專利名稱：基于離子通道和適配體制備生物傳感器檢測凝血酶的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物傳感器領域，具體涉及一種基于離子通道和適配體制備生物傳感器檢測凝血酶的方法。
背景技術：
凝血酶是一種多功能絲氨酸蛋白酶，在生物體內一系列生理和病理過程中起重要作用。它不但參與止血和凝血、炎癥、免疫反應、組織修復和創(chuàng)傷愈合，而且可激活正常細胞的致瘤潛能和導致惡性細胞的轉移表型。隨著現(xiàn)代社會的發(fā)展，人們的物質生活水平不斷提高，但隨之而來的是各種疾病的侵襲。而這其中有很大一部分是心血管及腦部疾病，由于現(xiàn)在的檢測技術有限，使很多可以治愈的疾病失去了最佳治療期，從而造成不可挽回的后果。新近的研究表明，血凝塊產生的凝血酶在這些過程中起著關鍵作用。從而為腦出血的治療及研究提供了可能。參考文獻[l]ChunhaiFan, Kevin ff. Plaxco, and Alan J. Heeger. Electrochemical interrogation of conformational changes as a reagentless method for the sequence-specific detection of DNA. Applied Biological Sciences，2003， 100(16),9134-9137中記載，Plaxco K. W等人分別利用亞甲藍標記的2個含堿基數(shù)不同的凝血酶適體構建了信號抑制型(信號抑制)和信號放大型(信號增益)的電化學傳感器，將亞甲藍標記的帶32個堿基的凝血酶適體通過自組裝作用固定在金電極表面。當未加入凝血酶時，適體呈隨意的卷曲狀態(tài)，亞甲藍離電極的距離近，電子傳遞能力強，電流信號較大； 當加入凝血酶，適體折疊與凝血酶特異性結合形成G-四聚體椅狀構象，亞甲藍離電極表面的距離變遠，電子傳遞能力減弱，電流信號顯著降低，即為信號抑制型，檢出限為6. 4nmol/ L。信號抑制型的優(yōu)點是電極的表面可以更新，缺點是會檢測到由于污染引起的假陽性結果。隨后，他們又設計了信號增益型通過巰基自組裝作用將27個堿基的適體固定在金電極表面，與另一條部分互補的標記亞甲藍DNA鏈雜交(21個堿基)，雜交后，亞甲藍距離電極表面較遠，電子傳遞能力弱，亞甲藍的還原電流很小；當加入凝血酶后，凝血酶與適體強烈的結合力使雜交雙鏈部分解離，亞甲藍離電極表面的距離變近，亞甲藍的還原電流增大。該法測定的靈敏度為3nmol/L。信號增益型克服了信號抑制型可能會檢測到的假陽性結果，提高了檢測的靈敏度。而基于光信號、pH信號、離子信號等的離子通道，也是當今一大熱門研究的方向。 參考文獻[2] CorrelI B A,Breach L B, King L G，et al. [J] · Nature，1997，387 :580-583 中記載，Correll等人在1997年研制出了一種新型的基于BLM的離子通道開關(ion_channel switch, ICS)生物傳感器。該傳感器在穩(wěn)定性、靈敏度、選擇性、可靠性等方面均有很大提高,通過改變受體的性質和類型,可用于血型分析,檢測細菌、病毒、DNA、藥物、抗體及電解質等，但是靈敏度和檢測限都遠遠不能滿足現(xiàn)有技術發(fā)展的需求
