灰灰菜全株植物提取物的新用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及灰灰菜全株植物提取物的新用途，屬于藥物、天然藥物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，已成為當(dāng)今世界面臨的一個(gè)重大的公共衛(wèi) 生問(wèn)題。肺癌是世界范圍內(nèi)排名首位的腫瘤致死性疾病，肺癌根據(jù)病理形態(tài)可以分為小細(xì) 胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC)和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC)，其中非小細(xì)胞肺癌占所有肺癌的85%左右。非小細(xì)胞肺癌大部分在發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)為 晚期病例且其5年生存率只有15%-16%。另外目前臨床上采用的化療藥物多數(shù)療效有限具 有較大的毒副作用且易被腫瘤耐受，嚴(yán)重影響患者的治療效果，因此亟待開(kāi)發(fā)有效的藥物。 中藥是我國(guó)傳統(tǒng)的天然醫(yī)藥，具備傳統(tǒng)化療藥物不具備的特殊優(yōu)勢(shì)：種類繁多，來(lái)源廣泛； 活性化合物具有立體空間結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)，毒副作用低；作用靶點(diǎn)眾多。近年來(lái)的一些的研宄證 明，藥用植物的提取物在體內(nèi)和體外都顯示出良好的抗癌活性。
[0003] 灰灰菜（Chenopodium album Linn)又名藜，為藜科一年生草本植物，廣泛分布于 世界各國(guó)，多生于田間路邊，全草可入藥，亦可作為野菜而食用，灰灰菜有多種藥理學(xué)功效， 它可以用作抗病毒，抗真菌，抗炎，抗過(guò)敏及免疫調(diào)節(jié)活性。然而對(duì)此種植物的抗癌功效研 宄比較少，Menka Khoobchandani等學(xué)者研宄發(fā)現(xiàn)其灰灰菜采用石油醚、乙醇和甲醇進(jìn)行 提取，發(fā)現(xiàn)其甲醇相提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制最為明顯，但其在抗肺癌活性及其作 用機(jī)理沒(méi)有進(jìn)行探宄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供灰灰菜全株植物石油醚提取物的一種新用途，該新用途是灰 灰菜全株植物提取物在制備抗非小細(xì)胞肺癌藥物中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述灰灰菜全株植物石油醚相提取物的制備方法，具 體包括以下步驟： (1) 利用95%乙醇對(duì)灰灰菜枝葉進(jìn)行浸泡過(guò)夜，然后超聲提取(在50~80°C，功率為200W 條件下）至少3次，每次提取0. 5~2h，減壓抽濾得到乙醇提液，再多次用相同體積的乙醇浸 泡并重復(fù)第一次的提取流程，直到乙醇提取液無(wú)色為止，最后合并所有的乙醇提取液； (2) 利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)灰灰菜全株植物的乙醇提取液進(jìn)行減壓蒸餾，得到乙醇提取物 浸膏，然后用蒸餾水對(duì)其進(jìn)行溶解； (3) 用石油醚對(duì)灰灰菜全株植物的乙醇提取物的水溶液進(jìn)行多次萃取，直到萃取相無(wú) 色為止，合并多次萃取得到石油醚相萃取物； 本發(fā)明的有益效果： (1)本發(fā)明首次探索研宄灰灰菜石油醚相提取物在抗非小細(xì)胞肺癌上的應(yīng)用。
[0006] (2)試驗(yàn)證明，本發(fā)明的灰灰菜全株植物石油醚相提取物對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞的增殖具有一定程度的抑制作用，隨著提取物作用濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì) A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用呈現(xiàn)出明顯的劑量-時(shí)間依賴效應(yīng)，Hoechst染色及流式細(xì)胞儀 檢測(cè)結(jié)果表明灰灰菜石油醚相提取物可以引起細(xì)胞核染色質(zhì)聚縮、細(xì)胞周期Gl期阻滯及 誘導(dǎo)早期凋亡的細(xì)胞比例增加，并且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系；因此本發(fā)明對(duì)于制備抗非 小細(xì)胞肺癌藥物具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0007] 圖1為灰灰菜全株植物石油醚相提取物對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制柱形圖； 圖2為灰灰菜全株植物石油醚提取物對(duì)A549細(xì)胞克隆形成劑量曲線圖； 圖3為灰灰菜全株植物石油醚相取物對(duì)A549細(xì)胞核染色圖； 圖4為流式細(xì)胞儀檢石油醚相提取物對(duì)A549細(xì)胞周期影響圖； 圖5為流式細(xì)胞儀檢測(cè)石油醚相提取物對(duì)A549細(xì)胞早期凋亡作用圖。
【具體實(shí)施方式】
[0008] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍 并不限于所述內(nèi)容。
