Tc標記的錳基螯合物MR/SPECT雙模態(tài)探針的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于雙模態(tài)分子影像探針的制備領(lǐng)域,特別涉及一種葉酸靶向99mTc標記的 錳基螯合物MR/SPECT雙模態(tài)探針的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥(cancer),醫(yī)學術(shù)語亦稱惡性腫瘤,現(xiàn)在已直接或間接的影響許多人的生活, 成為威脅人類健康的頭號殺手。因此,早期的診斷和治療成為治愈癌癥的關(guān)鍵。在腫瘤的 早期診斷方面,傳統(tǒng)的影像技術(shù)只能了解腫瘤體積大小和解剖定位,而分子影像學技術(shù)可 以獲得更多的檢測參數(shù),如腫瘤生長動力學評估,惡變前的分子異常檢測,腫瘤細胞標記物 等,且活體分子成像可以實現(xiàn)在無損生物體微環(huán)境的狀況下進行發(fā)病機制的研宄,并幫助 破譯復(fù)雜的分子運動軌跡。目前應(yīng)用于臨床的分子影像學技術(shù)主要包括超聲成像、SPECT成 像、CT成像和核磁共振成像(MRI)等。
[0003] 作為分子影像學的重要組成部分,造影劑的適當選擇可以大大地提高成像診斷的 靈敏性、特異性。而作為理想的且能應(yīng)用于臨床癌癥早期靶向診斷的納米材料體系,在生物 安全性得以保障的同時,更要兼顧能同時攜帶靶向分子、成像試劑分子、制備方法簡便、原 材料價廉易得幾個主要因素。目前應(yīng)用于臨床的造影劑,如應(yīng)用于CT成像的Omnipaque,用 于MRI的六種釓基小分子造影劑都存在不可克服的缺陷,而應(yīng)用于SPECT成像的DTPA- 99mTc 造影劑主要是腎臟顯影,上述的分子影像劑均存在不足之處如:血液循環(huán)時間過短、無組織 特應(yīng)性,尤其是釓基造影劑一定濃度下還存在腎毒性。因此,臨床醫(yī)學界更加期望能開發(fā)出 兼具兩種或者多種成像模式的分子影像探針,進而彌補單一分子影像成像的不足之處。
[0004] 納米技術(shù)的發(fā)展使越來越多的科研工作者開始研發(fā)雙模態(tài)甚至多模態(tài)造影劑以 滿足臨床的需求。前期工作中,Shi和其合作者首先通過共沉淀法制備得到四氧化三鐵納 米顆粒,然后再在其表面層層靜電自組裝上聚谷氨酸和聚賴氨酸,最后將包裹有金納米顆 粒的第五代聚酰胺-胺樹狀大分子在EDC作用下修飾到氧化鐵表面,實現(xiàn)了 T2加權(quán)MR成 像和CT成像雙模態(tài)造影(J. Mater. Chem.,2012, 22, 15110-15120);隨后,Shi等人利用第 五代聚酰胺-胺樹狀大分子為平臺,將螯合試劑DOTA-NHS連接到樹狀大分子表面用于螯 合釓離子用于MR成像,同時利用樹狀大分子特殊的空腔結(jié)構(gòu),包裹金納米顆粒用于CT成 像,實現(xiàn)了 T1加權(quán)MR增強和CT增強的MR/CT雙模態(tài)成像功能(Biomaterials,34,(2013), 1570-1580)。正是基于前人以及本課題組的前期研宄工作基礎(chǔ)之上,本發(fā)明將靶向試劑葉 酸、螯合試劑DOTA結(jié)合到樹狀大分子上,然后將放射核素 99mTc成功地標記到DOTA上,從而 制備出可實現(xiàn)MR/SPECT雙模態(tài)成像的分子影像探針。
[0005] 檢索國內(nèi)外文獻,尚沒有發(fā)現(xiàn)關(guān)于葉酸靶向放射核素 99mTc標記的樹狀大分子基錳 螯合物MR/SPECT雙模態(tài)分子影像探針的制備及其用于體內(nèi)腫瘤模型靶向MR/SPECT雙模態(tài) 成像應(yīng)用研宄的相關(guān)報道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種葉酸靶向99mTc標記的錳基螯合物MR/ SPECT雙模態(tài)探針的制備方法,本發(fā)明的合成工藝簡單,反應(yīng)條件溫和可控,易于操作;制 備得到的MR/SPECT雙模態(tài)分子影像探針具有良好是生物相容性和血液相容性,并且在細 胞水平和動物水平能實現(xiàn)良好的靶向MR/SPECT雙模態(tài)顯影功能;最終造影劑會隨代謝排 出體外,不會在體內(nèi)長時間蓄積。