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是結合離子通道和傳統(tǒng)的電極上的基于適配體生物傳感器，使得適配體在電極上的修飾成為三維立體，脫離傳統(tǒng)的二維平面的修飾。另外借助離子通道的開關概念，使得檢測具有仿生和智能的性質。制備出機理為信號增益的檢測凝血酶的生物傳感器，達到信號放大的效果。本發(fā)明可以達到很低的檢測限(IpM)和非常好的選擇性，在實際樣品中也有很好的應用。本發(fā)明提供的基于離子通道和適配體制備生物傳感器檢測凝血酶的方法，具體步驟如下第一步離子通道的制備將刻蝕液9M NaOH溶液滴在PET膜一面上，在35攝氏度的溫度下，進行刻蝕。通過控制時間的長短可控制離子通道孔徑的大小。通?？涛g30分鐘，此時的孔徑用電子顯微鏡測試后，約150nm 200nm。刻蝕完畢后，浸泡在IM HCOOH阻止溶液中30分鐘。洗凈放入去離子水中待用。第二步DNA適配體的配置與準備在PBS (phosphate buffer solution)緩沖溶液中加入DNA適配體，形成DNA適配體溶液，DNA適配體溶液放置在90攝氏度水浴下5分鐘，然后自然冷卻到常溫。使用前放置在-20攝氏度條件下保存。第三步=P-ATP (對巰基苯胺)的配置以無水乙醇為溶劑，向溶劑中加入P-ATP， 得到含有IOmM的P-ATP的乙醇溶液，該乙醇溶液在使用前配置，密封保存，以免液體揮發(fā)。第四步在第一步制備的離子通道上修飾第二步中制備的DNA適配體將刻蝕好離子通道的PET膜放入DNA適配體溶液中，浸泡18小時以上。用去離子水沖洗表面，用濾紙吸干，再將其浸泡在第三步所配置的P-ATP的混合溶液中12小時。用去離子水沖洗表面， 也用濾紙吸干表面。第五步噴金作為工作電極在第四步處理好的PET膜的一面噴上納米金，得到基于離子通道和適配體的生物傳感器。所述的噴上納米金的條件為電流為50mA，時間為8分鐘，納米金的厚度約為30nm。第六步應用第五步中的生物傳感器進行檢測(I)將制備好的噴金后的PET膜(即生物傳感器)固定，并使PET膜上的離子通道與含有IOmM[Ru(NH3)6]3+的緩沖溶液充分接觸，38攝氏度常溫孵化30分鐘。(2)在含有[Ru(NH3)6]3+的緩沖溶液中放入?yún)⒈入姌O和對電極，用循環(huán)伏安法進行測量。(3)向緩沖溶液中加入待測量的凝血酶溶液，超聲I分鐘，放入38攝氏度的孵化箱 30分鐘，再進行測量。(4)重復⑵ (3)，對不同濃度的凝血酶進行測量。循環(huán)伏安的掃描范圍是
O -O. 5V。本發(fā)明的優(yōu)點在于簡單快速，靈敏度高，選擇性好，可以進行實際樣品中的檢測， 具體為(I)本發(fā)明提供的檢測方法對于凝血酶的最低檢測濃度可以達到ΙρΜ，并且線性范圍較大。在3nM-50nM濃度范圍內，檢測后的方波伏安峰電流和濃度的對數(shù)呈線性關系；(2)檢測速度快，峰電流值穩(wěn)定，第10圈與第100圈峰值相差在3%以內；(3)本發(fā)明提供的檢測方法具有很強的專一性，類似的凝血酶都不會對待測的凝血酶的檢測產生干擾(如牛血紅蛋白、溶菌酶和牛血清白蛋白)；
(4)重復性好，數(shù)次檢測結果的標準偏差不高于3% ；(5)本發(fā)明提供的檢測方法具有良好的實用性，在實際樣品中的回收率在92% 105%范圍。


圖I :本發(fā)明中基于離子通道和適配體制備生物傳感器檢測凝血酶的機理圖；圖2 :本發(fā)明中的檢測方法中所用模具的結構示意圖；圖3 :本發(fā)明中凝血酶濃度的電化學檢測圖(a)循環(huán)伏安圖，檢測電流峰高與濃度之間的關系圖；(b)濃度與峰高值的關系圖，插入的圖為濃度3nM 50nM對數(shù)值與電流峰高值的線性關系圖；圖4 :本發(fā)明中檢測的專一性(a)循環(huán)伏安圖，(b)不同類似酶的相關信號百分數(shù)的柱狀圖。
