膚吸收的主要途徑。藥物要達(dá)到透皮吸收的作用，需要達(dá)到以下要求:計(jì)量小而作用強(qiáng)；分子量大于600的物質(zhì)較難通過角質(zhì)層；有機(jī)弱酸或有機(jī)弱堿藥物以分子形式存在，有較大的經(jīng)皮透過能力；脂溶性藥物透皮吸收效果理想，而離子型藥物一般不易透過角質(zhì)層。黃芩素分子量為270.24，分子式如圖1，屬于有機(jī)弱酸性藥物，并且具有很好的脂溶性，可以很好地達(dá)到透皮吸收的效果，并且透皮吸收達(dá)到真皮層后，由于其良好的脂溶性，不會(huì)被親水性組織吸收擴(kuò)散到毛細(xì)血管進(jìn)入體循環(huán)，因此可以達(dá)到局部作用的效果，而不會(huì)作用于除皮膚組織以外的其它組織器官。
[0042]2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、免疫組化染色、Masson三色染色及天狼星紅染色一一顯示組織內(nèi)膠原
[0043]2.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
[0044]張力誘導(dǎo)的增生性瘢痕模型:
[0045]取12只體重相近年齡為8周的雌性昆明小鼠，將背部毛發(fā)剔除干凈，隨機(jī)平均分成(I)張力+DMSO組；(2)張力+黃芩素組，每組12只。每只小鼠背部皮膚中線上半部分垂直皮膚全層切開，切口 1.5厘米，張開后及時(shí)做全層間斷縫合。4天后拆線，用縫線固定牽開器并開始施加機(jī)械張力。同時(shí)在張力+DMSO組小鼠切口局部涂抹DMS0，張力+黃芩素組小鼠切口局部涂抹黃芩素(濃度為10 μ M)，每天三次，第14及28天將各組一半小鼠處死，取小鼠切口處皮膚，用4%多聚甲醛于室溫下固定過夜。流水沖洗過夜洗凈，按照標(biāo)準(zhǔn)石蠟組織包埋方法，將皮膚組織進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等處理，得到皮膚組織石蠟切片(5 μ m) ο
[0046]2.2免疫組化染色
[0047]切片經(jīng)充分脫蠟后，用PBS洗凈。用EDTA修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)并滅活內(nèi)源性過氧化物酶。加入5%胎牛白蛋白進(jìn)行非特異蛋白結(jié)合位點(diǎn)封閉。加入一抗ant1-PCNA(Abcam)或ant1-a-SM(Abcam)，4°C下孵育過夜。TBS洗滌標(biāo)本3次。加入帶HRP標(biāo)記的二抗。室溫下孵育15分鐘。TBS洗標(biāo)本3次(每次洗5分鐘，震蕩，洗干凈)甩去多余液體。DAB染色10分鐘。蘇木素復(fù)染I分鐘，1%鹽酸酒精分化。復(fù)染后自來水沖洗干凈，用100%，95%，85%，75%酒精脫水，二甲苯透明兩次，每次5分鐘。中性樹脂封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察免疫組化染色結(jié)果。
[0048]2.3Masson 三色染色
[0049]Masson染色是顯示組織中纖維蛋白染色的主要方法之一。該法染色原理與陰離子染料分子的大小和組織的滲透有關(guān)。分子的大小由分子量來體現(xiàn)，小分子量易穿透結(jié)構(gòu)致密、滲透性低的組織，而大分子量則只能進(jìn)入結(jié)構(gòu)疏松的、滲透性高的組織。淡綠分子量最大。因此Masson染色肌纖維呈紅色，膠原纖維蛋白呈藍(lán)色，主要用于區(qū)分膠原纖維蛋白和肌纖維蛋白。用Masson復(fù)合染色液染色5min，水洗，磷鉬酸染色5min，用干，苯胺藍(lán)染色5min，水洗，必要時(shí)可分化。流水沖洗lOmin，用95%酒精快速分化，梯度無水酒精脫水，二甲苯透明，封固。
[0050]2.4天狼星紅染色
[0051]天狼星紅染色是膠原纖維染色權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法?？蓪⒛z原纖維染成紅色，非膠原組織則不著色。且天狼星紅染色后的膠原組織在偏光顯微鏡下經(jīng)過偏振光的折射，可以區(qū)分出I型膠原與III型膠原，其中I型膠原呈紅色，III型膠原呈綠色。用天狼星紅染色液染色I(xiàn)小時(shí)，水洗。蘇木素復(fù)染I分鐘。復(fù)染后自來水沖洗干凈，用梯度無水酒精脫水，二甲苯透明兩次，每次5分鐘。中性樹脂封片。
[0052]3、細(xì)胞分離和培養(yǎng)
[0053]皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞:皮膚瘢痕來源于第九人民醫(yī)院整形外科切除的皮膚瘢痕組織(經(jīng)過患者同意)。皮膚瘢痕組織消毒干凈后，將組織中的皮下脂肪組織去除(保證去除干凈，同時(shí)不損傷瘢痕組織)，將皮膚瘢痕樣本切成小長條形，浸泡于8UM的中型蛋白酶(dispase I,Roche,USA)中，于4°C冰箱內(nèi)消化過夜。消化12-16小時(shí)，用顯微鑷將表皮層從真皮層分離丟棄，剩下的瘢痕組織用375U/ml的I型膠原酶(Sigma-Aldrich)于37°C消化半小時(shí)，不時(shí)震蕩。消化液用濾網(wǎng)過濾后，將濾液離心得到細(xì)胞沉淀，用含10%胎牛血清(Gibco)、100U/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素的DMEM-高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，接種到1mm培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，未貼壁的死細(xì)胞在24小時(shí)后換液時(shí)被吸走。第2至5代的細(xì)胞用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析。