[0007] 本發(fā)明的一種葉酸靶向99mTc標記的錳基螯合物MR/SPECT雙模態(tài)探針的制備方 法,包括:
[0008] (1)分別將第五代聚酰胺-胺樹狀大分子G5、螯合試劑DOTA-NHS溶解在溶劑中, 待分別完全溶解后,攪拌條件下將DOTA-NHS溶液逐滴加入到G5溶液中,持續(xù)攪拌反應(yīng) 20-24h,得到G5. NH2-DOTA ;其中G5和DOTA-NHS二者之間的摩爾比為1 :35~40 ;
[0009] (2)將葉酸FA和EDC各自溶解在溶劑中,完全溶解后,將EDC溶液逐滴加入到FA 溶液中,避光攪拌20-30min,得到FA和EDC溶液;將NHS溶解在溶劑中,然后滴加到FA和 EDC溶液中,避光攪拌2-3h,得到活化后的FA溶液中,然后邊攪拌邊滴加入步驟(1)所得 G5. NH2-DOTA 中,避光持續(xù)反應(yīng) 60-72h,得到 G5. NH2-FA-DOTA ;
[0010] (3)將異硫氰酸熒光素 FI溶解在溶劑中,邊攪拌邊滴加到步驟⑵的 G5. NH2-FA-DOTA 中,避光持續(xù)反應(yīng) 20-24h,得到 G5. NH2-Fi-FA-DOTA ;
[0011] (4)將MnSO4. H2O溶解在超純水中,邊攪拌邊滴加入步驟(3)體系中,避光持續(xù)攪 拌 20-24h,得到 G5. NH2-FI-FA-DOTA-Mn ;
[0012] (5)將三乙胺加入到步驟(4)反應(yīng)體系中,避光持續(xù)攪拌反應(yīng)20-30min,然后再加 入乙酸酐,避光持續(xù)攪拌反應(yīng)20-24h,透析,冷凍干燥,得到G5. NHAc-FI-FA-DOTA-Mn ;
[0013] (6)將G5. NHAc-FI-FA-DOTA-Mn溶解在緩沖液中,然后加入99mTc淋洗液、還原劑, 將99niTc與DOTA螯合,分離純化,得到G5. NHAc-FI-FA-D0TA-Mn」9niTc,即為葉酸靶向99niTc標 記的錳基螯合物MR/SPECT雙模態(tài)探針。
[0014] 所述步驟⑴中G5、DOTA-NHS分別溶解的溶劑的體積比為10-12:2-3。
[0015] 所述步驟(1)中第五代聚酰胺-胺樹狀大分子G5的分子量為26010。
[0016] 所述步驟⑵中FA、EDC和NHS的比例為8. 8-10mg: 19. 2~21. 4mg :11· 5~ 12. lmg,F(xiàn)A和G5的摩爾比為8. 83~9 :13 ;FA溶解在溶劑中的濃度為1-2. 5mg/ml ;EDC溶 解在溶劑中的濃度為2-5mg/ml ;NHS溶解在溶劑中的濃度為l-4mg/ml。
[0017] 所述步驟⑶中FI與G5的比例為0· 97~I. 56mg :13mg ;FI溶解在溶劑中的濃度 為 0· 5mg/mL ~L 5mg/mL〇
[0018] 所述步驟⑷中MnSO4. H2O與DOTA的比例為7. 6~9. 2mg :23mg ;MnS04. H2O溶解 在超純水中后的濃度為lmg/mL~2. 5mg/mL。
[0019] 所述步驟(5)中三乙胺和乙酸酐與G5的比例為46~50. 5 yL :26~31. 2 yL : 13mg〇
[0020] 所述步驟(6)中緩沖液為PBS緩沖液;G5. NHAc-FI-FA-DOTA-Mn溶于緩沖液后的 濃度為1~I. 2mg/mL ;還原劑為氯化亞錫SnCl2。
[0021] 所述步驟(6)中G5. NHAc-FI-FA-D0TA-Mn、99niTc淋洗液、還原劑的比例為3-5mg : 0.5_lmL :50-100 μ g。
