藻酸鈉溶液的濃度為2-10wt %。配置濃度為0.05- 2 wt %的CaCl2溶液，將重組膠原-海藻酸鈉混合液與CaCl 2溶液按體積比7:3混合均勻，得到基質(zhì)材料。
[0021]所述重組膠原為重組膠原蛋白，也稱為重組類人膠原蛋白，具有可加工性、無(wú)病毒隱患、低排異反應(yīng)、變形溫度提高的優(yōu)點(diǎn)。
[0022]所述基質(zhì)材料做為細(xì)胞載體，具有天然細(xì)胞外基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)和組成成分，以實(shí)現(xiàn)相同的生理功能。理想的基質(zhì)材料具有無(wú)毒性、有良好的生物相容性、一定成形性的。目前用于細(xì)胞組裝的基質(zhì)材料以天然生物材料為主，包括明膠、纖維蛋白、海藻酸鈉、殼聚糖等。這些天然材料來(lái)自生物體，與細(xì)胞外基質(zhì)的成分相似，與細(xì)胞親和性強(qiáng)，且含有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖等生命活動(dòng)的因子?；趯?duì)于基質(zhì)材料要求的分析和天然高分子物質(zhì)的特點(diǎn)，本發(fā)明選擇了具有良好生物相容性、可降解性和細(xì)胞親和性的重組類人膠原蛋白和海藻酸鈉做為基質(zhì)材料。
[0023]3)細(xì)胞共混物制備:通過(guò)醫(yī)用三通閥將負(fù)載細(xì)胞微球體和基質(zhì)材料混合，其中負(fù)載細(xì)胞微球體的濃度為105-107/mL。
[0024]4)打印負(fù)載細(xì)胞三維支架:采用生物打印機(jī)將材料擠出在載有滅菌玻璃底板的三維微動(dòng)平臺(tái)上，在具有層片信息的CAD模型直接驅(qū)動(dòng)下，形成不同的層面，不同的層面之間再層層交錯(cuò)疊加，形成三維結(jié)構(gòu)體，用無(wú)菌1-20 wt % 0&(:12溶液交聯(lián)2-20 min，制得負(fù)載細(xì)胞三維支架。
5)第五步，支架交聯(lián)，將負(fù)載細(xì)胞三維支架用無(wú)菌2 wt % 0&(:12溶液浸泡，交聯(lián)2 min。
[0025]6)用PBS溶液漂洗負(fù)載細(xì)胞三維支架3遍，DMEM培養(yǎng)液漂洗3遍后，置六孔板中常規(guī)體外培養(yǎng)，隔天換液并定期觀察。
[0026]利用本發(fā)明方法制備得