恢復(fù)排泄物微生物群的組合物及其制造和使用方法
【專利說明】恢復(fù)排泄物微生物群的組合物及其制造和使用方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明大體涉及醫(yī)學(xué)和胃腸病學(xué)，藥理學(xué)和微生物學(xué)。在可選的實(shí)施方案中，本發(fā) 明提供了用于治療哺乳動物中各種疾病和病癥的組合物和方法，所述疾病和病癥包括在胃 腸道中存在異常微生物群或微生物群落異常分布的慢性疾病。在可選的實(shí)施方案中，本發(fā) 明提供了源自經(jīng)處理（例如過濾和/或離心）的人排泄物（例如糞便）的流體制劑或配制 物，所述處理使得去除了所有細(xì)菌、真菌孢子和病毒，但是保留了來自于排泄物的天然生物 活性分子。在可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了"粗"過濾，"不完全"過濾或中等程度過濾 的微生物群，其仍包含細(xì)菌的天然生理成分或營養(yǎng)因子，例如，保留了天然生物活性成分或 營養(yǎng)活性成分。在可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與本發(fā)明的流體制劑或配制物相組合 的高度過濾的或基本上純化的微生物群，或者添加回本發(fā)明的流體制劑或配制物的高度過 濾的或基本上純化的微生物群。在可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在其中培養(yǎng)，或在厭氧 條件下培養(yǎng)，或在厭氧條件下收獲、保存和/或培養(yǎng)細(xì)菌或微生物群組分的組合物或配制 物。在可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療這些病癥疾病和病癥的各種添加物，組合 物和供體限制條件。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 人胃腸（GI)微生物菌群落，又被稱為微生物群，與人微生物組包含約25, 000個基 因相比，包含大約330萬基因?？偟倪@些基因組合物被稱為人腸道微生物組。野生型，或正 常的GI微生物群包含超過1，200-1，500種不同的細(xì)菌物種和少量病毒及一些真菌。GI微 生物群中有其他組分，包括纖維蛋白，少量未吸收的碳水化合物，粘液，灰分，礦物鹽，微量 元素，脂肪，微量營養(yǎng)素，死菌和偶爾未消化的食物。
[0004] 在細(xì)胞數(shù)目方面，微生物群組成了非常大的活的人體結(jié)構(gòu)組分。據(jù)說，GI微生物 群內(nèi)活菌細(xì)胞的絕對數(shù)目超過人體所有活細(xì)胞約9倍。確實(shí)，按照細(xì)胞計(jì)數(shù)，我們?yōu)?0%人 和90 %細(xì)菌群落。
[0005] 因此，人GI微生物群被認(rèn)為是"虛擬器官"，其在我們體內(nèi)具有"活的"人體器官的 特征，并且產(chǎn)生后具有解剖學(xué)、生理學(xué)、病理學(xué)和其他特點(diǎn)的器官形成特征。GI微生物群具 有發(fā)育不良或被各種寄生蟲、病毒、真菌或細(xì)菌感染的可能性。因此，需要開發(fā)對于此類器 官的治療。除了抗生素之外，正如其他器官，移植是一種可能的治療。
[0006] 當(dāng)受到可暫時或長期停留，甚至在菌群中終身存活的各種病原體侵入時，就是這 種GI微生物群構(gòu)成了我們以前沒有意識到的與小腸和大腸有關(guān)的各種疾病，這些疾病由 "超級感染"我們的最大器官引起，例如引起腸易激綜合征（IBS)，艱難梭狀芽胞桿菌感染 (CDI)，腹瀉，假膜性結(jié)腸炎等等。
