一種豬瘟活疫苗的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種制備豬瘟活疫苗的方法，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬瘟（Classical Swine Fever，CSF)俗稱"爛腸瘟"，是由豬瘟病毒引起的一種急 性熱性全身性敗血性傳染病，各種年齡豬只均可發(fā)病，病程從急性到慢性等多種多樣。一年 四季流行，傳染性極強，具有高度發(fā)病率和死亡率，一旦發(fā)生具有毀滅性。目前使用的豬瘟 病毒兔化弱毒（C株)是國際公認(rèn)的最佳豬瘟病毒疫苗株，已被歐洲很多國家采用，它有效的 控制了豬瘟的流行。近年來，豬瘟常有免疫失敗的報道，其原因雖然很多，但疫苗的質(zhì)量有 很重要的影響。
[0003] 豬瘟活疫苗現(xiàn)在采用的仍是傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝技術(shù)，隨著生物反應(yīng)器在獸用 疫苗行業(yè)逐步應(yīng)用，許多企業(yè)也致力于開發(fā)生物反應(yīng)器生產(chǎn)工藝技術(shù)，但是由于豬瘟病毒 及制苗細(xì)胞的生物學(xué)特性，還經(jīng)常出現(xiàn)半成品效價低、批間差異大、疫苗質(zhì)量不夠穩(wěn)定等問 題，這就限制了豬瘟活疫苗的質(zhì)量與產(chǎn)量。因此從行業(yè)需求出發(fā)，也急需開發(fā)一種高效、快 捷、穩(wěn)定的豬瘟活疫苗生產(chǎn)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種豬瘟活疫苗的制備方法，它具有產(chǎn)品質(zhì)量批間穩(wěn)定性 高，產(chǎn)品副反應(yīng)發(fā)生率低、工藝簡單、成本低，適于規(guī)?；a(chǎn)的特點。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 一種豬瘟活疫苗的制備方法，制備按以下步驟進(jìn)行： a. 生產(chǎn)用細(xì)胞的制備 用EDTA-胰酶細(xì)胞分散液消化已長滿良好單層的豬睪丸細(xì)胞（ST)，加入細(xì)胞生長液終 止消化，制備細(xì)胞懸液。將豬瘟病毒毒種與細(xì)胞懸液同步接入轉(zhuǎn)瓶中，補入細(xì)胞生長液進(jìn)行 培養(yǎng)，每4d收獲一次毒液，收獲1~3次，收獲后補加細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)，最后一次收獲 毒液后將帶毒細(xì)胞消化、凍存，作為生產(chǎn)用細(xì)胞，備用； 所述豬瘟病毒毒種為豬瘟兔化弱毒株脾毒或豬瘟兔化弱毒株細(xì)胞毒； b. 制苗用毒液的制備 復(fù)蘇生產(chǎn)用細(xì)胞，接種至轉(zhuǎn)瓶或生物反應(yīng)器中培養(yǎng)。細(xì)胞長滿后更換細(xì)胞維持液繼續(xù) 培養(yǎng)，每2d或4d收獲換液一次，共10~15次，收獲的毒液為制苗用毒液； c. 疫苗制備 向制苗用毒液中加入凍干保護(hù)劑，分裝、凍干，即得豬瘟活疫苗。
[0006] 上述制備方法，所述步驟a中，在接入豬瘟病毒的同時加入聚乙二醇（PEG)，所述 聚乙二醇選用PEG4000和PEG6000, PEG的使用濃度為2% (m:V)。
[0007] 上述制備方法，所述步驟a中，細(xì)胞凍存時二甲基亞砜（DMS0)的使用濃度為10~ 15% (V:V)〇
[0008] 上述制備方法，所述步驟b中，在收獲制苗用毒液過程中，當(dāng)?shù)?~10次收獲換液 時，補入生產(chǎn)用細(xì)胞，補入量為接種量的1/5。
[0009] 上述制備方法，在步驟a和步驟b中，細(xì)胞生長液為含4% (V:V)新生牛血清的低 血清培養(yǎng)基，細(xì)胞維持液為含1% (V:V)新生牛血清的低血清培養(yǎng)基。
[0010] 上述制備方法，在步驟a和步驟b中，所述低血清培養(yǎng)基為低血清DMEM培養(yǎng)基 (DMEM/F12 )或低血清 MEM 培養(yǎng)基（MD611、OPT I -MEM )。
