分泌型IgA組合物、其制備方法和使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本公開內(nèi)容涉及產(chǎn)生分泌型IgA的方法、經(jīng)純化的分泌型IgA、包含分泌型IgA的 組合物及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 免疫球蛋白A是5類免疫球蛋白中最豐富的并且主要存在于胃腸道和呼吸道的粘 膜中。存在兩種類型的免疫球蛋白A :分泌型IgA和血清型IgA。血清型IgA-般是存在于 很多物種血清中的單體，其中其作為第二防線介導(dǎo)對已突破粘膜表面的病原體的消除。分 泌型IgA(SIgA)是二聚體或多聚體，并且包含除IgA之外的分泌型組分。SIgA是用于幼體 之母乳的常見成分，并且是斷奶后的發(fā)育期和成年期中進(jìn)入胃腸系統(tǒng)中的分泌型蛋白質(zhì)。 已提出全身施用IgA可保護(hù)免受導(dǎo)致感染性休克的炎癥的發(fā)展。目前，沒有被設(shè)計(jì)來矯正 動物和人的胃腸道中SIgA缺乏的方法，并且也沒有證據(jù)證明所述施用可矯正這些疾病。
[0003] 已表明，SIgA與廣泛多種環(huán)境蛋白質(zhì)和多糖（例如，細(xì)菌、病毒、毒素和食物組分） 的結(jié)合阻止其進(jìn)入體內(nèi)并激活宿主炎癥免疫機(jī)制。目前，除了動物中的合成之外，沒有已知 用于產(chǎn)生具有各種抗原結(jié)合活性的SIgA的方法（例如，具有多種抗原結(jié)合活性的SIgA不 能夠用化學(xué)物質(zhì)、重組微生物在發(fā)酵或干細(xì)胞中產(chǎn)生）。此外，動物對環(huán)境損害的暴露越多 樣化，SIgA活性的庫（r印ertoire)和多樣性越大。為了探索SIgA作為用于治療疾病的飲 食/ 口服補(bǔ)充劑的用途，必須存在可直接從動物收集的SIgA源。此外，有利的是，所收集材 料的量相對于疾病病癥的治療是成本效益的，因?yàn)榭捎肧IgA治療的很多疾病沒有威脅生 命到足以必須進(jìn)行昂貴的藥物治療。
[0004] 所需要的是可用作治療SIgA相關(guān)疾病的補(bǔ)充劑的SIgA源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 在一方面，組合物包含分離自豬或牛的腸腔液或腸粘膜的任選經(jīng)巴氏滅菌的純的 分泌型IgA。
[0006] 在另一方面，本文包括從來源分離的分泌型IgA，所述來源是豬或牛的腸粘膜，其 中分離的分泌型IgA中分泌型IgA的濃度是來源材料中的濃度的至少兩倍，其中所述來源 材料是干燥腸粘膜、由腸粘膜制備的水性蛋白質(zhì)制備物或由腸粘膜制備的干蛋白質(zhì)制備 物。
[0007] 在又一方面，食物組合物包含基礎(chǔ)食物組合物和有效提高動物的生長速率、提高 動物的飼料效率、減少動物的胃腸炎癥、降低動物的胃腸感染的風(fēng)險(xiǎn)或其組合的量的分泌 型 IgA。
[0008] 在又一方面，提高對象的生長速率、提高對象的飼料效率、減少對象的胃腸炎癥、 降低對象的胃腸感染的風(fēng)險(xiǎn)或其組合的方法包括向所述對象施用有效提高所述對象的生 長速率、提高所述對象的飼料效率、減少所述對象的胃腸炎癥、降低所述對象的胃腸感染的 風(fēng)險(xiǎn)或其組合的量的分泌型IgA。
[0009] 在另一方面，提高動物的生長速率、提高動物的飼料效率、減少動物的胃腸炎癥、 降低動物的胃腸感染的風(fēng)險(xiǎn)或其組合的方法包括向所述動物施用來自豬或牛的干燥腸粘 膜，其中所述干燥腸粘膜是未經(jīng)水解的，并且其中所述干燥腸粘膜包含有效提高所述動物 的生長速率、提高所述動物的飼料效率、減少所述動物的胃腸炎癥、降低所述動物的胃腸感 染的風(fēng)險(xiǎn)或其組合的量的分泌型IgA。