[0007] 最近在我們對于腸道菌群相關(guān)病癥的理解方面有了極大的擴(kuò)展。這些病癥中一些 易于理解為由異常細(xì)菌所引起，例如沙門氏菌腸炎，而諸如肥胖的其他病癥在機(jī)制方面更 難于理解，所述機(jī)制可能在肥胖的因果關(guān)系中起作用但仍起源于腸道菌群。然而，目前與GI 微生物群例如腸微生物組相關(guān)的各種病癥的名單正在增長。目前認(rèn)為，僅舉幾個例子來說， 諸如IBS，結(jié)腸炎，克羅恩氏病，便秘，代謝綜合征的病癥在很大程度上是由異常的腸道菌落 或異常的GI微生物群引起。
[0008] 在研宄界活躍著試圖修復(fù)菌群并且嘗試和改善或治愈可能由異常的GI微生物群 (即定居在腸道的異常細(xì)菌組合物）介導(dǎo)的此類病癥。抗生素可產(chǎn)生暫時的改善，但是經(jīng)常 失效（例如，復(fù)發(fā)的⑶I)，而這些失效表明對新的治療方法的需求。
[0009] 所有此類病癥共有的常見基本因素是它們的發(fā)作是在一些外來侵入GI感染之 后，即使父母可能不記得這個，因?yàn)樗赡馨l(fā)生在十幾年前，例如，正如IBS或便秘。在這些 病癥中有許多不能通過培養(yǎng)來證明感染，因?yàn)槿薌I微生物群（GI菌落）中存在著超過330 萬個不同的微生物基因和數(shù)量相當(dāng)大的亞種，因此微生物亞種水平組合物的多樣性是相當(dāng) 巨大的，而在這些中只有很小的百分比可被培養(yǎng)。因此，大多數(shù)這些病癥不可能是簡單超級 感染特定單一病原體的結(jié)果，例如，正如CDI，并且也不可能很快就可以測定哪種特定物種 和/或亞種是任何具體疾病或病癥（病原）的原因或參與了任何具體疾病或病癥。因此， 目前的想法是，可能最有效的療法（例如，對CDI而言）應(yīng)當(dāng)是僅僅找到用于輸注供體菌群 的適當(dāng)組合物和遞送系統(tǒng)，從而可以逆轉(zhuǎn)或改善隱藏的或病原菌過度生長的狀態(tài)。
[0010] 糞便微生物群移植（FMT)以前又被稱為"糞便細(xì)菌療法"（例如，參見 Borody (2004) J. Clin. Gast. 38:475-483)，其代表允許結(jié)腸微生物群落正常組分最迅速重 建的治療方法。它是患有重度CDI尤其是復(fù)發(fā)CDI的患者最新的治療手段。現(xiàn)在FMT在 醫(yī)學(xué)上越來越被認(rèn)可；然而，存在對改進(jìn)基于FMT療法的不足的需求。雖然有良好供體FMT 物質(zhì)的廣泛實(shí)用性，仍需要設(shè)計(jì)臨床活性組分的復(fù)合物，該復(fù)合物是患者可接受的，例如不 類似于未加工的有氣味的糞便，而是將獲得更廣泛的患者和醫(yī)師接受度的更可接受的藥 物樣"生物"組合物。為廣泛的患者和醫(yī)師團(tuán)體更為接受的臨床活性FMT組合物的需求在 非絕癥的患者范圍是有需求的（其中接受度是很高的）。未加工的均質(zhì)化人糞便的植入 (例如移植）已消除⑶I，并且供體菌群植入長時間段，例如，參見Grehan (2010) J. Clin. Gastroenterol. 44(8):551-561〇
[0011] 發(fā)明概述
[0012] 在可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，包括配制物，藥物組合物，食物，飼 料，補(bǔ)充劑，制造產(chǎn)品等，其包含處理的或未處理的人GI微生物群，或部分、基本上或完全 分離的人GI微生物群；以及制備和使用它們的方法。
[0013] 在可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了以下組合物及其制備、保存和使用方法，并且 本發(fā)明提供了以下組合物的方法和用途：
[0014] (1)流體制劑
