苷酸 編碼一種第二免疫原性多肽，或者它可以含有不止一種異源多核苷酸，所述異源多核苷酸 在多于1個的啟動子的控制下編碼多于1種的第二免疫原性多肽。
[0087] 至于預(yù)防性疫苗接種，本發(fā)明的組合物還可以用于已經(jīng)被病原體感染的個體中， 結(jié)果是改善對已形成的感染的免疫控制。這在病原體為HIV時尤其受關(guān)注。在HIV的情況 下，這種控制被認(rèn)為是通過特異性識別HIV感染的細(xì)胞的CD8陽性T細(xì)胞達(dá)成的。這種CD8 陽性T細(xì)胞反應(yīng)通過HIV特異性CD4陽性的輔助性T細(xì)胞的存在來維持，因此，兩種類型的 免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)都特別有用，可以通過組合不同的疫苗組合物來達(dá)成。特別關(guān)注的是加佐 劑的蛋白與重組腺病毒的組合。在接種時為HIV感染的初級（primary)感染、潛伏期或末 期的HIV感染患者都將從上述疫苗接種中獲益。患者在疫苗接種時可以經(jīng)受或不經(jīng)受其他 抗病原體的治療干涉（在HIV的情況下-例如，高活性的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療）。
[0088] 抗原
[0089] 根據(jù)本發(fā)明使用的抗原源自病原體。病原體包括病毒、細(xì)菌、原生動物和其他對哺 乳動物（包括人）有害的寄生有機體。
[0090] 作為多肽或編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的多核苷酸給予的合適多肽抗原包括源自下 列的抗原：HIV (如HIV-1)、人皰疹病毒（如gH、gL、gM、gB、gC、gK、gE或gD或其衍生物、或 立即早期蛋白（Immediate Early protein)，如來自 HSV1 或 HSV2 的 ICP27、ICP47、ICP4、 ICP36)、巨細(xì)胞病毒（尤其人的，如gB或其衍生物）、EB(Epstein Barr)病毒（如gp350 或其衍生物）、水痘帶狀皰疹病毒（如gpl、II、III和IE63);或來自肝炎病毒，如乙肝病 毒（例如，乙肝表面抗原、PreSl、PreS2和表面env蛋白、乙肝核心抗原或pol)、丙肝病毒 (如核心、El、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和B)和戊型肝炎病毒抗原；或來自其他病 毒病原體，如副粘病毒（paramyxovirus):呼吸道合胞病毒（如F和G蛋白或其衍生物）； 或來自下列的抗原：副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳頭瘤病毒（例如，HPV6、11、 16、18，如1^1、1^2、￡1、￡2、￡3、￡4、￡5、￡6、￡7)、黃病毒（如，黃熱病病毒、登革熱（〇6即116)病 毒、蜱傳腦炎病毒（Tick-borne encephalitis virus)、日本腦炎病毒）或流感病毒（如， 血凝素（haemaggluttin)、核蛋白、NA或M蛋白、或它們的組合）；或源自細(xì)菌病原體的 抗原，如奈瑟菌屬（Neisseria spp)，包括：淋病奈瑟菌（N. gonorrhea)和腦膜炎奈瑟菌 (N. meningitidis)，如轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白、乳鐵蛋白結(jié)合蛋白、PilC、粘附素）；化膿性鏈球 菌（S. pyogenes)(例如，M蛋白或其片段、C5A蛋白酶、無乳鏈球菌（S. agalactiae)、變形 