包含m10c1化合物與活性成分的組合物及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領域，具體涉及包含MlOCl化合物與活性成分的組合物及其 制備方法。
【背景技術】
[0002] 雙鏈RNA(dsRNA)抑制蛋白的表達，沉默基因，具有廣泛的、潛在的治療人類疾 病的用途。dsRNA誘導基因沉默有三種方式：1、轉(zhuǎn)錄功能的失活，這一現(xiàn)象是指RNA指導 下的DNA或組蛋白甲基化；2、小干擾核酸（smallinterferingRNA，siRNA)誘導的信使 RNA(mRNA)的降解；3、RNA介導的轉(zhuǎn)錄功能的衰減。但一般認為dsRNA誘導的基因干擾（抑 制）指的是動物細胞內(nèi)的RNA降解?；瘜W合成的小分子RNA，如siRNA，能夠在亞微摩爾濃 度中，酶催化下降解細胞內(nèi)的mRNA達95 %以上。
[0003]RNAi的效果能夠持續(xù)很長時間，甚至持續(xù)至幾代細胞分裂，同時基因干擾是序列 特異性的抑制。所以，RNAi能特異性的抑制基因表達，而不影響其他的mRNA，這種特異性的 抑制在研究基因功能和藥物靶點的簽定有特別重要作用。siRNA能夠用于開發(fā)成藥物治療： 1、由于基因過度表達或正常下不表達的基因；2、突變的基因而引起的疾病。
[0004]RNAi能應用于開發(fā)不同于小分子和蛋白的新一類藥物，雖然長的dsRNA引起細胞 的干擾素反應，不能直接傳遞到細胞，但siRNA的應用還是比較成功的。已經(jīng)成功的廣泛應 用于研究并已進行了臨床試驗。
[0005] 應用于治療方面，首先是用于老年性黃斑性病變和呼吸道合胞病毒。其它報道的 治療的疾病，包括抗病毒HIV，甲、乙、丙型肝炎、感冒和麻疹等；治療神經(jīng)性退行性病變，特 別是亨廷頓氏病，如多聚谷氨酰胺疾病也有報道。RNAi也可以通過抑制過度表達的基因遏 制腫瘤細胞的分裂，治療癌癥。然而，一個非常重要的領域是開發(fā)一個安全的siRNA傳遞技 術，才能保證RNAi的臨床應用。
[0006] 盡管細胞水平的研究表明RNAi是一個非常有前途的藥物開發(fā)平臺，siRNA的脫靶 效應，是否可引起一些副作用也同時引起了注意，因為脫靶效應可抑制與靶基因相似序列 的基因。據(jù)計算，脫靶效應可達10%。在哺乳細胞，長的雙鏈siRNA可誘導干擾素反應。因 此，siRNA或者iNA(interferingnucleicacid，干擾核酸）必須保持短的序列，以避免干 擾素反應。能夠設計一個siRNA或iNA沒有干擾素反應最好的一個方法是設計一個治療性 的iNA或siRNA能作用于一個或一個以上的靶基因，或一個靶基因的不同部位，它的結(jié)構(gòu)可 是一個方向，或不同方向，環(huán)形的，類似環(huán)形的、或直線型的。這幾種類型iNAorsiRNA與 常用的siRNA的結(jié)構(gòu)不同。研究表明：通過對siRNA結(jié)構(gòu)進行化學修飾和對siRNA骨架進 行載體修飾是提高siRNA體內(nèi)傳遞穩(wěn)定性的兩個重要途徑。
[0007]siRNA發(fā)揮作用時具有高度的序列特異性和很強的靶向性。RNAi具有級聯(lián)放大效 應，極少量的雙鏈核糖核酸（double-strandedRNA，dsRNA)便可降解比自身濃度大得多的 mRNA，但體內(nèi)注射siRNA后，必須經(jīng)過包裹，通過全身循環(huán)系統(tǒng)，盡可能避免腎臟腎小球的 濾過，吞噬細胞的吞，血清蛋白吸附和內(nèi)源性核酸酶的降解，以及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES)的 滯留才能到達靶細胞。siRNA在血清中的穩(wěn)定性較差，容易被核酸酶RNase降解。靜脈注 射SiRNA后，SiRNA通過血液循環(huán)分布到各大器官，同時被消除。包裹的SiRNA經(jīng)血管進入 組織間質(zhì)（外滲），然后橫跨間質(zhì)到達靶細胞，到達靶細胞后通過內(nèi)吞攝取。在此過程中， 包裹的siRNA被內(nèi)涵體啟動的內(nèi)吞小囊泡包埋，必須從內(nèi)涵體逃逸，釋放到細胞質(zhì)中，并加 載至RISC方能發(fā)揮作用。siRNA的外滲和穿透能力取決于靶組織的物理結(jié)構(gòu)，而它的胞內(nèi) 攝取量還與siRNA與載體的表面性質(zhì)有關。將siRNA傳遞到靶部位的最大障礙是內(nèi)涵體對 siRNA和載體的包埋和溶酶體對siRNA和載體的降解。
[0008] 裸SiRNA自身帶負電，分子量大，極性強，很難穿過細胞膜、血管內(nèi)皮，容易在脾臟 滯留，在生物體內(nèi)容易被核酸酶降解，半衰期短，轉(zhuǎn)染效率低，甚至會產(chǎn)生強烈的炎癥反應 等。因此，siRNA的體內(nèi)穩(wěn)定性對其療效的發(fā)揮至關重要。利用各種載體的協(xié)助，將siRNA 通過不同的手段高效地遞送到靶細胞是當前研究的重點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明一個技術方案是提供一種包含MlOCl化合物與活性成分的組合物，所述的 MlOCl化合物結(jié)構(gòu)式如下：