[0015] 在可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了源自經(jīng)處理（例如過濾和/或離心）的人排 泄物（例如糞便）的流體制劑或配制物，所述處理使得去除了所有細(xì)菌、真菌孢子和病毒， 但是保留了來自于排泄物的天然生物活性分子，所述流體制劑或配制物包括，例如細(xì)菌分 泌產(chǎn)物，如，例如細(xì)菌素（包括大腸桿菌素，troudulixine或putaindicine，或小菌素或 subtilosin A)，Ianbiotics (包括蘇云金菌素，乳酸鏈球菌肽，枯草菌素，表皮素，變鏈素 (mutacin)，美殺菌素（mersacidin)，阿肽加定（actagardine)，肉桂霉素），乳鏈球菌素和 其他成孔肽毒素；其中流體制劑的這些和/或其他組分可以用作抗孢子（例如，抗艱難梭狀 芽孢桿菌孢子），抗菌和/或抗炎化合物（例如，白細(xì)胞介素，細(xì)胞因子）；并且還包括由微 生物群的細(xì)菌或其他微生物產(chǎn)生的其他生物活性分子（BAMs)。然而，這種過濾水平保留了 亞病毒大小的噬菌體，并將有助于這種濾液的治療能力。
[0016] (2) "耜"討濾，"不完全"討濾或中等稈度討濾的微牛物群
[0017] 在可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了"粗"過濾，"不完全"過濾或中等程度過濾的 微生物群，其仍包含細(xì)菌的天然生理成分或營養(yǎng)因子，例如，保留了天然生物或營養(yǎng)活性成 分，例如，如以上所述的細(xì)菌分泌產(chǎn)物，包括例如，抗菌（例如，抗孢子）和抗炎產(chǎn)物。在一 實(shí)施方案中，取排泄物（例如，糞便），使其溶解和均質(zhì)化，并通過孔徑逐漸變小的過濾器或 濾網(wǎng)，在0.1 mm篩孔/濾孔處停止；由此保留了生物和營養(yǎng)活性的天然流體組分。
[0018] 這種"粗"過濾，"不完全"過濾或中等程度過濾的微生物群示例性實(shí)施方案與高度 純化的制劑形成對比，例如，如Sadowsky等在WO 2012/122478 Al中所述，他通過繼續(xù)通過 更小的篩孔過濾，直到糞便通過濾網(wǎng)直至〇. 020_而制備出FMT物質(zhì)，由此產(chǎn)生極高度純化 的微生物群團(tuán)塊，具有遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過95%單獨(dú)的細(xì)菌細(xì)胞，然而丟棄了周圍天然的"生物和營養(yǎng) 活性"流體物質(zhì)。
[0019] 在可選的實(shí)施方案中，通過保持它的天然流體組分和小的纖維分子以為微生物群 落提供營養(yǎng)物，這種示例性"粗過濾"或"中等程度過濾"的組合物保持它的生理學(xué)狀態(tài)，還 有重要的營養(yǎng)狀態(tài)。在這種示例性實(shí)施方案中，"不完全"過濾如最終直至約〇. Imm的篩孔， 留下了供體菌群，從而允許為細(xì)菌殘留了一些生理"食物"，并保留了具有其抗微生物（例 如，抗孢子）和抗炎產(chǎn)物的流體組分。
[0020] (3)高度討濾或基本h純化的微牛物群添加回流體制劑或配制物
[0021] 在可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與本發(fā)明的流體制劑或配制物（如上文（1) 組中所概述）相組合的高度過濾或基本上純化的微生物群，或者添加回本發(fā)明的流體制劑 或配制物（如上文（1)組中所概述）的高度過濾或基本上純化的微生物群。通過將高度過 濾或基本上純化的微生物群"添加回"或復(fù)原本發(fā)明的流體制劑或配制物，最終的組合物或 配制物的性質(zhì)被極大地增強(qiáng)，例如，高度過濾或基本上純化的微生物群現(xiàn)在具有本發(fā)明的 流體制劑或配制物的性質(zhì)，例如，如（1)組中所概述。