鏈球菌（S.mutans);杜克雷嗜血桿菌（H. ducreyi);莫拉克氏菌屬（Moraxella spp)，包括 粘膜炎莫拉菌（M.Catarrhalis)，也稱為粘膜炎布蘭漢氏菌（Branhamella Catarrhalis) (例如，高分子量和低分子量粘附素和侵襲素）；博德特氏菌（Bordetella spp)，包括百 日咳桿菌（B. pertussis)(例如，百日咳菌粘附素（pertactin)、百日咳毒素或其衍生物、 絲狀血凝素、腺苷酸環(huán)化酶、菌毛（fimbriae))、g[J百日咳桿菌（B. parapertussis)和支氣 管敗血性博德特氏菌（B.bronchiseptica);分支桿菌屬（Mycobacterium spp)，包括結(jié)核 分支桿菌（M. tuberculosis)、牛分支桿菌（M.bovis)、麻風(fēng)分支桿菌（M. leprae)、鳥分支 桿菌（M. avium)、副結(jié)核分支桿菌（M. paratuberculosis)、恥垢分支桿菌（M. smegmatis); 軍團桿菌屬（Legionella spp)，包括嗜肺性軍團桿菌（L. pneumophila);埃希氏菌屬 (Escherichia spp)，包括腸毒性大腸桿菌（E.coli)(例如，移生因子（colonization factor)、不耐熱腸毒素或其衍生物、熱穩(wěn)定性毒素或其衍生物）、腸出血性大腸桿菌、腸致 病性大腸桿菌（例如，志賀毒素（shiga toxin)樣毒素或其衍生物）；弧菌屬（Vibrio spp)， 包括霍亂弧菌（V. cholera)(例如，霍亂毒素或其衍生物）；志賀菌屬（Shigella spp)，包 括宋內(nèi)志賀菌（S. sonnei)、痢疾志賀菌（S. dysenteriae)、福氏志賀菌（S. flexnerii); 耶爾森菌屬（Yersinia spp)，包括小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Y. enterocolitica)(例如， Yop蛋白）、鼠疫耶爾森菌（Y. pestis)、假結(jié)核耶爾森菌（Y. Pseudotuberculosis);彎 曲桿菌屬（Campylobacter spp.)，包括空腸彎曲桿菌（C. jejuni)(例如，毒素，粘附素 和侵襲素）和結(jié)腸彎曲桿菌（C.coli);沙門氏菌屬（Salmonella spp)，包括傷寒沙門 氏菌（S.typhi)、副傷寒沙門氏菌（S. paratyphi)、豬霍亂沙門氏菌（S.choleraesuis)、 腸炎沙門氏菌（S.enteritidis);李斯特菌屬（Listeria spp)，包括單核細(xì)胞增多性 李斯特菌（L. monocytogenes);螺旋桿菌屬（Helicobacter spp)，包括幽門螺旋桿菌 (H. pylori)(例如脲酶、過氧化氫酶、空泡毒素）；假單胞菌屬（Pseudomonas spp)，包括綠 膿假單胞菌（P. aeruginosa);葡萄球菌屬（Staphylococcus spp)，包括金黃色葡萄球菌 (P. aureus)、表皮葡萄球菌（P.epidermidis);腸球菌屬（Enterococcus spp)，包括奠腸球 菌（E.faecalis)、屎腸球菌（E.faecium);梭菌屬（Clostridium spp)，包括破傷風(fēng)梭狀芽 孢桿菌（C. tetani)(例如，破傷風(fēng)毒素及其衍生物）、肉毒梭狀芽孢桿菌（C. botulinum)(例 如，肉毒桿菌毒素及其衍生物）、艱難梭狀芽孢桿菌（C. difficile)(例如梭菌毒素A或B及 其衍生物）；桿菌屬（Bacillus spp)，包括炭疽桿菌（B. anthracis)(例如，肉毒桿菌毒素及 