綠原酸在制備治療黑色素瘤的藥物中的用途及治療黑色素瘤的藥物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是黑色素瘤治療領(lǐng)域，具體為綠原酸在制備治療 黑色素瘤的藥物中的用途及治療黑色素瘤的藥物。本發(fā)明通過(guò)綠原酸對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào) 節(jié)，實(shí)現(xiàn)對(duì)黑色素瘤的治療。
【背景技術(shù)】
[0002] 綠原酸（chlorogenic acid)是一種從雙子葉植物（如忍冬葉、咖啡豆、向日葵） 的葉和果實(shí)分離得到的酚類(lèi)，其是植物體在有氧呼吸過(guò)程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙 素類(lèi)化合物。其是是廣泛存在于各種植物中的重要成分，與日常生活相關(guān)的植物包括葵花 籽、水果（蘋(píng)果、梨、葡萄）、蔬菜（土豆）、大豆、小麥、可可豆、咖啡豆、沙棘果和傳統(tǒng)中草藥 (杜仲、金銀花）均不同程度地含有綠原酸。
[0003] 綠原酸作為一種由咖啡酸（caffeic acid)與奎尼酸（雞納酸，quinic acid， 即1-羥基六氫沒(méi)食子酸）縮合而成的縮酚酸，異名咖啡鞣酸，化學(xué)名3-0-咖啡?？崴?(3-0-caffeoylquinic acid)，分子式為C16H18O9,分子量：345. 31，半水合物為針狀晶體， IKTC時(shí)變?yōu)闊o(wú)水化合物，易溶于熱水、乙醇、丙酮，微溶于乙酸乙酯，常溫下呈淡黃色或類(lèi) 白色粉末。
[0004] 目前，已經(jīng)報(bào)道了綠原酸有多種藥理作用，其中關(guān)于綠原酸癌癥的治療用途僅限 于宮頸癌、肺癌、肝癌、膀胱癌的報(bào)道。其中，CN200710140602. 7公開(kāi)了綠原酸在制備治療 小細(xì)胞肺癌的藥物中的用途；CN201210086313. 4公開(kāi)了綠原酸在制備治療小鼠膀胱癌的 藥物中的用途。
[0005] 截止目前，還未有關(guān)于綠原酸治療黑色素瘤的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種綠原酸的新用途，具體為綠原酸在制備治療黑色 素瘤的藥物中的用途及治療黑色素瘤的藥物。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，綠原酸能夠促進(jìn)單核 細(xì)胞向Ml型巨噬細(xì)胞極化，抑制單核細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞極化，及抑制Ml型巨噬細(xì)胞向 M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞向Ml型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，最終達(dá)到治療黑色素瘤的目 的。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] 綠原酸在制備治療黑色素瘤的藥物中的用途。
[0009] 以綠原酸為有效成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成。
[0010] 該藥物中，每制劑單位含有綠原酸l-l〇〇〇mg。
[0011] 其作用機(jī)理為：綠原酸通過(guò)對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)治療黑色素瘤中的用途。
[0012] 綠原酸通過(guò)促進(jìn)單核細(xì)胞向Ml型巨噬細(xì)胞極化，達(dá)到治療黑色素瘤和控制黑色 素瘤轉(zhuǎn)移的用途。
[0013] 綠原酸通過(guò)抑制單核細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞極化，達(dá)到治療黑色素瘤和控制黑色 素瘤轉(zhuǎn)移的用途。
[0014] 綠原酸通過(guò)抑制Ml型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，同進(jìn)促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞向 Ml型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，達(dá)到治療黑色素瘤和控制黑色素瘤轉(zhuǎn)移的用途。
[0015] 綠原酸與化療藥在制備治療黑色素瘤的聯(lián)合用藥中的用途。
[0016] 所述化療藥為順鉑、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、阿霉素、環(huán)磷酰胺中的一種或多種。
[0017] 一種用于治療黑色素瘤的藥物，活性成分為綠原酸。
[0018] 以綠原酸為有效成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成。
