蜂蜜曲霉蛋白酶在用于去除細菌生物膜的用圖
【專利說明】
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年5月8日提交的美國臨時申請序列號61/820, 915的權益和 2012年5月11日提交的美國臨時申請序列號61/645, 815的權益。所引用申請的內容以引 用方式并入本申請中。
技術領域
[0003] 本發(fā)明大體上涉及可用于治療生物膜的方法和組合物。所述組合物可以包含蜂蜜 曲霉蛋白酶（Seaprose)作為活性成分。
【背景技術】
[0004] 生物膜是附著于惰性表面或有生命表面的細菌或真菌的群體。生物膜中的細菌嵌 入在細胞外聚合物基質（通常是多糖基質）中，所述細胞外聚合物基質將細菌以團塊的形 式保持在一起，并且將細菌團塊緊緊地附著于下面的表面。有證據顯示生物膜對人類健康 構成顯著的威脅。公共衛(wèi)生署（Public Health Service)估計生物膜是造成人類80%以 上的細菌感染的原因（國立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health) ,1998RFA編號 DE-98-006)。生物膜參與許多健康病況，諸如泌尿道感染、膀胱炎、肺部感染、皮膚感染、竇 感染、耳部感染、痤瘡、齲齒、牙周炎、醫(yī)院內感染、開放性傷口和慢性傷口。在生物膜中生長 的細菌表現(xiàn)出對抗生素和抗微生物劑增加的耐藥性并且非常難以消除。
[0005] 傷口和皮膚病灶特別容易發(fā)生細菌感染。從微生物學的角度來看，正常、完整皮膚 的主要功能是控制在皮膚表面上生活的微生物群和防止下面的組織被潛在的病原體定植 和侵襲。諸如傷口或皮膚病灶等皮下組織的暴露提供了潮濕的、溫暖的和有營養(yǎng)的環(huán)境，所 述環(huán)境有益于微生物定植和增殖。由于細菌在傷口中的定植大多數(shù)是多種微生物的，涉及 大量的潛在致病性微生物，因此任何傷口或皮膚病灶均處于被感染的高度風險下。
[0006] 傷口常常具有多個針對愈合的屏障。傷口愈合和感染受到細菌在傷口環(huán)境內建 立穩(wěn)定興旺群落的能力與宿主控制細菌群落的能力之間的關系影響。由于細菌在附著 于表面后能夠快速地形成它們自己的保護性微環(huán)境，即，生物膜，因此，宿主控制這些生 物體的能力可能隨著生物膜群落的成熟而下降，最終影響傷口愈合的能力。愈合延遲的 傷口，即，慢性傷口，與生物膜形成特別有關系。一些人已經將生物膜與慢性傷口相關聯(lián) (Mertz, 2003, Wounds, 15:1-9)。諸如糖尿病性足潰瘍、靜脈性下肢潰瘍、動脈性下肢潰瘍、 褥瘡性潰瘍、淤滯性潰瘍、燒傷和壓力性潰瘍等傷口是可能變成慢性傷口的傷口的示例。慢 性傷口中的細菌生物膜通常不被宿主的免疫系統(tǒng)消解，并且這些生物膜對全身性和局部抗 微生物劑/抗生素劑具有增加的耐藥性。因此，慢性傷口中的細菌生物膜感染非常難以消 除。
[0007] 傷口中特別有毒性的生物體是革蘭氏（gram)陽性細菌，諸如葡萄球菌屬 (staphylococcus spp·)、鏈球菌屬(streptococcus spp.)和腸球菌屬(enterococci spp.)。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)(包括耐藥株，諸如耐甲氧西林 (methicillin)金黃色葡萄球菌（MRSA))的生物膜在傷口和皮膚病灶中變得越來越成問 題。這些生物體、尤其是MRSA可以駐留在鼻前孔中并且引起鼻中的皮膚病灶，其也可以擴 散到身體的其它部分，從而引起那些部位處的皮膚病灶。
[0008] 近年來，已經付出了大量的努力來使用各種抗生素和抗微生物劑以治療未愈合 的、臨床感染的皮膚病灶和慢性傷口。這些抗微生物藥劑是多種多樣的化學化合物，并且尤 其包括肽，諸如萬古霉素（vancomycin),抗微生物劑，諸如莫匹羅星（mupirocin)，以及銀/ 銀離子。然而，某些革蘭氏陽性細菌（諸如金黃色葡萄球菌，包括MRSA)對這些化合物已經 變得越來越耐藥。