其衍生物）；棒狀桿菌屬（Corynebacterium spp)，包括白喉桿菌（C.diphtheriae)(例如， 白喉毒素及其衍生物）；疏螺旋體屬（Borrelia spp)，包括博氏疏螺旋體（B. burgdorferi) (例如，0spA、0spC、DbpA、DbpB)、B. garinii (例如，OspA、OspC、DbpA、DbpB)、B. afzelii (例 如，OspA、OspC、DbpA、DbpB)、B. andersonii (例如，OspA、OspC、DbpA、DbpB)、赫氏疏螺旋 體（B.hermsii);埃利希氏體屬（Ehrlichia spp)，包括馬埃里希體（E.equi)和人粒細(xì)胞 性埃利希體（Human granulocytic ehrlichiosis)的制劑；立克次氏體屬（Rickettsia spp)，包括立克氏立克次氏體（R.rickettsii);衣原體屬（Chlamydia spp)，包括沙眼 衣原體（C. trachomatis)、肺炎衣原體（C. pneumoniae)、鶴鵡熱衣原體（C.psittaci); 鉤端螺旋體屬（Leptospira spp)，包括問號鉤端螺旋體（L. interrogans);密螺旋體屬 (Treponema spp)，包括梅毒密螺旋體（T. pal 1 idum)(例如，微量外膜蛋白）、齒垢密螺 旋體（T. denticola)、舌骨痢疾密螺旋體（T. hyodysenteriae);或源自寄生蟲，如皰原蟲 屬（Plasmodium spp)，包括惡性皰原蟲和間日皰原蟲（P.vivax);弓形體屬（Toxoplasma spp)，包括鼠弓形體（T. gondii)(例如，SAG2、SAG3、Tg34);內(nèi)阿米巴屬（Entamoeba spp)， 包括溶組織內(nèi)阿米巴（E. histolytica);巴貝西蟲屬（Babesia spp)，包括果氏巴貝蟲 (B. microti);錐蟲屬（Trypanosoma spp)，包括克氏錐蟲（T.cruzi);賈第蟲屬（Giardia spp)，包括蘭伯賈第蟲（G.lamblia);利什曼原蟲屬（Leishmania spp)，包括碩大利什曼 原蟲（L. major);肺囊蟲屬（Pneumocystis spp)，包括卡氏肺囊蟲（P.carinii);毛滴蟲 屬（Trichomonas spp)，包括陰道毛滴蟲（T. vaginalis);血吸蟲屬（Schisostoma spp)， 包括曼氏血吸蟲（S.mansoni);或源自酵母，如念珠菌屬（Candida spp)，包括白色念珠菌 (C. albicans);隱球菌屬（Cryptococcus spp)，包括新型隱球菌（C.neoformans)。
[0091]其他的細(xì)菌抗原包括源自下列的抗原：鏈球菌屬（Streptococcus spp)，包 括肺炎鏈球菌（S. pneumoniae) (PsaA、PspA、鏈球菌溶血素、膽堿結(jié)合蛋白）和蛋白抗 原肺炎球菌溶血素（Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007 ;Rubins 等人，Microbial Pathogenesis, 25, 337-342)、及其突變蛋白去毒衍生物（WO 90/06951 ;W0 99/03884)。其 他細(xì)菌抗原包括源自下列的抗原：嗜血桿菌屬（Haemophilus spp)，包括B型流感嗜血桿菌 (H. influenzae type B)(例如PRP及其結(jié)合物）、非典型性流感嗜血桿菌，例如0MP26、高分 子量粘附素、P5、P6、蛋白D和脂蛋白D、和絲束蛋白和絲束蛋白來源的肽（US 5, 843, 464) 或其多拷貝變體或融合蛋白。
