用濃度，石油 醚提取物溶液終濃度為 50(^g /ml，25(^g /ml，125Pg /ml，62.5Pg /ml，31.25Pg /ml， 15. 63Pg /ml和L 8Mg /ml。每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔。
[0020] 對(duì)照組：非小細(xì)胞肺癌A549的培養(yǎng)孔內(nèi)加入DMS0,每孔加入?μL，然后再向每個(gè)培 養(yǎng)孔中補(bǔ)加100K1RPMI-1640完全培養(yǎng)基，一共設(shè)置5個(gè)DMSO陰性對(duì)照孔。
[0021] 將上述培養(yǎng)板置于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)72h。
[0022] 72h后向每孔加入2〇μ1新鮮配制的濃度為5mg/ml的四甲基偶氮唑鹽（MTT)溶液， 并在37°C，5%C0 2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸除上清；每孔加入10〇μ1的DMS0,室溫下震 蕩10min，在多功能酶標(biāo)儀上測定各孔在490nm處的吸光值（0D值)，按公式計(jì)算癌細(xì)胞生長 抑制率：癌細(xì)胞增殖抑制率=(對(duì)照孔測定的平均OD值-加藥組測定的平均OD值)/對(duì)照 孔測定的平均OD值X 100%。
[0023] 利用GraphPad Prism 5軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析處理，得到灰灰菜全株植物石油醚相 提取物對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549作用72h后的半數(shù)抑制濃度（IC5tl),結(jié)果如下表1所示：表1
灰灰菜全株植物的石油醚提取物對(duì)A549細(xì)胞分別作用24h，48h，72h后生長抑制的劑 量-效應(yīng)柱形圖如圖1所示；結(jié)果顯示隨著提取物處理細(xì)胞濃度的增加及作用時(shí)間的延長， 其對(duì)A549細(xì)胞的生長抑制明顯的增加，呈現(xiàn)明顯的劑量-時(shí)間依賴效應(yīng)。
[0024] 細(xì)胞克隆形成試驗(yàn) A549細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期后，加入0. 25%的EDTA-胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞。用RPMI 1640培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋成密度為200個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加 入Iml腫瘤細(xì)胞懸液。接種細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)24h加入向每個(gè)孔中各加入10 μ 1終濃度為 7. 81，15. 63, 31. 25,62. 5和125Pg/ml石油醚相提取物，對(duì)照組加入10 μ 1的DMSO,再向每 個(gè)孔補(bǔ)加 Iml的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12天后棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醇固定，結(jié)晶紫染 色，顯微鏡下觀察，計(jì)算細(xì)胞數(shù)大于50的細(xì)胞克隆數(shù)；結(jié)果如圖2所示，隨著提取物濃度的 增加，形成的細(xì)胞克隆數(shù)目明顯的減少，提取物對(duì)細(xì)胞的毒性呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。
[0025] Hoechst33342 染色試驗(yàn)： A549細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期后，加入0. 25%的EDTA-胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞。用RPMI 1640培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋成密度為IX IO5個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔 加入1ml腫瘤細(xì)胞懸液。細(xì)胞接種后繼續(xù)培養(yǎng)24h加入向每個(gè)孔中各加入10 μ 1終濃度為 62. 5ug/ml和31. 25ug/ml的灰灰菜石油醚相提取物，對(duì)照組加入10 μ 1的DMSO,再向每個(gè) 孔補(bǔ)加 Iml的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。棄掉培養(yǎng)基，PBS洗1遍，4%多聚甲醛固 定15-20min，PBS洗2遍，Hoechst33342染色液室溫下避光染色30min，PBS洗2遍，用倒置 熒光顯微鏡藍(lán)色熒光觀察、拍照。結(jié)果如圖在灰灰菜濃度62. 5 μ g/ml時(shí)如圖3B所示與細(xì) 胞對(duì)照組（圖3A)相比，加藥物的細(xì)胞出現(xiàn)核染色質(zhì)皺縮，出現(xiàn)月牙形或者是斷裂的片段，亮 度增加，明顯的細(xì)胞早期凋亡的細(xì)胞學(xué)表型 細(xì)胞周期檢測： A549細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期后，加入0. 25%的EDTA-胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞。用RPMI 1640培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋成密度為5 X IO5個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔 加入1ml腫瘤細(xì)胞懸液。