專利名稱：一種豬瘟活疫苗的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豬瘟活疫苗的生產(chǎn)方法，屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬瘟(ClassicalSwine Fever，CSF)是由豬癌病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的一種高度接觸性、致死性的豬傳染病，在世界上很多國家和地區(qū)均有發(fā) 生，給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將豬瘟列為法定通報(bào) 性疫病，我國將其劃為一類動物傳染病。目前世界上主要有3種效果較好的豬瘟活疫苗，即日本的GPE株、法國的 Thiverval株和中國的兔化弱毒株(C株)，其中兔化弱毒株應(yīng)用最為廣范并為世界上許多 國家豬瘟的控制和消滅做出了重要貢獻(xiàn)。目前，我國也實(shí)行強(qiáng)制免疫豬瘟弱毒活疫苗作為 控制豬瘟的主要手段。雖然三種疫苗均能有效用于豬瘟防制，但也都存在著一定不足。其中GPE株、 Thiverval株是用豬源傳代細(xì)胞系生產(chǎn)的，其存在已知或未知外源病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)較大，一 旦控制不好，很容易導(dǎo)致某種已有的或新發(fā)現(xiàn)的傳染病大面積流行。其中兔化弱毒活疫苗 目前有兩種生產(chǎn)工藝，第一種工藝是用兔體生產(chǎn)，取接種家兔的組織或淋巴結(jié)或脾臟制苗， 該工藝可以有效避免外源病毒污染，同時保證了病毒的遺傳穩(wěn)定性，病毒毒力不返強(qiáng)，但需 要使用大量家兔，質(zhì)量控制難度較高且生產(chǎn)成本較高；第二種工藝是應(yīng)用牛、羊原代細(xì)胞或 豬傳代細(xì)胞生產(chǎn)，該工藝避免大量使用實(shí)驗(yàn)動物，但存在外源病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)(因?yàn)榕?、?原代細(xì)胞或豬傳代細(xì)胞對很多已知或未知的外源病毒易感)并且病毒遺傳穩(wěn)定性稍差，病 毒有獨(dú)立返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)。另外，豬瘟兔化弱毒是經(jīng)過兔體連續(xù)傳代馴化而成的，種毒并未經(jīng)過 克隆純化，因次不同批次的種毒對同一批家兔或同一批次的種毒對不同批次的家兔感染性 和免疫原性往往存在一定差異。由此可見，亟需一種新的豬瘟活疫苗生產(chǎn)工藝來克服已有 的幾種疫苗存在的不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服豬瘟活疫苗現(xiàn)有生產(chǎn)工藝的不足之處，提供一種用克隆化豬 瘟兔化弱毒種毒接種兔源細(xì)胞或常用細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，收獲病毒液生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方 法。該方法具有生產(chǎn)工藝簡單、易于質(zhì)量控制、外源病毒污染風(fēng)險(xiǎn)小、生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)。 利用本發(fā)明生產(chǎn)的豬瘟活疫苗遺傳穩(wěn)定性好、純凈性高、病毒效價(jià)高、免疫原性強(qiáng)。本發(fā) 明是用豬瘟兔化弱毒株病毒經(jīng)過病毒基因拯救技術(shù)獲得的一株豬瘟兔化弱毒克隆株CSFV CC-2，該病毒株已于2010年7月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心，保藏號為CGMCC No. 4059，將CSFV CC-2通過兔源細(xì)胞和/或常用細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)， 收獲病毒液；將收獲的病毒液加入常用的凍干保護(hù)劑，充分混合后分裝后經(jīng)冷凍真空干燥 而制成凍干活疫苗，每頭份含毒量不低于6000TCID5(i或400RID。包括以下技術(shù)步驟1豬瘟兔化弱毒的克隆與鑒定
CGMCC No. 4059豬瘟兔化弱毒克隆株病毒是通過應(yīng)用病毒基因拯救法將豬瘟兔化 弱毒進(jìn)行克隆，獲得高度適應(yīng)兔源細(xì)胞或常用細(xì)胞、基因型單一并且能穩(wěn)定遺傳的純系豬 瘟兔化弱毒株病毒。1. 1豬瘟兔化弱毒的克隆用病毒基因拯救法進(jìn)行。(1)病毒RNA提取RNA提取試劑盒提取豬瘟兔化弱毒細(xì)胞培養(yǎng)液的總RNA ；(2)全基因組cDNA克?、僭O(shè)計(jì)幾對引物分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，分別進(jìn)行純化、回收，電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物；②將PCR產(chǎn)物分別克隆到載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；③挑取轉(zhuǎn)化成功的菌落，大量培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，雙向測序鑒定；④將重組質(zhì)粒，酶切，純化；⑤將純化產(chǎn)物連接，得到全基因組cDNA ；⑥將全基因組cDNA克隆到載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；⑦篩選重組載體，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，酶切，純化，得到大量全基因組cDNA ；(3)體外 RNA 轉(zhuǎn)錄；(4)體外RNA脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；(5)培養(yǎng)傳代，熒光抗體檢測呈陽性，則克隆成功，命名為CSFV CC_2(該病毒株 已于2010年7月28日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為 CGMCCNo. 