[0010]
[0011] 進一步地，還包含膽固醇-聚乙二醇，所述的活性成分為SiRNA。
[0012] 更進一步地，按照質(zhì)量份數(shù)計算，所述的siRNA1-5份和MlOCl化合1-24份，膽固 醇-聚乙二醇1-10份。
[0013] 進一步地，所述的siRNA序列為HBVsiRNA:
[0014]正義鏈：[mC]CG[mU]GUG[mC]ACUUCGCUU[mC]A[dT] [dT];
[0015]反義鏈：UGAAGCGAA⑶G[mC]A[mC]ACGGUC。
[0016] 進一步地，按照質(zhì)量份數(shù)計算，所述的siRNAl份MlOCl化合物I.5份，膽固醇-聚 乙二醇3份。
[0017] 進一步地，膽固醇-聚乙二醇選自膽固醇-PEG400,膽固醇-PEG600和膽固 醇-PEG2000,膽固醇-PEG1000,膽固醇-PEG5000中的一種或幾種。
[0018] 本發(fā)明還提供包含MlOCl化合物與活性成分的組合物的制備方法，包括以下步 驟：
[0019] (1)將SiRNA溶解于枸櫞酸溶液中，pH5. 0,得溶液一；
[0020] (2)取膽固醇-聚乙二醇，MlOCl化合物，并將膽固醇-聚乙二醇和MlOCl化合物 溶解于溶劑中得溶液二；
[0021] (3)將溶液一放置于磁力攪拌器上，一邊攪拌一邊將溶液二緩慢滴入溶液一中，混 合后，加入磷酸緩沖液，將pH調(diào)至6-8,優(yōu)選7,通過透析，置換緩沖液，濃縮；
[0022] (4)再對濃縮液進行高壓均質(zhì)、凍干，形成干燥物，即得所述的組合物。
[0023] 步驟（2)的組分的重量的和與所述siRNA序列組中的一組或混合的重量比為 2-10 : 1;配制完成后的溶液一與溶液二的體積比為1 : 0. 2-1，優(yōu)選1 : 0.25-0.8。
[0024] 更進一步地，所述溶劑為甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯中的一種或兩種以上的 組合。
[0025] 本發(fā)明的包含MlOCl化合物與活性成分的組合物可提高siRNA治療的藥動學特 征，改變生物分布、胞內(nèi)攝取量、靶向性和轉(zhuǎn)染效率，減少不良反應等。MlOCl化合物與活性 成分組成的組合物，能夠?qū)iRNA包裹，在體內(nèi)遞送到靶組織中，穩(wěn)定siRNA分子。在納米 顆粒被內(nèi)吞攝取，進入細胞的內(nèi)涵體時MlOCl也起著關鍵的作用。MlOCl分子是一個兩性大 環(huán)脂質(zhì)分子。在納米顆粒形成后，其親水基團暴露在顆粒外邊。而且納米顆粒的表面電荷 隨其環(huán)境pH的變化而變化。在正常的血液中，pH接近中性，其顆粒表面不帶電荷，避免與 血漿蛋白結(jié)合及被白細胞的吞噬。當進入到細胞內(nèi)涵體時，由于其PH值降低，呈酸性而帶 正電（表一）。在氫離子從外部流入內(nèi)涵體過程中，由于內(nèi)涵體的壓力增加而破裂（海綿似 的效應）。釋放siRNA到細胞質(zhì)中，發(fā)揮其特異性的基因抑制功能（基因沉默）。
【具體實施方式】
[0026] 實施例1合成化合物MlOCl化合物
[0027]MlOCl化合物是（1，4, 7,10,13,16-六氮雜環(huán)十八烷六鹽酸鹽）和環(huán)氧化合物在裝 有攪拌子的玻璃瓶內(nèi)無溶劑下90°C反應得到。反應時間為90°C下24-72小時。其N，N-二 (3-氨丙基）甲胺與環(huán)氧烷基化合物（烷基（C12-C14)縮水甘油醚，C12-14縮水甘油醚在 反應中比例（摩爾比）為1 : 4。其結(jié)果已知從薄層色譜（TLC)上得到證實，反應混合物中 只存在一種主要產(chǎn)物。反應物的產(chǎn)物通過提純后即可應用；
[0028] 實施例2
[0029] 膽固醇_聚乙二醇化合物的合成方法是：在2000毫升圓底燒瓶放置，為（1S，2R， 55，105，115，141?，151?)-2，15-二甲基-14-[(21?)-6-甲基庚基-2基]四環(huán)[8.7.0.0~[2， 7].(T[11，15]]十七烷-7-烯-5-醇（200 克，517. 26mmol，l. 0 當量，吡啶（1000毫升）。加入 4-甲苯磺酰氯（148克，776. 30 1. 50當量）。在油浴50°C攪拌過夜。反應混合物用水/冰浴 冷卻到低溫室。加2000毫升醚稀釋。向混合物加水1X1000水和5x1000 20%檸檬酸。由此產(chǎn) 生的混合物用IxlOOOmlsat.NaClaq洗。由此產(chǎn)生的產(chǎn)品在真空下濃縮。大約180克（64%) 白色固體（1S，2R，5S，10S，11S，1