[0054]Western blot 檢測蛋白表達(dá)
[0055]進(jìn)行a -SMA檢測時(shí)，皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞用2ng/ml的TGF- β I刺激同時(shí)分別用DMSO和黃芩素(I μΜ、5μΜ、10μΜ)處理，3天后收集細(xì)胞。進(jìn)行TGF β信號(hào)通路分析時(shí)，皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞分別用DMSO和黃芩素(I μΜ、5μΜ、10μΜ)處理，12h后收集細(xì)胞。收集的細(xì)胞樣品用細(xì)胞裂解液在冰上裂解細(xì)胞30分鐘。細(xì)胞裂解液成分為:50mM Tris - HCl，pH7.4，150mM NaCl, I % Nonidet P-40，0.I % SDS，蛋白酶抑制劑混合物(lOmg/ml leupeptin，lOmg/ml pepstatin A和lOmg/ml aprotinin)。反復(fù)吹打至細(xì)胞裂解，冰上孵育30min。4°C，12000rpm離心5min，將上清轉(zhuǎn)移備用。蛋白濃度測定采用BCA蛋白濃度測定試劑盒。蛋白樣品上樣量為20 μ g，在8 % SDS - PAGE跑膠并轉(zhuǎn)膜到PVDF蛋白膜上。將PVDF膜浸于一抗孵育液，所用一抗 ant1-a-SMA(Abcam)稀釋比例為 1:1000，ant1-Smads (1:1000，Cell Signaling Technology)，ant1-TGF-β I,ant1-TGFβ RI,ant1-TGFβ RH(1:1000，CellSignaling Technology)。GAPDH作為內(nèi)參抗體，稀釋比例1:10000。4°C過夜，以TBST洗膜。將PVDF膜浸入含HRP標(biāo)記的二抗孵育液中，在室溫下?lián)u晃孵育90-120min，再以TBST洗膜，方法同前。采用Tanon成像儀掃描蛋白條帶。
[0056]5、免疫熒光染色
[0057](I) a-SMA及鬼筆環(huán)肽染色
[0058]皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞分為2組，分別為:對(duì)照組、黃芩素組。兩組細(xì)胞用2ng/ml的TGF-β I刺激同時(shí)分別用DMS0、黃芩素(10 μ Μ)處理48h及72h，移去培養(yǎng)液，用PBS洗滌一次后，用4%多聚甲醛于室溫下固定細(xì)胞15分鐘，移去固定液，用PBS洗滌3次，每次10分鐘。加入透膜液0.25% TritonXlOO，透膜10分鐘。加入3%胎牛白蛋白進(jìn)行非特異蛋白結(jié)合位點(diǎn)封閉。封閉后，加入一抗ant1-a-SMA (1:200，Abeam)及Alexa Fluor 488標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽 Phalloidin (1:200, Cytoskeleton, Inc, Denver, CO, USA)于室溫下染色 2 小時(shí)。用PBST震蕩洗滌3次，每次10分鐘。加入按1:500比例稀釋的相應(yīng)的帶熒光標(biāo)記的羊抗兔或者抗鼠的二抗(Invitrogen)，室溫下孵育I小時(shí)，染色結(jié)束后，加入100 μ I DAPI (2mg/ml, Invitrogen)進(jìn)行細(xì)胞核染色10分鐘。染色結(jié)束后，于激光共聚焦顯微鏡下觀察。
[0059](2) Smad2/3 染色
[0060]皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞分為2組，分別為:對(duì)照組、黃芩素組。兩組細(xì)胞用2ng/ml的TGF-β I刺激同時(shí)分別用DMS0、黃芩素(10 μΜ)處理2小時(shí)，移去培養(yǎng)液，用PBS洗滌一次后，用4%多聚甲醛于室溫下固定細(xì)胞10分鐘，移去固定液，用PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入透膜液0.25% TritonXlOO，透膜10分鐘。加入3%胎牛白蛋白進(jìn)行非特異蛋白結(jié)合位點(diǎn)封閉。封閉后，加入一抗 anti_Smad2/3 (1:200，Cell Signaling Technology)，室溫下孵育2小時(shí)，將染色液洗去，用PBST震蕩洗滌3次，每次10分鐘。加入按1:500比例稀釋的相應(yīng)的帶熒光標(biāo)記的羊抗兔的二抗(Invitrogen)，室溫下孵育I小時(shí)，染色結(jié)束后，加入100 μ I DAPI (2mg/ml, Invitrogen)染細(xì)胞核，染核10分鐘后，將染色液洗去，用PBST震蕩洗滌3次，每次10分鐘，如前所述。染色結(jié)束用抗熒光淬滅封片劑封片。于激光共聚焦顯微鏡下觀察蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位。
[0061]二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0062]1、黃芩素抑制張力誘導(dǎo)的小鼠增生性瘢痕形成
[0063]首先，我們建立了張力誘導(dǎo)的小鼠增生性瘢痕模型，通過組織牽開器對(duì)皮膚切口施加張力從而造成皮膚增生性瘢痕的形成。與張力+DMSO組相比，每天局部應(yīng)用黃芩素可以顯著降低瘢痕的大體觀、橫切面大小及瘢痕指數(shù)(圖2A)。統(tǒng)計(jì)張力+DMSO組和張力+黃芩素組小鼠瘢痕大體觀、橫切面大小及瘢痕指數(shù)求其平均值，分別為大體面積:58.89±10.28mm2； 17.59±5.25mm2，橫