4059)；1. 2克隆株的鑒定經(jīng)鑒定，克隆株CSFV CC-2具有以下特性(1)對細(xì)胞的適應(yīng)性將CSFV CC-2接種兔源細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)并取樣測 定毒價(jià)，經(jīng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)最高毒價(jià)彡106 0TCID50/0. 1ml，經(jīng)微載體或懸浮培養(yǎng)最高毒價(jià) ^ IO6 8TCID5tlA). Irnl ；將CSFV CC-I接種常用細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)并取樣測定毒價(jià)，經(jīng)轉(zhuǎn)瓶培 養(yǎng)最高毒價(jià)彡105 0TCID50/0. 1ml，經(jīng)微載體或懸浮培養(yǎng)最高毒價(jià)彡106 °TCID50/0. Iml ；(2)遺傳穩(wěn)定性將CSFV CC-2經(jīng)兔源細(xì)胞連續(xù)傳代并進(jìn)行基因序列測定，第30代 與第1代克隆化種毒核苷酸同源性為99. 9%，氨基酸同源性為100%;將CSFV CC-2經(jīng)常用 細(xì)胞連續(xù)傳代并進(jìn)行基因序列測定，第30代與第1代克隆化種毒核苷酸同源性為99. 5%, 氨基酸同源性為99.9% ；(3)生物學(xué)特性將CSFV CC-2進(jìn)行豬瘟抗體抑制試驗(yàn)，豬瘟抗體能特異性抑制該 種毒的熒光產(chǎn)生；將CSFV CC-2以15TCID5(I (或1RID) /只的劑量靜脈接種健康家兔，結(jié)果 95%產(chǎn)生定型熱或輕型熱；(4)免疫原性將CSFV CC-2以150RID/只的免疫劑量肌肉接種非免疫健康豬， 抗體平均最高滴度達(dá)到1 128，平均持續(xù)時間為400d;免疫后2周攻Iml豬瘟石門血毒 (IO5MLD/Iml)，100%保護(hù)，最高體溫彡41%且持續(xù)不超過3d ；(5)安全性將 CSFV CC-2(彡 105 °TCID50/0. lml) IOml 注射家兔、IOOml 注射豬、 5ml注射豚鼠、Iml注射小鼠均不引起死亡；2疫苗的制備2. 1種毒的繁殖
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將CSFV CC-2種子批種毒接種生長良好的兔源細(xì)胞或常用細(xì)胞的種子批細(xì)胞，培 養(yǎng)3 4天后收毒，作為生產(chǎn)用種毒；種毒檢驗(yàn)按《中華人民共和國獸藥典》(中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸 藥典二〇〇五年版三部.中國農(nóng)業(yè)出版社，2006，本發(fā)明文件中簡稱為《中國獸藥典》)進(jìn)行 檢驗(yàn)，應(yīng)符合無菌檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；2. 2生產(chǎn)用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)種子批細(xì)胞經(jīng)消化、分散后，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，形成單層或生長至合適密度時，用于 繼續(xù)傳代或接種病毒；細(xì)胞檢驗(yàn)按《中國獸藥典》規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合生產(chǎn)、檢驗(yàn)用細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；2. 3生產(chǎn)用病毒液的繁殖將生產(chǎn)種毒接種生長良好的生產(chǎn)用細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，3 4天后收獲病毒 液，-15°C以下保存；生產(chǎn)用病毒液檢驗(yàn)按《中國獸藥典》規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合無菌檢驗(yàn)和外源病毒 檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；并且每ml含毒量不少于60000 (或4000RID)；2. 4配苗、分裝和凍干將檢驗(yàn)合格的病毒液，加入適當(dāng)穩(wěn)定劑和抗菌素，混勻，定量分裝，每頭份含毒量 不低于6000TCID5(1 (或400RID)，冷凍真空干燥即成；成品檢驗(yàn)按《中國獸藥典》規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合無菌檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn) 規(guī)定；用10頭份注射敏感子豬，應(yīng)不引起明顯癥狀；每頭份含毒量不少于6000TCID5(I(或 400RID)。