細(xì)胞接種后繼續(xù)培養(yǎng)24h，向孔中各加入10 μ 1終濃度為62. 5ug/ ml和31. 25ug/ml灰灰菜石油醚相提取物，對(duì)照組加入10 μ 1的DMSO,再向每個(gè)孔補(bǔ)加 Iml 的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。用胰酶消化細(xì)胞，1000 g離心3-5分鐘沉淀細(xì)胞。小心 吸除上清加入1ml冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。再次加入 Iml冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞。1000 g離心3-5分鐘沉淀細(xì)胞，75%冰浴預(yù)冷的95%乙醇重 懸細(xì)胞混勻后4°C固定24h。洗去固定液，碘化丙啶染色室溫下避光孵育30min，流式細(xì)胞儀 檢測，其結(jié)果用Flowjo. 7. 6軟件進(jìn)行分析。結(jié)果如圖4所示灰灰菜全株植物石油醚相提取 物以62. 5ug/ml的濃度處理細(xì)胞后（圖4C) Gl期占76. 93%，31. 25ug/ml的濃度處理細(xì)胞后 (圖4B)G1期占69. 74%與對(duì)照組細(xì)胞（圖4A)相比細(xì)胞周期明顯的阻滯在Gl期且對(duì)著藥物 濃度的增加 Gl期阻滯效果越明顯。
[0026] 細(xì)胞凋亡檢測： A549細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期后，加入0. 25%的EDTA-胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞。用RPMI 1640培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋成密度為5 X IO5個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔 加入1ml腫瘤細(xì)胞懸液；細(xì)胞接種24h后，加入10 μ 1終濃度為62. 5ug/ml和31. 25ug/ml 石油醚提取物，對(duì)照組加入10 μ 1的DMSO,再向每個(gè)孔補(bǔ)加 Iml的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù) 培養(yǎng)24h。用4°C預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞兩次，用250 μ 1結(jié)合緩沖液重新重懸細(xì)胞，加入5 μ 1 Annexin V/FITC和10μ1 20μg/ml的碘化丙啶溶液，混勻后于室溫避光孵育15min。流式 細(xì)胞儀檢測，其結(jié)果用Flowjo. 7. 6軟件進(jìn)行分析。結(jié)果如圖5所示灰灰菜全株植物石油醚 相提取物以62. 5ug/ml的濃度處理細(xì)胞后（圖5C)細(xì)胞凋亡比率為23. 3%，31. 25ug/ml的濃 度處理細(xì)胞后（圖5B)細(xì)胞凋亡率為11. 9%，與對(duì)照組細(xì)胞（圖5A)相比提取物能誘導(dǎo)細(xì)胞的 凋亡且隨著藥物濃度的增加細(xì)胞的凋亡率也隨之增加。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 灰灰菜全株植物提取物在制備抗非小細(xì)胞肺癌藥物中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述灰灰菜全株植物提取物在制備抗非小細(xì)胞肺癌藥物中的應(yīng)用， 其特征在于，灰灰菜全株植物提取物的制備方法具體包括以下步驟： (1) 利用乙醇對(duì)灰灰菜全株植物枝葉進(jìn)行浸泡過夜，然后超聲提取至少3次，每次提取 0.5~2h，減壓抽濾得到乙醇提液，再多次用相同體積的乙醇浸泡并重復(fù)第一次的提取流程， 直到乙醇提取液無色為止，最后合并所有的乙醇提取液； (2) 利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)灰灰菜葉的乙醇提取液進(jìn)行減壓蒸餾，得到乙醇提取物浸膏，然 后用蒸餾水對(duì)其進(jìn)行溶解； (3) 用石油醚對(duì)灰灰菜全株植物乙醇提取物的水溶液進(jìn)行多次萃取，直到萃取相無色 為止，合并多次萃取得到石油醚相萃取物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述灰灰菜全株植物提取物在制備抗非小細(xì)胞肺癌藥物中的應(yīng)用， 其特征在于：所述超聲提取的溫度為50~80°C，功率為200W。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述灰灰菜全株植物提取物在制備抗非小細(xì)胞肺癌藥物中的應(yīng)用， 其特征在于：所述乙醇的體積百分比濃度為95%。
【專利摘要】本發(fā)明公開灰灰菜全株植物提取物的新用途，屬于藥物、天然藥物技術(shù)領(lǐng)域。該新用途是灰灰菜全株植物石油醚相的提取物在制備抗非小細(xì)胞肺癌藥物中的應(yīng)用。所述提取物的制備方法如下：以95%乙醇為提取劑，利用超聲提取法對(duì)灰灰菜全株進(jìn)行提取，得到其乙醇總提物，然后用石油醚對(duì)乙醇總提物進(jìn)行萃取，濃縮萃取液得到石油醚相提取物。本發(fā)明所提供的灰灰菜全株植物的石油醚相提取物對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞具有明顯的抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。
【IPC分類】A61P35/00, A61K36/185
【公開號(hào)】CN104983756
【申請?zhí)枴緾N201510263636
【發(fā)明人】趙揚(yáng), 趙婷, 李拓, 梁超, 潘卉, 馮陽
【申請人】昆明理工大學(xué)
【公開日】2015年10月21日
【申請日】2015年5月22日