具體實施例方式下面將結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。本發(fā)明提供的檢測方法，是結合離子通道和適配體制備生物傳感器檢測凝血酶的方法。其具體原理如下如圖I所示，本發(fā)明中在PET膜I上制備離子通道101，離子通道101的孔徑為 150nm 200nm，在離子通道101的內壁修飾能與目標物4專一性結合的適配體2。所述的適配體 2 的 DNA 序列為 5 (NH2)-(CH2)6-CCA TCT CCA CTT GGT TGG TGT GGTTGG-3，。端基修飾氨基是為了和PET膜I上的羧基進行結合而設計的。然后將[Ru(NH3)6]3+(在附圖I 中的編號為5進行示意)修飾在DNA的磷酸骨架上，再在PET膜I的一面噴金作為工作電極3，當目標物4(待測凝血酶)結合適配體2時，釋放的[Ru(NH3)6]3+會因為負電壓的作用吸引到工作電極3表面，從而產生檢測信號?；谝陨显?，本發(fā)明的結合離子通道和適配體制備生物傳感器檢測凝血酶的方法，具體步驟為第一步離子通道的制備將刻蝕液9M NaOH溶液滴在PET膜一面上，在35攝氏度的溫度下，進行刻蝕。通過控制時間的長短可控制離子通道孔徑的大小。通常刻蝕30分鐘，此時的孔徑用電子顯微鏡測試后，約150nm 200nm?？涛g完畢后，浸泡在IM HCOOH阻止溶液中30分鐘，用于中和NaOH，防止進一步的刻蝕，使刻蝕停止。用去離子水洗凈多余的 HCOOH和其他離子，并放入去離子水中待用。第二步DNA適配體的配置與準備在PBS緩沖溶液(也叫磷酸鹽緩沖液)中加入 DNA適配體，形成DNA適配體溶液，DNA適配體溶液中含有ΙμΜ DNA，將DNA適配體溶液放置在90攝氏度水浴下5分鐘，然后自然冷卻到常溫。使用前放置在-20攝氏度條件下保存。第三步=P-ATP(對巰基苯胺)乙醇溶液的配置在無水乙醇中加入P-ATP配置 P-ATP的乙醇溶液，乙醇溶液中含有IOmM的Ρ-ΑΤΡ，該乙醇溶液在使用前配置，密封保存，以免液體揮發(fā)。第四步在離子通道上修飾DNA適配體將刻蝕好離子通道的PET膜放入第二步中制備的DNA適配體溶液中，浸泡18小時以上。用去離子水沖洗表面，輕輕擦干或者用濾紙吸干表面，再將其浸泡在第三步所配置的P-ATP乙醇溶液中12小時，然后用去離子水沖洗表面，輕輕擦干或者用濾紙吸干即可使用。在上述的修飾過程中，一端是氨基的P-ATP也能修飾在PET膜的表面，占據(jù)適配體沒有修飾的羧基上，使適配體DNA能夠直立修飾在PET膜的表面。第五步噴金作為工作電極在修飾好DNA適配體的具有離子通道的PET膜的一面噴上納米金，噴金采用的電流為50mA，時間為8分鐘，納米金的厚度約為30nm。得到基于離子通道和適配體的生物傳感器。第六步進行凝血酶的檢測(I)將制備好的噴金后的PET膜(即第五步中的生物傳感器)固定在第一模具和第二模具之間，噴金的工作電極位于第一模具的一側，第二模具中加入含有 IOmM[Ru(NH3)6]3+的緩沖溶液，生物傳感器的離子通道與含有[Ru(NH3)6]3+的緩沖溶液充分接觸，在38攝氏度孵化30分鐘。如圖2所示，所述的第一模具是實心的方體結構，第二模具是具有橫向圓柱形孔洞的長方體結構，所述的孔洞的直徑為O. 9cm，容積為2mL，圓柱形孔洞一端開口位于第二模具上與第一模具連接的面上，另一端是封閉，即孔洞的長度小于第二模具的長度。檢測時，將PET膜固定在兩塊模具中間，PET膜上具有噴金的工作電極的一面朝向第一模具，具有離子通道的一面朝向第二模具上具有孔洞開口的側面，當兩個模具用鐵槽固定起來后， 就形成了兩面都封口的橫向圓柱形容器，作為檢測場所和目標物結合適配體的反應場所。 連接固定后，在第二模具的上表面分別有兩個直徑為O. 5cm的圓形通孔作為參比電極和鉬對電極的插入孔道，所述圓形通孔與圓柱形孔洞是相通的，保證在銀/氯化銀參比電極和鉬對電極插入后，可以與圓柱形孔洞內的溶液充分接觸。(2)在含有[Ru(NH3)6]3+的緩沖溶液中放入?yún)⒈入姌O和對電極，用循環(huán)伏安法進行測量。(3)在第二模具的圓柱形孔洞內繼續(xù)加入待測量的凝血酶溶液，超聲I分鐘，放入 38攝氏度的孵化箱30分鐘，再進行測量。測量為三電極體系，采用循環(huán)伏安法，測量電流隨電壓的變化趨勢。(4)重復⑵ (3)，對不同濃度的凝血酶進行測量。循環(huán)伏安的掃描范圍是