[0092] 具體地，本發(fā)明的方法或組合物可以用于預(yù)防或治療病毒性疾病，如由乙肝病毒、 丙肝病毒、人乳頭瘤病毒、人免疫缺陷性病毒（HIV)、或單純胞疹病毒引起的疾?。患?xì)菌性 疾病，如由結(jié)核分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis，TB)或衣原體屬引起的那些疾??； 和寄生蟲感染，如瘧疾。
[0093] 應(yīng)認(rèn)識到這些具體的疾病狀況、病原體和抗原僅為示例性參考，而不旨在限制本 發(fā)明的范圍。
[0094]TB 抗原
[0095] 病原體可以為（例如）結(jié)核分支桿菌。
[0096] 源自結(jié)核分枝桿菌的示例性抗原為：例如，a -晶體蛋白（HspX)、HBHA、Rvl753、 Rv2386、Rv2707、Rv2557、Rv2558、RPFs :Rv0837c、Rvl884c、Rv2389c、Rv2450、Rv100 9、 aceA(Rv0467)、ESAT6、Tb38-1、Ag85A、Ag85B 或 Ag85C、MPT 44、MPT59、MPT45、HSP10、 HSP65、HSP70、HSP75、HSP90、PPD 19kDa[Rv3763]、PPD 38kDa[Rv0934]、PstSl (Rv0932)、 SodA(Rv3846)、Rv2031c，16kDa、Ral2、TbH9、Ra35、Tb38-1、Erd 14、DPV、MTI、MSL、DPPD、 mTCCl、mTCC2、hTCCl (TO 99/51748)和 hTCC2，尤其是 Mtb32a、Ra35、Ral2、DPV、MSL、 MTI、Tb38-1、mTCCl、TbH9 (Mtb39a)、hTCCl、mTCC2 和 DPPD。源自結(jié)核分枝桿菌的抗原 還包括融合蛋白及其變體，其中至少兩個或（例如，3個）結(jié)核分枝桿菌的多肽融合成 較大的蛋白。這種融合體可以包括Ral2-TbH9-Ra35、Erdl4-DPV-MTI、DPV-MTI-MSL、 Erdl4-DPV-MTI-MSL-mTCC2、Erdl4-DPV-MTI-MSL、DPV-MTI-MSL-mTCC2、TbH9-DPV-MTI(W0 99/51748)、Ral2-Tbh9-Ra35-Ag85B 和 Ral2-Tbh9-Ra35-mTCC2?？梢蕴岬降木唧w的 Ral2-Tbh9-Ra35序列定義為W0 2006/117240SEQ ID No 6與其中該序列的Ser 70突變?yōu)?非絲氨酸（例如Ala)的變體以及它們整合了適當(dāng)長度的N末端His標(biāo)簽的衍生物（如，TO 2006/117240的SEQ ID No2或4)。還參見SEQ ID No 10,它是含有任選的初始M和任選的 N末端His-His標(biāo)簽（位置2和3)并且其中在位置706的Ala突變?yōu)橐吧蚐er的序列。 [0097] 衣原體抗原
[0098] 病原體可以為（例如）衣原體屬，如沙眼衣原體。
[0099] 源自如沙眼衣原體等衣原體屬的示例性抗原選自：CT858、CT 089、CT875、M0MP、 CT622、PmpD、PmpG及其片段、SWIB和它們?nèi)魏我环N的免疫原性片段（如PmpDpd和PmpGpd) 和它們的組合。優(yōu)選的抗原組合包括CT858、CT089和CT875?？梢圆捎玫木唧w序列和組合 描述于 W02006/104890。
[0100] 瘧原蟲抗原
[0101]病原體可以為（例如）引起瘧疾的寄生蟲，如瘧原蟲屬，如惡性瘧原蟲（P falciparum)或間日癥原蟲（P vivax)。