【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明人已經發(fā)現(xiàn)蜂蜜曲霉蛋白酶（Seaprose)可以用來破壞和去除來自表面的 生物膜。
[0010] 在一種情況下，公開了破壞存在于表面上的細菌生物膜的方法，該方法包括將包 含蜂蜜曲霉蛋白酶的組合物施用到所述細菌生物膜，其中將所述組合物施用到所述細菌生 物膜破壞所述細菌生物膜的基質。所述表面可以在生命體或非生命體上。例如，所述表面可 以是皮膚或傷口。傷口可以是慢性傷口（非限制性示例包括糖尿病性足潰瘍、靜脈性下肢 潰瘍、動脈性下肢潰瘍、褥瘡性潰瘍、淤滯性潰瘍、皮膚潰瘍、燒傷或壓力性潰瘍）。在一些情 況下，傷口可以包括壞死組織（例如，焦痂）。本發(fā)明的組合物可以清除壞死組織。在一個 方面，所述表面可以是上皮表面（非限制性示例包括口腔的一部分、角膜表面的一部分、生 殖道的一部分、泌尿道的一部分、呼吸道的一部分、胃腸道的一部分、腹膜的一部分、中耳的 一部分或前列腺的一部分）。非生物體的表面的非限制性示例可以是醫(yī)用植入物裝置（例 如，導管，支架，骨板、骨螺釘、骨釘或骨棒，脊椎盤，耳管或接觸鏡）。在某些方面，所述組合 物可以包含0. 0001重量％到1重量％或0. 001重量％到1重量％的蜂蜜曲霉蛋白酶（還 涵蓋這些范圍以下和以上的量和范圍一例如，0. 〇〇〇〇〇1%、〇. 〇〇〇1%、1. 5%、2%、3%、4%、 5%、6%、7%、8%、9%、10%或更高的量）。蜂蜜曲霉蛋白酶可以是分離的或純化的。所述 組合物可以被配制用于局部或注射應用。所述配方的示例可以是凝膠、乳膏、軟膏、糊劑和 溶液。在一種特定的情況下，所述組合物可以進一步包含甘油聚丙烯酸酯包合物（glycerin polyacrylate clatharate)、甘油、乳化錯、或礦脂或其任一組合。在某些方面，所述組合物 不包含羥乙基纖維素。細菌生物膜可以是革蘭氏陰性細菌生物膜。革蘭氏陰性生物膜的非 限制性示例包括由假單胞菌屬細菌（Pseudomonas bacteria)產生的生物膜。假單胞菌屬 細菌的非限制性示例是銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)。在其它方面，細菌生物 膜可以是革蘭氏陽性細菌生物膜。革蘭氏陽性細菌生物膜的非限制性示例是由葡萄球菌產 生的細菌生物膜。葡萄球菌的非限制性示例是金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)。 金黃色葡萄球菌細菌可以是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA)。還涵蓋在利用本發(fā)明的組 合物破壞來自表面的生物膜后去除所述生物膜的至少一部分。所述組合物可以進一步包含 抗微生物劑（示例包括抗生素劑、抗真菌劑、防腐劑或清潔劑一說明書在下面還提供了這 些試劑的示例）。在一些情況下，所述方法進一步包括在將含有蜂蜜曲霉蛋白酶的組合物施 用到細菌生物膜之前、期間或之后向所述細菌生物膜施用第二組合物。第二組合物可以包 含抗微生物劑（諸如上文提到的那些）。 toon] 還涵蓋用于破壞細菌生物膜的組合物，其包含有效量的蜂蜜曲霉蛋白酶和可接受 的載體。如上面所解釋的，該組合物可以包含〇. 0001重量％到1重量％或〇. 001重量％到 1重量％的蜂蜜曲霉蛋白酶（還涵蓋這些范圍以下和以上的量和范圍一例如，〇. 000001 %、 0.0001%、1.5%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或更高的量）。蜂蜜曲霉蛋白酶 可以是分離的或純化的蜂蜜曲霉蛋白酶?？山邮艿妮d體可以是藥學上可接受的局部載體或 藥學上可接受的可注射載體。所述組合物可以被配制成凝膠、乳膏、溶液、糊劑或軟膏。在 特定的情況下，所述組合物可以是包含礦脂的軟