O -O. 5V。本發(fā)明提供的檢測方法對檢測信號具有放大作用，通過結合離子通道和適配體制備生物傳感器，利用循環(huán)伏安法來進行凝血酶檢測，以得到對凝血酶檢測范圍以及最低檢測限。圖3a和圖3b出示了應用本發(fā)明的生物傳感器檢測凝血酶的循環(huán)伏安圖以及循環(huán)伏安峰電流和凝血酶濃度的關系曲線。從圖3a可以看出，循環(huán)伏安峰電流隨著凝血酶濃度的增加而增大。從圖3b的插圖中看出，在3nM 50nM濃度范圍內，循環(huán)伏安峰電流和凝血酶濃度的對數(shù)成良好的線性關系，檢測限為ΙρΜ。和其他信號抑制的生物傳感器檢測對比能很清楚的看出通過結合離子通道與適配體后，生物傳感器對目標物的傳感能力大大增強，響應百分數(shù)從40% 400%，遠遠高于信號抑制的響應百分數(shù)。本發(fā)明提供的檢測方法的專一性是通過檢測另外三種性質相似的氨基酸牛血紅蛋白(Bovine Hemoglobin),牛血清白蛋白(Bovine serum albumin)和溶菌酶(Iysozyme) 來證明的,這三種氨基酸的濃度均為ImM。應用本發(fā)明中生物傳感器的檢測結果,如圖4a，圖中曲線4為空白溶液作為背景峰，凝血酶濃度為InM，當檢測濃度均為ImM的溶菌酶、牛血紅蛋白和牛血清白蛋白的混合物時，反應后的循環(huán)伏安曲線相對于背景峰沒有出現(xiàn)明顯的信號變化。當加入濃度為InM的凝血酶時，循環(huán)伏安電流信號明顯增強。結果表明，本發(fā)明的生物傳感器對凝血酶的檢測具有明顯的專一性。圖4b出示了該傳感器檢測上述不同的氨基酸后的方波伏安峰電流相對于背景方波峰電流信號的信號變化柱狀圖，從圖4b可以看出，同InM凝血酶的電流相比，濃度為ImM的溶菌酶、牛血紅蛋白和牛血清白蛋白產生的方波峰電流改變不到10%。這表明用本發(fā)明的生物傳感器對凝血酶進行檢測具有明顯的專一性。對本發(fā)明提供的檢測方法的穩(wěn)定性也有良好的體現(xiàn)，掃描循環(huán)伏安圖中，第10圈和第100圈的峰值偏差只有2. 6%，顯示了本發(fā)明提供的檢測方法具有很好的穩(wěn)定性能。為了檢驗本發(fā)明提供的檢測方法對實際樣品是否具有實用性，我們測試了一個人體生理基質和具有不同濃度的凝血酶的加標樣品，當使用本發(fā)明制備生物傳感器時，向所在溶液添加10pM、IOOpMUnM和3nM的凝血酶后的回收率分別是102. 3%,92. 1%U04. 1% 和101. 6%，說明該該發(fā)明的生物傳感器有希望應用于復雜生物樣品的分析。
權利要求
1.基于離子通道和適配體制備生物傳感器檢測凝血酶的方法，其特征在于第一步離子通道的制備將刻蝕液9M NaOH溶液滴在PET膜的一面上，在35攝氏度的溫度下，進行刻蝕；第二步DNA適配體的配置與準備在PBS緩沖溶液中加入DNA適配體，形成DNA適配體溶液，DNA適配體溶液放置在90攝氏度水浴下5分鐘，然后自然冷卻到常溫；第三步=P-ATP的配置以無水乙醇為溶劑，向溶劑中加入P-ATP，得到含有IOmM的 P-ATP的乙醇溶液；第四步在第一步制備的離子通道上修飾第二步中制備的DNA適配體將刻蝕好離子通道的PET膜放入DNA適配體溶液中，浸泡18小時以上；用去離子水沖洗表面，用濾紙吸干，再將其浸泡在第三步所配置的P-ATP的混合溶液中12小時，用去離子水沖洗表面，也用濾紙吸干表面；第五步噴金作為工作電極在第四步處理好的PET膜的一面噴上納米金，得到基于離子通道和適配體的生物傳感器；第六步應用第五步中的生物傳感器進行檢測。