[0010] 在另一方面，用于純化分泌型IgA的方法包括用分子量為3000至30, 000的聚乙 二醇處理豬的腸腔液以沉淀分泌型IgA，并分離沉淀的分泌型IgA。在另一方面，制備動物 食物的方法包括干燥未經(jīng)水解的豬或牛腸粘膜，并將干燥的未經(jīng)水解的豬或牛腸粘膜添加 至基礎(chǔ)動物食物組合物。
[0011] 根據(jù)以下發(fā)明詳述、附圖和所附權(quán)利要求書，本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解并了解上述 及其它特征。
[0012] 發(fā)明詳述
[0013] 本文描述了包含SIgA的組合物和用于從動物（例如豬和牛）的腸腔液或腸粘膜 中純化SIgA的方法。SIgA是具有多種抗原結(jié)合活性的免疫球蛋白。當(dāng)SIgA從粘膜釋放至 外部環(huán)境時(shí)，其與病原體、食物抗原和變應(yīng)原形成免疫復(fù)合物，從而阻止它們結(jié)合并穿透腸 粘膜。因此，經(jīng)純化的SIgA可用于補(bǔ)充動物的SIgA缺乏以及提高其體重增加和/或飼料 效率。
[0014] 目前，豬和牛腸通常被用作肝素的來源。肝素是高度硫酸化的糖胺聚糖，其被廣 泛用作抗凝劑。與SIgA類似，肝素不能通過現(xiàn)代的化學(xué)方法產(chǎn)生，而是從生物來源分離。 通常使用包括高溫、高壓和/或蛋白酶的方法使肝素與組織分離來從全豬腸或內(nèi)皮內(nèi)襯 (endothelial lining)(粘膜）純化肝素。最后的純化通常包括陽離子交換樹脂的使用。本 申請的目的是從腸粘膜分離SIgA以及在制備用于提取肝素的腸期間從腸腔液分離SIgA。
[0015] 本文中使用的腸腔液是存在于動物腸腔內(nèi)的液體。所述腔是腸的內(nèi)腔，消化的食 物通過內(nèi)腔并且營養(yǎng)物質(zhì)在此被吸收。腸腔液的組成根據(jù)生物體的飲食、進(jìn)食/禁食狀態(tài) 和疾病狀態(tài)而不同。腸腔液包含例如脂質(zhì)；蛋白質(zhì)，包括SIgA ;細(xì)菌；離子，例如鈉、鉀和鈣； 以及固體未消化物質(zhì)。
[0016] 此外，本文中使用的腸粘膜指腸的內(nèi)壁（腔內(nèi)襯（luminal lining))。腸包括稱為 漿膜的外壁、中間肌肉層和稱為粘膜的內(nèi)部。
[0017] 在一實(shí)施方案中，本文描述了包含分離的SIgA和/或純的SIgA的組合物。分離 的SIgA或純的SIgA分離或純化自豬或牛的腸腔液或腸粘膜。
[0018] 本文中使用的術(shù)語"分離的"蛋白質(zhì)包括與存在于該蛋白質(zhì)的天然來源中的其它 蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)分子的至少一部分分離的蛋白質(zhì)分子。分離的蛋白質(zhì)不含來自為該蛋白 質(zhì)之來源的細(xì)胞、組織或體液源的大量細(xì)胞材料或其它污染性多肽。分離的SIgA的SIgA 濃度可以是來源材料中濃度的兩倍，即來源腸粘膜或腸腔液中SIgA濃度的兩倍。在另一些 實(shí)施方案中，與來源腸粘膜中的濃度相比，分離的SIgA的濃度是3倍、4倍、5倍、10倍或更 多倍。
[0019] 在一實(shí)施方案中，分泌型SIgA分離自為豬或牛之腸粘膜的來源，其中分離的分泌 型IgA中分泌型IgA的濃度是來源材料中濃度的至少兩倍，其中來源材料是干燥腸粘膜、腸 粘膜的水性制備物或由腸粘膜制備的干蛋白質(zhì)制備物。