[0102] 例如，源自惡性皰原蟲的抗原包括環(huán)子孢子（circumsporozoite)蛋白（CS蛋白）、 PfEMP-1、Pfs 16 抗原、MSP-1、MSP-3、LSA-1、LSA-3、AMA-1 和 TRAP。可以提及的具體的雜 合抗原為RTS。RTS是包含惡性瘧原蟲的環(huán)子孢子（CS)蛋白的基本上所有的C末端部分的 雜合蛋白，該C末端部分通過乙肝表面抗原的PreS2部分的4個氨基酸連接到乙肝病毒表 面（S)抗原。當(dāng)在酵母中表達(dá)時，產(chǎn)生的RTS為脂蛋白粒子，當(dāng)其與來自HBV的S抗原共表 達(dá)時，產(chǎn)生稱為RTS, S的混合粒子。RTS和RTS, S的結(jié)構(gòu)公開于W0 93/10152。TRAP抗原描 述于W0 90/01496中。其他的瘧原蟲抗原包括惡性瘧原蟲EBA、GLURP、RAP1、RAP2、鉗合蛋 白、Pf332、STARP、SALSA、PfEXPl、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs48/45、Pfs230 以及它們在 其他瘧原蟲中的類似物。本發(fā)明的一個實施方式是包含下列的組合物：RTS，S或CS蛋白或 其片段，如RTS，S的CS部分與一種或多種另外的瘧疾抗原的組合，該另外的瘧疾抗原可以 選自：例如]\〇 3-1、]\03-3、4麻-1、？€8 16、1^4-1或1^4-3。來自間日瘧原蟲的可能抗原包 括環(huán)子孢子蛋白（CS蛋白）和Duffy抗原結(jié)合蛋白及其免疫原性片段，如RvRII (參見，例 如 TO02/12292)。
[0103] 因此，在本發(fā)明的一個合適的實施方式中，第一和第二免疫原性多肽選自源自惡 性瘧原蟲和/或間日瘧原蟲的抗原。
[0104] 例如，第一和/或第二免疫原性多肽選自源自惡性瘧原蟲和/或間日瘧原蟲的抗 原，該抗原選自 RTS (如，RTS，S)、環(huán)子孢子（CS)蛋白、MSP-l、MSP-3、AMA-l、LSA-lSLSA-3 以及它們的免疫原性衍生物或它們的免疫原性片段。
[0105] 可以提及的一個具體的衍生物為稱為RTS的雜合蛋白，尤其在其以稱為RTS，S的 混合粒子形式存在時。
[0106] 示例性惡性瘧原蟲CS蛋白源抗原示于SEQ ID No 12中。該具體序列對應(yīng)于惡性 瘧原蟲（3D7株系）的CSP序列，該序列還含有來自7G8株系的19aa的插入序列（81-100)。
[0107] 在本發(fā)明的一個【具體實施方式】中，第一免疫原性多肽為RTS，S，第二免疫原性多肽 為來自惡性瘧原蟲的CS蛋白或其免疫原性片段。
[0108] HPV 抗原
[0109] 病原體可以為（例如）人乳頭瘤病毒。
[0110] 因此本發(fā)明中所用的抗原可以源自：例如認(rèn)為能產(chǎn)生生殖器疣的人乳頭瘤病毒 (HPV) (HPV6或HPV11和其他）、和/或產(chǎn)生子宮頸癌的HPV病毒（HPV16、HPV18、HPV33、 HPV51、HPV56、HPV31、HPV45、HPV58、HPV52和其他）。在一個實施方式中，生殖器疣預(yù)防或 治療組合物的形式包括L1粒子或殼粒、和融合蛋白，該融合蛋白包含一種或多種選自HPV 蛋白E1、E2、E5、E6、E7、L1和L2的抗原。在一個實施方式中，融合蛋白的形式為：L2E7,如 W096/26277中所公開；和PCT/EP98/05285中所公開的蛋白D(l/3)-E7。