2.根據(jù)權利要求I所述的基于離子通道和適配體制備生物傳感器檢測凝血酶的方法， 其特征在于第一步中刻蝕時間30分鐘，孔徑為150nm 200nm，刻蝕完畢后，浸泡在IM HCOOH阻止溶液中30分鐘，然后洗凈放入去離子水中待用。
3.根據(jù)權利要求I所述的基于離子通道和適配體制備生物傳感器檢測凝血酶的方法， 其特征在于第二步中制備的DNA適配體溶液中含有I μ M DNA。
4.根據(jù)權利要求I所述的基于離子通道和適配體制備生物傳感器檢測凝血酶的方法， 其特征在于第二步中制備的DNA適配體溶液，在使用前放置在-20攝氏度條件下保存。
5.根據(jù)權利要求I所述的基于離子通道和適配體制備生物傳感器檢測凝血酶的方法， 其特征在于第五步中所述的噴上納米金的條件為電流為50mA，時間為8分鐘，納米金的厚度約為30nm。
6.根據(jù)權利要求I所述的基于離子通道和適配體制備生物傳感器檢測凝血酶的方法， 其特征在于第六步中的檢測具體為(1)將制備好的噴金后的PET膜固定，并使PET膜上的離子通道與含有 IOmM[Ru(NH3)6]3+的緩沖溶液充分接觸，孵化30分鐘；(2)在含有[Ru(NH3)6]3+的緩沖溶液中放入?yún)⒈入姌O和對電極，用循環(huán)伏安法進行測(3)向緩沖溶液中加入待測量的凝血酶溶液，超聲I分鐘，放入38攝氏度的孵化箱30 分鐘，再進行測量；(4)重復步驟(2) (3)，對不同濃度的凝血酶進行測量，循環(huán)伏安的掃描范圍是O -O. 5V。
7.根據(jù)權利要求6所述的基于離子通道和適配體制備生物傳感器檢測凝血酶的方法， 其特征在于，所述的PET膜的固定，具體為將PET膜固定在第一模具和第二模具中間，PET 膜上具有噴金的工作電極的一面朝向第一模具，具有離子通道的一面朝向第二模具上具有孔洞開口的側面，當兩個模具固定起來后，就形成了兩面都封口的橫向圓柱形容器，作為檢測場所和目標物結合適配體的反應場所；在所述的第二模具的上表面分別有兩個直徑為O. 5cm的圓形通孔作為參比電極和鉬對電極的插入孔道，所述圓形通孔與圓柱形孔洞是相通的，保證在銀/氯化銀參比電極和鉬對電極插入后，與圓柱形孔洞內的溶液充分接觸；所述的第一模具是實心的方體結構，第二模具是具有橫向圓柱形孔洞的長方體結構， 所述的孔洞的直徑為O. 9cm，容積為2mL，圓柱形孔洞一端開口位于第二模具上與第一模具連接的面上，另一端是封閉。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于離子通道和適配體制備生物傳感器檢測凝血酶的方法，屬于生物傳感器領域，所述的檢測方法在離子通道上修飾DNA適配體，并采用P-ATP的混合溶液進行處理，最后進行噴金作為工作電極，得到基于離子通道和適配體的生物傳感器對凝血酶進行檢測。本發(fā)明的優(yōu)點在于簡單快速，靈敏度高，選擇性好，可以進行實際樣品中的檢測，對凝血酶的最低檢測濃度達到1pM，并且線性范圍較大。在3nM-50nM濃度范圍內，檢測后的方波伏安峰電流和濃度的對數(shù)呈線性關系；峰電流值穩(wěn)定，第10圈與第100圈峰值相差在3％以內；具有很強的專一性、重復性和實用性，在實際樣品中的回收率在92％～105％范圍。
文檔編號G01N27/26GK102608177SQ20121005409
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月2日 優(yōu)先權日2012年3月2日
發(fā)明者李麗東, 林麗娟, 牟曉姣, 陳鄭博 申請人:北京航空航天大學