[0022] 在可選的實(shí)施方案中，該實(shí)施方案使用基本上分離或純化的糞便菌群或整個（或 基本上整個）微生物群，所述微生物群為（或包含）至少約90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%分離或純的糞便 菌群分離物，或者具有不超過約 〇. l%、〇. 2%、0. 3%、0. 4%、0. 5%、0. 6%、0. 7%、0. 8%、 0. 9 %或I. 0 %或更多的非糞便菌群物質(zhì)的糞便菌群分離物。在可選的實(shí)施方案中，該實(shí)施 方案使用基本上分離、純化、或基本上整個微生物群，如Sadowsky等在WO 2012/122478A1 中所述，或如Borody等在WO 2012/016287 A2中所述。
[0023] (4)培養(yǎng)的和/或厭氣的微牛物群
[0024] 在可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物或配制物，其中將高度過濾或基本上 純化的微生物群組合物與如以上（3)所述的添加回的流體組分置于富集培養(yǎng)物中，任選地 在厭氧條件下，或任選地在厭氧條件下收獲，保存和/或培養(yǎng)。
[0025] 在可選的實(shí)施方案中，培養(yǎng)細(xì)菌或微生物群組分約2小時至約72小時，或約1小 時至24小時，或約30分鐘至12小時，從而增加細(xì)菌數(shù)目及其產(chǎn)物，而不需要使用大量供 體。
[0026] 在可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了配制物或藥物制劑，其包含：
[0027] (a)⑴獲取自排泄物的流體制劑，其中所述流體制劑能夠通過至少約0. 22微米 的過濾器，并且不含任何或基本上所有的完整病毒、真菌孢子和細(xì)菌，但是保留了噬菌體； 或
[0028] (ii)通過包括以下的方法制備的流體制劑：（1)提供排泄物；和（2)使排泄物通 過至少約0. 22微米（μ )的過濾器，從而使得濾液不含任何或基本上所有的完整病毒、真菌 孢子和細(xì)菌，
[0029] 其中任選地，在所得到的流體制劑最終通過至少約0. 22微米的過濾器之前，使排 泄物通過一系列尺寸逐漸變小的過濾器，
[0030] 和任選地，在使排泄物通過至少約0. 22微米的過濾器之前，首先離心排泄物，并 將上清液用作步驟（i)或（ii)中流體制劑的起始物質(zhì)，
[0031] 和任選地，在排泄物通過至少約0. 22微米的過濾器之前和/或在離心之前，首先 用鹽水或緩沖液使排泄物均質(zhì)化，
[0032] 和任選地，在排泄物通過至少約0. 22微米的過濾器之前，用一個或幾個過濾器來 過濾起始排泄物或離心后的上清液，從而最終從流體制劑去除所有（或基本上所有）細(xì)菌 來源的細(xì)胞，或最終從流體制劑去除所有（或基本上所有）直徑小于約5微米（μ m)的細(xì) 胞；
[0033] (b) (a)的流體制劑，其中所述排泄物由人排泄物組成；
[0034] (c) (a)或（b)的流體制劑，還包括添加至所述流體制劑的以下成分：纖維，生物活 性蛋白或肽，微量營養(yǎng)素，脂肪，糖或小碳水化合物，微量元素，礦物鹽，灰分，粘液，氨基酸， 營養(yǎng)物，維生素或礦物質(zhì)，或其全部或其任意組合，任選地，"添加回"以復(fù)原"野生型"健康 菌群或人微生物群環(huán)境；
[0035] (d) (a)至（C)中任一所述的流體制劑，其用于冷凍或冷凍-干燥而進(jìn)一步處理或 配制成粉末或等同物，和任選地，還包含冷凍保護(hù)劑、凍干保護(hù)劑或防腐劑；或者
[0036] (f) (d)中的流體制劑，其通過在液體中復(fù)原冷凍或凍干的粉末來進(jìn)一步處理或配 制，其中任選地，所述液體為無菌鹽水。