本發(fā)明涉及的一些專用詞的界定1.兔源細(xì)胞是指兔原代細(xì)胞或傳代細(xì)胞；2.常用細(xì)胞是指牛睪丸原代細(xì)胞、羊睪丸原代細(xì)胞、羊腎原代細(xì)胞、牛BT細(xì)胞 系、豬SK-6細(xì)胞系、豬ST細(xì)胞系、豬PK-15細(xì)胞系、豬IBRS-2細(xì)胞系；3.細(xì)胞培養(yǎng)是指細(xì)胞在適宜的溫度和密度下，經(jīng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)或細(xì)胞微載體培養(yǎng)或 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。本發(fā)明的積極意義本發(fā)明通過將豬瘟兔化弱毒克隆，獲得高度適應(yīng)細(xì)胞并且能穩(wěn)定遺傳的純系種 毒，再接種細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，生產(chǎn)病毒液，最后配苗、分裝、凍于。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明 具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)相對于已有技術(shù)，本發(fā)明克隆、純化了種毒，保證了種毒的遺傳和生物表現(xiàn)型 的單一性，提高了疫苗的遺傳穩(wěn)定性和生物安全性；(2)相對于已有技術(shù)，本發(fā)明克隆、純化了種毒，生產(chǎn)的病毒液毒價(jià)更高，單位體積 內(nèi)的疫苗有效成分含量更高；(3)相對于已有技術(shù)，本發(fā)明克隆、純化了種毒，疫苗免疫原性更穩(wěn)定、可靠；(4)相對于已有的兔體制苗技術(shù)，本發(fā)明避免了飼養(yǎng)動物、觀測動物等長時間、高 強(qiáng)度勞動，降低了生產(chǎn)成本，同時降低了細(xì)菌、霉菌和支原體污染的風(fēng)險(xiǎn)。


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圖1豬瘟病毒兔化弱毒株(細(xì)胞源)7個cDNA片段。圖2圖中箭頭所示豬瘟病毒兔化弱毒株(細(xì)胞源)克降后在RK-13細(xì)胞上的熒光 染色斑。
具體實(shí)施例本發(fā)明的實(shí)施例為進(jìn)一步描述本發(fā)明的技術(shù)方案，但不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。實(shí)施例1豬瘟兔化弱毒的克隆與鑒定1.豬瘟兔化弱毒的克隆用病毒基因拯救法進(jìn)行。(1)病毒RNA提取用TRIzol Reagent試劑盒(購自Invitrogen公司)提取豬 瘟兔化弱毒細(xì)胞培養(yǎng)液的總RNA ；(2)全基因組cDNA克隆1)設(shè)計(jì)7對引物(序列1 14，表1)分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn) 行純化、回收，瓊脂糖電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)，結(jié)果出現(xiàn)目標(biāo)條帶，表明擴(kuò)增成功；表1用于擴(kuò)增豬瘟病毒兔化弱毒株(細(xì)胞源)全基因組的引物序列 2)將純化回收的目的基因片段分別克隆至pGEM-T Easy載體(購自Promega公 司)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109 (購自Promega公司)；3)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布于含有X-Gal和IPTG的AMP+ LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng) 12 16h ；隨機(jī)挑取3-4個自色單菌落，接種于AMP+ LB液體培養(yǎng)基，37 °C振蕩培養(yǎng)12 16h ；用 Wizard Plus Minipreps DNA Purification System 試劑盒(購自 Promega 公司) 提取重組質(zhì)粒，送至北京華大中生科技發(fā)展有限公司雙向測序鑒定，結(jié)果與設(shè)計(jì)的目的基 因片段序列一致。4)大量培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，用試劑盒大量提取重組質(zhì)粒，分別用核酸內(nèi)切酶
6(購自NEB公司)酶切，純化；5)將純化產(chǎn)物依次用T4DNA連接酶(購自NEB公司)連接，得到全基因組cDNA ；6)將全基因組cDNA克隆到pGEM_T Easy載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109 ；7)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布于含有X-Gal和IPTG的AMP+ LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng) 12 16h ；隨機(jī)挑取3-4個白色單菌落，接種于AMP+ LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)12 16h;用試劑盒提取重組質(zhì)粒，送公司雙向測序鑒定，結(jié)果與目標(biāo)序列一致。