[0020] 在一實(shí)施方案中，分離的SIgA制備物是來源于腸粘膜的干制備物，其中在分離的 SIgA中包含的IgA為蛋白質(zhì)材料的5%或更多。不受理論的限制，認(rèn)為每100g粘膜蛋白質(zhì) 含有5至IOg SIgA。在另一些實(shí)施方案中，在分離的SIgA中包含的IgA多于蛋白質(zhì)材料的 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 95%。
[0021] 術(shù)語純的在提及SIgA時(shí)指SIgA是分離的并且SIgA組分（IgA和分泌型組分）占 樣品中蛋白質(zhì)的多于75%，具體地多于85%，并且更具體地多于95%。純的SIgA可由腸粘 膜或腸腔液制備而來。
[0022] 在一實(shí)施方案中，純的SIgA制備物是經(jīng)巴氏滅菌的。巴氏滅菌是這樣的過程：將 液體加熱至特定的溫度并持續(xù)限定的時(shí)間長度，隨后基本上立即將液體冷卻。巴氏滅菌的 目的是減少液體中存活病原體的數(shù)目。用于巴氏滅菌的示例性條件是50°C至KKTC持續(xù)5 至30秒或120°C至150°C持續(xù)1至8秒，用于儲存穩(wěn)定性巴氏滅菌。如本文中所示，對分離 自豬腸粘膜的SIgA進(jìn)行巴氏滅菌在使用該SIgA制備物提高雞的飼料效率方面是重要的。
[0023] 在一實(shí)施方案中，純的SIgA組合物的分泌型IgA脂多糖（LPS)結(jié)合活性為血清型 IgA脂多糖結(jié)合活性的至少5倍。間接ELISA可證明LPS結(jié)合活性。將LPS包被在微量滴 定板上。將腸 SIgA或血清IgA以不同的稀釋度添加至結(jié)合在微量滴定板上的LPS。在將未 結(jié)合的SIgA通過洗滌除去之后，使用與酶（如辣根過氧化物酶）偶聯(lián)的抗-IgA抗體加底 物檢測與結(jié)合于板之LPS結(jié)合的SIgA的量。當(dāng)給定量的腸 SIgA相對于相同量的血清IgA 具有更高的結(jié)合能力時(shí)，結(jié)合增加。
[0024] 在一實(shí)施方案中，經(jīng)巴氏滅菌的純的SIgA是包含可藥用賦形劑的藥物組合物的 形式。
[0025] 在一實(shí)施方案中，用于純化SIgA組合物的方法包括用分子量為3000至30, 000的 聚乙二醇處理豬或牛的腸腔液并分離沉淀的SIgA。在一實(shí)施方案中，與腸腔液中的SIgA 濃度相比，SIgA被富集至少兩倍。在另一實(shí)施方案中，所述方法還包括將所沉淀的SIgA重 懸于分子量為3000至30, 000之聚乙二醇的溶液中以產(chǎn)生再沉淀的SIgA，并分離再沉淀的 SIgA?？芍貜?fù)重懸和沉淀直至產(chǎn)生本文中所述的純的SIgA組合物。
[0026] 在一實(shí)施方案中，沉淀的SIgA組合物是如上文所述經(jīng)巴氏滅菌的。
[0027] 可對沉淀的純的SIgA進(jìn)行另外的處理/純化步驟，例如過濾滅菌、使用冰冷乙醇 的沉淀（低于〇°C以使PEG溶解并只留下純的蛋白質(zhì)）、脫鹽。用于純化的其它方法例如硫 酸鈉沉淀和γ角叉菜膠以及尺寸排阻層析。
[0028] 在一實(shí)施方案中，純的SIgA或分離的SIgA由豬或牛的腸粘膜制備而來。在一實(shí) 施方案中，純的SIgA或分離的SIgA的制備包括裂解腸粘膜、通過例如離心除去碎片并隨后 將上清液中的蛋白質(zhì)用不同濃度的分子量為3000至30, 000的聚乙二醇（3. 5%至15% w/ v)依次沉淀，從而將使SIgA與