[0019] 巨噬細(xì)胞參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，巨噬細(xì)胞的不同極化類(lèi)型（Ml、M2)對(duì)腫瘤產(chǎn)生的 作用不同。Ml型巨噬細(xì)胞通過(guò)多種途徑殺傷腫瘤細(xì)胞；而M2型巨噬細(xì)胞卻參與了腫瘤的 發(fā)生、生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的過(guò)程，常常表現(xiàn)為促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、腫瘤血管的生成以及腫瘤細(xì)胞 的迀移等過(guò)程。腫瘤局部微環(huán)境使腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs)向M2型巨噬細(xì)胞分化。研宄 認(rèn)為T(mén)AMs在腫瘤的起始階段表現(xiàn)為Ml型，在進(jìn)展階段則表現(xiàn)為M2型。同樣，大量研宄表 明，存在于腫瘤組織中的TAMs大部分表現(xiàn)出M2的表型，且與腫瘤的治療和預(yù)后相關(guān)。
[0020] 其中，Ml型巨噬細(xì)胞極化的信號(hào)通路如下：IFN-y通過(guò)IFNR激活巨噬細(xì)胞信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子 I (Signal transducer and activator of transcription, STAT1)通 路，直接促進(jìn)IL-2、N0S2和MHC II基因的表達(dá)上調(diào)，這些是Ml型巨噬細(xì)胞極化所必需的 條件。目前發(fā)現(xiàn)的Ml表面標(biāo)志物有IL-6、IL-12、iNOS、TNF- α、ΜΑΡΚΟ受體、CD80、CD86、 TLR-2、TLR-4、FcRIII (CD16)、CD32、CD62、IL-1R1、CD127 等，在平常的研宄中受用得較多的 是 iN0S、TNF-a、IL-12 等。
[0021] M2型巨噬細(xì)胞的激活途徑主要由STAT6介導(dǎo)。M2型巨噬細(xì)胞極化的信號(hào)通路如 下。首先IL-4通過(guò)與IL-4Ra和IL-12Ry受體（I型受體）結(jié)合，或者IL-4和IL-13分 別與各自的受體IL_4Ra和IL_13Ra結(jié)合，受體二聚化（Π 型受體）后分別激活Janus激 酶Jakl/Jak3或Jakl/Jak2/Tyk2,從而募集胰島素受體底物家族主要成員IRS形成復(fù)合物。 磷酸化的IRS激活銜接蛋白酶Grb2和PI3K，進(jìn)一步募集STAT6。并使STAT6發(fā)生酪氨酸磷 酸化。磷酸化的STAT6形成二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核后，啟動(dòng)若M2功能相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，使巨噬 細(xì)胞逐步向M2極化。M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物有精氨酸酶I (Argl)、甘露糖受體（MRC1， CD206)、CD163、FcR2 (CD23, CD209)、FIZZ1、ST2、SR-A、M60 受體、CD184、TRAIL 等，常用的包 括ArgUMRClFIZZl和一些趨化因子等。
[0022] 申請(qǐng)人通過(guò)研宄發(fā)現(xiàn)，綠原酸能夠用于黑色素瘤的預(yù)防、治療，控制其轉(zhuǎn)移，具有 明顯效果。實(shí)驗(yàn)表明，綠原酸能夠促進(jìn)單核細(xì)胞向Ml型巨噬細(xì)胞極化，抑制單核細(xì)胞向M2 型巨噬細(xì)胞極化，同時(shí)抑制Ml型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞向Ml 型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，有效起到黑色素瘤預(yù)防、治療、控制其轉(zhuǎn)移的目的。
[0023] 基于上述發(fā)現(xiàn)，綠原酸可以單獨(dú)或與其他具有已知功效的藥物一起，采用各種制 藥技術(shù)，制備成注射制劑、口服劑等劑型。
[0024] 以下通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)綠原酸所具有的上述功效加以證實(shí)。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實(shí) 驗(yàn)例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改 進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 本發(fā)明將通過(guò)例子并參照附圖的方式說(shuō)明，其中：
[0026] 圖1為實(shí)施例1對(duì)iNOS的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果圖。
[0027] 圖2為實(shí)施例1對(duì)IL-12的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果圖。
[0028] 圖3為實(shí)施例1對(duì)Arg的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果圖。
[0029] 圖4為實(shí)施例1對(duì)TNF- α的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果圖。
[0030] 圖5為實(shí)施例2對(duì)Ml型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果圖。