[0037] 在可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含以下的配制物或藥物制劑：
[0038] (a) (i)高度過濾或基本上純化的微生物群，和（ii)本發(fā)明所述的流體制劑或配 制物；
[0039] (b) (a)的配制物或藥物制劑，其中高度過濾或基本上純化的微生物群包含基本上 分離或純化的糞便菌群或整個（或基本上整個）微生物群，或由基本上分離或純化的糞便 菌群或整個（或基本上整個）微生物群組成；
[0040] (c) (a)或（b)的配制物或藥物制劑，其中高度過濾或基本上純化的微生物群包 含糞便菌群分離物或由糞便菌群分離物組成，所述糞便菌群分離物為至少約90%、91 %、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%、99· 6%、99· 7%、99· 8%或 99. 9%分 離或純的糞便菌群分離物，或者具有不超過約0. l%、〇. 2%、0. 3%、0. 4%、0. 5%、0. 6%、 0. 7%、0. 8%、0. 9%或1. 0%或更多的非糞便菌群物質(zhì)；
[0041] (d) (a)至（c)中任一所述的配制物或藥物制劑，其中高度過濾或基本上純化的微 生物群包含以下或由以下組成：如Sadowsky等在WO 2012/122478 Al中所述或者如Borody 等在WO 2012/016287 A2中所述的基本上分離、純化或基本上整個微生物群；
[0042] (e) (a)至（d)中任一所述的配制物或藥物制劑，其中通過使用血漿除去法，離心 法，細(xì)胞分離法（celltrifuge)，柱色譜法，親和色譜法，免疫沉淀法，或固定在固體表面、珠 或平板的抗體來制備高度過濾或基本上純化的微生物群；
[0043] (f) (a)至（e)中任一所述的配制物或藥物制劑，其中本發(fā)明所述的流體制劑或配 制物組成最終配制物或藥物制劑體積的約1 %至99 %，或者約1 %、10 %、20 %、30 %、40 %、 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95% 或更多；
[0044] (g) (a)至（f)中任一所述的配制物或藥物制劑，其用于冷凍或冷凍-干燥以進(jìn)一 步處理或配制成粉末或等同物，和任選地，還包含冷凍保護(hù)劑、凍干保護(hù)劑或防腐劑；或者
[0045] (h) (g)中所述的流體制劑，其通過在液體中復(fù)原冷凍或凍干的粉末來進(jìn)一步處理 或配制，其中任選地，所述液體為無菌鹽水。
[0046] 在可選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了配制物或藥物制劑，其包含：
[0047] (a) (i) "粗"過濾，"不完全"過濾或中等程度過濾的微生物群，其包含糞便樣品或 分離物，所述糞便樣品或分離物包含或保留微生物群細(xì)菌的天然或野生型生理成分或營養(yǎng) 因子，
[0048] 其中任選地，所述樣品或分離物能夠通過約0.1 mm的篩孔或?yàn)V孔；或者
[0049] (ii)通過包括以下的方法制備的包含糞便樣品或分離物的"粗"過濾，"不完全" 過濾或中等程度過濾的微生物群：（1)提供排泄物；和（2)使排泄物通過約0.1 mm的篩孔或 濾孔；
[0050] (b) (a)的包含糞便樣品或分離物的"粗"過濾，"不完全"過濾或中等程度過濾的 微生物群，其中所述糞便樣品或分離物由人排泄物組成；
[0051] (C) (a)或（b)的包含糞便樣品或分離物的"粗"過濾，"不完全"過濾或中等程度 過濾的微生物群，其還包含加入以下成分：纖維，生物活性蛋白或肽，微量營養(yǎng)素，脂肪，糖 或小碳水化合物，微量元素，礦物鹽，灰分，粘液，氨基酸，營養(yǎng)物，維生素或礦物質(zhì)，或其全 部或其任意組合，任選地，"添加回"以復(fù)原"野生型"健康菌群或人微生物群環(huán)境；