[0011] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果： 1、本發(fā)明采用同步接毒的方法接種豬瘟病毒，且利用PEG促進(jìn)胞膜融合，加快了豬瘟 病毒感染制苗用細(xì)胞的速度，提高了病毒感染率，進(jìn)一步提升病毒產(chǎn)量。
[0012] 2、本發(fā)明將帶毒細(xì)胞直接用于生產(chǎn)，省略了接種病毒步驟，簡化了操作，有利于提 高產(chǎn)品質(zhì)量批間穩(wěn)定性，降低生產(chǎn)成本，更適合規(guī)?；a(chǎn)。
[0013] 3、本發(fā)明在毒液收獲過程中補加生產(chǎn)用細(xì)胞，增加了高效價毒液收獲次數(shù)，提高 了單批次制苗用毒液產(chǎn)量。
[0014] 4、本發(fā)明使用低血清培養(yǎng)基，降低生產(chǎn)成本，減少產(chǎn)品副反應(yīng)發(fā)生率。
【具體實施方式】
[0015] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，其中各實施例僅用于說明本 發(fā)明而并非限定本發(fā)明的專利保護(hù)范圍。
[0016] 豬睪丸細(xì)胞（ST)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；豬瘟病毒疫苗株為豬瘟病毒兔化弱 毒株（C株)，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；豬瘟兔化弱毒株脾毒由本公司自行繁殖并保存。
[0017] 實施例1 本實施例采用轉(zhuǎn)瓶制備豬瘟活疫苗 細(xì)胞生長液的配方為：體積百分含量96%的MD611液，4%新生牛血清，調(diào)整pH值為 7. 2； 細(xì)胞維持液的配方為：體積百分含量99%的MD611液，1%新生牛血清，調(diào)整pH值為 7.4； 1、生產(chǎn)用細(xì)胞的制備 A.從液氮罐中取出凍存的豬睪丸細(xì)胞（ST細(xì)胞)復(fù)蘇后，轉(zhuǎn)至10L轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)，長滿良 好單層后用EDTA-胰酶分散液消化，加入細(xì)胞生長液終止消化后，按1 :2~3分散制備成細(xì) 胞懸液(含細(xì)胞及細(xì)胞生長液)。
[0018] B.按照3. 0g/轉(zhuǎn)瓶的接毒量，稱取豬瘟兔化弱毒株脾毒，去除脂肪組織后研磨， MD611液沖洗，過濾、離心取上清，制備成脾毒懸液。
[0019] C.分別量取細(xì)胞懸液、豬瘟兔化弱毒株脾毒懸液、100ml PEG6000(質(zhì)量濃度20%) 接入轉(zhuǎn)瓶中，補加細(xì)胞生長液至l〇〇〇ml，置于37°C溫室培養(yǎng)。每4d收獲一次，收獲毒液后 補加1000ml細(xì)胞維持液。
[0020] D.第3次收獲完成后，將收獲的病毒液凍存，作為豬瘟兔化弱毒株細(xì)胞毒；消化 帶毒細(xì)胞并凍存，作為生產(chǎn)用細(xì)胞(標(biāo)記為SC3)，使用的凍存液二甲基亞砜（DMS0)使用濃 度為 15% (V:V)。
[0021] 2、制苗用毒液的制備 A、從液氮罐中取出凍存的生產(chǎn)用細(xì)胞（SC3)復(fù)蘇并轉(zhuǎn)至10L轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)，細(xì)胞長滿良 好單層后將培養(yǎng)液更換為細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)。收獲制苗用毒液，每4d收獲換液一次，在 第10次收獲換液時，補入生產(chǎn)用細(xì)胞（SC3)，補入量為接種量的1/5,繼續(xù)培養(yǎng)，收獲至第15 次。收獲的病毒液作為制苗用毒液，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0022] B.制苗用毒液效力檢驗 用標(biāo)準(zhǔn)的兔體定型熱反應(yīng)法測定制苗用毒液效價，15批次收獲病毒液效價均 彡 0? 4X106RID/ml。（如表