8)將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)，大量提取重組質(zhì)粒，用核酸內(nèi)切酶酶切，純化， 得到大量全基因組cDNA;(3)體外 RNA 轉(zhuǎn)錄ATP 溶液 2 μ 1、CTP 溶液 2 μ 1、GTP 溶液 2 μ 1、UTP 溶液 2 μ 1、 IOXReaction Buffer 2 μ 1、線性化模板DNA 3 μ g、酶混合液2 μ 1，加無Rnase水補(bǔ)充至 20 μ 1 ；在 PCR 儀中，39°C反應(yīng) 2h ；(4)體外RNA脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞將6孔細(xì)胞板長滿80%左右的RK-13細(xì)胞；用 Opti-MEM培養(yǎng)基(購自GIBCO公司)小心稀釋轉(zhuǎn)錄RNA ；將10 μ 1 LipofectamineTM 2000 (購自GIBCO公司)加入到240 μ 1 Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕柔混合，室溫下孵育5min ；再 與稀釋的RNA輕柔混均，室溫下孵育20min ；將轉(zhuǎn)染混合液加入到漂洗過的6孔細(xì)胞板中， 輕柔搖動培養(yǎng)板，使混合液完全覆蓋細(xì)胞表面，放入37°C的5% CO2培養(yǎng)箱中作用6h ；細(xì)胞 單層用MEM(無雙抗、無血清)培養(yǎng)液漂洗三遍，加入MEM培養(yǎng)液(無雙抗)，置于37°C 的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h ；(5)培養(yǎng)傳代按常規(guī)方法將轉(zhuǎn)染后的病毒液盲傳2 3代，用豬瘟熒光抗體檢 測，結(jié)果呈陽性(圖2)，則表明克隆成功，命名為CSFV CC-2；2.克隆株的鑒定經(jīng)鑒定，克隆株CSFV CC-2具有以下特性(1)對細(xì)胞的適應(yīng)性將CSFV CC-2接種RK-13細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)并取樣測定毒 價(jià)，經(jīng)懸浮培養(yǎng)最高毒價(jià)彡106-8TCID50/0. Iml ；(2)遺傳穩(wěn)定性將CSFV CC-2經(jīng)RK-13細(xì)胞連續(xù)傳代并進(jìn)行基因序列測定，第30 代與第1代克隆化種毒核苷酸同源性為99. 9%，氨基酸同源性為100% ；(3)生物學(xué)特性將CSFV CC-2進(jìn)行豬瘟抗體抑制試驗(yàn)，豬瘟抗體能特異性抑制該 種毒的熒光產(chǎn)生；將CSFV CC-2以15TCID5(I (或1RID) /只的劑量靜脈接種健康家兔，結(jié)果 95%產(chǎn)生定型熱或輕型熱；(4)免疫原性將CSFV CC-2以150RID/只的免疫劑量肌肉接種非免疫健康豬， 抗體平均最高滴度達(dá)到1 128，平均持續(xù)時間為400d;免疫后2周攻Iml豬瘟石門血毒 (IO5MLD/Iml)，100%保護(hù)，最高體溫彡41%且持續(xù)不超過3d ；(5)安全性將 CSFV CC-2(彡 105 °TCID50/0. lml) IOml 注射家兔、IOOml 注射豬、 5ml注射豚鼠、Iml注射小鼠均不引起死亡；實(shí)施例2疫苗的制備1.種毒的繁殖將CSFV CC-2種子批種毒接種生長良好的RK-13種子批細(xì)胞，培養(yǎng)3 4天后收 毒，作為生產(chǎn)用種毒；種毒檢驗(yàn)按《中國獸藥典》規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果符合無菌檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；2.生產(chǎn)用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)種子批細(xì)胞RK-13經(jīng)消化、分散后，進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，生長至合適密度時，用于 繼續(xù)傳代或接種病毒；細(xì)胞檢驗(yàn)按《中國獸藥典》規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果符合生產(chǎn)、檢驗(yàn)用細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；3.生產(chǎn)用病毒液的繁殖將生產(chǎn)種毒接種生長良好的生產(chǎn)用細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，3 4天后收獲病毒 液，-15°C以下保存；生產(chǎn)用病毒液檢驗(yàn)按《中國獸藥典》規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果符合無菌檢驗(yàn)和外源病 毒檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；并且每ml含毒量> 60000TCID5(1 (或4000RID)；4.配苗、分裝和凍干將檢驗(yàn)合格的病毒液，加入適當(dāng)穩(wěn)定劑和抗菌素，混勻，定量分裝，每頭份含毒量 不低于6000TCID5(1 (或400RID)，冷凍真空干燥即成；成品檢驗(yàn)按《中國獸藥典》規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果符合無菌檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)標(biāo) 準(zhǔn)規(guī)定；用10頭份注射敏感子豬，結(jié)果不引起明顯癥狀；每頭份含毒量> 6000TCID5(I(或 400RID)。