[0009] 實(shí)施例1 灰灰菜全株植物石油醚相提取物的制備，具體包括以下步驟： (1)對(duì)采集得到的全株灰灰菜枝葉進(jìn)行陰干，得到干燥的灰灰菜全株植184. 25g，與濃 度95%乙醇混合浸泡過(guò)夜，然后超聲提取3次，超聲提取的溫度為50°C，功率為200W，每次 提取0. 5 h，然后將超聲提取液過(guò)濾得到濾液1，再以與初始比例相同的濃度95%乙醇浸泡 濾渣，不斷重復(fù)上述相同的提取流程，得到濾液2-n，直到濃度95%乙醇提取液無(wú)色為止，最 后合并所有的濾液，得到總的濃度95%乙醇提取液。
[0010] (2)利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)灰灰菜總的濃度95%乙醇提取液進(jìn)行減壓蒸餾，得到濃度 95%乙醇提取物浸膏，然后用蒸餾水對(duì)其進(jìn)行溶解。
[0011] (3)用石油醚對(duì)灰灰菜全株植物乙醇提取物的水溶液進(jìn)行多次萃取，直到萃取相 無(wú)色為止，合并多次萃取得到的萃取相，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)上述萃取相進(jìn)行減壓蒸餾，得到 灰灰菜全株植物石油醚提取部分的浸膏。
[0012] 實(shí)施例2 (1)對(duì)采集得到的全株灰灰菜枝葉進(jìn)行陰干，得到干燥的灰灰菜全株植物184. 25g，與 濃度95%乙醇混合浸泡過(guò)夜，然后超聲提取4次，超聲提取的溫度為60°C，功率為200W，每 次提取I h，然后將超聲提取液過(guò)濾得到濾液1，再以與初始比例相同的濃度95%乙醇浸泡 濾渣，不斷重復(fù)上述相同的提取流程，得到濾液2-n，直到濃度95%乙醇提取液無(wú)色為止，最 后合并所有的濾液，得到總的濃度95%乙醇提取液。
[0013] (2)利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)灰灰菜總的濃度95%乙醇提取液進(jìn)行減壓蒸餾，得到濃度 95%乙醇提取物浸膏，然后用蒸餾水對(duì)其進(jìn)行溶解。
[0014] (3)用石油醚對(duì)灰灰菜全株植物乙醇提取物的水溶液進(jìn)行多次萃取，直到萃取相 無(wú)色為止，合并多次萃取得到的萃取相，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)上述萃取相進(jìn)行減壓蒸餾，得到 灰灰菜全株植物石油醚提取部分的浸膏。
[0015] 實(shí)施例3 (1)對(duì)采集得到的全株灰灰菜枝葉進(jìn)行陰干，得到干燥的灰灰菜全株植物184. 25g，與 濃度95%乙醇混合浸泡過(guò)夜，然后超聲提取5次，超聲提取的溫度為80°C，功率為200W，每 次提取2 h，然后將超聲提取液過(guò)濾得到濾液1，再以與初始比例相同的濃度95%乙醇浸泡 濾渣，不斷重復(fù)上述相同的提取流程，得到濾液2-n，直到濃度95%乙醇提取液無(wú)色為止，最 后合并所有的濾液，得到總的濃度95%乙醇提取液。
[0016] (2)利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)灰灰菜總的濃度95%乙醇提取液進(jìn)行減壓蒸餾，得到濃度 95%乙醇提取物浸膏，然后用蒸餾水對(duì)其進(jìn)行溶解。
[0017] (3)用石油醚對(duì)灰灰菜全株植物乙醇提取物的水溶液進(jìn)行多次萃取，直到萃取相 無(wú)色為止，合并多次萃取得到的萃取相，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)上述萃取相進(jìn)行減壓蒸餾，得到 灰灰菜全株植物石油醚提取部分的浸膏。
[0018] 實(shí)施例1~3中得到的灰灰菜全株植物石油醚提取物在抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用 將非小細(xì)胞肺癌A549培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的混合液的 RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，置于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，加入 0. 25%的EDTA-胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，然后用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整成濃度為5 X IO4 個(gè)/ml的細(xì)胞懸液；再將其接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔10〇μ1，于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁； (1)將實(shí)施例1、2、3中制得的灰灰菜全株植物石油醚提取物溶解于DMSO中，制成濃度 為100mg/ml的篩選母液備用。
[0019] (2)利用DMSO進(jìn)行倍比稀釋，分別得到石油醚提取物終濃度為50(^g /ml，25〇μ8 /ml，125Pg /ml，62.5Pg /ml，31.25Pg /ml，15.63Pg /ml，7.81/ml 的 DMSO 溶液，分別設(shè)置試 驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行試驗(yàn)： 試驗(yàn)組：將灰灰菜石油醚提取物加入到96孔板的A549細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)，每孔加入?μL， 再向每個(gè)培養(yǎng)孔中補(bǔ)加100K1RPMI-1640完全培養(yǎng)基。設(shè)置不同的提取物作