[0031] 圖6為實(shí)施例2對(duì)M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志Arg的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果圖。
[0032] 圖7為實(shí)施例3對(duì)iNOS的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果圖。
[0033] 圖8為實(shí)施例3對(duì)ILlO的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果圖。
[0034] 圖9為實(shí)施例3對(duì)Arg的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 本說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的所有特征，或公開(kāi)的所有方法或過(guò)程中的步驟，除了互相排斥 的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。
[0036] 本說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的任一特征，除非特別敘述，均可被其他等效或具有類(lèi)似目的的 替代特征加以替換。即，除非特別敘述，每個(gè)特征只是一系列等效或類(lèi)似特征中的一個(gè)例子 而已。
[0037] 實(shí)施例1綠原酸促進(jìn)單核細(xì)胞向Ml型巨噬細(xì)胞極化
[0038] (1)動(dòng)物模型的建立
[0039] 小鼠黑色素瘤B16模型，選用C57BL/6小鼠，雄性，18-22g。實(shí)驗(yàn)時(shí)，取生長(zhǎng)良好的 腫瘤組織，剪碎，研磨，過(guò)濾，用無(wú)菌生理鹽水按1 :3比例稀釋后，制成腫瘤細(xì)胞懸液，每只 小鼠腋背部接種〇.2ml腫瘤細(xì)胞懸液。接種后次日動(dòng)物隨機(jī)分組，稱(chēng)重，并開(kāi)始給藥。綠原 酸注射液給藥體積為每IOg小鼠腹腔注射〇. 2ml，每日1次，連續(xù)給藥13天。
[0040] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共分4組，陰性對(duì)照組、綠原酸5mg/kg、綠原酸10mg/kg、綠原酸20mg/kg 三個(gè)劑量組。每組15只動(dòng)物。綠原酸停藥后次日處死動(dòng)物，稱(chēng)體重，剝瘤并稱(chēng)瘤重。根據(jù) 腫瘤重量計(jì)算腫瘤抑制率（％)。體重及瘤重用均值土標(biāo)準(zhǔn)差（X土SD)表示。
[0041] ⑵樣本收集
[0042] 成功麻醉小鼠后，摘除其雙側(cè)眼球放血致死，確定小鼠無(wú)自主心跳后，手提鼠尾將 小鼠整只置于75%酒精中浸泡5-10秒，取出后將其四肢固定在小鼠手術(shù)臺(tái)上，小鼠呈仰臥 位腹面朝上。用5ml無(wú)菌注射器預(yù)先抽取37°C預(yù)熱無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基5ml，用鑷子提起小 鼠中下腹部皮膚，向腹腔中注入5ml預(yù)先抽取的37°C預(yù)熱無(wú)血清培養(yǎng)基（注意針尖朝上，避 開(kāi)腸管和脂肪），然后輕輕揉壓雙側(cè)腹膜壁約20-30秒，使腹腔內(nèi)液體充分流動(dòng)。收集腹腔 液時(shí)，先用手術(shù)剪在小鼠下腹部皮膚剪開(kāi)一小口，向兩側(cè)撕開(kāi)皮膚，完全暴露腹膜，用75 % 酒精棉球擦拭腹膜消毒。再用眼科剪在小鼠腹膜剪開(kāi)一小口約〇. 5-lcin，用5ml無(wú)菌注射 器回抽腹腔液（盡量不要吸到腸管和脂肪，否則容易引起成纖維細(xì)胞污染），轉(zhuǎn)移至15. Oml 離心管。1200rpm/min離心5分鐘，去掉上清液。用無(wú)菌生理鹽水重懸至1200~1，轉(zhuǎn)移至 1.5ml離心管，待用。
[0043] 在剪碎的腫瘤組織中，根據(jù)組織塊沉淀體積，加入相當(dāng)于腫瘤組織10倍體積的酶 工作液（IX，含IV型膠原酶（lmg/ml)、透明質(zhì)酸酶（1% )、DNA酶1(0. 25% ))，將離心管置 于37t :水浴消化2小時(shí)左右，直至腫瘤組織充分消化，酶消化期間每隔10-15分鐘振蕩離 心管1次。當(dāng)離心管內(nèi)液體變渾獨(dú)，腫瘤組織塊已分散，且失去塊狀的形態(tài)，一經(jīng)搖動(dòng)即成 細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，可認(rèn)為腫瘤組織塊已充分消化。酶消化時(shí)間可以根據(jù)腫瘤組織消化程 度適當(dāng)縮短或延長(zhǎng)。充分混勻液體，吸取腫瘤組織消化液，經(jīng)7 (Hun不繡鋼濾網(wǎng)過(guò)濾到新的 15. Oml離心管中，去除未消化的較大組織塊。1200rpm/min離心5分鐘，去掉上清液。用無(wú) 菌生理鹽水重懸細(xì)胞至1200~11，移至I. 5ml離心管待用。
[0044] (3)采用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表型進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)樣品的相應(yīng) 標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)。其結(jié)果如圖1-3所示，其中，圖1、2、3分別為實(shí)施例1對(duì)iNOS、IL-12、