[0022] 所述步驟(1)-⑶中的溶劑均為二甲基亞砜DMSO ;步驟(5)中透析為用截留分子 量為8000~14000的透析袋透析三天;步驟(6)中分離純化為用凝膠過濾柱分離純化。
[0023] 所述葉酸靶向放射核素99mTc標記的樹狀大分子基錳螯合物作為MR/SPECT雙模態(tài) 分子影像探針的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明首先分別將螯合試劑(DOTA-NHS)和靶向分子葉酸(FA)修飾到第五代聚酰 胺-胺樹狀大分子(G5)表面,然后利用配位化學方法將錳離子螯合到DOTA上,最終標記放 射核素 99mTc。其制備方法:第一步,經(jīng)表面共價修飾將螯合試劑DOTA-NHS修飾到G5表面; 第二步,將靶向分子FA連接到G5表面;第三步,將示蹤分子異硫氰酸熒光素(FI)標記到G5 上;第四步,利用DOTA配位螯合錳離子;第五步,利用乙?;磻?yīng)將G5表面氨基轉(zhuǎn)化為乙 ?;?;最后,將放射核素 99mTc標記到剩余的DOTA上。本發(fā)明以G5為平臺,將靶向分子FA、 MR成像造影劑(DOTA-Mn螯合物)和SPECT成像放射核素99mTc三者有機結(jié)合,得到功能化 的樹狀大分子基MR/SPECT雙模態(tài)分子影像探針。
[0025] 本發(fā)明利用樹狀大分子表面存在大量氨基從而可實現(xiàn)多功能化修飾這一特性,首 先采用化學鍵合法將螯合試劑DOTA連接到G5表面氨基上,進一步將靶向分子葉酸(FA)、熒 光分子(FI)修飾到G5表面。FA可以實現(xiàn)對葉酸受體高表達細胞株系或者腫瘤模型特異靶 向性,F(xiàn)I分子為在細胞水平研宄葉酸的靶向能力起到了分子探針的作用,而DOTA的存在不 僅僅可以起到螯合金屬離子錳的作用,同時還可標記放射核素 99mTc。
[0026] 本發(fā)明采用的合成工藝簡單,反應(yīng)條件溫和可控,易于操作。制備得到的MR/SPECT 雙模態(tài)分子影像探針具有良好是生物相容性和血液相容性,并且在細胞水平和動物水平能 實現(xiàn)良好的靶向MR/SPECT雙模態(tài)顯影功能,最終造影劑會隨代謝排出體外,不會在體內(nèi)長 時間蓄積。該方法制備的FA靶向的MR/SPECT雙模態(tài)分子影像探針在分子影像診斷領(lǐng)域有 著潛在的應(yīng)用。
[0027] 本發(fā)明使用紫外可見吸收光譜(UV-Vis)、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法 (ICP-AES)、Zeta電勢、水合粒徑等方法表征制備得到的分子探針的物理化學性質(zhì),并通過 核磁共振成像儀分析分子探針的T 1成像性能和r i弛豫率,然后通過溶血實驗、MTT法評價該 探針的血液相容性和細胞毒性,再利用流式細胞術(shù)、體外和體內(nèi)核磁共振成像實驗檢測FA 修飾的分子探針對腫瘤細胞的靶向成像效果。具體測試結(jié)果如下:
[0028] (1)紫外吸收(UV-Vis)測試結(jié)果
[0029] 通過分析G5. NHAc-FI-FA-DOTA-Mn分子影像探針的紫外圖譜(圖1)發(fā)現(xiàn)在500nm 處有一個明顯的FI的紫外特征吸收峰,由此可以說明已經(jīng)成功地將FI修飾到G5表面上。
[0030] (2) Zeta電勢及水合粒徑測試結(jié)果
[0031] 本發(fā)明制備得到的G5. NHAc-FI-FA-DOTA-Mn分子影像探針表面有大量的伯氨基 存在而具有較高的正電荷,較高的正電荷會制約該材料在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用。因此本發(fā) 明對修飾后的實驗組材料和對照組材料進行了完全乙?;幚恚云诮档头肿佑跋裉结樀?表面電勢,從而提高其生物相容性。表面電勢和水合粒徑測定結(jié)果如表1所示:合