[0111] 優(yōu)選的HPV子宮頸感染或癌癥預(yù)防或治療組合物可以包含HPV16或18抗原。例 如，L1或L2抗原單體、或一起作為病毒樣粒子（VLP)存在的L1或L2抗原或在VLP或殼 粒結(jié)構(gòu)中單獨存在的L1蛋白。這類抗原、病毒樣粒子和殼粒本身是已知的。參見，例如 冊94/00152、1094/20137、1094/05792、和冊93/02184?？梢詥为毣蛞匀诤系鞍仔问桨ㄆ?他的早期蛋白，如E7、E2或優(yōu)選E5 ;它的具體的優(yōu)選實施方式包括含有L1E7融合蛋白的 VLP(W0 96/11272)。在一個實施方式中，HPV16抗原包括早期蛋白E6或E7與蛋白D載體 融合形成來自HPV的蛋白D-E6或E7融合體、或它們的組合；或E6或E7與L2的組合（WO 96/26277)?；蛘逪PV 16或18早期蛋白E6和E7可以單個分子存在，優(yōu)選為蛋白D-E6/E7 融合體。這種組合物可以任選提供來自HPV18的E6和E7蛋白的任一種或兩種，優(yōu)選為蛋 白D-E6或蛋白D-E7融合蛋白或蛋白D-E6/E7融合蛋白的形式。可以采用來自其他HPV菌 株的其他抗原，優(yōu)選來自HPV31或33菌株。
[0112] HIV 抗原
[0113] 病原體可以（例如）為HIV，如HIV-1。
[0114] 因此，抗原可以選自HIV源抗原，具體為HIV-1源抗原。
[0115] HIV Tat和Nef蛋白為早期蛋白，即，它們在感染早期表達(dá)，不存在結(jié)構(gòu)蛋白。
[0116] Nef基因編碼早期HIV輔助蛋白，該蛋白已顯示具有一些活性。例如，已知Nef?蛋 白引起⑶4(HIV受體）從細(xì)胞表面移除，盡管此功能的生物學(xué)重要性還有爭議。此外，Nef 與T細(xì)胞信號通路相互作用，誘導(dǎo)活性狀態(tài)，繼而可以促進(jìn)更有效的基因表達(dá)。一些HIV分 離物在此區(qū)域具有突變或缺失，這使它們不編碼功能蛋白并嚴(yán)重降低它們在體內(nèi)的復(fù)制和 致病性。
[0117] Gag基因由全長RNA翻譯產(chǎn)生前體多聚蛋白，該前體多聚蛋白隨后被裂解為3-5個 外殼蛋白；基質(zhì)蛋白pl7、外殼蛋白p24和核酸結(jié)合蛋白（Fundamental Virology, Fields BN，Knipe DM and Howley M 19962.Fields Virology 第 2卷 1996)〇
[0118] Gag基因產(chǎn)生55千道爾頓（kd)的Gag前體蛋白，也稱為p55,其由未剪接的病毒 mRNA表達(dá)。在翻譯期間，p55的N末端被十四烷基化，從而觸發(fā)其與細(xì)胞膜胞質(zhì)方面的結(jié) 合。膜結(jié)合的Gag多聚蛋白募集兩個拷貝的病毒基因組RNA與觸發(fā)病毒粒子從感染的細(xì)胞 表面出芽的其他病毒和細(xì)胞蛋白。在出芽后，在病毒成熟過程中，p55被病毒編碼的蛋白酶 (Pol基因的產(chǎn)物）裂解成4個較小的蛋白，稱為MA(基質(zhì)[pl7])、CA(外殼[p24])、NC(核 殼[P9])、和 p6. (4)。
[0119] 除了 3個主要的Gag蛋白（p 17、p24和p9)外，所有的Gag前體都含有幾個其他的 區(qū)域，它們被裂解并以各種大小的肽保留在病毒粒子中。這些蛋白具有不同的作用，例如， P2蛋白在調(diào)控蛋白酶的活性中有作用并且有助于校正蛋白水解進(jìn)程的時限。
[0120] MA多肽源自p55的十四烷基化N末端。大部分MA分子仍然連接在病毒粒子脂質(zhì) 雙層的內(nèi)表面，穩(wěn)定粒子。MA的一個亞群在病毒粒子更深層內(nèi)募集，它們在此處成為復(fù)合體 的一部分保護病毒DNA到核。這些MA分子促進(jìn)病毒基因組的核轉(zhuǎn)運，因為MA上的親核信 號能夠被細(xì)胞核輸入機制識別。這種現(xiàn)象使得HIV能夠感染未分裂的細(xì)胞，這是反轉(zhuǎn)錄病 毒不常見的特性。
[0121] p24(CA)蛋白形成病毒粒子的錐形核。已證明親環(huán)蛋白（Cyclophil