實(shí)施例3疫苗的制備1.種毒的繁殖將CSFV CC-2種子批種毒接種生長良好的SK-6種子批細(xì)胞，培養(yǎng)3 4天后收毒， 作為生產(chǎn)用種毒；種毒檢驗(yàn)按《中國獸藥典》規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果符合無菌檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)標(biāo) 準(zhǔn)規(guī)定；2.生產(chǎn)用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)種子批細(xì)胞SK-6經(jīng)消化、分散后，進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，生長至合適密度時，用于繼 續(xù)傳代或接種病毒；細(xì)胞檢驗(yàn)按《中國獸藥典》規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果符合生產(chǎn)、檢驗(yàn)用細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；3.生產(chǎn)用病毒液的繁殖將生產(chǎn)種毒接種生長良好的生產(chǎn)用細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，3 4天后收獲病毒 液，-15°C以下保存；生產(chǎn)用病毒液檢驗(yàn)按《中國獸藥典》規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果符合無菌檢驗(yàn)和外源病 毒檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；并且每ml含毒量> 60000TCID5(1 (或4000RID)；4.配苗、分裝和凍干將檢驗(yàn)合格的病毒液，加入適當(dāng)穩(wěn)定劑和抗菌素，混勻，定量分裝，每頭份含毒量 不低于6000TCID5(1 (或400RID)，冷凍真空干燥即成；成品檢驗(yàn)按《中國獸藥典》規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果符合無菌檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)標(biāo) 準(zhǔn)規(guī)定；用10頭份注射敏感子豬，結(jié)果不引起明顯癥狀；每頭份含毒量> 6000TCID5(I(或 400RID)。
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權(quán)利要求
一種豬瘟活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是用豬瘟兔化弱毒株病毒經(jīng)過病毒基因拯救技術(shù)獲得的一株豬瘟兔化弱毒克隆株CSFV CC 2，該病毒株已于2010年7月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.4059，將CSFV CC 2通過兔源細(xì)胞和/或常用細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，收獲病毒液；將收獲的病毒液加入常用的凍干保護(hù)劑，充分混合后分裝后經(jīng)冷凍真空干燥而制成凍干活疫苗，每頭份含毒量不低于6000TCID50或400RID。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種豬瘟活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是制備豬瘟活疫苗所用 一株CGMCC No. 4059豬瘟兔化弱毒克隆株病毒是通過應(yīng)用病毒基因拯救法將豬瘟兔化弱毒 進(jìn)行克隆，獲得高度適應(yīng)兔源細(xì)胞或常用細(xì)胞、基因型單一并且能穩(wěn)定遺傳的純系豬瘟兔 化弱毒株病毒。全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬瘟活疫苗的生產(chǎn)方法。本發(fā)明包括以下技術(shù)步驟(1)豬瘟兔化弱毒株的克隆與鑒定；(2)克隆株種毒的繁殖；(3)生產(chǎn)用細(xì)胞的繁殖；(4)生產(chǎn)用病毒液的繁殖；(5)配苗、分裝和凍干。本發(fā)明具有生產(chǎn)工藝簡單、穩(wěn)定，病毒免疫原性和遺傳穩(wěn)定性好，外源病毒污染風(fēng)險(xiǎn)小，檢驗(yàn)方便，生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)，利用本發(fā)明生產(chǎn)的豬瘟活疫苗遺傳穩(wěn)定性好、純凈性高、免疫原性強(qiáng)。
文檔編號C12N7/04GK101905020SQ20101024511
公開日2010年12月8日 申請日期2010年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月5日
發(fā)明者關(guān)孚時, 戴志紅, 李翠, 王在時, 秦玉明, 蔣卉, 趙耘 申請人:中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所